Artykuł metodologiczny

Mikromacierze DNA i RNA o dużej gęstości - synteza fotolitograficzna, hybrydyzacja i przygotowanie dużych bibliotek kwasów nukleinowych

20.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59936

⸱

12 sierpnia 2019

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Inorganic Chemistry, Faculty of Chemistry, University of Vienna

W tym artykule

Podsumowanie

W tym artykule prezentujemy i omawiamy nowe osiągnięcia w syntezie i zastosowaniach mikromacierzy kwasów nukleinowych wytwarzanych in situ. W szczególności pokazujemy, w jaki sposób protokoły syntezy DNA można rozszerzyć na RNA i jak można wykorzystać mikromacierze do tworzenia pobieralnych bibliotek kwasów nukleinowych.

Streszczenie

Fotolitografia jest potężną techniką syntezy oligonukleotydów DNA na szkiełkach podstawowych, ponieważ łączy w sobie efektywność reakcji sprzęgania fosforoamidytu z precyzją i gęstością światła UV odbijanego od mikrometrowych luster. Fotolitografia pozwala uzyskać mikromacierze, które mogą pomieścić od setek tysięcy do kilku milionów różnych sekwencji DNA, 100-nt lub dłuższych, w ciągu zaledwie kilku godzin. Dzięki tak dużej przestrzeni sekwencji, mikromacierze są idealnymi platformami do badania mechanizmów oddziaływań kwas-ligand nukleinowy, które są szczególnie istotne w przypadku RNA. Niedawno informowaliśmy o przygotowaniu nowego zestawu fosforoamidynów RNA kompatybilnych z fotolitografią in situ, które następnie wykorzystano do hodowli oligonukleotydów RNA, homopolimerów, a także sekwencji mieszanych zasad. Tutaj szczegółowo ilustrujemy proces wytwarzania mikromacierzy RNA, od projektu eksperymentalnego, po konfigurację instrumentalną, syntezę macierzy, deprotekcję i końcowy test hybrydyzacji na przykładzie sekwencji matrycy 25mer zawierającej wszystkie cztery zasady. Równolegle wychodzimy poza eksperymenty oparte na hybrydyzacji i wykorzystujemy fotolitografię mikromacierzy jako niedrogą bramę do złożonych bibliotek kwasów nukleinowych. Aby to zrobić, mikromacierze DNA o dużej gęstości są wytwarzane na wrażliwym na zasady monomerze, który umożliwia wygodne rozszczepianie i pobieranie DNA po syntezie i deprotekcji. Protokół produkcyjny jest zoptymalizowany tak, aby ograniczyć liczbę błędów syntetycznych i w tym celu wprowadza się warstwę roztworu β-karotenu w celu pochłaniania fotonów UV, które w przeciwnym razie mogłyby odbijać się z powrotem na substratach syntezy. Opisujemy krok po kroku cały proces przygotowania biblioteki, od projektu po podział i kwantyfikację.

Wprowadzenie

Praktyczne zastosowanie mikromacierzy DNA tradycyjnie polegało na badaniu różnic w poziomach ekspresji genów między dwiema populacjami komórek, przy użyciu nici komplementarnych i fluorescencji jako metody wykrywania1. Od czasu do czasu mikromacierze DNA zapuszczają się w wiązania z ligandami niebędącymi kwasami nukleinowymi, takimi jak białka, ze strategią systematycznej permutacji sekwencji, która oferuje kompleksowy przegląd krajobrazu wiązań2,3,4,5. Podejście to skutecznie przekształca mikromacierze ze zwykłych powierzchni hybrydyzacyjnych w platformy o szerokim pokryciu sekwencji, co byłoby atutem w badaniu bogatszego i bardziej złożonego świata struktury i funkcji RNA. Wspierane przez niezwykle wydajną reakcję sprzęgania fosforoamidytu6, zsyntetyzowane macierze DNA in situ mogą być teraz również uważane za tanie źródło DNA7, co staje się szczególnie istotne, biorąc pod uwagę stale rosnące zapotrzebowanie na materiał kwasu nukleinowego do składania genów8,9, nanostruktury oparte na DNA10, przechowywanie lub sekwencjonowanie informacji11,12. Podobnie, technologie sekwencjonowania prawdopodobnie skorzystają na rozwoju metod, które dają bardzo złożone mieszaniny oligonukleotydów RNA13. W tym kontekście, protokoły wytwarzania macierzy, które pozwalają na syntezę oligonukleotydów in situ i przy dużej gęstości, są idealnie przygotowane do zaspokojenia potrzeb szybko rozwijającej się dziedziny biotechnologii kwasów nukleinowych. Jednak w tak różnorodnej dziedzinie, jaką jest biotechnologia, cel każdej aplikacji może wymagać, aby DNA na mikromacierzy było wytwarzane albo z wysoką przepustowością, albo z bardzo małą liczbą błędów syntetycznych14,15, lub jedno i drugie, co wymaga bliższego przyjrzenia się protokołom syntezy mikromacierzy DNA, które historycznie były przede wszystkim optymalizowane pod kątem testów hybrydyzacji. Tymczasem stwierdzono, że synteza in situ mikromacierzy RNA jest trudnym przedsięwzięciem, z większością trudności związanych z grupą ochronną dla funkcji 2'-OH, zwykle ugrupowania sililowego w standardowej syntezie w fazie stałej, które jest usuwane za pomocą odczynników na bazie fluoru, substancji chemicznych, które są niekompatybilne z powierzchniami szklanymi lub krzemowymi. Te zagadnienia i wyzwania związane z syntezą mikromacierzy DNA i RNA były ostatnio przedmiotem wielu prac, w szczególności w zakresie podejścia do fotolitografii16.

Fotolitografia wykorzystuje światło UV do odblokowywania oligonukleotydów przed sprzężeniem i wymaga masek do konstruowania wzoru ekspozycji na promieniowanie UV, tym samym przestrzennie organizując i kontrolując wzrost oligonukleotydów. Maski fizyczne zostały zastąpione sterowanymi komputerowo mikrolustrami, których przechylenie selektywnie odbija światło UV na podłoże mikromacierzy17,18,19. Jako źródło UV używamy światła 365 nm ze źródła LED o dużej mocy20. Obecne układy fotolitograficzne są wyposażone w układy mikroluster zawierające od 1024 × 768 luster, odpowiadających ponad 780 000 indywidualnie adresowalnych punktów ("cech") na małej powierzchni zaledwie 1,4cm2 lub 1080p z matrycami od 1920 × 1080, czyli >2 miliona luster. Każde z luster w urządzeniu ma zatem bezpośrednią kontrolę nad sekwencją wyhodowaną na odpowiedniej funkcji. Z wyjątkiem światła UV, fotolitografia działa jak technika syntezy w fazie stałej i przyjmuje chemię fosforamidytu opartą na cyklu. Tyle tylko, że wymaga to zupełnie innej strategii ochrony, aby synteza RNA zakończyła się sukcesem. Opracowaliśmy nową serię światłoczułych fosforamidynów RNA zawierających grupy chroniące przed labilnością hydrazyny21. Monomery te pozwalają na deprotekcję RNA w łagodnych warunkach, które nie wpływają na integralność powierzchni. Pierwszy etap deprotekcji wykorzystuje trietyloaminę do usunięcia grup ochronnych fosfodiestru cyjanoetylu, podczas gdy hydrazyna jest stosowana w drugim, oddzielnym etapie do usunięcia tych o funkcjach 2'-OH i amin egzocyklicznych. W ten sposób oligonukleotydy RNA o długości ~30-nt i dowolnej sekwencji mogą być teraz syntetyzowane in situ na mikromacierzach22,23. Równolegle niedawno zaczęliśmy zajmować się kwestiami przepustowości, jakości i szybkości w fotolitografii DNA i RNA. Zmierzyliśmy wydajność sprzężenia >99% dla wszystkich amidynów DNA i RNA (Rysunek 1) i zbadaliśmy każdy pojedynczy etap cyklu wydłużania oligonukleotydów, od czasu utleniania, przez wybór aktywatora i optymalną ekspozycję na promieniowanie UV24,25. Wprowadziliśmy nowe światłoczułe grupy ochronne 5', które można usunąć w ciągu zaledwie kilku sekund, przekształcając syntezę setek tysięcy 100merów w kilkugodzinny proces26. Podwoiliśmy również przepustowość produkcji tablic, udostępniając jednocześnie dwa podłoża27. Na koniec wprowadziliśmy fosforoamidyn dT zawierający wrażliwą na zasady grupę sukcynylową jako wygodny sposób rozszczepiania, zbierania i analizowania oligonukleotydów DNA i RNA, co ma kluczowe znaczenie dla przygotowania biblioteki28.

Pomimo stosunkowo przyziemnego aspektu syntezy DNA i RNA w fazie stałej, szczególnie dla chemików kwasów nukleinowych, fotolitografia mikromacierzy pozostaje nietrywialnym ulepszeniem, wymagającym skomplikowanej konfiguracji, starannej kontroli i nadzoru nad procesem oraz oddzielnych instrukcji do obsługi po syntezie, w zależności od charakteru oligonukleotydu i rodzaju zastosowania. W tym artykule pragniemy szczegółowo przedstawić całą procedurę syntezy in situ mikromacierzy DNA i RNA metodą fotolitografii, od projektu eksperymentalnego po analizę danych, z naciskiem na przygotowanie instrumentów i materiałów eksploatacyjnych. Następnie opisujemy postsyntetyczne metody deprotekcji, które odpowiadają zamierzonemu celowi wytwarzania mikromacierzy (tj. hybrydyzacja lub odzyskiwanie bibliotek kwasów nukleinowych).

Protokół

1. Projektowanie mikromacierzy

  1. Napisz sekwencje do syntezy w edytorze tekstu, od 5' do 3', po jednej sekwencji w każdym wierszu. Dla kontroli jakości 25mera użyj sekwencji „GTCATCATCATGAACCACCCTGGTC”. Użyj liter A, C, G i T dla nukleotydów DNA oraz cyfr 5, 6, 7 i 8 dla nukleotydów RNA.
  2. W przypadku przygotowania biblioteki dodaj dodatkową cyfrę (czyli 9) na końcu każdej sekwencji (3'). Odpowiadać ona będzie sprzężeniu monomeru wrażliwego na zasady.
  3. Każda sekwencja musi być poprzedzona przecinkiem. Przypisz nazwę każdej sekwencji po przecinku i sprawdź, czy każdy wiersz ma format [sekwencja,#nazwa_sekwencji] (bez nawiasów). Zapisz listę sekwencji jako plik .txt.
  4. Uruchom MatLaba, a następnie załaduj program ChipDesign.m. Uruchom program.
  5. W oknie Panelu Właściwości załaduj plik układu mikromacierzy EntireChip. Załaduj plik układu MilliChip, jeśli celem jest synteza całej macierzy w czterech identycznych lokalizacjach.
  6. W oknie Panel Właściwości, w sekcji Specyfikacja Czipa, wybierz Wybierz Kontener, a następnie Obszar Syntezy. W sekcji Wzór wybierz wzór zapewniający odpowiednią liczbę adresowalnych cech, obliczoną jako liczba sekwencji × liczba replikat. Dla kontrolnej sekwencji 25mer wybierz wzór 25:36.
  7. W sekcji Wybierz Kontener wybierz Fiducjalny. Cechy fiducjalne są zazwyczaj syntezyowane w narożnikach obszaru syntezy i służą do wyodrębniania danych hybrydyzacji. Po wybraniu opcji Fiducjalny napisz sekwencję (5'→3'), która zostanie zsyntetyzowana na cechach fiducjalnych i może działać jako kontrola pozytywna. Dla eksperymentu z 25merem użyj tej samej sekwencji DNA.
  8. W sekcji Sekwencja załaduj plik tekstowy zawierający wszystkie napisane sekwencje. Upewnij się, że wybrana jest opcja Losuj. Nadaj tytuł eksperymentowi w polu Tytuł Projektu, a w polu Sekwencja Łącznika wpisz TTTTT (odpowiadający łącznikowi T5).
  9. Kliknij Generuj, a następnie znajdź pliki projektu macierzy i maski (Rycina 2) w folderze MaskGen_delta_rc1/Designs. Upewnij się, że zawiera on skrypt wyświetlania, sekwencję przepływu oraz plik projektu.
  10. W przypadku przygotowania biblioteki otwórz skrypt wyświetlania. Dodaj dodatkowy wiersz na dole skryptu wyświetlania, który dokładnie powiela pierwszy wiersz skryptu (np. display First_Mask.bmp 150). Spowoduje to usunięcie terminalnej grupy fotoprotekcyjnej z końca 5' wszystkich oligonukleotydów.
  11. Uruchom program tworzenia zadań AutoJob, załaduj szablon, klikając Wczytaj Szablon, a następnie kliknij Skrypt Wyświetlania, aby załadować plik skryptu wyświetlania wygenerowany przez MatLaba. Naciśnij Generuj. Ten krok utworzy serię instrukcji, zwanych plikiem zadań (jobfile), które będą kontrolować komunikację komputera z mikrolusterkami i syntezatorem DNA.

2. Przygotowanie i funkcjonalizacja szkiełek

  1. Wywiertaj jedną szklankę w dwóch miejscach odpowiadających położeniu rurek doprowadzającej i odprowadzającej w komórce syntezy. Użyj wiertła diamentowego o średnicy 0,9 mm na frezarko-wiertarce CNC, aby dokładnie i niezawodnie wykonać otwory. Przepłucz wywiercone szklanki wodą ultra czystą i ułóż je w stojaku na szkiełka.
  2. Oczyść powierzchnie, sonikując szkiełka w łaźni wodnej zawierającej 5% amoniakalnego środka czyszczącego przeznaczonego do specjalnych zastosowań przez 30 minut w temperaturze 35 °C. Przepłucz szkiełka dwukrotnie destylowaną H2O i przenieś je do czystego, suchego stojaka.
  3. Ułóż wywiercone i niewywiercone szkiełka mikroskopowe w stojaku. W dużej cylindrycznej kolbie miarowej przygotuj roztwór funkcjonalizujący, mieszając 475 mL etanolu (EtOH) z 25 mL ddH2O, 10 g odczynnika silanizującego (N-(3-triethoxysilylpropyl)-4-hydroksybutyramid) oraz 1 mL kwasu octowego. Dobrze wymieszaj do uzyskania jednolitego roztworu, a następnie przenieś do odpowiedniego, szczelnie zamkniętego pojemnika.
  4. Umieść załadowany stojak w pojemniku, zamknij pokrywkę i pozostaw pojemnik na delikatnym kołysaniu na wstrząsarce orbitalnej przez 4 godziny w temperaturze pokojowej.
  5. Po 4 godzinach odrzuć roztwór funkcjonalizujący i zastąp go 500 mL roztworu płuczącego, składającego się z 475 mL EtOH, 25 mL ddH2O oraz 1 mL kwasu octowego. Wymieszaj powoli przez 20 minut w temperaturze pokojowej, następnie odrzuć i zastąp 500 mL świeżego roztworu płuczącego.
  6. Po dodatkowych 20 minutach w temperaturze pokojowej odrzuć roztwór, osusz szkiełka strumieniem argonu i utwardzaj je w uprzednio nagrzanym piecu próżniowym w temperaturze 120 °C. Po 2 godzinach wyłącz piec i pompę próżniową, ale pozostaw szkiełka pod zmniejszonym ciśnieniem na całą noc. Następnie przywróć ciśnienie atmosferyczne w piecu i przechowuj szkiełka w eksykatorze do dalszego użytku.

3. Przygotowanie odczynników i substratów do syntezy

  1. Przenieś proszki fosforoamidów (Rysunek 1) z temperatury przechowywania (-25 lub -45 °C) do temperatury pokojowej w desykatorze.
  2. Gdy fosforoamidy osiągną temperaturę pokojową, rozpuść proszek w objętości bezwodnego acetonitrylu (<30 ppm H2O), aby uzyskać stężenie 30 mM dla standardowych fosforoamidów DNA i RNA oraz 50 mM dla monomeru wrażliwego na zasady dT (przygotowanie biblioteki). Dodaj mały woreczek ze sitem molekularnym, aby związać śladowe ilości wilgoci.
  3. Przygotuj roztwór 1% (w/w) imidazolu w DMSO, rozpuszczając 11 g imidazolu w 1 L suchego DMSO. Dobrze wstrząśnij, aż do całkowitego rozpuszczenia. Podłącz roztwór do dodatkowego portu syntezy DNA. Będzie to rozpuszczalnik niezbędny do pełnego usunięcia grupy 5′-fotoodpornego ochronnego.
  4. Dla syntezy bibliotek, przygotuj roztwór 1% (w/v) β-karotenu w dichlorometanie, rozpuszczając 100 mg β-karotenu w 10 mL dichlorometanu. Dobrze wstrząśnij w butelce z bursztynowego szkła, a następnie owiń folią aluminiową.

4. Przygotowanie i monitorowanie syntezy mikromacierzy.

  1. Zanotuj temperaturę i wilgotność w pomieszczeniu, w którym wykonuje się mikromacierze, i upewnij się, że syntezer DNA działa pod odpowiednim ciśnieniem helu.
  2. Włącz lampę UV-LED i jej wentylator chłodzący. Przymocuj miernik natężenia promieniowania UV w płaszczyźnie ogniskowej padającego światła UV i włącz go (Rysunek 3A).
  3. Na komputerze uruchom oprogramowanie sterujące plikami zadań, mikrolustrami i syntezą (o nazwie WiCell). Włącz, a następnie zainicjuj urządzenie mikrolustra i załaduj plik maski całkowicie białej, klikając prawym przyciskiem myszy na DMD, a następnie wybierając Wczytaj obraz.
  4. Kliknij prawym przyciskiem myszy na ikonę UVS i wybierz Otwórz przysłonę UV. Odczytaj wartość mocy (w mW/cm2) na mierniku natężenia i odlicz 60 s. Po 60 s ponownie odczytaj wartość mocy i zanotuj wartości początkową i końcową. Zamknij przysłonę, wybierając Zamknij przysłonę UV, a następnie wyłącz miernik natężenia. Oblicz średnią wartość natężenia UV w mW/cm2.
  5. Oblicz czas ekspozycji niezbędny do osiągnięcia energii promienistej 6 J/cm2 dla fotodeprotekcji 5'-NPPOC (mikromacierze DNA i RNA) oraz 3 J/cm2 dla fotodeprotekcji 5'-BzNPPOC (biblioteki DNA), korzystając z zależności Wzór równowagi statycznej, s=J/W, ilustracja równania edukacyjnego..
  6. W oprogramowaniu stacji syntezeru DNA utwórz plik sekwencji w edytorze sekwencji, kopiując i wklejając zawartość sekwencji przepływu wygenerowanej przez MatLab. Dodaj dodatkowe dwa kroki płukania na końcu 3' (domyślna litera cyklu: „s”), aby wypłukać powierzchnię podłoży przed przejściem do pierwszego sprzęgania. Zapisz i wyeksportuj plik sekwencji.
  7. W edytorze protokołu oprogramowania stacji utwórz protokół zawierający dedykowany cykl nazwany każdą z liter i cyfr występujących w pliku sekwencji (np. jeśli plik sekwencji zawiera tylko litery A, C, G i T, to plik protokołu musi zawierać cztery cykle o nazwach A, C, G i T).
  8. Ustaw czas sprzęgania dla fosforamidytów DNA (cykle A, C, G i T) na 15 s, dla fosforamidytu rU (cykl 8) na 120 s, a dla fosforamidytów rA, rC i rG (cykle 5, 6 i 7) na 300 s. W przypadku przygotowania bibliotek ustaw sprzęganie wrażliwego na zasady, podatnego na cięcie monomeru dT na 2 × 120 s (Tabela 1 i Tabela 2).
  9. Upewnij się, że czas oczekiwania między dwoma komunikatami Event 2 Out w każdym cyklu odpowiada obliczonemu czasowi ekspozycji UV niezbędnemu do osiągnięcia wymaganej energii promienistej. Tak jak w przypadku pliku sekwencji, zapisz i wyeksportuj plik protokołu.
  10. W oprogramowaniu WiCell załaduj pliki zadania, sekwencji i protokołu do odpowiednich podokien, a następnie kliknij Wyślij, aby przesłać pliki sekwencji i protokołu do syntezeru DNA.
  11. W pliku sekwencji policz liczbę sprzęczeń dla każdego fosforamidytu.
  12. Aby zmierzyć wymaganą objętość (w µL) roztworu fosforamidytu niezbędną do przeprowadzenia każdej syntezy, pomnóż liczbę sprzęczeń przez 60. Dodaj do każdej objętości 250 µL na potrzeby bezpieczeństwa oraz wstępnego napełnienia linii w syntezerze DNA. Dla fosforamidytów wymagających tylko jednego sprzęgania użyj objętości podstawowej 250 µL.
  13. Szybko przenieś roztwór do fiolki na syntezerze DNA odpowiadającej literze/numerowi portu w cyklach protokołu.
  14. Wstępnie napełnij porty roztworami fosforamidytów, wykonując po 10 impulsów napełniania dla każdego, aby wypełnić linie odczynnikiem. Wstępnie napełnij linię płukania acetonitrylem przed podłączeniem komory reakcyjnej.
  15. Aby złożyć komorę syntezy, najpierw umieść grubą (250 µm) uszczelkę z perfluoroelastomeru (FFKM) na bloku kwarcowym komory. Umieść nawiercony, funkcjonalizowany szkiełko mikroskopowe na pierwszej uszczelce i sprawdź, czy otwory na szkiełkach są połączone z rurkami doprowadzającą i odprowadzającą komory syntezy.
  16. Umieść drugą, cienką (50 µm) uszczelkę z politetrafluoroetylenu (PTFE) nad nawierconym szkiełkiem, otaczającą dwa otwory. Na końcu umieść drugie, funkcjonalizowane, ale nie nawiercone szkiełko na drugiej uszczelce (Rysunek 3B). Umieść metalową ramę z czterema śrubami na złożonej komorze podwójnego podłoża i dokręć śruby do tej samej siły docisku (0,45 Nm), używając śrubokręta momentowego.
  17. Podłącz rurki doprowadzające i odprowadzające do syntezeru DNA. Wstępnie napełnij linię płukania acetonitrylem i sprawdź prawidłowy przepływ acetonitrylu (ACN) przez podłoża. W razie potrzeby rozłącz i ponownie zmontuj komorę, jeśli na tym etapie zaobserwujesz wyciek ACN. Zmierz objętość ACN w rurce odpływowej po przejściu przez 7 cykli napełniania ACN. Objętość ta powinna wynosić 2 mL.
  18. Umieść komorę syntezy w płaszczyźnie ogniskowej padającego światła UV. W przypadku przygotowania bibliotek dodaj dodatkowe rurki doprowadzającą i odprowadzającą do tylnej części komory i wypełnij komorę tylną roztworem β-karotenu (wystarczy 2 mL roztworu). Upewnij się, że nie ma wycieku (Rysunek 3C).
  19. Rozpocznij syntezy, najpierw klikając Uruchom w oprogramowaniu WiCell. Po pierwszej komendzie CZEKAJ w pliku zadania naciśnij Start na syntezerze DNA.
  20. Podczas syntezy regularnie sprawdzaj, czy wyświetlanie plików masek pokrywa się z ekspozycją na UV i otwarciem przysłony.
  21. Po zakończeniu syntezy zwykłych mikromacierzy odłącz komorę od syntezeru, rozłącz komorę i za pomocą pióra diamentowego wytraw numer syntezy na szkiełkach mikroskopowych. Wytraw numer na niesyntetyzowanej stronie każdego szkiełka. Przenieś szkiełka do probówek wirowania o pojemności 50 mL i przechowuj w suchym miejscu do dalszego użytku.
  22. Po zakończeniu syntezy mikromacierzy bibliotecznych najpierw opróżnij komorę z roztworu β-karotenu, a następnie wypłucz ją, przepuszczając 2 × 5 mL CH2Cl2, a następnie opróżnij. Kontynuuj rozłączanie zgodnie z krokiem 4.21. Utworzona macierz może być widoczna gołym okiem (Rysunek 4).

5. Dezprotekcja mikromacierzy DNA

  1. Wypełnij szklaną pojemnik do barwienia 20 mL EtOH i 20 mL etylenodiaminy (EDA). Umieść mikromacierze zawierające wyłącznie DNA pionowo w pojemniku, zamknij wieczko i pozostaw preparaty do ochrony przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: EDA jest cieczą o ostrych właściwościach toksycznych, żrących i łatwopalnych. Pracuj w rękawiczkach pod dobrze wentylowaną szafką wywiewną.
  2. Po upływie 2 godzin wyjmij preparaty za pomocą pęsety i dokładnie opłucz je dwukrotnie destylowaną H2O.
  3. Osusz preparaty w wirówce do mikromacierzy przez kilka sekund, a następnie przechowuj w eksykatorze.

6. Dezprotekcja mikromacierzy RNA

  1. W 50 mL probówce do wirowania przygotuj suchy roztwór trietyloaminy i ACN w stosunku 2:3 (odpowiednio 20 mL i 30 mL). Umieść jedną mikromacierz RNA do probówki, zamknij pokrywkę, a następnie owiń folią uszczelniającą. Delikatnie wstrząsaj probówką na wstrząsarce orbitalnej przez 1 godzinę i 30 minut w temperaturze pokojowej.
  2. Po upływie 1 godziny i 30 minut wyjmij mikromacierz, przepłucz 2 × 20 mL suchego ACN, a następnie osusz w wirówce do mikromacierzy przez kilka sekund.
    UWAGA: Trietyloamina jest cieczą o ostrych właściwościach toksycznych, żrących i łatwopalnych. Acetonitryl jest toksyczny i łatwopalny. Pracuj w rękawiczkach pod dobrze wentylowaną szafą wyciągową.
    UWAGA: Pierwszy etap ochrony zakończony.
  3. Przygotuj 0,5 M roztwór hydrazyny wodnej w mieszaninie pirydyna/kwas octowy w stosunku 3:2. Najpierw wymieszaj 20 mL kwasu octowego i 30 mL pirydyny w cylindrze miarowym. Poczekaj, aż roztwór ostygnie, zanim dodasz 1,21 mL hydrazyny wodnej. Przelej około 40 mL uzyskanego roztworu do 50 mL probówki do wirowania.
    UWAGA: Hydrazyna wodna jest cieczą o ostrych właściwościach toksycznych i żrących. Pirydyna jest łatwo palna i o ostrych właściwościach toksycznych. Kwas octowy jest łatwopalny i żrący. Pracuj w rękawiczkach pod dobrze wentylowaną szafą wyciągową.
  4. Po pierwszym etapie ochrony umieść mikromacierz RNA w roztworze hydrazyny wodnej, zamknij pokrywkę i owiń folią uszczelniającą. Delikatnie wstrząsaj probówką na wstrząsarce orbitalnej przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Po upływie 2 godzin wyjmij mikromacierz, przepłucz 2 × 20 mL suchego ACN, a następnie osusz w wirówce do mikromacierzy przez kilka sekund.
    UWAGA: Drugi etap ochrony zakończony.
  5. Jeśli mikromacierz RNA zawiera również nukleotydy DNA, przeprowadź trzeci etap ochrony. W 50 mL probówce do wirowania wymieszaj 20 mL EDA z 20 mL EtOH. Dodaj mikromacierz DNA/RNA do roztworu EDA/EtOH w stosunku 1:1 i pozostaw w temperaturze pokojowej na 5 minut.
  6. Po upływie 5 minut wyjmij mikromacierz, przepłucz 2 × 20 mL wody sterylnej, a następnie osusz w wirówce do mikromacierzy i przechowuj w eksykatorze.

7. Hybrydyzacja z komplementarnym nicią oznakowaną fluorescencyjnie

  1. Odmrozić acetylowany albuminę surowicy bydlęcej (10 mg/mL) oraz komplementarny nicię znakowaną Cy3 (100 nM) i ogrzać do temperatury pokojowej.
  2. W sterylnym mikroprobówce o pojemności 1,5 mL wymieszać 150 µL buforu 2x MES (200 mM 2-(N-morfolino)etanosulfonian; 1,8 M NaCl; 40 mM EDTA; 0,02% Tween-20) z 26,7 µL DNA znakowanego Cy3, 13,4 µL acetylowanej BSA oraz 110 µL sterylnej H2O. Wymieszać i wirwować. Podwoić objętość, jeśli obie szklanki mają być używane do hibrydyzacji.
  3. Wstępnie nagrzać piec hibrydyzacyjny do temperatury poniżej Tm dwuniciowego kompleksu, ale wystarczająco wysokiej, aby zapewnić dobrą dyskryminację między sekwencjami idealnie pasującymi a niepasującymi. Dla 25meru kontrolnego jakości ustawić temperaturę na 42 °C (Tm wynosi 59 °C).
  4. Uważnie umieścić samoprzylepne 300 µL komory hibrydyzacyjnej nad obszarem syntezy na każdej szklance i dodać pipetą przygotowany roztwór hibrydyzacyjny. Zakryć otwory komory samoprzylepnymi kropkami i zawinąć całą szklankę w folię aluminiową.
  5. Umieścić szklankę z mikromacierzą w piecu hibrydyzacyjnym, przykryć i pozostawić do delikatnego obrotu w wybranej temperaturze hibrydyzacji przez 2 godziny.
  6. Po upływie 2 godzin odłączyć szklankę, usunąć folię aluminiową i ostrożnie zdjąć komorę hibrydyzacyjną. Przenieść szklanki do probówek wirówkowych zawierających po 30 mL buforu płukania nieselektywnego (NSWB; 0,9 M NaCl, 0,06 M fosforan, 6 mM EDTA, 0,01% Tween20, pH 7,4) i intensywnie wstrząsać przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
  7. Przenieść szklankę do probówki wirówkowej zawierającej 30 mL buforu płukania selektywnego (SWB; 100 mM MES, 0,1 M NaCl, 0,01% Tween20) i intensywnie wstrząsać przez 1 minutę.
  8. Na końcu przenieść szklankę do probówki wirówkowej zawierającej 30 mL buforu końcowego płukania (FWB; 0,1x roztwór cytrynianu sodowo-solnego) i wstrząsać przez kilka sekund. Osuszyć szklankę w wirówce do mikromacierzy.
  9. Umieścić suchą mikromacierz, stroną syntezy skierowaną do dołu, w uchwycie skanera mikromacierzy. W przypadku kompleksów znakowanych Cy3, przeskanować z rozdzielczością 5 µm, przy długości fali wzbudzenia 532 nm, filtrze 575 nm i napięciu fotopowielacza 350. Zapisz skan o wysokiej rozdzielczości jako plik obrazu .tif (Rycina 5A).

8. Ekstrakcja i analiza danych

  1. Przed wyodrębnieniem danych obróć zapisany skan mikromacierzy w edytorze obrazu tak, aby najdłuższy łańcuch cech orientacyjnych znalazł się w lewym górnym rogu skanu. Zapisz obrócony obraz.
  2. Uruchom NimbleScan, następnie naciśnij Plik | Otwórz i załaduj skan mikromacierzy. Następnie, klikając przycisk Przeglądaj w sekcji plik projektowy, załaduj automatycznie wygenerowany podczas projektowania eksperymentu mikromacierzy plik projektu o rozszerzeniu ndf. Kliknij następnie Otwórz.
  3. W menu Widok wybierz opcję Automatyczny kontrast/jaskrawość. Kliknij ikonę Ręczne wyrównanie znajdującą się nad skanem. Umieść cztery kwadratowe znaczniki w czterech rogach skanu, a następnie ponownie kliknij ikonę, która teraz powinna być zielona. Wyodrębnij dane hybrydyzacji, klikając kolejno Analiza, Raporty, a następnie Raport sond.
  4. Otwórz plik raportu o rozszerzeniu probe w edytorze arkusza kalkulacyjnego. Zachowaj kolumny B i I, a pozostałe odrzuć, zanim przejdziesz do obliczania wartości średnich i odchylenia standardowego na podstawie wyodrębnionych danych (Rysunek 5B).

9. Dezaktywacja biblioteki, odłączenie i odzyskanie

  1. Aby usunąć ochronne grupy i odłączyć biblioteki DNA, przygotuj roztwór w stosunku 1:1 suchy EDA/toluen w rurce wirowarkowej o pojemności 50 mL. Zanurzaj szkiełko w roztworze cięcia, zamknij rurkę i owiń folią zabezpieczającą, a następnie inkubuj przez 2 godziny w temperaturze pokojowej na wstrząsarce orbitalnej.
  2. Po 2 godzinach usuń szkiełko i przepłucz 2 × 20 mL starannie wysuszonego ACN. Usuń szkiełko i pozostaw do wyschnięcia w powietrzu.
  3. Za pomocą pipety nałóż 100 µL sterylnej H2nad terenem syntezy, który teraz jest wyraźnie widoczny. Przepipetuj roztwór kilkakrotnie w górę i w dół, zanim przeniesiesz go do rurki mikrocentryfugowej o pojemności 1,5 mL. Powtórz proces i połącz eluat z mikromacierzy w tej samej rurce (Rycina 6).
  4. Odparować 2 × 100 µL próbki eluatów z chipa do sucha, a następnie rozpuścić ponownie w 10 µL nukleazowej wody2O. Zmierz absorbancję za pomocą spektrofotometru UV-Vis.
  5. Odsólczyć bibliotekę DNA na 10 µL końcówka pipety wyposażona w żel C18. Najpierw przekształć eluat z chipu w roztwór buforowy zawierający 0,1 M octan trietyloamony (TEAA).
  6. Namoć żywicę, aspirując 3 x 10 µL H2O/ACN 1:1 oraz wyrównaj żywicę poprzez przemywanie 3 x 10 µL 0,1 M buforu TEAA. Wiąż DNA, przez 10-krotne aspirację i dispensację eluatów z chipu do góry i na dół przez żel. Przepłucz żel 3 x 10 µL 0,1 M buforu TEAA, 3 x 10 µL H2O.
  7. Eluuj DNA pozbawione soli z końcówki, przemywając żywicę za pomocą 10 µL H2O/ACN 1:1. Odparować do sucha desolubilizowany roztwór i rozpuścić ponownie w 10 µL z jałowego H2O. Zmierz absorbancję za pomocą spektrofotometru UV-Vis (Rycina 7). Odparować bibliotekę do sucha i przechowywać w -20 °C do dalszego użytku

Wyniki

Hybrydyzacja mikromacierzy DNA i RNA
Rysunek 5 przedstawia wyniki testu hybrydyzacji przeprowadzonego na mikromacierzy zawierającej wersje DNA i RNA sekwencji 25-meru (5'-GTCATCATCATGAACCCTGGTC-3' w formie DNA). Skan na Rysunku 5A jest przedstawiony w skali odcieni zieleni odpowiadającej widmu wzbudzenia/emisji fluorescencji Cy3, przy czym intensywność fluorescencji została zarejestrowana w jednostkach arbitralnych w zakresie od 0 do 6536. Projekt macierzy był zgodny z układem cech 25:36 opisanym w sekcji protokołu. Skan pokazano po prawidłowym zorientowaniu macierzy, z lewym górnym rogiem wypełnionym najdłuższym łańcuchem cech fiducjalnych. W tym przypadku cechy fiducjalne zawierają wersję DNA 25-meru i powinny, w zasadzie, zawsze dawać dodatni sygnał fluorescencyjny w celu przeprowadzenia wyrównania skanu i ekstrakcji danych. Zhybrydyzowana mikromacierz powinna być jednolicie jasna, przy czym krawędzie obszaru syntezy są zazwyczaj jaśniejsze niż centrum (nawet o 50%). Duża liczba replik sekwencji, rozmieszczonych losowo na całym obszarze, zmniejsza wpływ artefaktów przestrzennych. Tutaj każda sekwencja (DNA i RNA) została zsyntetyzowana w 20 losowych lokalizacji. Zazwyczaj występuje niski szum fluorescencyjny (tło), <50 a.u., co prowadzi do stosunku sygnału do szumu rzędu od 200:1 do 80:1 w testach hybrydyzacyjnych. Po ekstrakcji danych intensywności fluorescencji są uśredniane i przedstawiane jako ±SD.

Występuje znaczna zmienność bezwzględnych wartości fluorescencji pomiędzy poszczególnymi eksperymentami. Przedstawiamy tutaj wyniki trzech niezależnych syntez z zastosowaniem tych samych parametrów wytwarzania i tej samej procedury postępowania po syntezie. 25mer DNA, po hybrydyzacji z komplementarną nicią DNA znakowaną Cy3, generuje sygnały fluorescencyjne w zakresie od 20 0 do 30 0, bardzo rzadko powyżej lub poniżej tych wartości. 25mer RNA, po hybrydyzacji z tym samym komplementarnym DNA znakowanym Cy3, wykazuje intensywność fluorescencji na odpowiadających mu obszarach w zakresie od 15 0 do 20 0. Jednakże intensywność fluorescencji dupleksów RNA/DNA sporadycznie spada poniżej 8 0, podczas gdy odpowiadające im dupleksy DNA/DNA nadal fluorescują w zakresie 20 0-30 0. W takich przypadkach wyniki dla RNA można uznać za suboptymalne. Niepowodzenie syntezy lub hybrydyzacji, zarówno w przypadku DNA, jak i RNA, będzie natychmiast zauważalne podczas skanowania ze względu na oczywisty brak fluorescencji. Istnieje wiele możliwości niepowodzenia lub jedynie częściowego sukcesu syntezy RNA, które zostaną omówione w części dyskusyjnej.

Deprotekcja, odszczepienie i odzysk biblioteki
W zależności od złożoności i gęstości biblioteki, kształt i zarys zsyntetyzowanej macierzy mogą być widoczne bez powiększenia, lecz przy odpowiednim oświetleniu (Rycina 4), gdy DNA nadal znajduje się w formie chronionej. Po deprotekcji za pomocą EDA/toluenu, a przed dodaniem wody w celu zebrania odszczepionej biblioteki, obszar syntezy zawierający obecnie zdeprotektowane oligonukleotydy może wyróżniać się jako strefa hydrofilowa, podczas gdy reszta szkiełka przedmiotowego będzie wydawać się pokryta mętną warstwą hydrofobową. Bezpośrednia obserwacja obszaru syntezy zależy od całkowitej powierzchni wykorzystanej do syntezy oligonukleotydów: większe wykorzystanie obszaru syntezy będzie wiązać się z większą szansą na wyraźne rozróżnienie między regionami hydrofilowymi a hydrofobowymi na powierzchni. I odwrotnie, biblioteki syntetyzowane przy użyciu mniejszej liczby luster i z mniejszymi elementami mogą nie być natychmiast widoczne.

Podobnie, ilość odzyskanego DNA po odsoleniu jest bezpośrednio proporcjonalna do całkowitej powierzchni wykorzystanej do syntezy. Jeśli wszystkie obszary zostaną wykorzystane do syntezy oligonukleotydów, procedura odcinania i odzyskiwania powinna przynieść od 25 do 30 pmol DNA. Wykorzystanie 10% powierzchni syntezy pozwoli zatem na uzyskanie jedynie około 3 pmol DNA.

Schemat fosforamidytów DNA i RNA; struktury chemiczne do syntezy, analizy i znakowania.
Rysunek 1Struktury chemiczne fosforamidytów DNA i RNA wykorzystywanych w syntezie oligonukleotydów metodą fotolitografii mikromacierzy. Standardowe światłoczułe grupy ochronne nitrofenylopropylokarbonylowe (NPPOC) w pozycji 5'-OH są stosowane w rutynowej syntezie mikroarrayów DNA i RNA do celów hybrydyzacji. W przypadku syntezy złożonych bibliotek DNA w pozycji 5'-OH preferowany jest bardziej fotolabilny benzyl-NPPOC (BzNPPOC), ponieważ BzNPPOC jest usuwany dwukrotnie szybciej niż NPPOC, co znacząco skraca całkowity czas syntezy mikroarrayu. Oligonukleotydy DNA przeznaczone do bibliotek wymagają również sprzęgnięcia monomeru dT z grupą odspajalną na końcu 3'. Monomer ten, zawierający funkcję estru succynylowego, ulegnie hydrolizie podczas deprotekcji, co umożliwi odzyskanie DNA z mikrochipu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ilustracji.

Równowaga statyczna; wzór ΣFx=0; tło z wzorcem szumu; koncepcja równowagi statycznej.
Rysunek 2Przykład maski w formie pliku obrazu przesyłanego do urządzenia z mikrolustrami podczas naświetlania promieniowaniem UV. Białe piksele odpowiadają lustrom, które zostaną nachylone w „WŁ.pozycja, odbijająca światło UV do celi syntezy. Piksele czarne odpowiadająWYŁ.lustra, w których światło UV zostanie odbite od komórki. Białe piksele umożliwią zatem przyłączenie kolejnego nadchodzącego fosforamidytu do oligonukleotydów znajdujących się na odpowiadających im obszarach na podłożach szklanych. Oligonukleotydy syntetyzowane na obszarach, których odpowiadające im lustra w tym pliku maski są czarnymi pikselami, pozostaną jednak nieaktywne podczas kolejnego etapu przyłączania. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Układ do syntezy nanocząsteczek z UV-LED, DMD i komorą syntezy; schemat odczynników, warstw slajdu.
Rysunek 3Zdjęcia optycznej aparatury do fotolitografii mikroarrayów oraz układu do syntezy. (A) Układ optyczny do ekspozycji UV. Światło UV z diody UV-LED jest najpierw homogenizowane za pomocą światłowodu o prostokątnym przekroju, a następnie odbija się od mikrolusterek. Mikrolusterka ustawione w pozycji „OFF” (wyłączone) odbijają światło UV w kierunku przeciwnym do komórki syntezy, natomiast mikrolusterka w pozycji „ON” (włączone) kierują światło na komórkę syntezy, znajdującą się w płaszczyźnie ogniskowej, po uprzednim przejściu przez system obrazujący Offner Relay o powiększeniu 1:1. (BZmontowana komórka syntezy składa się z nawierconego szkiełka przedmiotowego, które jako pierwsze zostaje umieszczone na bloku kwarcowym komórki, oddzielone grubą uszczelką z PTFE (nie pokazano). Następnie nad nawierconym szkiełkiem umieszcza się drugie, nienawiercone szkiełko, oddzielone cienką uszczelką z PTFE. Całość konstrukcji jest utrzymywana przez metalową ramkę (nie pokazano).C). W celu przygotowania biblioteki, po zamocowaniu komory syntezy w płaszczyźnie ogniskowej padającego światła UV, przestrzeń znajdująca się pomiędzy blokiem kwarcowym a nawierconym szkiełkiem wypełnia się 1% roztworem β-karotenu w CH2Cl2W tym celu do bloku kwarcowego podłączono dodatkowe przewody wlotowe i wylotowe, a pomarańczowy roztwór przepływa z pozycji skrajnie prawej do skrajnie lewej. Przepływ odczynników i rozpuszczalników stosowanych w syntezie zaznaczono białymi strzałkami. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej figury.

Układ spektroskopowy z chipem mikroprzepływowym, wykorzystywany do separacji DNA i analizy optycznej.
Rysunek 4Obszar syntezy jest zazwyczaj widoczny gołym okiemTutaj można zobaczyć bibliotekę DNA na szklanej powierzchni bezpośrednio po syntezie, gdy DNA znajduje się wciąż w formie chronionej. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wyniki mikroarray DNA, wykres intensywności fluorescencji, analiza syntezy RNA, dane eksperymentalne.
Rycina 5Analizy hybrydyzacyjne z 25-merowymi sekwencjami DNA i RNA syntetyzowanymi in situ na mikromacierzach. (A) Skan fluorescencyjny całego zhybrydyzowanego mikroarrays DNA i RNA. 25-merowe oligonukleotydy DNA i RNA zhybrydyzowano z ich komplementarnymi nićmi znakowanymi Cy3. Array został przeskanowany laserem o długości fali wzbudzenia 532 nm, przy 5 µm rozdzielczość. (B) Intensywności fluorescencji (jednostki umowne) dupleksów DNA:DNA i RNA:DNA w trzech oddzielnych eksperymentach. Jasnozielone dane dla oligonukleotydów RNA syntetyzowanych in situ można uznać za suboptymalne w porównaniu z intensywnością fluorescencji odpowiadających im sekwencji DNA. Słupki błędów oznaczają SD. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat równowagi statycznej z etapami reakcji chemicznej; EDA/toluen, proces pipetowania.
Rysunek 6Schematyczna prezentacja procedury deprotekcji, odszczepiania i odzyskiwania bibliotek DNA syntetyzowanych na mikromacierzach. Sekwencje DNA są syntezowane na nukleozydzie dT z grupą odcinającą wrażliwą na zasady (pokazaną w powiększonym obszarze). Po syntezie deprotekcja oligonukleotydów DNA (grupy chroniące zasady przedstawiono jako czerwone sfery) w mieszaninie EDA/toluen pozostawia zdeprotekcjonowany materiał związany elektrostatycznie z powierzchnią, który można następnie odessać pipetą, aplikując niewielką ilość wody na obszar syntezy. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykres absorbancji w funkcji długości fali; wynik spektroskopii UV-Vis; analiza piku w zakresie 260–280 nm.
Rycina 7Reprezentatywne widmo absorbancji (20 – 350 nm) pociętej i odsolonej biblioteki DNA zawierającej 40 różnych sekwencji o długości 10 nt. Z pojedynczej syntezy macierzy wyizolowano łącznie 940 ng DNA, co odpowiada 30 pmol DNA łącznie lub 15 pmol na jeden podłoże szklane. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Cykl BzNPPOC-dA; tabela; synteza DNA; etapy: sprzęganie, capping, utlenianie; impulsy, czas, opis.
Tabela 1. Reprezentatywny protokół cyklu dla sprzęgania/utleniania/fotodeprotekcji 5'-BzNPPOC-dA, przy założeniu, że odpowiadający mu fosforamidyt został umieszczony w porcie „A”. Czas sprzęgania (w sekundach) jest wskazany w linii „couple monomer” (sprzęgaj monomer). Czas fotodeprotekcji UV, odpowiadający w tym przypadku energii promieniowania 3 J/cm22 (fotochemia BzNPPOC) oblicza się jako czas, który upłynął pomiędzy dwoma sygnałami komunikacyjnymi „Event 2 Out”.

Tabela procesu cyklicznego dla NPPOC-rA przedstawiająca etapy sprzęgania, blokowania i utleniania oraz szczegóły impulsów.
Tabela 2. Reprezentatywny protokół cyklu dla sprzęgania/utleniania/fotodeprotekcji 5'-NPPOC-rA, przy założeniu, że odpowiadający mu fosforamidyt RNA został załadowany do portu „A”. Czas sprzęgania (w sekundach) jest podany w linii „couple monomer”. Czas fotodeprotekcji UV odpowiada w tym przypadku energii promieniowania wynoszącej 6 J/cm²2 (fotochemia NPPOC) oblicza się jako czas, który upłynął pomiędzy dwoma sygnałami komunikacyjnymi „Event 2 Out”.

Dyskusja

Synteza DNA i RNA w fazie stałej jest chlebem powszednim każdego laboratorium chemicznego kwasów nukleinowych i chociaż dodanie komponentu fotolitograficznego jest niewątpliwie złożoną operacją, wytwarzanie mikromacierzy za pośrednictwem światła UV jest również bardzo niezawodnym procesem. Jest to ponadto jedyna dostępna metoda syntezy RNA in situ na mikromacierzach. Mimo to, jak w każdej wieloetapowej procedurze eksperymentalnej, istnieje duże pole do błędu ludzkiego.

Być może najbardziej krytycznym krokiem jest sprzężenie fosforamidytu, ponieważ musi to być reakcja chemiczna o stałej wysokiej wydajności, aby zapewnić oligonukleotydy z niewielką liczbą błędów syntetycznych. W naszym protokole syntezy mikromacierzy sprzężenie fosforamidytu ma jeszcze większe znaczenie dla ogólnej jakości syntezy, ponieważ proces wytwarzania omija ograniczanie i zapobiega oczyszczaniu oligonukleotydów. Dla wszystkich światłoczułych fosforoamidynów DNA i RNA obliczono stopniową sprawność sprzęgania powyżej 99%, nawet dla bardzo krótkich czasów sprzęgania (15 s)24, ale czasami mogą wystąpić niższe wydajności sprzęgania, szczególnie w przypadku amidynów dG. Stabilność rozpuszczonych fosforoamidynów w temperaturze pokojowej była badana już wcześniej i wykazano, że zależy od charakteru zasady nukleotydowej, przy czym fosforoamidyty guanozyny są podatne na rozległą degradację w ciągu zaledwie kilku dni29,30. Jednak przy przechowywaniu w temperaturze -25 °C, fosforamidyty dG rozpuszczone w ACN jako roztwór 30 mM okazały się stabilne przez kilka tygodni. Względna niestabilność roztworów fosforoamidytu dG w temperaturze pokojowej oznacza jednak, że nie powinny one być podłączone do syntezatora DNA przez kilka dni.

W przypadku fosforoamidynów RNA wydajność sprzęgania jest bardzo zależna od jakości fosforoamidytu (którą można ocenić za pomocą spektroskopii 31P NMR) i czasu sprzężenia. Konieczne wydaje się stosowanie czasów sprzęgania wynoszących 5 minut dla rA, rG, rC i 2 minuty dla rU. Rzeczywiście, odkryliśmy, że skrócenie czasu kondensacji do 2 minut dla wszystkich fosforoamidynów RNA doprowadziło do znacznie niższych sygnałów hybrydyzacji.

Sam syntezator DNA, podobnie jak odczynniki i rozpuszczalniki, z pewnością musi być tak czysty, jak to tylko możliwe, aby osiągnąć najwyższą wydajność syntezy oligonukleotydów. Jednak nierozpuszczalny materiał, sole lub cząstki, mogą z czasem gromadzić się w przewodach i rurkach systemu dostarczania, prowadząc do stopniowego zmniejszania zużycia odczynników i reagentów. Tam, gdzie ogólne czyszczenie syntezatora nie rozwiązuje problemu niskiej głośności wyjściowej, alternatywnym rozwiązaniem może być zwiększenie liczby impulsów. Szczególnie przydatna w przypadku niskiego zużycia fosforoamidytu jest możliwość modyfikacji linii w protokole sprzęgania odpowiadającej pompowaniu mieszaniny fosforoamidytu i aktywatora (trzecia linia podsekcji sprzęganie w tabeli 1 i tabeli 2) z 6 do 9 impulsów bez odczuwalnego negatywnego wpływu na jakość syntezy. Ponadto liczba impulsów aktywatora potrzebnych do doprowadzenia mieszaniny amidytu/aktywatora do substratu syntezy (obecnie 6, czwarta linia w podsekcji sprzężenia, patrz Tabela 1 i Tabela 2) zależy od samego syntezatora DNA, a także od długości rurki w komórce syntezy. Liczbę tę można dostosować po zastąpieniu fosforoamidytu kolorowym roztworem i zliczeniu liczby impulsów potrzebnych do wypchnięcia kolorowej mieszanki na szklane podłoże w celu sprzężenia.

Opisana w niniejszym artykule metoda pozwala na równoczesne przeprowadzanie syntezy DNA i RNA na tej samej mikromacierzy. Hybrydy DNA i RNA mogą być również przygotowywane bez żadnych zmian w protokołach wytwarzania macierzy i pod warunkiem, że przestrzegany jest trzyetapowy protokół deprotekcji. Należy jednak zauważyć, że mikromacierze zawierające tylko RNA wymagają tylko dwuetapowej deprotekcji: najpierw decyanoetylacji za pomocą Et3N, a następnie deprotekcji hydroksylowej i zasadowej za pomocą hydrazyny. Stwierdzono, że zasady nukleotydowe DNA nie są całkowicie pozbawione ochrony w tych warunkach i wymagają dodatkowego kroku w EDA, aby doprowadzić do całkowitego usunięcia grup fenoksyacetylowych (Pac). To dodatkowe leczenie EDA jest krótsze (5 minut) niż w przypadku standardowej deprotekcji mikromacierzy DNA31, ale jest wystarczające, aby doprowadzić je do końca po zabiegach trietyloaminą i hydrazyną. Ponadto krótki czas reakcji z EDA ogranicza narażenie w pełni zdechronionego oligonukleotydu RNA na warunki podstawowe.

Przewagą syntezy macierzy RNA in situ nad alternatywnymi metodami, takimi jak plamienie lub transkrypcja DNA 32,33,34, jest możliwość przechowywania zsyntetyzowanego mikrochipa RNA w postaci chronionej do momentu użycia, co pozwala uniknąć ryzyka potencjalnej degradacji RNA. Z drugiej strony, procedury postsyntetyczne dla RNA oznaczają, że materiały eksploatacyjne i odczynniki są utrzymywane w sterylności, a obchodzenie się z nimi odbywa się w warunkach wolnych od RNaz. Warto zauważyć, że dodanie inhibitora RNazy do mieszanki hybrydyzacyjnej nie dało silniejszych sygnałów hybrydyzacji dla cech RNA.

Synteza bibliotek DNA na wrażliwym na zasady monomerze jest bardziej złożona niż synteza kilku sekwencji kontrolnych na powierzchni i jako taka jest z pewnością bardziej podatna na błędy projektowe. Zakładając jednak, że projekt sekwencji (tj. natura i liczba sekwencji) jest poprawny, przekształcenie tej listy w zbiór masek ekspozycji i uporządkowaną serię cykli sprzęgania pozostaje prostym procesem. Istnieją jednak istotne różnice w stosunku do standardowej syntezy mikromacierzy, które mają kluczowe znaczenie dla pomyślnego wytworzenia tablicy bibliotecznej o dużej gęstości.

Po pierwsze, wrażliwy na zasady monomer dT jest sprzężony jako pierwszy fosforamidyn po syntezie łącznika. Stwierdzono, że wydajność sprzęgania tego monomeru (rysunek 1) jest stosunkowo niska, około 85%28, dlatego też podejmowane są wysiłki w celu poprawy szybkości jego włączania, albo poprzez zwiększenie jego stężenia w ACN z 30 mM do 50 mM, albo poprzez powtórzenie etapu sprzęgania: dwie następujące po sobie reakcje sprzęgania przy użyciu świeżych monomerów lub dwa oddzielne, ale następujące po sobie cykle sprzęgania.

Drugą zmianą jest dodanie roztworu β-karotenu w tylnej komorze komórki syntezy, który wygodnie pochłania światło o długości fali 365 nm. Jest to ważna modyfikacja konfiguracji fotolitografii, ponieważ zapobiega odbijaniu się światła UV z powrotem na podłoże matrycy. Rzeczywiście, po przejściu przez ośrodek śródmiąższowy między podłożami, wpadające światło UV wydostaje się przez wywiercony szkiełko i dociera do kwarcowego bloku komórki. Równania Fresnela przewidują, że ~ 4% prostopadle padającego światła UV odbije się od każdego z trzech dalszych interfejsów powietrze-szkło (strona wyjściowa 2. substratu i obie strony bloku kwarcowego) i z powrotem na substrat syntezy, prowadząc do niezamierzonej ekspozycji fotochronionych oligonukleotydów. Dyfrakcja i rozpraszanie również przyczyniają się do fotodeprotekcji "poza celem", a tym samym do insercji nukleotydów, co bezpośrednio wpływa na wskaźnik błędów syntezy, ale wkłady te są znacznie mniejsze niż odbicia i można je rozwiązać głównie poprzez zmniejszenie gęstości syntezy (pozostawiając przerwy między cechami). Odkryliśmy, że poziom roztworu β-karotenu w dolnej komorze komórki ma tendencję do nieznacznego obniżania się tylko w pierwszych minutach syntezy macierzy, dlatego musi być monitorowany i ponownie dostosowywany.

Wreszcie trzecią zmianą jest roztwór deprotekcyjny, zastępujący EtOH toluenem, który utrzymuje rozszczepioną bibliotekę DNA związaną z powierzchnią, prawdopodobnie poprzez oddziaływania elektrostatyczne. Nałożenie niewielkiej ilości wody na obszar syntezy po umyciu ACN pozwala na wygodne gromadzenie biblioteki. Proces ten jest jednak skuteczny tylko wtedy, gdy zawartość wody w EDA i toluenie jest minimalna, co sprawia, że kwas nukleinowy jest całkowicie nierozpuszczalny w koktajlu deprotekcyjnym. Alternatywnie, biblioteki DNA można odciąć od chipa za pomocą amoniaku 9,10,14,35, a następnie następnie odbezpieczyć przez podgrzanie wodnego roztworu amoniaku zawierającego DNA do temperatury 55 °C przez noc. Odzyskiwanie bibliotek DNA za pomocą amoniaku nie jest jednak zgodne z RNA. Oligonukleotydy RNA na podłożu rozszczepialnym przez zasadę mogą być eluowane z powierzchni przy użyciu tej samej procedury EDA/toluenu opisanej powyżej, ale tylko na przedostatnim etapie po dwuetapowej strategii deprotekcji Et3N i hydrazyny28.

Istnieją alternatywne strategie odzyskiwania pul oligonukleotydowych z mikromacierzy bez konieczności specjalnego leczenia podstawowego, są one zasadniczo zgodne z fotolitografią i opierają się na wykorzystaniu enzymów. Na przykład pojedynczy nukleotyd deoksyuracylu może być celem glikozylazy uracylo-DNA (UDG) i wycięty z reszty sekwencji DNA lub pojedyncza jednostka RNA może być rozpoznana przez enzymy RNazy H typu 2 i wiązanie fosfodiestrowe 5' z rozszczepionym RNA, uwalniając część 5' DNA23.

Mamy teraz potężną, niezawodną i gęstą metodę syntezy DNA, RNA i hybrydowych mikromacierzy DNA/RNA. Mogą one służyć nie tylko jako platformy do hybrydyzacji lub testów wiązania36, ale także stanowią szybki i niedrogi sposób tworzenia złożonych bibliotek kwasów nukleinowych. W przypadku cyfrowego przechowywania danych opartych na DNA, fotolitografia mikromacierzowa może stać się potencjalnym rozwiązaniem wąskiego gardła "zapisu" (tj. kodowania informacji przez syntezę). Sukces w cyfrowym kodowaniu DNA i składaniu genów de novo zależy od wierności sekwencji, która na poziomie syntezy przekłada się na poziom błędów. Błędy syntetyczne i optyczne w naszych obecnych protokołach produkcji matryc zostaną omówione i omówione w innym miejscu. Równolegle prowadzone są prace mające na celu dalsze zwiększanie skali produkcji i przepustowości.

Oświadczenia

Autorzy zaświadczają, że nie są powiązani z żadną organizacją nastawioną na zysk.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Austriacki Fundusz Naukowy (granty FWF P23797, P27275 i P30596) oraz Szwajcarską Narodową Fundację Nauki (Grant #PBBEP2_146174).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Slide funkcjonalizacja
kwas octowy >99,8%Sigma33209Do deprotekcji RNA
router CNCStepcraft300 CK
Absolut etanoluVWR1.07017.2511Do deprotekcji i funkcjonalizacji
N-(3-trietoksysililopropylo)-4-hydroksymaślanuGelestSIT8189.5Odczynnik do schylania sitowia
Nexterion Glass D Szkiełka mikroskopoweSchott1095568
Polymax 1040HeidolphWytrząsarka orbitalna
Proclean 507 Ultradźwiękowa kąpiel wodnaUlsonixDo czyszczenia szkiełek po wierceniu
Tickopur RW 77 Środek do czyszczenia specjalnego celuSigmaZ860086Do czyszczenia szkiełek po wierceniu
Synteza mikromacierzy
0,25 M dicyjanoimidazol w aktywatorze ACNBiosolve0004712402BS
0,7 XGA DMDTexas InstrumentsCyfrowe urządzenie do mikrolustra
20 mM I2 w pirydynie/H2O/THFSigmaL860020-06Utleniacz
250 μ m gruby Chemraz 584 perfluoroelastomerFFKMDolna uszczelka teflonowa
2'-O-ALE Fosforamidyty RNAChemGenes
365 nm UV-LED o dużej mocyNichiaNVSU333A
5'BzNPPOC Fosforamidyty DNAOrgentis
5'NPPOC Fosforamidyty DNAFlexGen
AcetonitrylBiosolve0001205402BSDo syntezy DNA
Rozcieńczalnik amidytowy do syntezy DNASigmaL010010Do rozpuszczania fosforoamidytów
Rozszczepialny dTChemGenesMonomer wrażliwy na zasady do przygotowania biblioteki
DMSOBiosolve0004474701BSJako rozpuszczalnik ekspozycyjny
Ochrona mikromacierzy DNA i RNA
Etylenodiamina >99,5%Sigma3550Do deprotekcji
Expedite 8909Syntezator DNAPerSeptive Biosystems
Hydratyk hydrazyny 50-60% hydrazynySigma225819Do deprotekcji RNA
ImidazolSigma56750
Taśma PTFE o niskiej gęstości o wytrzymałości przemysłowejGasoilaCienka, górna uszczelka teflonowa
Pirydyna >99%SigmaP57506Do deprotekcji RNA
Trietyloamina >99%SigmaT0886Do deprotekcji RNA
i beta;-karotenuSigmaC9750Do przygotowania biblioteki
Hybrydyzacja i skanowanie
20x Cytrynian soli sodowejRoth1054.1
Nici komplementarne znakowane 5'Cy3EurogentecDo hybrydyzacji duplex
Probówka mikrowirówkowa Biopur Safe-LockEppendorf
BSA (10 mg / mL)PromegaR3961
Klasa biologii molekularnej EDTAPromegaH5031
GenePix 4100AUrządzenia molekularne Skanermikromacierzy
Piec do hybrydyzacjiBoekel Scientific230500
MES monohydratSigma69889
MES sódSigmaM3058
NaCl >99,5%Sigma71376
Komora hybrydyzacyjna SecureSeal SA200Grace BioLabs623503
Spectrafuge miniLabnetC1301Wirówka mikromacierzowa
Tween-20 klasa biologii molekularnejSigmaP9416
Ekstrakcja danych
ExcelMicrosoftDo ekstrakcji danych
MatLabMathWorksProjektowanie
NimbleScan 2.1Roche NimbleGen
Odsalanie i kwantyfikacja
NanoDrop Jeden spektrofotometrThermo Scientific
ToluenMerck
ZipTip C18MilliporeZTC18s008Końcówki do pipet do odsalania
mikromacierzy

Bibliografia

  1. Bumgarner, R. Current protocols in molecular biology. 101, 22(2013).
  2. Berger, M. F., Bulyk, M. L. Universal protein-binding microarrays for the comprehensive characterization of the DNA-binding specificities of transcription factors. Nature Protocols. 4 (3), 393-411 (2009).
  3. Tietjen, J. R., Donato, L. J., Bhimisaria, D., Ansari, A. Z. Sequence-specificity and energy landscapes of DNA-binding molecules. Methods in enzymology. 497, 3-30 (2011).
  4. Katilius, E., Flores, C., Woodbury, N. W. Exploring the sequence space of a DNA aptamer using microarrays. Nucleic Acids Research. 35 (22), 7626-7635 (2007).
  5. Franssen-van Hal, N. L. W., et al. Optimized Light-Directed Synthesis of Aptamer Microarrays. Analytical Chemistry. 85 (12), 5950-5957 (2013).
  6. Matteucci, M. D., Caruthers, M. H. Nucleotide Chemistry .4. Synthesis of Deoxyoligonucleotides on a Polymer Support. Journal of the American Chemical Society. 103 (11), 3185-3191 (1981).
  7. Eroshenko, N., Kosuri, S., Marblestone, A. H., Conway, N., Church, G. M. Gene Assembly from Chip-Synthesized Oligonucleotides. Current Protocols in Chemical Biology. 2012, (2012).
  8. Kosuri, S., et al. Scalable gene synthesis by selective amplification of DNA pools from high-fidelity microchips. Nature Biotechnology. 28 (12), 1295(2010).
  9. Richmond, K. E., et al. Amplification and assembly of chip-eluted DNA (AACED): a method for high-throughput gene synthesis. Nucleic Acids Research. 32 (17), 5011-5018 (2004).
  10. Schmidt, T. L., et al. Scalable amplification of strand subsets from chip-synthesized oligonucleotide libraries. Nature Communications. 6, (2015).
  11. Grass, R. N., Heckel, R., Puddu, M., Paunescu, D., Stark, W. J. Robust Chemical Preservation of Digital Information on DNA in Silica with Error-Correcting Codes. Angewandte Chemie International Edition. 54 (8), 2552-2555 (2015).
  12. Erlich, Y., Zielinski, D. DNA Fountain enables a robust and efficient storage architecture. Science. 355 (6328), 950-953 (2017).
  13. Garalde, D. R., et al. Highly parallel direct RNA sequencing on an array of nanopores. Nature Methods. 15 (3), 201-206 (2018).
  14. Cleary, M. A., et al. Production of complex nucleic acid libraries using highly parallel in situ oligonucleotide synthesis. Nature Methods. 1 (3), 241-248 (2004).
  15. LeProust, E. M., et al. Synthesis of high-quality libraries of long (150mer) oligonucleotides by a novel depurination controlled process. Nucleic Acids Research. 38 (8), 2522-2540 (2010).
  16. Lietard, J., Damha, M. J., Somoza, M. M. Enzymatic and Chemical Synthesis of Nucleic Acid Derivatives. Fernández-Lucas, J. , Wiley Online Books. (2018).
  17. Fodor, S. P. A., et al. Spatially Addressable Parallel Chemical Synthesis. Science. 251 (4995), 767-773 (1991).
  18. Singh-Gasson, S., et al. Maskless fabrication of light-directed oligonucleotide microarrays using a digital micromirror array. Nature Biotechnology. 17 (10), 974-978 (1999).
  19. Pease, A. C., et al. Light-Generated Oligonucleotide Arrays for Rapid DNA-Sequence Analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (11), 5022-5026 (1994).
  20. Holz, K., Lietard, J., Somoza, M. M. High-Power 365 nm UV LED Mercury Arc Lamp Replacement for Photochemistry and Chemical Photolithography. ACS Sustainable Chemistry & Engineering. 5 (1), 828-834 (2017).
  21. Lackey, J. G., Mitra, D., Somoza, M. M., Cerrina, F., Damha, M. J. Acetal Levulinyl Ester (ALE) Groups for 2′-Hydroxyl Protection of Ribonucleosides in the Synthesis of Oligoribonucleotides on Glass and Microarrays. Journal of the American Chemical Society. 131 (24), 8496-8502 (2009).
  22. Lackey, J. G., Somoza, M. M., Mitra, D., Cerrina, F., Damha, M. J. In-situ chemical synthesis of rU-DNA chimeras on chips and enzymatic recognition. Chimica Oggi-Chemistry Today. 27 (6), 30-33 (2009).
  23. Lietard, J., Ameur, D., Damha, M., Somoza, M. M. High-density RNA microarrays synthesized in situ by photolithography. Angewandte Chemie International Edition. 57 (46), 15257-15261 (2018).
  24. Agbavwe, C., et al. Efficiency, Error and Yield in Light-Directed Maskless Synthesis of DNA Microarrays. Journal of Nanobiotechnology. 9, (2011).
  25. Sack, M., et al. Express photolithographic DNA microarray synthesis with optimized chemistry and high-efficiency photolabile groups. Journal of Nanobiotechnology. 14, (2016).
  26. Kretschy, N., Holik, A. K., Somoza, V., Stengele, K. P., Somoza, M. M. Next-Generation o-Nitrobenzyl Photolabile Groups for Light-Directed Chemistry and Microarray Synthesis. Angewandte Chemie International Edition. 54 (29), 8555-8559 (2015).
  27. Sack, M., Kretschy, N., Rohm, B., Somoza, V., Somoza, M. M. Simultaneous Light-Directed Synthesis of Mirror-Image Microarrays in a Photochemical Reaction Cell with Flare Suppression. Analytical Chemistry. 85 (18), 8513-8517 (2013).
  28. Lietard, J., et al. Base-cleavable microarrays for the characterization of DNA and RNA oligonucleotides synthesized in situ by photolithography. Chemical Communications. 50 (85), 12903-12906 (2014).
  29. Krotz, A. H., et al. Solution stability and degradation pathway of deoxyribonucleoside phosphoramidites in acetonitrile. Nucleosides Nucleotides & Nucleic Acids. 23 (5), 767-775 (2004).
  30. Hargreaves, J. S., Kaiser, R., Wolber, P. K. The Degradation of Dg Phosphoramidites in Solution. Nucleosides Nucleotides & Nucleic Acids. 34 (10), 691-707 (2015).
  31. McGall, G. H., et al. The efficiency of light-directed synthesis of DNA arrays on glass substrates. Journal of the American Chemical Society. 119 (22), 5081-5090 (1997).
  32. Collett, J. R., et al. Functional RNA microarrays for high-throughput screening of antiprotein aptamers. Analytical Biochemistry. 338 (1), 113-123 (2005).
  33. Buenrostro, J. D., et al. Quantitative analysis of RNA-protein interactions on a massively parallel array reveals biophysical and evolutionary landscapes. Nature Biotechnology. 32 (6), 562-568 (2014).
  34. Wu, C. -H., Holden, M. T., Smith, L. M. Enzymatic Fabrication of High-Density RNA Arrays. Angewandte Chemie International Edition. 53 (49), 13514-13517 (2014).
  35. Tian, J., et al. Accurate multiplex gene synthesis from programmable DNA microchips. Nature. 432 (7020), 1050-1054 (2004).
  36. Lietard, J., et al. Mapping the affinity landscape of Thrombin-binding aptamers on 2'F-ANA/DNA chimeric G-Quadruplex microarrays. Nucleic Acids Research. 45 (4), 1619-1632 (2017).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Mikromacierze DNAsynteza wiat em UVfunkcjonalizacja szkie kaprotok deprotekcjitest hybrydyzacjiroztw r do odcinaniaskaner mikromacierzy
Mikromacierze DNA i RNA o dużej gęstości - synteza fotolitograficzna, hybrydyzacja i przygotowanie dużych bibliotek kwasów nukleinowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.