Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wykrywanie 5-hydroksymetylocytozyny w nerwowych komórkach macierzystych i mózgach myszy

6.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59950

⸱

19 września 2019

 ,  ,  ,  , 
1The Children's Hospital, School of Medicine, Zhejiang University, 2The Institute of Translational Medicine, School of Medicine, Zhejiang University

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania 5-hydroksymetylocytozyny w komórkach i tkankach mózgu, wykorzystujący barwienie immunofluorescencyjne i metody dot-blot DNA.

Streszczenie

W genomie ssaków zidentyfikowano wiele modyfikacji DNA. Spośród nich intensywnie badano mechanizmy epigenetyczne za pośrednictwem 5-metylocytozyny i 5-hydroksymetylocytozyny. 5-hydroksymetylocytozyna wykazuje cechy dynamiczne podczas embrionalnego i pourodzeniowego rozwoju mózgu, pełni funkcję regulacyjną w ekspresji genów i bierze udział w wielu zaburzeniach neurologicznych. Tutaj opisujemy szczegółowe metody, w tym barwienie immunofluorescencyjne i kropkową plamę DNA w celu wykrycia 5-hydroksymetylocytozyny w hodowanych komórkach i tkankach mózgowych myszy.

Wprowadzenie

Wykazano, że modyfikacje epigenetyczne, w tym modyfikacja DNA, modyfikacja histonów i modyfikacja RNA, odgrywają kluczowe funkcje w różnych procesach biologicznych i chorobach1,2,3,4,5,6,7. Przez długi czas metylacja DNA (tj. 5-metylocytozyna (5-mC)) była postrzegana jako wysoce stabilny marker epigenetyczny i nie może być dalej modyfikowana w genomie. Niedawno stwierdzono, że 5-mC może być utleniany do 5-hydroksymetylocytozyny(5-hmC) przez białka z rodziny TET (translokacje Ten-jedenaście), w tym TET1, TET2 i TET38,9. Dalsze badania pokazują, że 5-hmC może służyć jako stabilny marker i odgrywać role biologiczne poprzez regulację ekspresji genów4,10,11,12.

Obecne dowody wskazują, że 5-hmC jest wysoce wzbogacony w tkanki/komórki neuronalne w porównaniu z innymi typami tkanek u ssaków i wykazuje dynamiczne cechy podczas rozwoju neuronów13,14. W układzie neuronalnym modyfikacje epigenetyczne za pośrednictwem 5-hmC odgrywają ważną rolę w regulacji nerwowych komórek macierzystych, aktywności neuronalnej, uczenia się i pamięci, a także biorą udział w wielu zaburzeniach neurologicznych, w tym zespole Retta, autyzmie, chorobie Alzheimera, chorobie Huntingtona itp.2,13,15,16,17,18,19,20.

Istnieje kilka podejść do wykrywania 5-hmC w komórkach i tkankach14,21,22,23,24. W tym miejscu opisujemy dwie metody wykrywania istnienia 5-hmC i ilościowego określania globalnego poziomu 5-hmC: barwienie immunofluorescencyjne i kropk-blot DNA. Te dwie metody są wygodne i czułe i zostały z powodzeniem wykorzystane w poprzednich badaniach25,26,27,28,29,30. Kluczowymi etapami tych dwóch metod jest denaturacja DNA. Do barwienia immunofluorescencyjnego 5-hmC wymagana jest wstępna obróbka próbek 1 M HCl. W przypadku 5-hmC dot-blot denaturację DNA przeprowadza się roztworem NaOH. Te dwie metody wraz z sekwencjonowaniem nowej generacji są bardzo przydatnymi narzędziami do badania funkcji 5-hmC.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki Zwierząt Uniwersytetu Zhejiang.

1. Hodowla dorosłych nerwowych komórek macierzystych i neuronów

  1. Wyizoluj dorosłe nerwowe komórki macierzyste z przodomózgowia dorosłego (8-10 tygodniowego) samca myszy C57/BL6, jak opisano wcześniej31,32.
  2. Hodowla dorosłych nerwowych komórek macierzystych w pożywce DMEM/F-12 zawierającej 20 ng/ml FGF-2, 20 ng/ml EGF, 2% suplementu B27, 1% antybiotyku przeciwgrzybiczego i 2 mM L-glutaminy w inkubatorze 5% CO2 w temperaturze 37 °C. Indukuj różnicowanie dorosłych nerwowych komórek macierzystych za pomocą 1 μM kwasu retinowego i 5 μM forskoliny przez 48 godzin, jak opisano wcześniej31, 32.
  3. Wyizoluj neurony z hipokampa myszy w dniu embrionalnym 17 (E17) i posiewz je za pomocą pożywki neurobazalnej zawierającej 0,25% L-glutaminy, 0,125% GlutaMax i 2% suplementu B27 w inkubatorze 5% CO2 w temperaturze 37 °C, jak opisano wcześniej33.

2. Perfuzja przezsercowa myszy

  1. Przygotować 10% hydrat chloralu, 4% paraformaldehydu (PFA) i sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) na jeden dzień przed eksperymentem i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  2. Znieczulić dorosłego samca lub samicę myszy C57 BL/6J 10% hydratem chloralu (50 mg/kg, i.p.) i upewnić się, że zwierzę jest głęboko znieczulone, sprawdzając reakcję organizmu. Przymocuj każdą kończynę taśmą klejącą do plastikowej deski (w pozycji zadrukowaną do góry).
  3. Przetnij skórę, a następnie mięsień nożyczkami chirurgicznymi. Otwórz klatkę piersiową nożyczkami chirurgicznymi. Odsłoń serce i odetnij niewielką część prawego przedsionka cienkimi nożyczkami chirurgicznymi.
  4. Przelej mysz jednorazową sterylizowaną strzykawką o pojemności 10 ml z lewej komory z zimnym PBS (około 30 ml na dorosłą mysz).
  5. Przetapiaj mysz 4% PFA (około 30 ml w ciągu 10 minut na dorosłą mysz), aż stanie się sztywna.
  6. Otwórz czaszkę myszy za pomocą kleszczy kostnych. Wyjąć mózg i umieścić w 5 ml 4% PFA w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml w celu późniejszego utrwalenia w temperaturze 4 °C.
    nuta: Oczyść obszar operacyjny po zakończeniu operacji.
  7. Co najmniej 24 godziny później przenieść próbki mózgu do 30% roztworu sacharozy w celu całkowitego odwodnienia w temperaturze 4 °C.

3. Sekcja mózgu

  1. Umieścić próbki mózgu w związku o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) w małym pojemniku i schłodzić w temperaturze -20 °C przez co najmniej 1 godzinę.
  2. Próbki mózgu należy przeciąć o grubości 20-40 μm za pomocą mikrotomu kriostatu.
  3. Zebrać skrawki do PBS i przechowywać w temperaturze 4 °C.

4. Barwienie immunofluorescencyjne

  1. Podnieś skrawki z docelowymi obszarami mózgu i umieść je na 24-dołkowej płytce z PBS. W przypadku hodowanych komórek na szkiełku nakrywkowym przejdź bezpośrednio do kroku 4.2.
  2. Myć PBS na shakerze w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Powtórz to jeszcze dwa razy.
  3. Usunąć PBS i traktować podgrzanym 1 M HCl przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
    nuta: Przygotuj 1 M HCl, dodając 1 ml kwasu solnego (36-38%) do 10 ml wody w kapturze chemicznym. Ogrzać 1 M HCl w inkubatorze w temperaturze 37 °C.
  4. Płukać próbki PBS przez 5 minut. Powtórzyć tę czynność jeszcze dwa razy.
  5. Blokuj próbki PBS zawierające 3% normalnej surowicy koziej i 0,1% Triton X-100 przez 1 godzinę na wytrząsarce w temperaturze pokojowej.
  6. Inkubować skrawki ze specyficznymi przeciwciałami pierwszorzędowymi przez noc w temperaturze 4 °C na wytrząsarce.
    nuta: Należy stosować następujące przeciwciała pierwszorzędowe: poliklonalne przeciwciała królika anty-5-hydroksymetylocytozynę (1:5,000), mysie przeciwciało monoklonalne anty-NeuN (1:500).
  7. Wyjąć próbki i kontynuować inkubację w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
  8. Płukać próbki PBS przez 10 minut. Powtórzyć tę czynność jeszcze dwa razy.
  9. Inkubować z przeciwciałami drugorzędowymi odpowiadającymi przeciwciałom pierwszorzędowym w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę na wytrząsarce. Przykryj płytę aluminium.
    nuta: Użyj następujących przeciwciał drugorzędowych: Alexa Fluor 488 kozia anty-królicza IgG (1:500), Alexa Fluor 568 kozia anty-mysia IgG (1:500). Przeciwbarwienie jąder za pomocą 4′-6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI).
  10. Umyć próbki PBS przez 10 minut na wytrząsarce. Powtórz to jeszcze dwa razy.
  11. Zamontuj sekcje mózgu na szkiełkach, dodaj odpowiednią ilość środka mocującego zapobiegającego blaknięciu (około 100-150 μL) i przykryj wysokiej jakości szkłem nakrywkowym. Uszczelnij lakierem do paznokci.
  12. Rób zdjęcia za pomocą zwykłego lub konfokalnego mikroskopu fluorescencyjnego.

5. Izolacja genomowego DNA

  1. Poddaj eutanazji dorosłą mysz C57 BL/6J (samca lub samicy) przez zwichnięcie szyjki macicy i usuń mózg.
  2. Wypreparuj tkanki hipokampa, kory i móżdżku na naczyniu chłodzonym lodem. Zmielić tkanki za pomocą młynka do tkanek w 1 ml buforu do lizy DNA i przenieść do czystej probówki do mikrowirówki. Dodać 250 μg proteinazy K na 600 μl buforu do lizy. W przypadku granulek komórkowych bezpośrednio dodaj bufor do lizy, proteinazę K i dokładnie wymieszaj.
    nuta: Przygotuj bufor do lizy DNA: 5 mM EDTA, 0,2% SDS, 200 mM NaCl w 100 mM Tris-HCl, pH 8,5. Umyj i autoklaw młynek do tkanek przed eksperymentem.
  3. Drugiego dnia dodawać około 50 μg RNazy A na próbkę przez co najmniej 12 godzin w temperaturze 37 °C.
  4. Dodać równą objętość alkoholu fenolo-chloroformowego:izoamylowego (25:24:1) i całkowicie wymieszać.
  5. Wirować przy 20,817 x g przez 15 minut i usunąć supernatant do nowej probówki do mikrowirówki.
  6. Dodać 600 μl chloroformu do supernatantu w celu wytrącenia DNA i dokładnie wymieszać.
  7. Wirować przy 20,817 x g przez 15 minut i usunąć supernatant do innej nowej probówki.
  8. Dodać 500 μl izopropanolu do supernatantu i dokładnie wymieszać.
  9. Wirować przy 20,817 x g przez 15 minut i całkowicie usunąć supernatant.
  10. Przepłukać osad 1 ml 70% etanolu, odwirować przy 20,817 x g przez 1 minutę i całkowicie usunąć sklarowany osad. Powtórz raz.
  11. Całkowicie wysuszyć osad DNA.
  12. Rozpuść osad DNA w buforze Tris-HCl (pH 8,5) do odpowiedniego stężenia.

6. Plama punktowa DNA

  1. Przygotować roztwory: 2 M NaOH, bufor Tris-HCl (pH 8,5), 6x sól fizjologiczna z cytrynianu sodu (SSC).
  2. Sporządza się mieszaninę próbek zgodnie z tabelą 1.
  3. Denaturować próbki DNA w temperaturze 100 °C przez 10 minut i schłodzić na lodzie.
  4. Przytnij odpowiedni rozmiar membrany nylonowej (np. Hybond-N+) i spłucz 6x SSC.
  5. Umieść membranę na aparacie dot-blot i podłącz do pompy próżniowej. Umieścić 6 μl mieszaniny na punkt na membranie.
  6. Hybrydyzować przez 30 minut w temperaturze 80 °C i zablokować błonę próbki mlekiem beztłuszczowym w soli fizjologicznej buforowanej tris (TBS) na 1 godzinę.
  7. Inkubować z przeciwciałem pierwszorzędowym w temperaturze 4 °C przez noc.
    UWAGA: następujące przeciwciało pierwszorzędowe: poliklonalna królicza anty-5-hydroksymetylocytozyna (1:5 000).
  8. Drugiego dnia inkubować błony próbki w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Myć TBS przez 10 minut. Powtórzyć to płukanie jeszcze dwa razy.
  9. Inkubować błonę z przeciwciałem drugorzędowym przeciwko królikowi (1:5 000) przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  10. Myć TBS przez 10 min. Powtórzyć to pranie jeszcze dwa razy.
  11. Wizualizacja sygnałów chemiluminescencyjnych i ilościowe określenie intensywności sygnału.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby ukazać rozmieszczenie 5-hmC w hipokampie dorosłych myszy, przeprowadziliśmy immunofluorescencję z przeciwciałami przeciwko komórkom neuronalnym (NeuN) oraz 5-hmC. W hipokampie 5-hmC wykazywało wyraźną kolokalizację z markerem komórek neuronalnych NeuN (Rycina 1A-H), co sugeruje wzbogacenie 5-hmC w neuronach.

Aby określić dynamikę 5-hmC podczas rozwoju neuronalnego, w pierwszej kolejności przeprowadzono analizę dot-blot z próbkami DNA wyizolowa...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Modyfikacje epigenetyczne odgrywają istotną rolę podczas rozwoju, dojrzewania i funkcjonowania mózgu. Jako stabilny marker modyfikacji DNA, dynamiczny 5-hmC reaguje na adaptację behawioralną, aktywność neuronalną i jest dodatnio skorelowany z ekspresją genów; W związku z tym bierze udział w prawidłowym funkcjonowaniu mózgu i zaburzeniach neurologicznych4. Aby zbadać jego funkcję w komórkach i tkankach, konieczne jest wykrycie obecności 5-hmC i porównanie poziomu przed i po leczeniu. Tutaj zademons...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie istnieją konkurencyjne interesy finansowe.

Podziękowania

XL był częściowo wspierany przez Narodowy Kluczowy Program Badawczo-Rozwojowy Chin (2017YFE0196600) oraz Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (Grant nr 31771395, 31571518). Q.S. był wspierany przez Narodowy Kluczowy Program Badawczo-Rozwojowy Chin (2017YFC1001703) oraz Kluczowy Program Badawczo-Rozwojowy Prowincji Zhejiang (2017C03009). W.X. był wspierany przez Fundację Nauk Przyrodniczych prowincji Zhejiang (LY18H020002) oraz Departament Technologii Naukowych Prowincja Zhejiang (2017C37057).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
4'-6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI)Sigma-AldrichD8417
Oprogramowanie Adobe PhotoshopAdobe Inc./
Alexa Fluor 488 kozia anty-królicza IgGThermo FisherA11008
Alexa Fluor 568 kozia anty-mysia IgGThermo FisherA11001
anty-5-hydroksymetylocytozynaAktywny motyw39769
anty-NeuNMilliporeMAB377
B27 suplementGibco12587-010
B27 suplementGibco12580-010
B27 suplementGibco17504-044
Mikrotom kriostatuLeicaCM1950
DMEM/F-12 mediumOmegaScientificDM25
Naskórkowy czynnik wzrostuPeproTech100-15
Czynnik wzrostu fibroblastów-podstawowyPeproTech100-18B
ForskolinaSigma-AldrichF6886
GlutaMaxThermo35050061
L-GlutaminaGibco25030-149
Podłoże neuropodstawoweGibco21103-049
Normalna surowica koziaVector LaboratoriesZ0325
Membrana nylonowa (Hybond™-N+ )Amersham Biosciences
PAŹLeica14020108926
Pen StrepGibco15140-122
Fenol: chloroform: alkohol izoamylowy (25: 24:1 )Sigma-Aldrich516726
Poli-D-LizynaSigmaP0899-10
Proteinaza KVVR39450-01-6
KwasretinowySigma-AldrichR2625
Triton X-100SolarbioT8210
RPN303B

Bibliografia

  1. Tan, L., Shi, Y. G. Tet family proteins and 5-hydroxymethylcytosine in development and disease. Development. 139 (11), 1895-1902 (2012).
  2. Yao, B., et al. Epigenetic mechanisms in neurogenesis. Nature Reviews Neuroscience. 17 (9), 537-549 (2016).
  3. Day, J. J., Sweatt, J. D. DNA methylation and memory formation. Nature Neuroscience. 13 (11), 1319-1323 (2010).
  4. Wu, X. J., Zhang, Y. TET-mediated active DNA demethylation: mechanism, function and beyond. Nature Reviews Genetics. 18 (9), 517-534 (2017).
  5. Sun, W. J., Guan, M. X., Li, X. K. 5-Hydroxymethylcytosine-Mediated DNA Demethylation in Stem Cells and Development. Stem Cells and Development. 23 (9), 923-930 (2014).
  6. Li, S., Mason, C. E. The pivotal regulatory landscape of RNA modifications. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 15, 127-150 (2014).
  7. Hwang, J. Y., Aromolaran, K. A., Zukin, R. S. The emerging field of epigenetics in neurodegeneration and neuroprotection. Nature Reviews Neuroscience. 18 (6), 347-361 (2017).
  8. Kriaucionis, S., Heintz, N. The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain. Science. 324 (5929), 929-930 (2009).
  9. Tahiliani, M., et al. Conversion of 5-Methylcytosine to 5-Hydroxymethylcytosine in Mammalian DNA by MLL Partner TET1. Science. 324 (5929), 930-935 (2009).
  10. Guo, J. U., et al. Neuronal activity modifies the DNA methylation landscape in the adult brain. Nature Neuroscience. 14 (10), 1345-1351 (2011).
  11. Feng, J., et al. Dnmt1 and Dnmt3a maintain DNA methylation and regulate synaptic function in adult forebrain neurons. Nature Neuroscience. 13 (4), 423-430 (2010).
  12. Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nature Geneticset. , Suppl 33. 245-254 (2003).
  13. Szulwach, K. E., et al. 5-hmC-mediated epigenetic dynamics during postnatal neurodevelopment and aging. Nature Neuroscience. 14 (12), (2011).
  14. Song, C. X., et al. Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine. Nature Biotechnology. 29 (1), 68-72 (2011).
  15. Shu, L. Q., et al. Genome-wide alteration of 5-hydroxymenthylcytosine in a mouse model of Alzheimer's disease. BMC Genomics. 17, (2016).
  16. Cruvinel, E., et al. Reactivation of maternal SNORD116 cluster via SETDB1 knockdown in Prader-Willi syndrome iPSCs. Human molecular genetics. 23 (17), 4674-4685 (2014).
  17. Bernstein, A. I., et al. 5-Hydroxymethylation-associated epigenetic modifiers of Alzheimer's disease modulate Tau-induced neurotoxicity. Human Molecular Genetics. 25 (12), 2437-2450 (2016).
  18. Wang, F. L., et al. Genome-wide loss of 5-hmC is a novel epigenetic feature of Huntingtons disease. Human Molecular Genetics. 22 (18), 3641-3653 (2013).
  19. Yu, H., et al. Tet3 regulates synaptic transmission and homeostatic plasticity via DNA oxidation and repair. Nature Neuroscience. 18 (6), 836-843 (2015).
  20. Wu, H., Zhang, Y. Reversing DNA methylation: mechanisms, genomics, and biological functions. Cell. 156 (1-2), 45-68 (2014).
  21. Lister, R., et al. Global epigenomic reconfiguration during mammalian brain development. Science. 341 (6146), 1237905(2013).
  22. Inoue, A., Zhang, Y. Replication-Dependent Loss of 5-Hydroxymethylcytosine in Mouse Preimplantation Embryos. Science. 334 (6053), 194(2011).
  23. Pastor, W. A., et al. Genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine in embryonic stem cells. Nature. 473 (7347), 394-397 (2011).
  24. Ito, S., et al. Role of Tet proteins in 5mC to 5hmC conversion, ES-cell self-renewal and inner cell mass specification. Nature. 466 (7310), (2010).
  25. Wang, T., et al. Genome-wide DNA hydroxymethylation changes are associated with neurodevelopmental genes in the developing human cerebellum. Human Molecular Genetics. 21 (26), 5500-5510 (2012).
  26. Song, C. X., et al. Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine. Nature Biotechnology. 29 (1), 68-72 (2011).
  27. Wang, T., et al. Subtelomeric hotspots of aberrant 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic modifications during reprogramming to pluripotency. Nature Cell Biology. 15 (6), 700-711 (2013).
  28. Li, X., et al. Ten-eleven translocation 2 interacts with forkhead box O3 and regulates adult neurogenesis. Nature Communications. 8, 15903(2017).
  29. Szulwach, K. E., et al. 5-hmC-mediated epigenetic dynamics during postnatal neurodevelopment and aging. Nature Neuroscience. 14 (12), 1607-1616 (2011).
  30. Tao, H., et al. The Dynamic DNA Demethylation during Postnatal Neuronal Development and Neural Stem Cell Differentiation. Stem Cells International. 2018, 2186301(2018).
  31. Li, X. K., et al. Ten-eleven translocation 2 interacts with forkhead box O3 and regulates adult neurogenesis. Nature Communications. 8, (2017).
  32. Li, X., et al. Epigenetic regulation of the stem cell mitogen Fgf-2 by Mbd1 in adult neural stem/progenitor cells. Journal of Biological Chemistry. 283 (41), 27644-27652 (2008).
  33. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature Protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Wykrywanie 5-hydroksymetylocytozynybarwienie immunofluorescencyjnedot-blot DNAtkanka mózgu myszysekcjonowanie tkanekmikrotom kriostatowyprzeciwciała pierwotneprzeciwciała wtórnemikroskopia konfokalna
Wykrywanie 5-hydroksymetylocytozyny w nerwowych komórkach macierzystych i mózgach myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.