Celem tego protokołu jest wykrycie różnych toksnotypów Clostridium perfringens w lokalnie zakupionej żywności, szczególnie w przypadku szczepów B i D wytwarzających toksynę epsilon, bez użycia komór beztlenowych.
Artykuł metodologiczny
Wzbogacanie i wykrywanie toksyn Clostridium perfringens w detalicznych próbkach żywności
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Clostridium perfringens (C. perfringens) jest płodnym producentem toksyn i powoduje szeroki zakres chorób u różnych gospodarzy. C. perfringens dzieli się na pięć różnych toksnotypów, od A do E, w oparciu o nosicielstwo czterech głównych genów toksyn. Rozpowszechnienie i dystrybucja tych różnych toksnotypów jest niedostatecznie zbadana, zwłaszcza ich wszechobecność w amerykańskiej żywności detalicznej. Szczególnie interesujące są dla nas szczepy typu B i D, które wytwarzają toksynę epsilon, niezwykle śmiertelną toksynę, o której sugeruje się, że jest środowiskowym czynnikiem wywołującym stwardnienie rozsiane u ludzi. Aby ocenić obecność różnych toksnotypów C. perfringens w różnych próbkach żywności, opracowaliśmy łatwą metodę selektywnej hodowli tych bakterii bez użycia beztlenowego systemu pojemników obejmującego tylko trzy etapy hodowli. Żywność jest kupowana w lokalnych sklepach spożywczych i transportowana do laboratorium w warunkach otoczenia. Próbki są mielone i zaszczepiane na zmodyfikowane szybkie podłoża perfringens (RPM) i inkubowane przez noc w temperaturze 37 °C w szczelnej, hermetycznej stożkowej probówce. Nocne kultury są zaszczepiane na dolnej warstwie stałego agaru z cykloseryną siarczynu tryptozy (TSC), a następnie nakładane na górną warstwę stopionego agaru TSC, tworząc "warstwowe", beztlenowe środowisko. Płytki agarowe inkubuje się przez noc w temperaturze 37 °C, a następnie ocenia się pod kątem pojawienia się czarnych kolonii redukujących siarczyny. Kolonie C. perfringens są usuwane z agaru TSC za pomocą sterylnych zakraplaczy do oczu, a następnie inokulowane do RPM i hodowane przez noc w temperaturze 37 °C w hermetycznej stożkowej probówce. DNA jest ekstrahowane z subkultury RPM, a następnie analizowane pod kątem obecności genów toksyny C. perfringens za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). W zależności od rodzaju pobranej żywności, zazwyczaj 15–20% próbek daje wynik pozytywny na obecność C. perfringens.
Wprowadzenie
Clostridium perfringens (C. perfringens) to Gram-dodatnia, beztlenowa, tworząca przetrwalniki, pałeczkowata bakteria, która jest powszechnie występująca w środowisku. Ten gatunek bakterii jest nosicielem genów kodujących ponad 17 toksyn i historycznie został scharakteryzowany w pięciu toksinotypach (A-E) w oparciu o obecność czterech różnych genów toksyn: alfa, beta, epsilon i toksyny jota (Tabela 1)1. Ostatnio zasugerowano, że ten schemat typowania powinien zostać rozszerzony o typy F i G, które zawierają odpowiednio enterotoksynę C. perfringens (CPE) i toksynę NetB2. Potrzebne są jednak dalsze badania, zanim ten system intryg zostanie formalnie zaakceptowany. Podczas gdy gen toksyny alfa jest ściśle zlokalizowany chromosomalnie, gen CPE można znaleźć zarówno na chromosomie, jak i plazmidach. Dla porównania, geny pozostałych toksyn znajdują się na różnych plazmidach o różnej wielkości. Jesteśmy szczególnie zainteresowani występowaniem C. perfringens typu B i D, ponieważ szczepy te wytwarzają toksynę epsilon, niezwykle silną, tworzącą pory toksynę, która, jak sugeruje się, odgrywa rolę w wywoływaniu stwardnienia rozsianego (MS) u ludzi3,4,5,6,7. Nie wiadomo, w jaki sposób ludzie zarażają się lub kolonizują te szczepy. Jednym z możliwych wyjaśnień jest spożywanie skażonych produktów spożywczych. Aby odpowiedzieć na to pytanie, staraliśmy się określić częstość występowania różnych toksnotypów C. perfringens w amerykańskich próbkach żywności.
Obecność toxinotypów C. perfringens w amerykańskich próbkach żywności jest niedostatecznie zbadana i często wymaga użycia beztlenowych systemów pojemników i licznych etapów hodowli pod8,9,10,11. Chociaż do uzyskania oczyszczonych izolatów potrzebne są liczne etapy hodowli, metoda ta może z czasem prowadzić do utraty plazmidów12,13,14, co może mieć wpływ na wykrywanie genów toksyn plazmidowych, w tym genu toksyny epsilon. Staraliśmy się opracować łatwą metodę, z mniejszą liczbą etapów hodowli cząstkowej, do selektywnej hodowli C. perfringens bez użycia komór beztlenowych, słoików lub worków. Krótko mówiąc, próbki żywności są inokulowane w pożywce Rapid Perfringens (RPM) przez noc (ON), a następnie "umieszczane" w agarze TSC i inkubowane ON. Kolonie podejrzane o bycie C. perfringens są następnie subhodowane do RPM i ponownie inkubowane ON. DNA jest ekstrahowane i przeprowadzany PCR w celu określenia genotypu (Figura 1). Zdecydowaliśmy się użyć RPM, ponieważ wykazano, że zwiększa on odzysk szczepów C. perfringens z próbek żywności w porównaniu z innymi, bardziej standardowymi podłożami15. Ponadto RPM został z powodzeniem wykorzystany do wyizolowania szczepu typu B wytwarzającego toksynę epsilon od pacjenta ze stwardnieniem rozsianym4. Używamy zmodyfikowanej wersji RPM zamiast oryginalnej wersji, aby umożliwić łatwą ekstrakcję DNA. Chociaż metoda ta pozwala na łatwą identyfikację genów toksyn w próbkach, możliwe jest, że pojedyncza próbka będzie zawierać więcej niż jeden toksynotyp C. perfringens. Ponieważ nasza metoda nie izoluje oczyszczonych szczepów przy użyciu wielu rund oczyszczania, identyfikacja wielu toksynotypów z jednej próbki nie jest możliwa. Jednak standardowe techniki oczyszczania (zazwyczaj smugi na płytkach TSC lub płytkach z agarem z krwią) mogą być stosowane pod koniec naszego protokołu, aby uzyskać oczyszczone kultury.
Protokół
UWAGA: C. perfringens jest uważany za organizm o poziomie zagrożenia bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL2). Chociaż nie wszystkie próbki żywności będą zawierały C. perfringens, wszystkie próbki hodowlane powinny być traktowane jako takie. Przez cały czas należy nosić wszystkie odpowiednie środki ostrożności i środki ochrony osobistej (PPE). Odkaż cały materiał przed utylizacją.
1. Przygotuj zmodyfikowane RPM4,15
- Połączyć 30 g/l płynnego tioglikolanu, 60 g/l żelatyny, 5 g/l peptonu, 5 g/l glukozy, 5 g/l dwuzasadowego fosforanu potasu, 3 g/l ekstraktu drożdżowego, 1,5 g/l chlorku sodu, 0,5 g/l siarczanu żelazawego w wodzie dejonizowanej, aż do równomiernego rozproszenia. Zazwyczaj wykonujemy partie o pojemności 1 litra.
- Autoklaw w temperaturze 121 °C przez 15 min.
- Pozostawić do ostygnięcia do temperatury około 40 °C.
- Gdy RPM ostygnie, dodaj D-cykloserynę do końcowego stężenia 440 mg/L.
UWAGA: Podstawowe stężenia D-cykloseryny rozpuszczonej w sterylnej wodzie w stężeniu 50 mg/ml mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C do wykorzystania w przyszłości. - Przenieść aseptycznie 10 ml prędkości obrotowej na minutę do stożkowych probówek o pojemności 15 ml. RPM można przygotowywać partiami i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do jednego miesiąca.
- Przed użyciem rozgrzać obroty do 37 °C.
2. Pobieranie próbek i inkubacja RPM
- Żywność należy transportować do laboratorium w temperaturze otoczenia w ciągu 1 godziny. Żywność może być transportowana w oryginalnych opakowaniach lub sterylnych pojemnikach. Jeśli nie zostanie to natychmiast przetestowane, żywność może być przechowywana w temperaturze -20 °C do czasu użycia. Zanotuj rodzaj żywności i kraj pochodzenia zgodnie z etykietą na opakowaniu, jeśli jest dostępna, a także wszelkie inne istotne informacje.
- Usuń około 1,0–2,0 g pokarmu i przenieś na sterylną szalkę Petriego lub równoważną. Drobno zmielić sterylną żyletką lub skalpelem.
- Zaszczepić w 10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Dobrze wymieszaj.
- Aby wybrać komórki wegetatywne, przenieś 5 ml mieszaniny PBS i żywności do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 10 ml RPM. Szczelnie dokręć pokrywę.
- Aby wybrać zarodniki, podgrzej pozostałe 5 ml mieszaniny PBS i żywności w temperaturze 85 °C przez 15 minut, a następnie przenieś do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 10 ml obr./min. Szczelnie dokręć pokrywę.
- Wiruj i odwróć kultury żywności-RPM, aby zapewnić całkowite wymieszanie.
- Szczelnie zamknij stożkowe rurki i owiń pokrywki folią parafinową lub folią plastikową, aby zapewnić środowisko beztlenowe.
- Inkubować przez noc (ON) w temperaturze 37 °C.
- Następnego ranka zwróć uwagę na zmętnienie lub fermentację w rurach RPM.
3. Poszycie "kanapkowe" TSC
- Zaszczepić kultury ON RPM w agarze TSC przy użyciu techniki "kanapkowej" (Rysunek 2) opisanej poniżej.
- Przygotuj agar TSC zgodnie z instrukcjami producenta.
- Przygotować warstwę bazową płytek TSC, przenosząc 10 ml stopionego agaru TSC na sterylne szalki Petriego i pozostawić do zestalenia. Można je przygotować w stanie zaawansowanym i przechowywać w temperaturze 4 °C. Przed użyciem należy upewnić się, że talerze są ogrzane do temperatury pokojowej.
- W przypadku górnej warstwy płytki TSC utrzymuj pozostały stopiony agar TSC w temperaturze 40 °C.
UWAGA: Chociaż temperatura topnienia agaru przekracza 85 °C, stopiony agar krzepnie około 32–45 °C.
- Ostrożnie pobrać kultury ON RPM i przenieść 100 μl na bazę agarową TSC. Z powodu fermentacji niektóre kultury mogą być pod presją. Upewnij się, że nosisz wszystkie odpowiednie środki ochrony osobistej.
- Rozprowadź inokulum RPM za pomocą wysterylizowanych szklanych kulek lub rozsiewacza komórek.
- Pozostaw RPM do "wchłonięcia" przez agar TSC przez 5–10 minut w temperaturze pokojowej.
- Ostrożnie przenieść 20 ml stopionego agaru TSC o temperaturze 40 °C na płytkę za pomocą pipety serologicznej.
- Załóż pokrywkę szalki Petriego i pozwól, aby agar TSC całkowicie zestalił się w temperaturze pokojowej.
- Odwrócić szalkę Petriego i inkubować w temperaturze 37 °C ON.
- Jeśli pożądane są seryjne rozcieńczenia, należy przeprowadzić rozcieńczenia kultur ON RPM do świeżego, wstępnie podgrzanego RPM przed inokulacją do agaru TSC.
4. Hodowla cząstkowa kolonii redukujących siarczyny
- Następnego ranka wyjmij płytki z inkubatora i sprawdź, czy nie rozwijają się bakterie. Bakterie tlenowe mogą być obecne na powierzchni agaru. Bakterie beztlenowe rosną w agarze i są osadzone w agarze . Bakterie redukujące siarczyny zmienią otaczający agar na. Możliwe kolonie C. perfringens będą czarne i osadzone w agarze .
- Podejrzewane kolonie C. perfringens będą dodatnie pod względem redukcji siarczynów i będą wyglądać na czarne, osadzone w agarze . Za pomocą sterylnego, jednorazowego zakraplacza "zerw" czarne kolonie z agaru i przenieś do 10 ml świeżej prędkości obrotowej w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Ważne jest, aby powietrze z zakraplacza zostało usunięte przed przekłuciem agaru.
- Jeśli na powierzchni płytki znajduje się gęsta ilość bakterii tlenowych, użyj sterylnego skrobaka do komórek, aby usunąć kolonie z wybranych obszarów. Z wielu kolonii podejrzanych o zakażenie C. perfringens można pobrać próbki z tej samej płytki TSC do oddzielnych kultur RPM.
- Szczelnie zabezpiecz stożkowe pokrywki tubek i zawiń w folię parafinową lub folię spożywczą. Inkubować w temperaturze 37 °C.
5. Ekstrakcja DNA
- Usuń kultury ON RPM i sprawdź oznaki wzrostu, w tym zmętnienie i fermentację.
- Delikatnie odwróć kulturę RPM, aby rozproszyć osiadłe bakterie i ostrożnie otwórz. Przenieść 1 ml kultury do probówki mikrowirówkowej.
- Wirować z maksymalną prędkością (około 15 000 x g) przez 10 minut, aby osadzać bakterie.
- Przemyć granulat 1 ml sterylnego PBS.
- W niektórych okolicznościach niestrawiona żelatyna osiada na wierzchu granulowanych bakterii. Aby usunąć żelatynę, należy ją "spulchnić", delikatnie mieszając z PBS za pomocą mikropipety. Spowoduje to "spulchnienie" żelatynę, pozostawiając nienaruszoną osadkę bakteryjną.
- Usunąć mieszaninę PBS i żelatyny z delikatnym zasysaniem. Ponownie zawiesić pozostały osad bakteryjny w 1 ml świeżego PBS.
- Odwirować zawieszony osad bakteryjny z maksymalną prędkością przez 10 minut i ostrożnie odessać supernatant.
- Natychmiast wykonaj ekstrakcję DNA przy użyciu zestawu do ekstrakcji DNA i protokołu stworzonego specjalnie do ekstrakcji DNA z bakterii Gram-dodatnich (patrz tabela materiałów).
- Wyekstrahowane DNA należy natychmiast zużyć lub przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu analizy PCR.
6. Wykrywanie C. perfringens za pomocą genotypowania PCR
- Aby ustalić, czy kultury są dodatnie dla toksnotypów C. perfringens, zbadaj wyekstrahowane DNA pod kątem różnych genów toksyn za pomocą PCR.
UWAGA: Ponieważ najbardziej interesują nas szczepy typu B i D C. perfringens wytwarzające toksynę epsilon, oceniamy obecność genów toksyny alfa, beta i epsilon. Startery wymieniono w tabeli 2. Startery dla 16s rybosomalnego DNA są stosowane jako kontrola ekstrakcji DNA. Dodatkowe startery mogą być używane do testowania na obecność toksynotypów od A do G i można je znaleźć w opublikowanej literaturze2,12,13. - Użyć wcześniej wyekstrahowanego DNA C. perfringens jako kontroli pozytywnej. Kontrola ta zapewnia, że wszystkie składniki reakcji PCR działają. Jako kontrolę pozytywną używamy DNA wyekstrahowanego z C. perfringens typu B (ATCC 3626). Hodować ATCC 3636 ON w prędkościach obrotowych w temperaturze 37 °C i ekstrahować DNA przy użyciu tych samych metod, które opisano w krokach 5.1–5.7. Wyekstrahowane DNA należy przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu użycia.
- Ustaw warunki PCR w następujący sposób: 94,0 °C przez 3 min; 94,0 °C przez 30 s; 47,9 °C przez 30 s, 72,0 °C przez 1 min (powtórz kroki 2–4 przez 35 cykli); 72,0 °C przez 10 min.
- Aby potwierdzić produkty PCR, należy przeprowadzić reakcje PCR na żelu agarozowym o stężeniu 1,8 g/100 ml przy użyciu standardowych technik. Oczekiwane rozmiary produktów do PCR podano w tabeli 2. Typowe wyniki PCR są wyświetlane w Rysunek 3.
Wyniki
Stosując tę metodę, w 15–20% naszych pobranych próbek żywności uzyskano wynik dodatni w kierunku C. perfringens. Chociaż większość szczepów wykazuje dodatni wynik dla toksynotypu A, w próbkach żywności skutecznie wykryto również typy B i D. W wcześniej opublikowanej pracy przebadzano łącznie 216 próbek żywności zakupionych w sklepach detalicznych w Nowym Jorku16 (Tabela 3). Próbki te obejmowały różne rodzaje mięsa (wołowinę, jagnięcinę, wieprzowinę i baraninę), próbki drobiu (kurczaka i indyka) oraz owoce morza i ryby (dorsza, łososia, skorupiaki, czerwonego snapsa, flundrę, kalmary, tilapię, tuńczyka oraz różne inne ryby). Przebadano również warzywa i owoce oraz produkty mleczne. Z 216 próbek 34 (16%) okazały się dodatnie pod kątem C. perfringens. Z 34 próbek dodatnich na C. perfringens, 31 (91,2%) zawierało toksynę alfa, jedna próbka (2,9%) zawierała toksyny alfa, beta i epsilon, a dwie próbki (5,9%) zawierały toksyny alfa i epsilon.
Co ciekawe, odkryliśmy również, że C. perfringens występował częściej w formie komórek wegetatywnych niż przetrwalników. Porównano 25 próbek pod kątem obecności wegetatywnych komórek C. perfringens lub przetrwalników. Przetrwalniki wyselekcjonowano poprzez szok termiczny próbek w 85 °C przez 15 min. Z 25 przebadanych próbek 16% było dodatnich pod kątem wegetatywnych szczepów C. perfringens, w porównaniu do 4% w przypadku przetrwalników. Wskazuje to, że bardziej efektywne kosztowo może być testowanie wyłącznie komórek wegetatywnych zamiast obu form.
Rysunek 1: Przegląd procedury.
Próbki żywności są rozdrabniane i rozcieńczane w sterylnym PBS. Połowę próbki żywności w PBS szczepia się w RPM w celu selekcji komórek wegetatywnych. Pozostałą część próbki żywności w PBS poddaje się szokowi termicznemu w 85 °C przez 15 min w celu wyselekcjonowania przetrwalników przed inokulacją w RPM. Kultury inkubowano przez noc w 37 °C następnie wysiano na agar TSC. Agar TSC inkubowano przez noc w temperaturze 37 °C a czarne, redukujące siarczyny kultury są przesiewane do świeżej pożywki RPM. Przesiane kultury w pożywce RPM są inkubowane przez noc w 37 °C Następnie ekstrahuje się DNA w celu przeprowadzenia genotypowania za pomocą PCR. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 2: Schemat techniki kanapki z agarem TSC.
pożywka RPM zawierająca C. perfringens Bakterie wysiewa się pomiędzy dwie warstwy agaru TSC, aby stworzyć środowisko beztlenowe. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 3: Wybrane wyniki PCR.
Przykładowe obrazy wyników genotypowania C. perfringens z siedmiu różnych rodzajów żywności oraz kontroli pozytywnej w postaci C. perfringens typ B. W celu przybliżenia rozmiaru produktów PCR w parach zasad (bp) wykorzystano drabinę mas cząsteczkowych (pierwsza ścieżka każdego żelu). Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
| Toksynotyp | Alfa | Beta | Epsilon | Iota | CPE | NetB | |
| Ustanowione | A | + | - | - | - | - | - |
| B | + | + | + | - | - | - | |
| C | + | + | - | - | + | - | |
| D | + | - | + | - | + | - | |
| E | + | - | - | + | + | - | |
| Proponowane | F | + | - | - | - | + | - |
| G | + | - | - | - | - | + | |
| + obecny - nieobecny +/- może być obecny lub nieobecny | |||||||
Tabela 1: Przegląd genotypów C. perfringens. Tabela przedstawiająca kombinacje toksyn produkowanych przez każdy toksynotyp C. perfringens.
| Cel | bất cặp starterów | Oczekiwany produkt PCR (bp) |
| alfa | F: GCT AAT GTT ACT GCC GTT GA R: CCT CTG ATA CAT CGT GTA AG | 325 |
| beta | F: GCG AAT ATG CTG AAT CAT CTA R: GCA GGA ACA TTA GTA TAT CTT C | 196 |
| epsilon | F: GCG GTG ATA TCC ATC TAT TC R: CCA CTT ACT TGT CCT ACT AAC | 655 |
| 16S rRNA | F: AGA GTT TGA TCC TGG CTC A R: GGT TAC CTT GTT ACG ACT T | ~1300 |
Tabela 2: Primery i oczekiwane produkty PCR dla wybranych genów toksyn. Primery wykorzystane w etapie genotypowania metodą PCR.
| Rodzaj żywności | Typ A | Typ B | Typ C | Typ D | C. perf + | |||||||
| dodatni w kierunku toksyny alfa | dodatni wynik w kierunku toksyny alfa, beta i epsilon | dodatni wynik w kierunku toksyny alfa i beta | dodatni wynik w kierunku toksyny alfa i epsilon | |||||||||
| n | n | % | n | % | n | % | n | % | n | % | ||
| Mięso | wołowina | 38 | 8 | 21% | 1 | 3% | 0 | 0% | 0 | 0% | 9 | 24% |
| jagnię | 10 | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | |
| wieprzowina | 15 | 2 | 13% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 2 | 13% | |
| mieszany | 1 | 1 | 100% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 1 | 100% | |
| suma częściowa | 64 | 11 | 17% | 1 | 2% | 0 | 0% | 0 | 0% | 12 | 19% | |
| Drób | kurczak | 19 | 5 | 26% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 5 | 26% |
| indyk | 7 | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | |
| suma częściowa | 26 | 5 | 19% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 5 | 19% | |
| Owoce morza | COD (chemiczne zapotrzebowanie na tlen) | 4 | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% |
| mieszany | 1 | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | |
| łosoś | 11 | 2 | 18% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 2 | 18% | |
| owoce morza | 32 | 1 | 3% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 1 | 3% | |
| snapper | 4 | 3 | 75% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 3 | 75% | |
| flądra | 12 | 4 | 33% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 4 | 33% | |
| kałamarnica | 4 | 1 | 25% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 1 | 25% | |
| tilapia | 21 | 2 | 10% | 0 | 0% | 0 | 0% | 2 | 10% | 4 | 19% | |
| tuńczyk | 3 | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | |
| inne | 8 | 1 | 13% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 1 | 13% | |
| suma częściowa | 100 | 14 | 14% | 0 | 0% | 0 | 0% | 2 | 2% | 16 | 16% | |
| Produkty mleczne | krowa | 3 | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% |
| koza | 4 | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | |
| mleko | 3 | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | |
| suma częściowa | 10 | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | |
| Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia. | warzywo | 12 | 1 | 8% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 1 | 8% |
| owoc | 1 | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | |
| zioło | 3 | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | |
| suma częściowa | 16 | 1 | 6% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 1 | 6% | |
| Suma | 216 | 31 | 14% | 1 | 0.50% | 0 | 0% | 2 | 0.90% | 34 | 16% | |
Tabela 3: Częstość występowania różnych toksynotypów C. perfringens w 216 próbkach żywności. Przykład wyników uzyskanych przy zastosowaniu tej metody do badania żywności detalicznej pod kątem obecności C. perfringens. Tabela ta została zmodyfikowana na podstawie wcześniej opublikowanej pracy Regana i wsp.16.
Dyskusja
W niniejszym artykule opisano metodę identyfikacji występowania C. perfringens w detalicznych próbkach żywności z ograniczoną subkulturą i bez użycia systemu komór beztlenowych. Metoda ta wykorzystuje kombinację technik w celu zwiększenia identyfikacji C. perfringens w próbkach żywności. Stosując zmodyfikowaną wersję pożywki RPM, umożliwiamy selektywny wzrost C. perfringens. Umieszczając zaszczepiony RPM pomiędzy warstwami agaru TSC, jesteśmy w stanie zidentyfikować i wyizolować beztlenowe bakterie redukujące siarczyny charakterystyczne dla C. perfringens. Aby potwierdzić obecność C. perfringens, kolonie redukujące siarczyny są subhodowane do świeżego RPM. Zmodyfikowana wersja lub RPM pozwala nam w łatwy sposób wyodrębnić DNA z kultur, umożliwiając potwierdzenie PCR określonych genów toksyn. Potwierdzenie skażonych C. perfringens próbek żywności można uzyskać w ciągu trzech dni.
We wczesnych eksperymentach próbki żywności były po prostu zaszczepiane w RPM i DNA ekstrahowane z kultur ON. Metoda ta doprowadziła do wykrycia C. perfringens w ograniczonej liczbie próbek (dane nie pokazane). Chociaż RPM jest selektywny dla wzrostu C. perfringens, nie jest wyłączny dla wzrostu C. perfringens. Inne, Gram-dodatnie, oporne na D-cykloserynę bakterie mogą nadal rosnąć w RPM. Postawiliśmy hipotezę, że zanieczyszczenie innymi gatunkami bakterii mogło zmniejszyć wykrywalność szczepów C. perfringens poprzez zmniejszenie czułości naszej analizy PCR w naszej pierwszej hodowli ON RPM. Kluczowym krokiem w zwiększeniu wykrywalności C. perfringens było włączenie techniki "kanapkowej" z agarem TSC. Pozwoliło nam to na rozróżnienie i selekcję kolonii beztlenowych, redukujących siarczyny, charakterystycznych dla C. perfringens. Kluczowym krokiem w tym procesie jest upewnienie się, że górna warstwa stopionego agaru TSC ma temperaturę 40 °C. Chociaż niektóre szczepy C. perfringens mogą rosnąć w podwyższonych temperaturach (46–48 °C)15,16, dodanie stopionego agaru w podwyższonych temperaturach znacznie zmniejsza ilość odzyskiwanych kultur, głównie z powodu śmierci komórki.
Istnieje kilka potencjalnych ograniczeń tej metody. Jak wspomniano wcześniej, ani agar RPM, ani agar TSC nie selekcjonują ani nie różnicują wyłącznie C. perfringens , co pozwala na wzrost innych gatunków bakterii obecnych w próbkach żywności. Może to zmniejszyć czułość testu w celu selekcji tylko dla C. perfringens . Jest to jednak powszechne ograniczenie w prawie wszystkich technikach hodowli. Potwierdzenie genotypowania oczyszczonych izolatów jest najlepszą metodą ostatecznej identyfikacji C. perfringens i innych gatunków bakterii. Kolejnym ograniczeniem tego badania jest to, że nie testujemy oczyszczonych izolatów. Celowo zrobiliśmy to, aby ograniczyć ilość subkulturacji, ponieważ obawia się, że powtarzające się subkulturowanie spowoduje utratę plazmidu. Ponieważ nie izolujemy do czystości, możliwe jest, że wiele toksnotypów C. perfringens może być obecnych w tej samej próbce lub subkulturze. Jeżeli badacze chcą otrzymać oczyszczone izolaty, standardowe metody oczyszczania mogą być stosowane na ostatniej kulturze RPM opisanej tą metodą; Zazwyczaj wymaga to użycia komór beztlenowych. Chociaż pierwotnie stosowana do izolowania C. perfringens z żywności, metoda ta może być stosowana do identyfikacji i izolowania C. perfringens z wielu źródeł. W szczególności jednym z takich zastosowań tej metody jest badanie próbek kału od ludzi (lub zwierząt), co do których istnieje podejrzenie, że są zakażone C. perfringens i toksnotypowanie bakterii, aby lepiej zrozumieć źródło infekcji.
Oświadczenia
Brak ujawniania informacji.
Podziękowania
To badanie nie otrzymało żadnego konkretnego finansowania od sektora publicznego, komercyjnego czy non-profit.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| D-Cycloserine | Sigma-Aldrich | C6880 | |
| Dekstroza | Sigma Life Science | D9434-250G | |
| Jednorazowe pipety transferowe | dowolnej marki | Wybierz jeden z cienką końcówką, taki jak jednorazowe pipety transferowe Thermo Scientific 137116M/EMD | |
| DNeasy Blood & Zestawy tkanek | Qiagen | 69504 | Uwaga: oceniono liczne zestawy do ekstrakcji DNA i plazmidu, ten zestaw dał najbardziej pożądane wyniki. |
| Suchy inkubator | dowolnej marki | ||
| Płynne podłoże tioglikolanowe | Remel | R453452 | |
| Żelatyna ze skóry świni | Sigma Life Science | G1890-500G | |
| Indywidualne podkłady | Invitrogen | ||
| Siarczan żelaza (II) siedmiowodny | Sigma Life Science | F8633-250 G | |
| Lizozym z białka jaja kurzego | Sigma-Aldrich | L6876 | Potrzebny do ekstrakcji DNA, brak w zestawie |
| probówka do mikrowirówki | dowolnej marki | ||
| parafilm lub folia | dowolnej marki | ||
| Pepton z kazeiny i innych białek zwierzęcych | Sigma-Aldrich | 70173-100G | |
| Perfringens Agar Base (TSC + SFP) | Oxoid | CM0587 | Wykonaj agar TSC zgodnie z instrukcją |
| Fosforan potasu dwuzasadowy | Sigma-Aldrich | P2222-100G | |
| Chlorek sodu | Sigma-Aldrich | S-7653 | |
| Skrobak do sterylnych komórek | dowolnej marki | ||
| Sterylny rozsiewacz komórek | dowolnej marki | ||
| Materiały eksploatacyjne i sprzęt do elektroforezy żelowej | dowolnej marki | ||
| marki | |||
| Taq PCR Master Mix Kit | Qiagen | 201443 | |
| Termocykler do reakcji PCR | kąpiel | ||
| marki | |||
| Ekstrakt drożdżowy | Sigma-Aldrich | 70161-100G |
Bibliografia
- Petit, L., Gibert, M., Popoff, M. R. Clostridium perfringens: toxinotype and genotype. Trends in Microbiology. 7, 104-110 (1999).
- Rood, J. I., et al. Expansion of the Clostridium perfringens toxin-based typing scheme. Anaerobe. , (2018).
- Murrell, T. G., O'Donoghue, P. J., Ellis, T. A review of the sheep-multiple sclerosis connection. Medical Hypotheses. 19, 27-39 (1986).
- Rumah, K. R., Linden, J., Fischetti, V. A., Vartanian, T. Isolation of Clostridium perfringens type B in an individual at first clinical presentation of multiple sclerosis provides clues for environmental triggers of the disease. PLoS One. 8, 76359(2013).
- Wagley, S., et al. Evidence of Clostridium perfringens epsilon toxin associated with multiple sclerosis. Multiple Sclerosis. , 1352458518767327 (2018).
- Linden, J. R., et al. Clostridium perfringens Epsilon Toxin Causes Selective Death of Mature Oligodendrocytes and Central Nervous System Demyelination. MBio. 6, 02513(2015).
- Popoff, M. R. Epsilon toxin: a fascinating pore-forming toxin. FEBS Journal. 278, 4602-4615 (2011).
- Lee, C. A., Labbe, R. Distribution of Enterotoxin- and Epsilon-Positive Clostridium perfringens Spores in U.S. Retail Spices. Journal of Food Protection. 81, 394-399 (2018).
- Wen, Q., McClane, B. A. Detection of enterotoxigenic Clostridium perfringens type A isolates in American retail foods. Applied and Environmental Microbiology. 70, 2685-2691 (2004).
- Cooper, K. K., Bueschel, D. M., Songer, J. G. Presence of Clostridium perfringens in retail chicken livers. Anaerobe. 21, 67-68 (2013).
- Strong, D. H., Canada, J. C., Griffiths, B. B. Incidence of Clostridium perfringens in American foods. Applied and Environmental Microbiology. 11, 42-44 (1963).
- Buogo, C., Capaul, S., Hani, H., Frey, J., Nicolet, J. Diagnosis of Clostridium perfringens type C enteritis in pigs using a DNA amplification technique (PCR). Journal of Veterinary Medicine, Series B. 42, 51-58 (1995).
- Yamagishi, T., Sugitani, K., Tanishima, K., Nakamura, S. Polymerase chain reaction test for differentiation of five toxin types of Clostridium perfringens. Microbiology and Immunology. 41, 295-299 (1997).
- Johansson, A., Engstrom, B. E., Frey, J., Johansson, K. E., Baverud, V. Survival of clostridium perfringens during simulated transport and stability of some plasmid-borne toxin genes under aerobic conditions. Acta Veterinaria Scandinavica. 46, 241-247 (2005).
- Erickson, J. E., Deibel, R. H. New medium for rapid screening and enumeration of Clostridium perfringens in foods. Applied and Environmental Microbiology. 36, 567-571 (1978).
- Regan, S. B., et al. Identification of epsilon toxin-producing Clostridium perfringens strains in American retail food. Anaerobe. 54, 124-127 (2018).
Przedruki i uprawnienia
