Artykuł metodologiczny

Wytwarzanie limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR) do immunoterapii adoptywnej

13.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59949

⸱

17 grudnia 2019

 , 
1Center for Cellular Immunotherapies, Perelman School of Medicine at the University of Pennsylvania

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy podejście do niezawodnego generowania limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR) i testowania ich różnicowania i funkcji in vitro i in vivo.

Streszczenie

Immunoterapia adopcyjna jest obiecująca w leczeniu raka i chorób zakaźnych. Opisujemy proste podejście do transdukcji pierwotnych ludzkich limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR) i ekspansji ich potomstwa ex vivo. Uwzględniamy testy do pomiaru ekspresji CAR, a także różnicowania, zdolności proliferacyjnej i aktywności cytolitycznej. Opisujemy testy do pomiaru produkcji cytokin efektorowych i wydzielania cytokin zapalnych w komórkach CAR T. Nasze podejście zapewnia wiarygodną i kompleksową metodę hodowli limfocytów CAR T do przedklinicznych modeli immunoterapii adoptywnej.

Wprowadzenie

Chimeryczne receptory antygenowe (CARs) stanowią obiecujące podejście do przekierowywania limfocytów T przeciwko różnym antygenom nowotworowym. CAR to syntetyczne receptory, które wiążą cel antygenowy. Chociaż ich dokładny skład jest zmienny, Republiki Środkowoafrykańskie zazwyczaj zawierają 3 odrębne domeny. Domena zewnątrzkomórkowa kieruje wiązanie z antygenem docelowym i zwykle składa się z fragmentu przeciwciała o pojedynczym łańcuchu połączonym z CAR za pomocą zawiasu zewnątrzkomórkowego. Druga domena, powszechnie wywodząca się z łańcucha CD3ζ kompleksu receptora komórek T (TCR), promuje aktywację limfocytów T po zaangażowaniu CAR. Trzecia domena kostymulacyjna jest uwzględniona w celu poprawy funkcji limfocytów T, wszczepienia, metabolizmu i trwałości. Sukces terapii komórkami CAR T w różnych nowotworach układu krwiotwórczego, w tym w ostrej białaczce limfoblastycznej z komórek B (ALL), przewlekłej białaczce limfocytowej (CLL) i szpiczaku mnogim, podkreśla terapeutyczną obietnicę tego podejścia1,2,3,4,5,6. Niedawne zatwierdzenia przez Agencję ds. Żywności i Leków (FDA) dla dwóch terapii limfocytami CAR T specyficznych dla CD19, tisagenlecleucel dla dzieci i młodych dorosłych ALL oraz axicabtagene ciloleucel dla chłoniaka rozlanego z dużych komórek B, wzmacniają wartość translacyjną terapii komórkami CAR T.

Podejścia oparte na CAR T polegają na izolacji limfocytów T z krwi obwodowej, aktywacji, modyfikacji genetycznej i ekspansji ex vivo. Różnicowanie jest ważnym parametrem regulującym skuteczność limfocytów CAR T. W związku z tym ograniczenie różnicowania limfocytów T podczas hodowli ex vivo zwiększa zdolność podawanego produktu do wszczepiania, rozszerzania się i utrzymywania, zapewniając długotrwały nadzór immunologiczny po transferze adoptywnym2,7,8,9. Limfocyty T składają się z kilku odrębnych podzbiorów, w tym: naiwnych limfocytów T (Tn), pamięci centralnej (Tcm), pamięci efektorowej (Tem), zróżnicowanej efektorowej (Tte) i pamięci komórek macierzystych (Tscm). Limfocyty T zróżnicowane efektorowo mają silną zdolność cytolityczną; Są one jednak krótkotrwałe i słabo się wszczepiają10,11,12. W przeciwieństwie do tego, limfocyty T o mniej zróżnicowanym fenotypie, w tym naiwne limfocyty T i Tcm, wykazują lepsze zdolności do wszczepiania i proliferacji po adoptywnym transferze komórek13,14,15,16,17,18. Skład pobranych limfocytów T w prefabrykowanym produkcie może się różnić u różnych pacjentów i koreluje z potencjałem terapeutycznym limfocytów CAR T. Odsetek limfocytów T o pierwotnym immunofenotypie w wyjściowym produkcie aferezy jest silnie skorelowany zarówno z wszczepieniem, jak i odpowiedzią kliniczną19.

Czas trwania hodowli jest ważnym parametrem wpływającym na różnicowanie w limfocytach CAR T przygotowanych do adopcyjnego transferu. Niedawno opracowaliśmy podejście do generowania najwyższej jakości komórek CAR T przy użyciu skróconego paradygmatu hodowli20. Korzystając z naszego podejścia, wykazaliśmy, że ograniczona hodowla powoduje powstawanie limfocytów CAR T o lepszej funkcji efektorowej i trwałości po transferze adoptywnym w ksenoprzeszczepowych modelach białaczki. W tym miejscu przedstawiamy podejścia do niezawodnego generowania komórek CART19 (autologiczne limfocyty T zaprojektowane do ekspresji anty-CD19 scFv przyłączone do CD3ζ i domen sygnalizacyjnych 4-1BB) i zawieramy szczegółowy opis testów, które zapewniają wgląd w bioaktywność i skuteczność CAR T przed transferem adoptywnym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie badania na zwierzętach są zatwierdzane przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Pensylwanii.

1. Aktywacja, transdukcja i ekspansja limfocytów T

  1. Aktywuj świeże lub kriokonserwowane pierwotne ludzkie limfocyty T przez zmieszanie z kulkami magnetycznymi anty CD3 / CD28 (np. Dynabeads) w stosunku 3 kulek na komórkę T w 6-dołkowych naczyniach do hodowli komórek. Hodowla limfocytów T w pożywce X-VIVO 15 uzupełniona 5% normalną ludzką surowicą AB, 2 mM L-glutaminy, 20 mM HEPES i IL2 (100 jednostek/ml). Utrzymuj limfocyty T w stężeniu 106 limfocytów T / ml podczas ekspansji. Hodowla limfocytów T w temperaturze 37 °C, 20% O2 i wilgotności 95% z 5% CO2 .
  2. Po całonocnej stymulacji dodać supernatant lentiwirusowy do aktywowanych limfocytów T. Obliczyć objętość supernatantu niezbędną do osiągnięcia wielokrotności infekcji (MOI) 3−5,
    nuta: Plazmid lentiwirusa CD19-BBζ CAR składa się z zawiasu CD8, domeny kostymulującej 4-1BB i domeny sygnalizacyjnej CD3ζ21. Supernatant lentiwirusowy CD19-BBζ został wygenerowany zgodnie z wcześniejszym opisem21.
  3. W dniu 3 należy pobrać reprezentatywną porcję komórek do krioprezerwacji. Przed krioprezerwacją należy usunąć kulki magnetyczne za pomocą delikatnego pipetowania i separacji magnetycznej. Przygotować pożywkę zamrażającą zawierającą sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) z 0,5% dimetylosulfotlenkiem (DMSO) i przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
    1. Odwirować limfocyty T przy 300 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant i dodać 5 ml PBS. Odwirować komórki o masie 300 x g przez 5 minut i wyrzucić PBS.
    2. Zawiesić osad komórkowy w 1 ml zimnego podłoża do kriokonserwacji. Zamrozić limfocyty T w schłodzonym pojemniku do zamrażania i przechowywać w temperaturze -80 °C przez 48 godzin. Przenieś zamrożone komórki do ciekłego azotu.
  4. Umyj resztę limfocytów T raz na 5 ml PBS, aby wyeliminować resztki wektora. Wirować przy 300 x g przez 5 min. Zdekantować PBS i ponownie zawiesić osad komórkowy w pożywce do hodowli limfocytów T w stężeniu 0,5 x 106 komórek/ml.
  5. Podziel limfocyty T na dwie kultury, wyznaczone na dzień 5 i dzień 9. Policz limfocyty T za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu kulek zliczających (tabela materiałów) i przeciwciał monoklonalnych przeciwko ludzkim CD4 i CD8, a także barwnika żywotności (tabela materiałów).
    1. Aby zmierzyć stężenie limfocytów T, należy przygotować mieszankę wzorcową zawierającą 500 μl PBS, 5 μl kulek liczących, 10 μl roztworu żywotności komórek D 7-amino-aktynomycyny, 4 μl CD4-FITC i 4 μl CD8-APC. Dodać 40 μl limfocytów T do mieszanki wzorcowej i zmierzyć stężenie komórek za pomocą cytometrii przepływowej na podstawie liczby żywych limfocytów T/kulek. Ponownie podawać, aby utrzymać kultury w stężeniu 0,5 x 106 komórek/ml co drugi dzień.
  6. W dniu 5 należy policzyć i dokonać kriokonserwacji kultur z dnia 5 zgodnie z opisem w krokach 1.3 i 1.5.
  7. W dniu 7 przemyj 0,5 x 106 limfocytów T w PBS i ponownie zawieś w 100 μl buforu do sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS). Wykrywanie ekspresji białek powierzchniowych CAR poprzez barwienie immunologiczne fluorescencyjnie sprzężonym idiotypem anty-CAR19 za pomocą cytometrii przepływowej.
  8. W dniu 9 policz kultury z dnia 9 i kriokonserwację zgodnie z opisem w kroku 1.3.

2. Fenotypowa ocena różnicowania limfocytów T

  1. Przygotować mieszaninę wzorcową zawierającą wstępnie miareczkowane przeciwciała przeciwko anty-CD3–BV605 (klon OKT3), anty-CD14–Pacific Blue (PB) (klon HCD14), anty-CD19–PB (klon HIB19), anty-CD4–BV510 (klon OKT4), anty-CD8–H7APC (klon SK1), anty-CCR7–FITC (klon 150503), anty-CD45RO–PE (klon UCHL1), anty-CD27–PE-Cy7 (klon 1A4CD27), anty-CD95–PerCP-Cy5.5 (klon DX2) i anty-CAR19-APC.
  2. Przygotuj indywidualne kontrole fluorescencji minus jeden (FMO) dla anty-CD45RO-PE, anty-CCR7-FITC, anty-CD27-PE-Cy7 i anty-CD95-PerCP-Cy5.5, aby odróżnić dodatnio barwione komórki od tła.
  3. Przygotować roztwór do barwienia martwych komórek, rozcieńczając żywy/martwy odczynnik (tabela materiałów) w stosunku 1:10 000 w PBS.
  4. Rozmrozić limfocyty T dnia 3, dnia 5 i dnia 9, które były wcześniej kriokonserwowane. Odwirować 1 x 106 limfocytów T z każdej grupy w ilości 300 x g przez 3 min. Odrzucić supernatant. Umyj komórki raz za pomocą PBS. Wirować przy 300 x g przez 3 minuty i wyrzucić PBS.
  5. Mieszać limfocyty T z martwym roztworem barwiącym przez 15 minut w temperaturze pokojowej (RT), chroniąc przed światłem.
  6. Dodaj 1 ml buforu FACS, aby ugasić barwnik barwiący martwe komórki. Wirować przy 300 x g przez 3 minuty, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 100 μl buforu FACS zawierającego koktajl przeciwciał opisany w krokach 2.1 i 2.2. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.
  7. Dodać 1 ml buforu FACS i odwirować przy 300 x g przez 3 minuty, aby zmyć niezwiązane przeciwciało. Powtórz trzy razy z buforem FACS.
  8. Zawiesić komórki w 1% paraformaldehydzie (PFA) i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  9. Ponieważ ekspresja CD45RO zmniejsza się po utrwaleniu, należy przeanalizować próbki za pomocą cytometrii przepływowej po barwieniu immunologicznym. Aby ocenić różnicowanie, bramka w następującej kolejności: pojedyncze (FSC-H vs FSC-A), żywe limfocyty T CD3 + (Dump [żywy-martwy fiolet, CD14-PB i CD19-PB vs CD3-BV605], CD4-BV510 vs CD8-APC-H7). W podzbiorach CD4 + i CD8 + bramka na CD45RO-PE vs CCR7-FITC w celu zdefiniowania naiwnopodobnych limfocytów T (CD45RO-CCR7 +), Tcm (CD45RO + CCR7 +), Tem (CD45RO + CCR7-) i Tte (CD45RO-CCR7-). Aby zidentyfikować Tscm, bramka na limfocytach T CD27 + w populacji naiwnych limfocytów T. W tym przedziale Tscm to CD95+, a Tn to CD95-.

3. Analiza funkcjonalna in vitro

  1. Proliferacja limfocytów CAR T i wydzielanie cytokin
    1. Sprawdź ekspresję CAR, a także żywotność komórek, jak opisano w krokach 1.5 i 1.7, za pomocą cytometrii przepływowej.
    2. Przemyć 5 x 106 limfocytów T z każdej grupy (dzień 3, dzień 5 i dzień 9) PBS i ponownie zawiesić w roztworze 1 μM estru sukcynimidylowego dioctanu karboksyfluoresceiny (CFSE) w PBS przez 3,5 minuty w temperaturze pokojowej.
    3. Natychmiast dodać 10 ml PBS zawierającego 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) w celu wygaszenia reakcji.
    4. Odwirować roztwór o stężeniu 300 x g przez 3 minuty. Wyrzucić supernatant i powtórzyć ten etap płukania trzy razy. Policz komórki po zakończeniu barwienia CFSE za pomocą licznika Coultera (tabela materiałów).
    5. Pobrać komórki barwione CFSE (niestymulowane), ponownie zawiesić w 1% PFA i przechowywać w temperaturze 4 °C do analizy za pomocą cytometrii przepływowej.
    6. Inkubować żądaną liczbę komórek CAR T barwionych CFSE z napromieniowanymi komórkami K562-CD19 (cel), jak również K562-dzikimi (kontrolnymi) w stosunku 1:1 przez 120 godzin w pożywce hodowlanej wolnej od cytokin i warunkach hodowli, jak opisano w kroku 1.1.
    7. Po 24 godzinach odwirować naczynie hodowlane o stężeniu 300 x g przez 5 minut. Zebrać 120 μl supernatantu komórkowego. Oceń zależną od aktywacji produkcję IL2, IFNγ, TNFα, GM-CSF i innych cytokin zapalnych (IL1β, IL4, IL5, IL6, IL8 i IL10) za pomocą analiz Luminex zgodnie z zaleceniami producenta.
    8. Zastąpić objętość supernatantu, która została zebrana w kroku 3.1.7, równoważną objętością (120 μl) świeżej pożywki.
    9. W dniu 3 (tj. po 96 godzinach) należy policzyć i ponownie podawać w stężeniu 0,5 x 106 komórek/ml za pomocą cytometrii przepływowej opartej na kulkach, jak poprzednio w kroku 1.5.
    10. W dniu 5 policz żywe komórki CD3 + i oblicz zmianę krotności żywych komórek T w stosunku do liczby żywych komórek T w dniu 0.
    11. Wykonaj kompleksową analizę rozcieńczenia CFSE w dzielących się limfocytach CAR T za pomocą oprogramowania FlowJo, aby podkreślić kolejne rundy podziału komórek.
      UWAGA: Testy proliferacji są dobrze opisane w podręczniku FlowJo.
  2. Test cytotoksyczności
    nuta: Zdolność komórek CART19 do zabijania komórek docelowych wykazujących ekspresję CD19 ocenia się za pomocą testu uwalniania 51Cr.
    1. Oznaczyć komórki docelowe, mieszając 5 x 105 komórek kontrolnych typu dzikiego K562-CD19, K562 lub komórek białaczkowych NALM6 z 50 μl Na251CrO4 i 0,5 ml RPMI uzupełnionych 10% FBS przez 90 minut w inkubatorze w temperaturze 37 °C.
    2. Odwirować komórki przy 300 x g przez 2,5 min. Wyrzucić radioaktywny supernatant do odpowiednich pojemników na odpady i umyć komórki docelowe w 5 ml PBS. Powtórz kroki prania dwukrotnie.
    3. Ponownie zawiesić komórki docelowe w pożywce wolnej od czerwieni fenolowej zawierającej 5% FBS. Użyj tego medium do dalszej części procedury, aby zmniejszyć tło.
    4. Po ocenie ekspresji CAR i żywotności komórek za pomocą cytometrii przepływowej (jak opisano w sekcji 5.1), zmieszać limfocyty CAR T ze znakowanymi komórkami docelowymi w proporcjach efektor:cel (E:T) 10:1, 3:1 i 1:1, w trzech powtórzeniach. Przenieść na 96-dołkową płytkę dolną w kształcie litery U.
    5. Równolegle należy uwzględnić same komórki docelowe i komórki docelowe z 1% dodecylosiarczanem sodu (SDS), aby określić odpowiednio spontaniczne (S) i maksymalne (M) uwalnianie 51Cr.
    6. Odwirować komórki przy ciśnieniu 300 x g przez 5 minut i inkubować przez 4 godziny lub 20 godzin w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
    7. Po upływie wyznaczonego czasu odwirować naczynie hodowlane o sile 300 x g przez 5 minut. Zebrać 35 μl supernatantu komórkowego i przenieść na płytkę czytnika. Unikaj bąbelków. Pozostaw talerz do wyschnięcia na noc.
    8. Uszczelnij płytkę za pomocą standardowej uszczelki płytowej i policz za pomocą licznika scyntylacji cieczy. Obfitość chromu w supernatancie stanowi wskaźnik zastępczy zabijania komórek docelowych. Oblicz procent lizy swoistej w następujący sposób: 100 x (liczba na minutę [cpm] wydanie eksperymentalne – uwolnienie cpm S)/ (uwolnienie cpm M – uwolnienie cpm S).

4. Analiza funkcjonalna in vivo

  1. Uzyskaj 6-10-tygodniowe myszy NOD-SCID γc–/– (NSG), które nie mają adaptacyjnego układu odpornościowego, i losowo przypisz je do grupy leczonej / kontrolnej.
  2. Wstrzyknąć zwierzętom dożylnie przez żyłę ogonową 1 x 106 komórek NALM6 w 0,1 ml sterylnego PBS.
  3. Po 5-7 dniach potwierdź wszczepienie guza za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego (BLI). Wstrzyknąć 150 mg/kg D-lucyferyny myszom, które zostały znieczulone izofluranem (objętość zależy od masy ciała).
  4. Zmierz wartości bioluminescencji za pomocą systemu obrazowania. Określ ilościowo całkowity strumień za pomocą odpowiedniego oprogramowania, rysując prostokąty o identycznym obszarze wokół myszy, sięgające od głowy do 50% długości ogona. Odejmij tło dla każdego obrazu z osobna.
  5. Po ustaleniu białaczki wstrzyknąć 3 x 106-dniowych 9 komórek CART19, 0,5 x 106-dniowych 3 limfocytów T CAR lub odpowiadających im nietransdukowanych (NTD) ludzkich limfocytów T przez żyłę ogonową w objętości 100 μL sterylnego PBS / Ca2 +,< br / > nuta: Ponieważ bioaktywność komórek zebranych w różnych odstępach czasu podczas procesu hodowli jest różna, wybrane stężenie komórek dnia 3 jest niższe niż dnia 9.
  6. Aby określić postęp choroby, mierz wartości bioluminescencji dwa razy w tygodniu, jak opisano powyżej w kroku 4.3.
  7. Aby określić wszczepienie limfocytów CAR T, należy pobrać 75 μl krwi przez krwawienie zaoczodołowe w probówce pokrytej EDTA. Przenieść 50 μl krwi do probówek do liczenia bezwzględnego.
  8. Zabarwić krew przeciwciałami przeciwko CD45, CD4, CD8 i CAR przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Dodać 400 μl 1x roztworu lizującego FACS do probówek i dokładnie odwirować. Po barwieniu przeanalizować ekspresję markera powierzchniowego za pomocą cytometrii przepływowej.
    nuta: Inne markery powierzchniowe można wykorzystać do oceny stanu różnicowania i wyczerpania limfocytów T we krwi.
  9. Aby zmierzyć poziom cytokin we krwi, należy odwirować krew o stężeniu 1 200 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C w celu oddzielenia surowicy od górnej warstwy krwi.
  10. Pobrać surowicę i zmierzyć cytokiny za pomocą przeznaczonej do tego płytki czytnika zgodnie z instrukcjami producenta.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Stosując opisane powyżej metody, stymulowaliśmy i namnażaliśmy limfocyty T przez 3 lub 9 dni (Rycina 1A,B). Przeanalizowaliśmy również ich profil różnicowania, zgodnie ze strategią bramkowania przedstawioną na Rycynie 1C, mierząc poziom poszczególnych glikoprotein eksprymowanych na powierzchni komórek. Wykazujemy progresywne przesunięcie w stronę różnicowania efektorowego w czasie trwania hodowli ex vivo (Ry...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym miejscu opisujemy podejścia do pomiaru funkcji i skuteczności limfocytów CAR T zbieranych w różnych odstępach czasu podczas hodowli ex vivo. Nasze metody zapewniają kompleksowy wgląd w testy przeznaczone do oceny zdolności proliferacyjnej, a także funkcji efektorowej in vitro. Opisujemy, jak mierzyć aktywność limfocytów CAR T po stymulacji za pomocą CAR i szczegółowo opisujemy modele ksenoprzeszczepów białaczki przy użyciu komórek CAR T pobranych w 3 dniu w porównaniu z 9 dniem ich logarytmicznej fazy ekspansji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była częściowo wspierana przez fundusze dostarczone przez Novartis Pharmaceuticals poprzez sojusz badawczy z Uniwersytetem Pensylwanii (Michael C. Milone), a także St. Baldrick's Foundation Scholar Award (Saba Ghassemi).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Anty CD3/CD28 TermoFisher40203D
Mysz APC Anti-Human CD8BD Biosciences555369RRID:AB_398595
Mysie przeciwciało anty-ludzkie CD8 APC-H7Biosciences560179RRID:AB_1645481
BD FACS Roztwór do lizy 10X KoncentratBD Biosciences349202
BD Trucount Absolutne probówki licząceBD Biosciences340334
Brilliant Violet 510 anty-ludzkie przeciwciało CD4BioLegend317444RRID:AB_2561866
Brilliant Violet 605 anty-ludzkie przeciwciało CD3BioLegend317322RRID:AB_2561911
Zestaw do proliferacji komórek CellTrace CFSE LifeTechnolohgiesC34554
CountBright Absolutne koraliki do liczenia,InvitrogenC36950
FITC anty-ludzkie przeciwciało CD197 (CCR7)BD Pharmingen561271RRID:AB_10561679
FITC Mysz anty-ludzka CD4BD Biosciences555346 RRID:AB_395751
HEPESGibco15630-080
Ludzka surowica ABValley BiomedicalHP1022
Ludzka IL-2 IS, premium klasaMiltenyi130-097-744
L-glutaminaGibco28030-081
Licznik scyntylacyjny cieczy, MicroBeta triluxPerkin Elmer
LIVE/DEAD Fixable Fioletowesondy molekularneL34964
Multisizer Coulter Licznik redlicBeckman Coulter
Na251CrO4Perkin ElmerNEZ030S001MC
Pacific Niebieskie przeciwciało anty-ludzkie CD14BioLegend325616RRID:AB_830689
Pacific Blue anty-ludzkie przeciwciało CD19BioLegend302223
PE anty-ludzkie przeciwciało CD45ROBD Biosciences555493RRID:AB_395884
PE/Cy5 anty-ludzkie przeciwciało CD95 (Fas)BioLegend305610RRID:AB_493652
Przeciwciało anty-ludzkie CD27 PE/Cy7Beckman CoulterA54823
Pożywka bez czerwieni fenolowejGibco10373-017
UltraPure SDS Solution, 10%Invitrogen15553027
Via-ProbeBD Biosciences555815
X-VIVO 15Gibco04-418Q
XenoLight D-Luciferin - K+ SaltPerkin Elmer122799
BD

Bibliografia

  1. Brentjens, R. J., et al. CD19-targeted T cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy-refractory acute lymphoblastic leukemia. Science Translational Medicine. 5 (177), 177ra138(2013).
  2. Grupp, S. A., et al. Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia. The New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).
  3. Kalos, M., et al. T Cells with Chimeric Antigen Receptors Have Potent Antitumor Effects and Can Establish Memory in Patients with Advanced Leukemia. Science Translational Medicine. 3 (95), 95ra73(2011).
  4. Kochenderfer, J. N., Rosenberg, S. A. Treating B-cell cancer with T cells expressing anti-CD19 chimeric antigen receptors. Nature Reviews. Clinical Oncology. 10 (5), 267-276 (2013).
  5. Maude, S. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia. The New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).
  6. Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia. The New England Journal of Medicine. 365 (8), 725-733 (2011).
  7. Porter, D. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia. Science Translational Medicine. 7 (303), 303ra139(2015).
  8. Maude, S. L., Teachey, D. T., Porter, D. L., Grupp, S. A. CD19-targeted chimeric antigen receptor T-cell therapy for acute lymphoblastic leukemia. Blood. 125 (26), 4017-4023 (2015).
  9. Kochenderfer, J. N., et al. Lymphoma Remissions Caused by Anti-CD19 Chimeric Antigen Receptor T Cells Are Associated With High Serum Interleukin-15 Levels. Journal of Clinical Oncology. 35 (16), 1803-1813 (2017).
  10. Bollard, C. M., Rooney, C. M., Heslop, H. E. T-cell therapy in the treatment of post-transplant lymphoproliferative disease. Nature Reviews. Clinical Oncology. 9 (9), 510-519 (2012).
  11. Brestrich, G., et al. Adoptive T-cell therapy of a lung transplanted patient with severe CMV disease and resistance to antiviral therapy. American Journal of Transplantation. 9 (7), 1679-1684 (2009).
  12. Savoldo, B., et al. Treatment of solid organ transplant recipients with autologous Epstein Barr virus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTLs). Blood. 108 (9), 2942-2949 (2006).
  13. Berger, C., et al. Adoptive transfer of effector CD8+ T cells derived from central memory cells establishes persistent T cell memory in primates. The Journal of Clinical Investigation. 118 (1), 294-305 (2008).
  14. Gattinoni, L., et al. A human memory T cell subset with stem cell-like properties. Nature Methods. 17 (10), 1290-1297 (2011).
  15. Hinrichs, C. S., et al. Adoptively transferred effector cells derived from naive rather than central memory CD8+ T cells mediate superior antitumor immunity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (41), 17469-17474 (2009).
  16. Klebanoff, C. A., et al. Central memory self/tumor-reactive CD8+ T cells confer superior antitumor immunity compared with effector memory T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (27), 9571-9576 (2005).
  17. Wang, X., et al. Engraftment of human central memory-derived effector CD8+ T cells in immunodeficient mice. Blood. 117 (6), 1888-1898 (2011).
  18. Wang, X., et al. Comparison of naive and central memory derived CD8+ effector cell engraftment fitness and function following adoptive transfer. Oncoimmunology. 5 (1), e1072671(2016).
  19. Fraietta, J., et al. Determinants of response and resistance to CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy of chronic lymphocytic leukemia. Nature Medicine. 24 (5), 563-571 (2018).
  20. Ghassemi, S., et al. Reducing Ex Vivo Culture Improves the Antileukemic Activity of Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells. Cancer Immunology Research. 6 (9), 1100-1109 (2018).
  21. Milone, M. C., et al. Chimeric receptors containing CD137 signal transduction domains mediate enhanced survival of T cells and increased antileukemic efficacy in vivo. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 17 (8), 1453-1464 (2009).
  22. Cieri, N., et al. IL-7 and IL-15 instruct the generation of human memory stem T cells from naive precursors. Blood. 121 (4), 573-584 (2013).
  23. Cui, G., et al. IL-7-Induced Glycerol Transport and TAG Synthesis Promotes Memory CD8 T Cell Longevity. Cell. 161 (4), 750-761 (2015).
  24. Xu, Y., et al. Closely related T-memory stem cells correlate with in vivo expansion of CAR.CD19-T cells and are preserved by IL-7 and IL-15. Blood. 123 (24), 3750-3759 (2014).
  25. Singh, N., Perazzelli, J., Grupp, S. A., Barrett, D. M. Early memory phenotypes drive T cell proliferation in patients with pediatric malignancies. Science Translational Medicine. 8 (320), 320ra323(2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ekspansja limfocyt w Ttransdukcja lentiwirusemcytometria przep ywowasekrecja cytokinaktywno cytolitycznapo ywka X Vivo 15kuleczki Anti CD3 CD28protok kriokonserwacjir nicowanie efektorowe

Powiązane artykuły