Artykuł metodologiczny

Przygotowanie próbki do spektrometrii mas z jonizacją elektrorozpylania sondy

DOI:

10.3791/59942

⸱

19 lutego 2020

 ,  , 
1Department of Anatomy and Cell Biology, University of Yamanashi School of Medicine, 2Shimadzu Corporation

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł przedstawia metody przygotowania próbek dla unikalnej metody analitycznej w czasie rzeczywistym opartej na spektrometrii mas otoczenia. Metoda ta pozwala nam na przeprowadzanie analizy cząsteczek biologicznych in vivo w czasie rzeczywistym bez konieczności przeprowadzania specjalnych zabiegów wstępnych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Spektrometria mas (MS) jest potężnym narzędziem w chemii analitycznej, ponieważ dostarcza bardzo dokładnych informacji o cząsteczkach, takich jak stosunek masy do ładunku (m/z), które są przydatne do dedukowania mas molekularnych i struktur. Chociaż jest to zasadniczo destrukcyjna metoda analityczna, ostatnie postępy w technice jonizacji otoczenia umożliwiły nam pozyskiwanie danych przy jednoczesnym pozostawieniu tkanki w stosunkowo nienaruszonym stanie pod względem integralności. Jonizacja elektronatryskowa sondy (PESI) jest tak zwaną metodą bezpośrednią, ponieważ nie wymaga skomplikowanej i czasochłonnej obróbki wstępnej próbek. Drobna igła służy jako selektor próbek, a także jako emiter jonizacji. Opierając się na bardzo ostrych i precyzyjnych właściwościach końcówki sondy, zniszczenie próbek jest minimalne, co pozwala nam uzyskać informacje molekularne w czasie rzeczywistym od żywych organizmów in situ. W niniejszym artykule przedstawiamy trzy zastosowania techniki PESI-MS, które będą przydatne w badaniach i rozwoju biomedycznym. Jedna z nich polega na zastosowaniu do tkanki stałej, co jest podstawowym zastosowaniem tej techniki w diagnostyce medycznej. Ponieważ technika ta wymaga tylko 10 mg próbki, może być bardzo przydatna w rutynowych warunkach klinicznych. Drugie zastosowanie dotyczy diagnostyki medycznej in vitro, w której mierzy się surowicę krwi ludzkiej. Możliwość pomiaru próbek płynów jest również cenna w różnych eksperymentach biologicznych, w których nie można zapewnić wystarczającej objętości próbki dla konwencjonalnych technik analitycznych. Trzecie zastosowanie skłania się ku bezpośredniemu zastosowaniu igieł sondowych u żywych zwierząt, gdzie możemy uzyskać w czasie rzeczywistym dynamikę metabolitów lub leków w określonych narządach. W każdej aplikacji możemy wywnioskować cząsteczki, które zostały wykryte przez stwardnienie rozsiane lub wykorzystać sztuczną inteligencję do uzyskania diagnozy medycznej.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Spektrometria mas (MS) jest technologiczną realizacją redukcjonizmu; redukuje obiekt analizy do jednostki, która może być interpretowana na podstawie gatunków molekularnych lub kaskad. Dlatego jest to reprezentatywna metoda chemii analitycznej. Składa się z czterech procesów: jonizacji, analizy, detekcji i akwizycji spektralnej. Ponieważ jonizacja cząsteczki jest pierwszym procesem w spektrometrii mas, na ogół ogranicza formę analitów, które mają być przetwarzane. Większość procedur jonizacji wymaga zniszczenia struktury, morfologii i procesów biologicznych próbek organicznych w czasie rzeczywistym. Na przykład jonizacja elektronatryskowa (ESI) MS wymaga, aby próbki były w stanie ciekłym w celu wydajnej jonizacji1. Próbki muszą zatem przejść przez złożony preparat biochemiczny, który zmienia skład cząsteczek. Alternatywnie, podczas gdy jonizacja desorpcji laserowej wspomaganej matrycą (MALDI) MS może rekonstruować mapy molekularne cienkich przekrojów tkanki2,3, jego wydajność jonizacji jest zbyt niska, aby wykryć wszystkie cząsteczki w próbkach i jest szczególnie słaba w analizie kwasów tłuszczowych. Biorąc pod uwagę te ograniczenia, jonizacja elektronopryskowa sondy (PESI)4 może być używana do obserwacji zmian w systemach biologicznych in situ w czasie rzeczywistym bez niszczenia integralności strukturalnej5, podczas gdy obserwowany organizm biologiczny jest technicznie w stanie żywym. W tym przypadku używana jest bardzo cienka igła, która służy jednocześnie jako pobieracz próbek i emiter jonów. Oznacza to, że złożone sekwencje obróbki wstępnej próbki można ominąć w celu uzyskania widm masowych, które odzwierciedlają składniki molekularne żywego systemu in situ.

Istnieje kilka innych metod jonizacji, które rywalizują z PESI-MS. Jednym z nich jest spektrometria mas szybkiej jonizacji wyparnej (REIMS)6. Ta technika działa dobrze podczas operacji, ponieważ jest montowana za pomocą noża elektrycznego i zbiera pióropusz jonów powstający podczas nacięcia. Chociaż REIMS jest bardzo przydatny w chirurgii, jest to zasadniczo metoda destrukcyjna, która wymaga elektrycznej ablacji tkanki. W związku z tym nie jest przydatny do szczegółowej analizy komórek i tkanek w próbce preparatywnej ani w analizach laboratoryjnych. Ponadto, ze względu na to, że zbiera dużą ilość pióropusza zawierającego resztki tkanek, wymaga długotrwałej konserwacji urządzeń po każdym użyciu, ograniczając w ten sposób korzystanie z tej maszyny do specjalnych zabiegów chirurgicznych. Podobna metoda, zwana spektrometrią mas z desorpcją desorpcji laserowej (LDI-MS)7, to kolejna technika, która jest nieinwazyjna i przydatna do analizy powierzchni. Ponieważ ta technika jest dobra w skanowaniu powierzchni próbki, zapewnia kompleksową dwuwymiarową analizę, taką jak spektrometria mas obrazowania MALDI8,9. Ponieważ jednak LDI-MS ma zastosowanie tylko do analizy powierzchni, PESI-MS jest korzystny do analizy próbek, np. w tkance. Inna technika, MasSpec Pen10, została zgłoszona w celu osiągnięcia wysokiej swoistości i czułości w diagnozowaniu raka tarczycy, ale średnica sondy jest rzędu mm i jest specyficzna dla analizy powierzchniowej, co oznacza, że nie może wykryć małych guzków raka lub głęboko zlokalizowanych zmian. Ponadto, ponieważ metoda ta wykorzystuje mikrokapilarny kanał przepływowy osadzony w piórze sondy, należy wziąć pod uwagę zanieczyszczenie krzyżowe, podobnie jak w przypadku LDI-MS. Istnieją inne techniki, które zostały zastosowane w warunkach klinicznych, takie jak sonda przepływu i formularz jonizacji swab11, ale nie są one rozpowszechnione.

PESI to ekstremalna miniaturyzacja ESI, w której kapilara nano-elektrosprayu zbiega się na stałej igle o promieniu krzywizny końcówki wynoszącym kilkaset nm. Jonizacja odbywa się w bardzo ograniczonym obszarze końcówki igły poprzez utworzenie stożka Taylora, na którym próbki pozostają do momentu zakończenia jonizacji całego płynu na końcówce12. Jeśli analit pozostaje na końcówce metalowej igły, nadmiar ładunku jest stale generowany na granicy faz między metalową igłą a analitami. Dlatego sekwencyjna jonizacja cząsteczek zachodzi w zależności od ich aktywności powierzchniowej. Ta właściwość sprawia, że końcówka igły jest rodzajem chromatogramu, rozdzielającego anality w zależności od ich aktywności powierzchniowej. Mówiąc bardziej technicznie, cząsteczki o silniejszej aktywności powierzchniowej wychodzą na powierzchnię stożka Taylora i są jonizowane wcześniej niż te o słabszej aktywności powierzchniowej, które przylegają do powierzchni igły do końca procesu jonizacji. W ten sposób uzyskuje się całkowitą jonizację wszystkich cząsteczek zebranych przez igłę13. Co więcej, ponieważ technika ta nie wiąże się z dodawaniem zbędnego rozpuszczalnika do próbki, wystarczy kilkaset femtolitrów, aby uzyskać widma masowe wystarczająco silne do dalszej analizy14. Właściwości te są korzystne dla analizy nienaruszonych próbek biologicznych. Jednak główną wadą PESI-MS jest brak ciągłości jonizacji spowodowany ruchem posuwisto-zwrotnym igły wzdłuż osi pionowej, podobnie jak w pilarce. Jonizacja ma miejsce tylko wtedy, gdy końcówka sondy osiąga najwyższy punkt, gdy wysokość otworu jonowego jest wyrównana na osi poziomej. Jonizacja ustaje, gdy igła pobiera próbki, a więc stabilność jonizacji nie jest równa tej w konwencjonalnym ESI. Dlatego PESI-MS nie jest idealną metodą proteomiki.

Do tej pory, PESI-MS był stosowany głównie do analizy systemów biologicznych, obejmując szeroki zakres dziedzin, od badań podstawowych po warunki kliniczne. Na przykład bezpośrednia analiza tkanki ludzkiej przygotowanej podczas operacji była w stanie ujawnić nagromadzenie triacyloglicerolu zarówno w raku nerkowokomórkowym15, jak i w raku płaskonabłonkowym gardła16. Metoda ta może również mierzyć próbki cieczy, takie jak krew, aby skupić się na profilu lipidowym. Na przykład niektóre cząsteczki zostały nakreślone podczas zmian w diecie królików; Doniesiono, że niektóre z tych cząsteczek zmniejszyły się na bardzo wczesnych etapach eksperymentów, co wskazuje na wysoką czułość i przydatność tego systemu w diagnostyce klinicznej17. Co więcej, bezpośrednia aplikacja na żywym zwierzęciu pozwoliła na wykrycie zmian biochemicznych w wątrobie już po jednej nocy postu5. Zaitsu et al.18 ponownie przeanalizowali ten eksperyment5 i przeanalizowali profile metaboliczne wątroby w prawie ten sam sposób, uzyskując wyniki, które wzmocniły stabilność i odtwarzalność naszej oryginalnej metody. Co więcej, byliśmy w stanie odróżnić tkankę nowotworową od otaczającej ją nienowotworowej wątroby u myszy za pomocą tej techniki19. Dlatego jest to wszechstronna technika spektrometrii mas, która jest przydatna w różnych warunkach, zarówno in vivo, jak i in vitro. Z innego punktu widzenia, moduł PESI może być dopasowany do różnych spektrometrów mas poprzez regulację mocowania montażowego. W tym krótkim artykule przedstawiamy podstawy i przykłady zastosowań (Rysunek 1), w tym aplikacje z żywymi zwierzętami5.

Zgodnie z regulacjami i prawami w każdym kraju, części tego protokołu będą musiały zostać zrewidowane, aby spełniały kryteria każdej instytucji. Zastosowanie do żywego organizmu jest najciekawsze i najtrudniejsze, ponieważ może zapewnić biochemiczne lub metaboliczne zmiany w tkankach lub narządach u żywych zwierząt in situ. Chociaż wniosek ten został zatwierdzony przez instytucjonalny komitet ds. opieki nad zwierzętami na Uniwersytecie Yamanashi, w 2013 roku5, teraz konieczna będzie kolejna runda zatwierdzania ze względu na niedawne zmiany w przepisach dotyczących eksperymentów na zwierzętach. W związku z tym zaleca się wprowadzenie kilku modyfikacji w schemacie eksperymentalnym. Jeśli chodzi o widma masowe uzyskane w eksperymentach, biorąc pod uwagę fluktuacje widm masowych między poszczególnymi pomiarami, nie ma systemu wymiany informacji spektralnych, który byłby wspólny dla społeczności sekwencjonowania nukleotydów. Należy zachować ostrożność podczas obchodzenia się z igłą przez operatora, aby uniknąć wypadków z ukłuciem igłą, zwłaszcza podczas wyjmowania igły z uchwytu igły. Do tego celu bardzo przydatne jest specjalne urządzenie do odłączania igły. Ponieważ komora modułu PESI jest szczelną, zamkniętą komorą, wyciek pióropusza jonów nie występuje, jeśli spektrometr masowy jest obsługiwany zgodnie z instrukcją.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Instytucjonalny komitet ds. opieki nad zwierzętami na Uniwersytecie Yamanashi zatwierdził wszystkie protokoły i wykorzystanie zwierząt doświadczalnych wymienione w niniejszym dokumencie. Wykorzystanie próbek przez ludzi zostało zatwierdzone przez instytucjonalną radę etyki na Uniwersytecie Yamanashi.

1. Przygotowanie tkanek stałych

UWAGA: Próbki muszą być przechowywane na lodzie po ich usunięciu z ciała zwierzęcia lub człowieka, aby zachować świeżość tkanek. Jeśli pomiary nie nastąpią bezpośrednio po sekcji, zaleca się przechowywanie tkanki w temperaturze -80 °C. Nie zaleca się umieszczania tkanki w jakimkolwiek buforze lub soli fizjologicznej, ponieważ mogą one wydobyć pewną zawartość z tkanki. Tkanka, która została utrwalona aldehydami lub zatopiona w parafinie/wosku lub kriożelu, nie nadaje się do pomiarów MS.

  1. Przyciąć próbkę tkanki na wymiary około 2 x 2 x 2 mm za pomocą skalpela lub noża. Alternatywnie, należy przebić próbkę trepanem (jednorazowy dziurkacz do biopsji, rozmiar otworu 3 mm) używanym do badania skóry. W takim przypadku należy przyciąć długość kolumny do 2 mm.
    UWAGA: Za pomocą tej metody można przeanalizować dowolną tkankę. W tym eksperymencie liver15 i kidney19 zostały pomyślnie przeanalizowane w celu uzyskania widm masowych. Ogólnie rzecz biorąc, narządy miąższowe dają dobre widma masowe, podczas gdy te, które mają składniki włókniste, nie.
  2. Jeśli tkanka jest zanieczyszczona krwią, przemyć ją krótko lodowatym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanem.
    UWAGA: Aby zminimalizować pośmiertne uszkodzenie tkanek, wykonaj ten krok tak szybko, jak to możliwe, w temperaturze pokojowej. Jeśli pomiary nie zostaną wykonane natychmiast, należy zamrozić tkankę w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C.
  3. Umieścić wyciętą lub wybitą próbkę (około 10 mg) w plastikowej mikroprobówce i dodać 100 μl 50% etanolu.
    UWAGA: Dokładna masa próbek nie jest określona, ponieważ spektrometria mas stosowana w tym systemie nie dostarcza danych ilościowych. Około 10 mg jest optymalne dla tkanki miąższowej.
  4. Homogenizować próbkę za pomocą mikrotłuczka.
  5. Umieścić 10 μl homogenatu w studzience wkładu (Rysunek 2).
  6. Umieść wkład w komorze jonizacyjnej spektrometru mas i zainstaluj sondę igłową ze stali nierdzewnej, która będzie używana do jonizacji próbki (Rysunek 2).
    UWAGA: Igły do sond są dostarczane przez producenta. Wykonane są ze stali nierdzewnej i mają promień krzywizny około 400 nm.
  7. Mocno zamknij pokrywę komory, aby automatycznie aktywować urządzenie zabezpieczające.
  8. Uruchom komputer pokładowy, klikając ikonę Start, aby przeanalizować. Korzystając z paneli ekranowych, przyłóż napięcie 2,3 kV do igły, aby wytworzyć elektrospray i upewnij się, że częstotliwość igły wynosi 3 Hz.
  9. Poczekaj 30 sekund na zakończenie pomiaru.
    UWAGA: Sesja zostaje automatycznie zakończona po zakończeniu pobierania danych. Jakość analizy jest monitorowana za pomocą chromatogramu jonów całkowitych (TIC). Czas pomiaru jest definiowany w celu uzyskania reprezentatywnych widm masowych i może być skrócony lub wydłużony.
  10. Po zmierzeniu każdej próbki należy wyrzucić wkład i igłę do utylizatora zagrożeń biologicznych.
    UWAGA: Jednorazowo można mierzyć tylko jedną próbkę. Nie jest konieczne kalibrowanie maszyny przed każdym pomiarem; Kalibracja zależy od regularnej kontroli przeprowadzanej przez dostawcę raz na sześć miesięcy.
  11. Przeanalizuj widma masowe i wyeksportuj dane tekstowe widma mas za pomocą oprogramowania powiązanego ze spektrometrem mas (patrz Tabela materiałów), jak podano w poniższych krokach (Rysunek 3).
    1. Kliknij plik lcd w oknie przeglądarki plików danych oprogramowania.
    2. Wybierz i kliknij pojedynczy pik w oknie widma masowego, aby automatycznie wyświetlić chromatogram wyekstrahowanych jonów (EIC).
    3. Sprawdź TIC i EIC i kliknij ikonę średniego widma, aby wybrać okno zakresu czasu do generowania widma masowego.
      UWAGA: W tej analizie cząsteczki docelowe pojawiają się w oknie stosunku masy do ładunku (m/z) (Rysunek 3). Ponadto, ponieważ czas jonizacji na pojedyncze pociągnięcie ruchu igły jest bardzo krótki, wszystkie uzyskane widma masowe są zasadniczo uśrednionymi widmami w ciągu 10 s (300 skanów).
    4. Wygeneruj plik tekstowy zawierający m/z i intensywność jonów, klikając zakładkę Eksport w celu dalszej analizy. Ten plik tekstowy może być przechowywany w dowolnym folderze.
      UWAGA: Wszelkie konserwanty RNA będą miały wpływ na natywny wzór spektralny próbek. Ponadto zaleca się obchodzenie się z tkanką i przechowywanie jej bez żadnych płynów (takich jak sól fizjologiczna buforowana fosforanami), aby zapobiec wymywaniu składników molekularnych z tkanki do cieczy podczas przechowywania. Idealnie byłoby, gdyby używane były świeże lub świeżo mrożone próbki bez żadnej obróbki.

2. Przygotowanie płynów ustrojowych (surowicy)

UWAGA: Cała ta procedura jest prawie identyczna z tą stosowaną w przypadku tkanek stałych. Kartridż z próbką płynu jest dostępny u producenta. Ponieważ zanieczyszczenie czerwonymi krwinkami (RBC) może znacznie zmniejszyć skuteczność spektralnego pozyskiwania zamierzonego składnika (osocza lub surowicy), należy upewnić się, że wszystkie krwinki czerwone zostały wyeliminowane przez odwirowanie przed pomiarami.

  1. Pobrać 10 μl próbki surowicy i umieścić ją w mikroprobówce o pojemności 1,5 ml.
    UWAGA: Można stosować zarówno świeże, jak i przechowywane serum.
  2. Dodaj 190 μl 50% etanolu do probówki o pojemności 1,5 ml, a następnie wiruj przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
  3. Odwirować ciecz o stężeniu 15 000 x g przez 1-5 minut w temperaturze 4 °C.
  4. Przenieść 10 μl supernatantu do dołka wkładu.
  5. Umieść wkład w komorze jonizacyjnej urządzenia i zainstaluj sondę igłową ze stali nierdzewnej, która będzie używana do jonizacji próbki (Rysunek 2).
  6. Mocno zamknij pokrywę komory, aby automatycznie aktywować urządzenie zabezpieczające.
  7. Uruchom komputer pokładowy, klikając ikonę Start, aby zjonizować.
  8. Po dokonaniu pomiarów należy wyrzucić wkład z próbką i igłę zgodnie z opisem w ppkt 1.10.
  9. Przeanalizuj otrzymane zestawy EIC, jak podano poniżej (Rysunek 3).
    1. Otwórz plik lcd w przeglądarce danych.
    2. Kliknij pojedynczy pik, aby wyświetlić TIC i EIC.
    3. Wybierz okno zakresu czasu do generowania widm masowych za pomocą ikony widma średniego.
    4. Wyeksportuj wygenerowany plik zawierający zarówno m/z, jak i intensywność jonów odpowiedniego piku, klikając kartę eksportu na monitorze.
      UWAGA: Ta procedura może być również stosowana do śliny, moczu i innych płynów ustrojowych.

3. Przygotowanie do PESI-MS in in vivo w organizmie żywym

UWAGA: W tej sekcji przedstawiono aplikację do monitorowania profilu metabolicznego 5-Fluoro-2'-deoksyurydyny (5-FdU) w modelu żywej myszy. Przez cały czas należy stosować warunki aseptyki.

  1. Wlej 100 μl 100 mM roztworu 5-FdU do żyły ogonowej 2-miesięcznej myszy (o wadze około 20 g).
    UWAGA: Nie ma preferencji co do płci, wieku ani odmiany myszy. Chociaż ten protokół został zatwierdzony w czasie, gdy przeprowadzaliśmy eksperyment5, wykonalność tego eksperymentu zależy od ograniczeń etycznych kraju, w którym zostanie przeprowadzony.
  2. Znieczul mysz zgodnie z zatwierdzonym protokołem opieki nad zwierzętami. Oceń głębokość znieczulenia na podstawie braku reakcji na szczypanie ogona.
    UWAGA: Jeśli stosowanie pentobarbitalu sodu nie jest dozwolone przez komisję etyczną do doświadczeń na zwierzętach, można zastosować metody alternatywne, takie jak chlorowodorek ketaminy.
  3. Ogol jamę brzuszną za pomocą elektrycznej maszynki do golenia i nałóż maść weterynaryjną na oczy.
  4. Umieść znieczuloną mysz w pozycji leżącej na plecach i przymocuj łapki do plastikowej płytki za pomocą taśmy naprawiającej. Trzykrotnie wyszoruj miejsce operowane peelingami o stężeniu 70% alkoholu.
  5. Rozetnij jamę brzuszną za pomocą nożyczek. Najpierw odetnij skórę bocznie (10 mm) tuż nad membraną. Przeciąć bocznie mięsień ściany brzucha i otrzewnej (ok. 7 mm) i przytrzymać ranę otwartą za pomocą drutu ze stali nierdzewnej, aby odsłonić powierzchnię wątroby.
    UWAGA: Nie ma potrzeby perfuzji powierzchni wątroby.
  6. Przyłóż końcówkę igły sondy do powierzchni wątroby. Dostosuj głębokość igły do około 0,5 mm, aby zoptymalizować wydajność jonizacji, sprawdzając jednocześnie TIC i wzór spektralny. Ustaw wysokie napięcie na 2,3 kV i częstotliwość na 3 Hz na ekranie centrali.
  7. Wyjmij zwierzę z plastikowej płytki.
  8. Zszyj ranę za pomocą chirurgicznego szwu jelitowego i włóż mysz z powrotem do klatki. Nie pozostawiaj myszy bez opieki, dopóki nie odzyska przytomności, aby utrzymać leżący mostek. Nie zwracaj myszy do towarzystwa innych zwierząt, dopóki w pełni nie wyzdrowieje.
  9. Wykonać przebieg czasowy intensywności jonów w EIC i procedurę przedstawiania EIC, jak w 1.11.1 do 1.11.4.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jak pokazano w Rysunek 3, dane uzyskane techniką PESI-MS to widma mas, których zakres m/z wynosi od 10 do 1,200 w tym systemie. Podczas gdy można wykryć cząsteczki do m/z 2000, w zakresie mas m/z 1200 uzyskano niewiele pików w tym zakresie. W związku z tym przeanalizowaliśmy piki od m/z 10 do 1 200. Widoczne były grupy szczytów w okolicach m/z 800 i 900; pierwszy reprezentuje składniki błony komórkowej, takie jak g...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chociaż PESI jest pochodną ESI dla spektrometrii mas4, jest najbardziej korzystny do monitorowania metabolomiki w czasie rzeczywistym, a także do analizy reakcji biochemicznych bez wykonywania skomplikowanych lub czasochłonnych zabiegów wstępnych 5,14,15,17. Jest to łatwa i natychmiastowa technika spektrometrii mas, którą można zastosować do zintegrowanego stanu organizm...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autor korespondencyjny został ufundowany przez firmę Shimadzu, producenta i dostawcę przyrządu PESI-MS.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Ayumi Iizuka za obsługę PESI-MS i Kazuko Sawa-nobori za jej pomoc w sekretariacie. Dziękujemy dr Bronwen Gardner z Edanz Group (www.edanzediting.com/ac) za redakcję szkicu tego manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
5-Fluoro-2'-deoksyurydyna (5-FdU)Sigma-AldrichF8791-25MG25mg
jednorazowy dziurkacz biposy (Trepan)kai Europa GmbHBP-30Frozmiar otworu 3mm
etanolnacalai tesque14710-25ekstra czysty odczynnik
LabSolutionsShimadzuver. 5.96, Mikrotłuczek analizatora danych
United Scientific DostarczaS13091
mikroprobówkaTreff9828550,5 ml przezroczysta
PESI-MS (bezpośrednia jonizacja sondy-MS)ShimadzuDPiMS-2020Spektrometr masowy wyposażony w filtr PESI
PPGTShimadzuNDDołączony do DPiMS-2020

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fenn, J. B., Mann, M., Meng, C. K., Wong, S. F., Whitehouse, C. M. Electrospray ionization for mass spectrometry of large biomolecules. Science. 246, 64-71 (1989).
  2. Karas, M., Bachman, D., Bahr, U., Hillenkamp, F. Matrix-Assisted Ultraviolet Laser Desorption of Non-Volatile Compounds. International Journal of Mass Spectrometry and Ion Processes. 78, 53-68 (1987).
  3. Tanaka, K., et al. Protein and polymer analyses up to m/z 100000 by laser ionization time-of flight mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 2, 151-153 (1988).
  4. Hiraoka, K., Nishidate, K., Mori, K., Asakawa, D., Suzuki, S. Development of probe electrospray using a solid needle. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 21, 3139-3144 (2007).
  5. Yoshimura, K., Chen, L. C., Yu, Z., Hiraoka, K., Takeda, S. Real time analysis of living animals by electrospray ionization mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 417, 195-201 (2011).
  6. Balog, J., et al. Intraoperative tissue identification using rapid evaporative ionization mass spectrometry. Science Translational Medicine. 5, 194ra93(2013).
  7. Boughton, B. A., Hamilton, B. Spatial metabolite profiling by matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry imaging. Advances in Experimental Medicine and Biology. 965, 291-321 (2017).
  8. Shimma, S., Sugiura, Y., Hayasaka, T., Hoshikawa, Y., Noda, T., Setou, M. MALDI-based imaging mass spectrometry revealed abnormal distribution of phospholipids in colon cancer liver metastasis. Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 855, 98-103 (2017).
  9. Sugiyama, E., Setou, M. Visualization of brain gangliosides using MALDI imaging mass spectrometry. Methods in Molecular Biology. 1804, 223-229 (2018).
  10. Zhang, J., et al. Nondestructive tissue analysis for ex vivo and in vivo cancer diagnosis using a handheld mass spectrometry system. Science Translational Medicine. 9, 406(2017).
  11. Pirro, V., Jarmusch, A. K., Vincenti, M., Cooks, R. G. Direct drug analysis from oral fluid using swab touch spray mass spectrometry. Analytica Chimca Acta. 861, 47-54 (2015).
  12. Chen, L. C., et al. Characterization of probe electrospray generated from a solid needle. Journal of Physical Chemistry. B. 112, 11164-11170 (2008).
  13. Mandal, M. K., Chen, L. C., Hiraoka, K. Sequential and exhaustive ionization of analytes with different surface activity by probe electrospray ionization. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 22, 1493-1500 (2011).
  14. Yoshimura, K., Chen, C. L., Asakawa, D., Hiraoka, K., Takeda, S. Physical properties of the probe electrospray ionization (PESI) needle applied to the biological samples. Journal of Mass Spectrometry. 44, 978-985 (2009).
  15. Yoshimura, K., et al. Analysis of renal cell carcinoma as a first step for mass spectrometry-based diagnostics. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 23, 1741-1749 (2012).
  16. Ashizawa, K., et al. Construction of mass spectra database and diagnosis algorithm for head and neck squamous cell carcinoma. Oral Oncology. 75, 111-119 (2017).
  17. Johno, H., et al. Detection of potential new biomarkers of atherosclerosis by probe electrospray ionization mass spectrometry. Metabolomics. 14, 38(2018).
  18. Zaitsu, K., et al. Intact endogenous metabolite analysis of mice liver by probe electrospray ionization/triple quadrupole tandem mass spectrometry and its preliminary application to in vivo real-time analysis. Analytical Chemistry. 88, 3556-3561 (2016).
  19. Yoshimura, K., et al. Real time diagnosis of chemically induced hepatocellular carcinoma using a novel mass spectrometry-based technique. Analytical Biochemistry. 441, 32-37 (2013).
  20. Nakagawa, H., et al. Lipid metabolic reprogramming in hepatocellular carcinoma. Cancers. 10, 447-461 (2018).
  21. Mandal, M. K., Chen, L. C., Hashimoto, Y., Yu, Z., Hiraoka, K. Detection of biomolecules from solutions with high concentration of salts using probe electrospray and nano-electrospray ionization mass spectrometry. Analytical Methods. 2, 1905-1912 (2010).
  22. Yoshimura, K., Chen, L. C., Johno, H., Nakajima, M., Hiraoka, K., Takeda, S. Development of non-proximate probe electrospray ionization for real-time analysis of living animal. Mass Spectrometry. 3, S0048(2014).
  23. Chen, L. C., et al. Ambient imaging mass spectrometry by electrospray ionization using solid needle as sampling probe. Journal of Mass Spectrometry. 44, 1469-1477 (2009).
  24. Yoshimura, K., Chen, C. L., Asakawa, D., Hiraoka, K., Takeda, S. Physical properties of the probe electrospray ionization (PESI) needle applied to the biological samples. Journal of Mass Spectrometry. 44, 978-985 (2009).
  25. Takeda, S., Yoshimura, K., Hiraoka, K. Innovations in analytical oncology - Status quo of mass spectrometry-based diagnostics for malignant tumor. Journal of Analytical Oncology. 1, 74-80 (2012).
  26. Hiraoka, K., et al. Component profiling in agricultural applications using an adjustable acupuncture needle for sheath-flow probe electrospray ionization/mass spectrometry. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 67, 3275-3283 (2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Analiza tkanekanaliza surowicy krwizastosowanie in vivometoda bezpo redniej jonizacjiwk ad silikagelowyig a ze stali nierdzewnejhomogenizacja w mikroprob wce

Powiązane artykuły