Artykuł metodologiczny

Niezwykle szybkie i swoiste znakowanie metaboliczne RNA in vivo za pomocą 4-tiouracylu (Ers4tU)

13.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59952

⸱

22 sierpnia 2019

 , 
1Wellcome Centre for Cell Biology, School of Biological Sciences, University of Edinburgh

W tym artykule

Podsumowanie

Użycie tiolowanego uracylu do wrażliwego i specyficznego oczyszczania nowo przepisanego RNA z drożdży Saccharomyces cerevisiae.

Streszczenie

Analog nukleotydu, 4-tiouracyl (4tU), jest łatwo pobierany przez komórki i włączany do RNA podczas transkrypcji in vivo, co pozwala na izolację RNA wytworzonego podczas krótkiego okresu znakowania. Odbywa się to poprzez dołączenie ugrupowania biotyny do włączonej grupy tio i oczyszczanie powinowactwa za pomocą kulek pokrytych streptawidyną. Osiągnięcie dobrej wydajności czystego, nowo zsyntetyzowanego RNA, które jest wolne od istniejącego wcześniej RNA, umożliwia skrócenie czasu znakowania i pozwala na zwiększenie rozdzielczości czasowej w badaniach kinetycznych. Jest to protokół bardzo specyficznego, wysokowydajnego oczyszczania nowo zsyntetyzowanego RNA. Przedstawiony tutaj protokół opisuje, w jaki sposób RNA jest ekstrahowane z drożdży Saccharomyces cerevisiae. Jednak protokół oczyszczania tiolowanego RNA z całkowitego RNA powinien być skuteczny przy użyciu RNA z dowolnego organizmu po jego ekstrakcji z komórek. Oczyszczony RNA nadaje się do analizy za pomocą wielu powszechnie stosowanych technik, takich jak odwrotna transkryptaza-qPCR, RNA-seq i SLAM-seq. Specyficzność, czułość i elastyczność tej techniki pozwalają na niezrównany wgląd w metabolizm RNA.

Wprowadzenie

RNA ma dynamiczną naturę; wkrótce po jego wyprodukowaniu wiele RNA ulega szybkiemu przetwarzaniu i degradacji. Obecnie większość badań nad metabolizmem RNA analizuje całkowite komórkowe RNA, które jest w większości w pełni przetworzone i na poziomie stanu stacjonarnego. Poziom ten zależy od równowagi między szybkością transkrypcji, dojrzewania potranskrypcyjnego i degradacji. Analiza procesów prowadzących do równowagi w stanie ustalonym wymaga specjalistycznych technik wychwytywania bardzo krótkożyciowych gatunków RNA.

Metaboliczne znakowanie RNA analogami nukleotydów, takimi jak 4-tiouracyl (4tU) lub 4-tiourydyna (4sU) (zobacz Duffy et al.1 dla doskonałej recenzji), oferuje możliwość izolowania powstających RNA znakowanych tio i ich produktów pośrednich. Jednak opublikowane protokoły obejmują czas oznaczania wynoszący kilka minut2,3, co jest powolne w stosunku do szybkości produkcji wielu transkryptów. Transkrypcja przeciętnego genu drożdży trwa około jednej minuty, więc znakowanie RNA drożdży przez mniej niż jedną minutę można uznać za niezwykle krótkie. Niezwykle szybki i specyficzny protokół 4 tiouracylu (ers4tU) maksymalizuje stosunek sygnału do szumu, maksymalizując inkorporację 4tU i minimalizując odzyskiwanie nieznakowanego, wcześniej istniejącego RNA, umożliwiając bardzo krótkie czasy znakowania4.

Zmodyfikowana tio zasada musi zostać szybko zaimportowana do komórek w wystarczającej ilości, aby skutecznie oznaczyć nowo zsyntetyzowane RNA (nsRNA). Aby to umożliwić, komórki są hodowane w pożywce wolnej od uracylu, a ekspresja odpowiedniej przepuszczalności pomaga zwiększyć wychwyt 4tU lub 4sU (patrz Tabela 1 dla listy plazmidów, które zawierają odpowiednie geny przepuszczalności i Rysunek uzupełniający 1). Rozpuszczalność 4tU w wodorotlenku sodu pozwala uniknąć konieczności stosowania toksycznych rozpuszczalników organicznych wymaganych przez inne analogi nukleotydów. Niestety, zaobserwowano, że hodowla kultur przez długi czas z nukleozydami modyfikowanymi tio, w stężeniach większych niż 50 μM, zakłóca działanie rybosomów5. Jednak zastosowane tutaj stężenie (10 μM) i niezwykle krótki czas znakowania minimalizują szkodliwe skutki5 (Rysunek 1a), jednocześnie dając wystarczającą ilość RNA do analizy.

Ta technika może być połączona z szybkim i specyficznym wyczerpaniem docelowego białka za pośrednictwem auksyny6,7 (Rysunek 2), określany jako protokół "β-est AID 4U", w którym β-estradiolowa regulowana ekspresja systemu degronowego indukowanego auksyną (AID) jest połączona z znakowaniem 4tU. Dzięki β-najbardziej zaawansowanemu podejściu AID 4U, docelowe białko może zostać zubożone, a wpływ na metabolizm RNA ściśle monitorowany (Rysunek 2). Czas ma kluczowe znaczenie; Zaleca się obejrzenie załączonego filmu i zwrócenie szczególnej uwagi na Rysunek 2 i jego animowaną formę (patrz Rysunek Uzupełniający 2).

Przetwarzanie i degradacja RNA muszą zostać zatrzymane bardzo szybko, aby uzyskać dokładne rozwiązanie czasowe. Osiąga się to za pomocą metanolu w niskiej temperaturze, który bardzo szybko wiąże zawartość komórki i degraduje błonę komórkową, zachowując jednocześnie zawartość kwasu nukleinowego8. Ekstrakcja RNA powinna być wydajna i nie uszkadzać RNA. Liza mechaniczna jest skuteczna przy braku środków chaotropowych (często zawierają one grupy tioowe, dlatego należy ich unikać). Preferowane jest wytrącanie RNA chlorkiem litu, ponieważ tRNA są mniej efektywnie wytrącane. tRNA są szybko transkrybowane i naturalnie tiolowane9, więc usunięcie tRNA zmniejsza konkurencję dla odczynnika biotynylacji. Jeśli interesujące są małe, wysoce ustrukturyzowane RNA, zalecane są metody wytrącania RNA na bazie alkoholu.

Aby odzyskać tiolowane RNA, biotyna jest kowalencyjnie przyłączana przez grupy tio włączone do RNA za pomocą 4tU. Zaleca się stosowanie modyfikowanej biotyny, która przyłącza się za pomocą rozdrobnionego wiązania dwusiarczkowego (np. HPDP-biotyna (N-[6-(Biotinamido)hexyl]-3'-(2'-pyridyldithio)propionamid, ) lub MTS-biotyna (tiosulfonian metanu)) jest zalecana, ponieważ umożliwia uwalnianie RNA przez dodanie środka redukującego. Biotynylowane RNA jest oczyszczone powinowactwem do streptawidyny sprzężonej z kulkami magnetycznymi. Ten protokół jest podobny do innych wymienionych wcześniej10, ale został intensywnie zoptymalizowany w celu zmniejszenia tła.

Istnieją dwa rodzaje eksperymentów z etykietowaniem tiolowym, które można przeprowadzić, etykietowanie ciągłe i nieciągłe. Każdy z nich ma swoje zalety. W przypadku znakowania ciągłego 4tU dodaje się do hodowli i próbek pobieranych w regularnych odstępach czasu. Ten rodzaj eksperymentu pokazuje, w jaki sposób RNA jest przetwarzane i jak jego poziomy zmieniają się w czasie. Przykładami mogą być eksperymenty z mutantami i dzikimi oraz eksperyment z pogonią za pulsem. Eksperymenty pokazane na rysunku 3b,c są tego typu. W przypadku znakowania nieciągłego indukowana jest zmiana w systemie i monitorowane jest RNA. Po wywołaniu zmiany kultura musi zostać podzielona na kilka subkultur, a w określonych momentach każda z nich jest następnie znakowana tio przez krótki okres. Jednym z przykładów jest β-est AID 4U pokazany w Rysunek 27. Ten rodzaj eksperymentu jest szczególnie przydatny do monitorowania wpływu zmiany metabolicznej na przetwarzanie RNA (patrz Rysunek 3d).

Graficzna reprezentacja eksperymentu z etykietowaniem tio jest przedstawiona w Rysunek 4 i Rysunek 5, a arkusz kalkulacyjny, który znacznie upraszcza działanie protokołu, jest dostępny (zobacz eksperyment 4tU template.xlsx). Oprócz tego informacje uzupełniające zawierają obszerny przewodnik rozwiązywania problemów. Aby zapoznać się z najbardziej β protokołem AID 4U, który integruje znakowanie 4tU z protokołem depulacji auksyny, zobacz Rysunek 2 i Rysunek uzupełniający 2. Zobacz Barrass et al.7, aby zapoznać się ze szczegółowym protokołem wyczerpania AID.

Protokół

1. Wzrost i tioetykietowanie

UWAGA: Czas na ukończenie tej sekcji protokołu jest bardzo zmienny, w zależności od tempa wzrostu komórek. Odczekać 1 godzinę na przygotowanie roztworów i sprzętu przed etykietowaniem tioetykietowym i 30 minut po etykietowaniu na przetworzenie próbek.

  1. Upewnij się, że szczep S. cerevisiae zawiera plazmid kodujący przepuszczalność (Tabela 1) w celu zwiększenia importu 4tU do komórki.
    UWAGA: Bez importera etykietowanie trwające krócej niż 2 minuty prawdopodobnie nie zakończy się sukcesem11 (zob. rysunek uzupełniający 1). Włączenie 4tU jest bardziej wydajne, jeśli wzrost odbywa się w podłożu bez uracylu, więc szczep musi mieć URA3+; kilka plazmidów w Tabeli 1 zawiera URA3 jako marker. Jeśli protokół ten ma być połączony z β-est AID depletion7, wymagane są dodatkowe modyfikacje szczepu.
  2. Przygotować pożywkę wolną od uracylu YMM, dodając 6,9 g drożdżowej zasady azotowej bez aminokwasów, 20 g glukozy i 1,92 g SCSM single drop-ura (tabela materiałów) do 1 l wody. Autoklaw lub filtr sterylizują pożywkę wzrostową przed użyciem.
    UWAGA: Sterylizacja filtra jest preferowana, ponieważ kompleksy peptydowo-cukrowe wytwarzane w autoklawie współwytrącają się z komórkami w metanolu używanym do pobierania próbek.
  3. Drożdże hodować w podłożu wolnym od uracylu YMM do gęstości optycznej przy 600 nm (OD600) 0,6−0,8. Upewnij się, że kultura jest w fazie logarytmicznej wzrostu i trwa co najmniej dwa podwojenia. Zwykle zaleca się wzrost w temperaturze 30 °C, ale inne temperatury mogą być stosowane, na przykład dla odmian wrażliwych na temperaturę.
    UWAGA: W zależności od szczepu, warunków wzrostu i wydajności RNA, potrzebne będzie około 30 ml objętości próbki. Kwota ta będzie przyjmowana w całym protokole. 30 ml kultury to najwięcej, co zmieści się w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml z 20 ml metanolu, więc jest to wygodna objętość do rozpoczęcia optymalizacji. Rozważ użycie większej objętości próbki we wczesnych punktach czasowych, aby zwiększyć odzysk RNA, do 2000 ml zostało użyte dla wolniej rosnących komórek w naprawdę krótkich czasach znakowania (<1 min).
  4. Schłodzić około 50 ml H2O na lodzie. Do każdej próbki dodaj 200 μl kulek cyrkonu do probówki z nakrętką o pojemności 2 ml i schłodź na lodzie. Wlej również 20 ml metanolu (UWAGA) do probówek wirówkowych o pojemności 50 ml i umieść na suchym lodzie (UWAGA). Metanol powinien stanowić od 1/3 do 2/3 objętości próbki.
    UWAGA: Metanol jest toksyczny przez wdychanie, kontakt i spożycie. Dozuj duże ilości do dygestorium i załóż dwie pary rękawiczek, ponieważ metanol może przeniknąć przez nitrylowe rękawice laboratoryjne. Metanol jest wysoce łatwopalny, należy go trzymać z dala od wszelkich źródeł zapłonu.
    UWAGA: Ponieważ suchy lód może powodować zimne oparzenia w kontakcie i wytwarza gaz drażniący, podczas obsługi i użytkowania w dobrze wentylowanym pomieszczeniu należy używać rękawiczek.
    UWAGA: Dodawanie kulek w tym momencie jest łatwiejsze niż po dodaniu próbki, ponieważ rurka jest sucha, a podczas wirowania w dół granulki komórek kulki są również odkręcane z gwintu rurki, co pozwala zaoszczędzić trochę czasu. Dodatkowo pozwala to na ostygnięcie kulek przed dodaniem próbki.
  5. Jeśli do kultury ma zostać dodany kolec S. pombe (raczej niż później), rozmrozić podwielokrotność tiolicznych komórek S. pombe na lodzie i dokładnie wirować, co najmniej 30 s, a następnie dodać do kultury. Jeśli zostanie przygotowana zgodnie z poniższymi instrukcjami, jedna podwielokrotność S. pombe wystarcza na 400 ml kultury (wystarcza na dwanaście próbek po 30 ml plus niewiele, aby uwzględnić błędy w obchodzeniu się z nimi). Jeśli używana jest większa lub mniejsza kultura, dostosuj objętość S. pombe dodawanego do kultury.
    1. Wyhoduj 1 l kultury S. pombe do OD600 do 0,8 dokładnie tak, jak opisano w protokole dla S. cerevisiae.
    2. Etykieta tio-logiczna jak w kroku 1.7, ale przez 10 minut.
    3. Utrwal całą kulturę za pomocą 400 ml metanolu na suchym lodzie, zasadniczo zgodnie z opisem w kroku 1.9.
    4. Granulować komórki przez odwirowanie przy 3000 x g przez 3 min.
    5. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 3,3 mlH2O.
    6. Podzielić na podwielokrotności po 80 μl każdy. Przechowywać w temperaturze -80 °C.
    7. Użyć całej jednej podwielokrotności na 400 ml kultury lub 10 μl na 30 ml próbki.
      UWAGA: Zmniejsz objętość kolca do 1/10 w przypadku wykonywania RNAseq. Nie używaj ponownie podwielokrotności; Wyrzuć niewykorzystany kolec. Ten skok jest przydatny do normalizacji i porównywania wyników w różnych punktach czasowych i eksperymentach.
  6. W przypadku nieciągłego znakowania należy wywołać wymagane zaburzenia metaboliczne (np. warunki wzrostu, indukcję lub zubożenie genów, takie jak β-est AID7 (ryc. 2 i ryc. uzupełniający 2), a następnie podzielić kulturę. Upewnij się, że wszystkie kolby i podłoża mają wymaganą temperaturę i, jeśli to możliwe, napowietrz pożywkę przed dodaniem kultury.
  7. Dodać 4tU do kultury o stężeniu 10 μmM i energicznie wymieszać (1/10 000 objętości kultury 100 mM 4tU rozpuszczonej w 1 M NaOH). Etykieta tiolowa przez 15 s do 5 min.
    UWAGA: Trzydzieści sekund to dobry punkt wyjścia. Etykietowanie tio-etykietowania przez mniej niż 20 s daje bardziej zmienne wyniki ze względu na trudności w manipulowaniu kulturą pod presją czasu. Jednak znakowanie trwające dłużej niż 1 minutę zmniejsza rozdzielczość czasową techniki.
  8. Jeżeli ma być przeprowadzony eksperyment z pościgiem, należy pozwolić na znakowanie tioznakowe przez 20−30 s, a następnie przeprowadzić pościg, dodając 1/200 objętości kultury 1 M urydyny (nietiolowanej) do końcowego stężenia 5 mM.
    UWAGA: Urydyna jest lepsza niż uracyl do pościgu, ponieważ urydyna jest bardziej rozpuszczalna w wodzie, co pozwala na dodanie mniejszej objętości do kultury, a więc jest mniej zakłóceń we wzroście komórek.
  9. Próbki kultury należy pobierać w regularnych odstępach czasu (co najmniej 15 s) do końca upływu czasu. Krótsze odstępy między próbkami są trudne do niezawodnego wykonania. Dodać próbkę do metanolu na suchym lodzie przygotowanym w kroku 1.4. Dla wygody dodaj 30 ml kultury do 50 ml probówki zawierającej 20 ml metanolu.
    UWAGA: Dwutlenek węgla rozpuszcza się w metanolu na zimno; Wydobywa się on z roztworu po dodaniu próbki i energicznie pieni się po zmieszaniu, co powoduje utratę próbki. Aby tego uniknąć, należy schłodzić metanol do temperatury <-70 °C w szczelnie zamkniętej probówce, aż zbliży się do czasu, w którym jest potrzebny, a następnie przenieść do suchego lodu.
  10. Zamknij probówkę i dokładnie wymieszaj, wstrząsając. Umieścić próbki na lodzie. Sprawdzić, czy żadna z próbek nie zamarzła; Jeśli tak, delikatnie rozgrzej w dłoni, ciągle odwracając. Najlepiej zrobić to w dłoni, ponieważ można ocenić temperaturę próbki, zawsze powinna być zimna. Ułóż na lodzie. To nie jest punkt pauzy; Gdy cała próbka stanie się płynna, przejdź do następnego kroku.
  11. Wirować w temperaturze 3000 x g przez 2 minuty (w temperaturze 4 °C, jeśli to możliwe), aby otoczkować komórki. Odlej płyn i ponownie zawieś granulki w co najmniej 1 ml lodowatej wody, delikatnie pipetując w górę iw dół.
    UWAGA: Pozostałości metanolu w osadkach próbki ułatwiają ponowne wymieszanie.
  12. Przenieść do probówek z nakrętką o pojemności 2 ml, jak przygotowano w kroku 1.4. Krótko odwirować (np. 10 s łącznie) przy >13 000 x g, aby ponownie zagnieździć komórki, umieścić z powrotem na lodzie i usunąć płyn.
    UWAGA: Osad komórkowy można przechowywać w temperaturze od -70 do -80 °C przez kilka miesięcy.

2. Przygotowanie całkowitego RNA

UWAGA: Czas na ukończenie to 90 min.

  1. Stosować roztwory poddane działaniu pirowęglanu dietylu (DEPC), aby chronić RNA przed degradacją. Roztwory należy rozdzielać za pomocą końcówek do pipet filtrujących i przez cały czas nosić rękawice.
    1. Do roztworu dodać 1/1000 objętości DEPC i wymieszać energicznie wstrząsając.
    2. Pozostawić w temperaturze pokojowej (RT) na 24 godziny, a następnie przelać w autoklawie.
    3. Roztwory z grupami aminowymi (takimi jak tris) nie mogą być traktowane metodą DEPC. Porcjować proszek i przechowywać specjalnie do pracy z RNA. Użyj wcześniej nasączonego DEPC H2O, aby przygotować roztwór.
      UWAGA: Ponieważ grupa tio-grupa na RNA jest fotoaktywowana, od tego momentu zminimalizuj ekspozycję na światło UV. Przechowywanie powinno odbywać się w ciemności, a inkubację najlepiej wykonywać w maszynie do PCR z pokrywką.
  2. Jeśli kolec S. pombe ma zostać dodany do osadu komórkowego, a nie do kultury (nie rób obu), dodaj go teraz. Rozmrozić podwielokrotność tiolicznych komórek S. pombe na lodzie i dokładnie wirować, co najmniej 30 s, przed dodaniem do osadu.
    UWAGA: W przypadku przygotowania zgodnie z krokami 1.5.1−1.5.7, na jeden osad pochodzący z 30 ml kultury wymagane jest 10 μl podwielokrotności S. pombe.
  3. Przed założeniem nakrętki należy wirować bardzo krótko przez 1-2 s, aby upewnić się, że między nasadką a probówką nie zostały uwięzione kulki cyrkonu, co może spowodować wyciek próbki i fenolu z probówki.
  4. Ponownie zawiesić komórki w 400 μl buforu octanowego EDTA (AE) (50 mM octanu sodu pH 5,3, 10 mM EDTA pH 8,0), energicznie wirując. Dodać 40 μl 10% (w/v) dodecylosiarczanu sodu (SDS). Nie wiruj, ponieważ SDS będzie się pienić.
  5. Jeśli ma być stosowany protokół β-est AID 4U, należy pobrać 40 μl zawiesiny komórkowej do analizy białek7. Dodaj 40 μl AE, aby objętość wróciła do 400 μl.
  6. Dodaj 800 μl fenolu (UWAGA) o niskim pH i wiruj przez 10 s.
    UWAGA: Fenol jest toksyczny i przez wdychanie i kontakt. Zawsze wykonuj zabiegi z użyciem fenolu w dygestoriach i noś dwie pary rękawiczek.
  7. Poddaj ogniwa lizie w homogenizatorze (np. Tabela materiałów) przez trzy 2-minutowe serie przy najniższym ustawieniu mocy. Pozostawić próbki na lodzie na 2 minuty między impulsami homogenizacji.
    UWAGA: Zoptymalizuj warunki, jeśli używasz innych homogenizatorów. Niewystarczające wytrząsanie spowoduje słabą wydajność, podczas gdy nadmierne wytrząsanie powoduje pozornie wyższą wydajność, jak określono na podstawie absorbancji przy 260 nm (A260), ale RNA może ulec degradacji. Preferowany jest homogenizator, ale można zastosować oczyszczanie gorącego fenolu RNA12.
  8. Umieść zlizowaną próbkę na suchym lodzie na 5 minut, aż zastygnie, co zmniejsza przenoszenie genomowego DNA do RNA. Nie zamrażaj zbyt długo, ponieważ próbka nie ulegnie rozmrożeniu. Wirowanie przez 5 minut w mikrofuge przy >13 000 x g przy RT; nie ulegaj pokusie, aby robić to w temperaturze 4 °C, ponieważ mieszanina próbki i fenolu pozostanie stała przez cały czas wirowania, jeśli zostanie wykonana w niskiej temperaturze.
    UWAGA: Jeśli próbka jest nadal zamrożona pod koniec wirowania, wiruj ponownie przez kolejne 5 minut, aż próbka całkowicie się rozmrozi.
  9. Ekstrakt fenolu/chloroformu, następnie ekstrakt chloroformowy o równej objętości (około 600 μl) fenolu: chloroform 5:1, a następnie chloroform (UWAGA). Przenieść górną fazę do innej probówki zawierającej fenol:chloroform 5:1 lub chloroform. Wiruj, a następnie wiruj przez 5 minut w mikrofuge w temperaturze RT. Następnie przenieś górną fazę do nowej probówki o pojemności 1,5 ml.
    UWAGA: Chloroform jest toksyczny przez drogi oddechowe i kontakt. Zawsze wykonuj zabiegi z użyciem chloroformu w dygestoriach i noś dwie pary rękawiczek.
  10. Dodać jedną trzecią do połowy objętości (około 300 μl) 10 M LiCl i wymieszać w celu wytrącenia RNA. Próbka powinna natychmiast zmętnieć, ale pozostawić na co najmniej 10 minut na lodzie lub w temperaturze 4 °C (nie przechowywać w temperaturze poniżej -20 °C, ponieważ spowoduje to zamarznięcie) lub do momentu, gdy osad się opadnie.
  11. Wirować przez 5 minut w temperaturze 13 000 x g w > w mikrofuge. Usuń płyn, krótko ponownie odwiruj i usuń osady. Umyj granulat 300−500 μl 70% etanolu, krótko odwiruj i usuń pozostały etanol.
    UWAGA: Podczas tych prań trzymaj pellet po tej samej stronie tuby, co przy pierwszym zakręceniu, w ten sposób pellet nie będzie się poruszał i pękał; jeśli się rozpadnie, część RNA może zostać przypadkowo utracona.
    UWAGA: Nie suszyć pelletu; Dopóki większość płynu zostanie usunięta, nie będzie on przeszkadzał w kolejnych krokach. Na tym etapie RNA może być również przechowywane w temperaturze -20 °C przez kilka miesięcy lub od -70 do -80 °C w przypadku długotrwałego przechowywania.
  12. Ponownie rozpuść osad RNA w 90 μl TE pH 7,0 (10 mM Tris HCl pH 7,0, 1 mM EDTA pH 8,0) poprzez ogrzewanie w temperaturze 65 °C z wytrząsaniem, ponieważ osad RNA może być trudny do ponownego rozpuszczenia. Nie może to trwać dłużej niż 5 minut, ponieważ RNA ulega degradacji w wyższych temperaturach. Sprawdź, czy RNA jest w pełni rozpuszczone, a następnie przenieś do probówki o pojemności 0,2 ml. Pipetować próbkę w górę i w dół; Nie powinno być żadnych "grudek", a płyn powinien płynnie unosić się i opadać w końcówce. Ten roztwór jest lepki, więc końcowy ruch pipetowania powinien być powolny.
    UWAGA: Na tym etapie RNA może być przechowywane w temperaturze -20 °C w ciemności; może to być również korzystne dla rozpuszczalności RNA.

3. Biotynylacja

UWAGA: Czas na ukończenie to 60 min. Poniższe kroki są wygodnie wykonywane w pasku tubek ze zintegrowanymi nasadkami, ponieważ mają one mniejszą tendencję do otwierania się podczas wirowania niż paski z oddzielnymi nasadkami.

  1. Biotynyl poprzez dodanie 10 μl (1/10 końcowej objętości) 5 mM roztworu HPDP-biotyny (MTS-biotyna może być stosowana dokładnie w taki sam sposób jak HPDP-biotyna) do RNA i dokładnie wymieszać. Przed dodaniem biotyny należy podgrzać RNA nie dłużej niż kilka sekund w temperaturze 65 °C. Inkubować w temperaturze 65 °C przez 15 minut do maksymalnie 30 minut w ciemności.
    UWAGA: To ogrzewanie jest wymagane, ponieważ niektóre partie HPDP wytrącają się w temperaturze pokojowej w próbce RNA. Blok PCR z podgrzewaną pokrywką jest do tego idealny.
  2. Przygotuj małą objętość żywicy, kolumnę wykluczającą rozmiar (tabela materiałów), aby wykluczyć niewłączoną biotynę. Usuń dolną etykietę kolumny i poluzuj nakrętkę, umieść w probówce wirówkowej o pojemności 2 ml. Wirować przy 1500 x g przez 1 minutę, aby wypłukać bufor Dodaj delikatnie 0,3 ml TE na górę kolumny i ponownie odwiruj. Powtórz pranie i odwiruj jeszcze dwa razy, w sumie 3 prania. Na koniec przenieś umytą kolumnę do świeżej probówki o pojemności 1,5 ml.
  3. Po zakończeniu inkubacji próbki (krok 3.1) dodać próbkę na górze kolumny. Wirować z prędkością 1500 x g przez 2 min. Biotynylowana próbka RNA znajduje się teraz na dnie probówki.
    UWAGA: 1-minutowe wirowanie nie wystarcza do wymycia całej próbki.
  4. Dodać trzecią do połowy objętości (około 40 μl) 10 M LiCl, wymieszać w celu ponownego wytrącenia RNA zgodnie z krokiem 2.10. Próbka powinna natychmiast zmętnieć, ale pozostawić na co najmniej 5 minut na lodzie lub w temperaturze 4 °C lub do momentu, gdy osad się opadnie; nie przechowywać w temperaturze poniżej -20 °C, ponieważ może zamarznąć. Odwirować próbkę przez 5 minut przy >13 000 x g w mikrofudze.
  5. Myć 80% etanolem, ≤1 h na zmianach. Postępuj zgodnie z procedurą opisaną w kroku 2.11, aby usunąć jak najwięcej płynu.
    UWAGA: Ponieważ HPDP-biotyna jest bardzo dobrze rozpuszczalna w 80% etanolu, jest to dodatkowy etap oczyszczania.
  6. Powtórz płukanie 80% etanolem, aby usunąć jak najwięcej niewbudowanej biotyny.
    UWAGA: Na tym etapie RNA może być również przechowywane w temperaturze -20 °C w ciemności.

4. Oczyszczanie nowo zsyntetyzowanego RNA

UWAGA: Czas na ukończenie to 2 godziny.

  1. Ponownie rozpuścić RNA w 200 μlH2Opoddanego działaniu DEPC (można zastosować inkubację w temperaturze 65 °C, podobnie jak w kroku 2.12).
  2. Zmierzyć stężenie RNA w A260 za pomocą spektrofotometru; próbka może wymagać rozcieńczenia w stosunku 1:10, aby znalazła się w zakresie liniowym spektrofotometru. Wirować to rozcieńczenie przez co najmniej 10 s, aby upewnić się, że lepki RNA jest równomiernie rozpuszczony.
    UWAGA: W razie potrzeby skuteczność biotynylacji można ocenić za pomocą kropki13.
  3. Dodać równe ilości RNA do świeżej probówki i uzupełnić do 200 μl w H2O poddanym działaniu DEPC. Należy użyć całej próbki o najniższym stężeniu RNA i użyć odpowiedniej objętości pozostałych próbek, aby uzyskać podobną ilość RNA dla każdej.
    UWAGA: Arkusz kalkulacyjny 4tU eksperyment template.xlsx zawiera formularz ułatwiający te obliczenia.
  4. Gdy próbka znajduje się w temperaturze pokojowej, dodać 25 μl 10 x bufor NaTM (0,1 M Tris HCl pH 7,0, 2 M NaCl, 250 mM MgCl2), 25 μl 1 M NaPi pH 6,8 (0,5 M NaH2PO4 0,5 M Na2HPO4) i 2,5 μl 10% SDS. Dokładnie wymieszaj i delikatnie odwiruj (<30 s; około 100 x g).
    UWAGA: Aby uniknąć wytrącania się kart charakterystyki i soli, próbki muszą być przechowywane w temperaturze pokojowej przez cały czas wykonywania następujących procedur, aż do kroku 4.13.
  5. Przygotuj bufor perełkowy zawierający 1x bufor NaTM, 0,1 M NaPi i 0,1% SDS, 2 ml na próbkę. Najpierw dodaj wymaganą ilośćH2O, a na końcu SDS. Za każdym razem musi być ona świeża, ponieważ po 24 h.
    tworzy się osad UWAGA: Aby uniknąć tworzenia się osadów, bufor kulki musi być utrzymywany w temperaturze RT podczas wykonywania poniższych procedur. Nie stosować DEPC ani autoklawu.
  6. Dodaj 50 μl kulek streptawidyny do probówki o niskiej retencji 1,5 ml. Umieść rurkę na stojaku magnetycznym, poczekaj, aż koraliki opadną, a następnie usuń płyn
  7. Umyj kulki streptawidyny.
    1. Dodać 200 μl buforu do kulek i wirować, aż granulka kulki zostanie całkowicie zawieszona. Zwykle wymagane jest 3-5 s. W przypadku płukania przed dodaniem próbki RNA wystarczy obrócić probówki tak, aby kulki przemieszczały się w poprzek probówki na drugą stronę. Następnie odwróć rurki z powrotem na pierwotną stronę, aby koraliki ponownie przesunęły się po rurce.
    2. Kręć rurkę z niską prędkością (około 100 x g) przez maksymalnie 5 sekund, aby odwirować płyn, ale nie kulki.
    3. Umieść w stojaku magnetycznym, aby koraliki mogły zostać uchwycone przez magnes.
    4. Usunąć płyn przez zasysanie dla niewielkiej liczby próbek; odlewać płyn, jeśli jest wiele próbek.
      UWAGA: Przy dużej liczbie próbek usunięcie całego płynu wyłącznie przez aspirację może być problematyczne, ponieważ kulki w pierwszej próbce mogą zostać wysuszone przed zakończeniem ostatniej próbki, co zwiększa tło. Mycie można przyspieszyć, wylewając płyn ze wszystkich próbek naraz na magnesie. Przed wylaniem należy je pozostawić trochę dłużej na magnesie, a niewielką ilość pozostałego płynu należy odessać, ale ogólnie oznacza to mniej czasu na magnesie i bez płynu. W ten sposób możliwe jest szybkie wykonanie 24 lub więcej ekstrakcji.
  8. Blok z 200 μl buforem kulkowym, 10 μl 20 mg/ml glikogenu i 2,5 μl 5 mg/ml tRNA, 20 min obracając się od końca do końca z umiarkowaną prędkością przy RT. Rotacja ma na celu utrzymanie koralików w zawieszeniu. Po zakończeniu blokowania usuń płyn zgodnie z krokami 4.7.2−4.7.4 i ponownie umyj, jak opisano w rozdziale 4.7.
  9. Ponownie zawieś koraliki w próbce. Inkubować w temperaturze pokojowej z rotacją przez 30 minut.
  10. Podczas inkubacji należy przygotować świeżą probówkę o pojemności 1,5 ml dla każdej próbki. Dodać 1/10 objętości (około 10 μl) 3 M octanu sodu o pH 5,3 i 20 μg glikogenu i wirować w temperaturze około 100 x g przez 3 s. Przechowuj w stojaku, aż będzie potrzebny.
  11. Usuń niezwiązany RNA z kulek, wykonując kroki 4.7.2−4.7.4. Niezwiązane RNA można wytrzymać w świeżej probówce, ale sole i SDS bardzo utrudniają jego oczyszczenie. Następnie umyć kulki, zgodnie z sekcją 4.7 z wirowaniem, co najmniej 3 do maksimum 5 razy.
  12. Po ostatnim płukaniu należy zachować szczególną ostrożność, aby zassać cały płyn; powrócić do każdej probówki i ponownie zassać resztki buforu.
  13. Aby wymyć RNA, dodać 50 μl świeżo przygotowanego 0,7 M β-merkaptoetanolu (βME) do kulek (rozcieńczenie 1:20 dostarczonego w handlu roztworu podstawowego). Wirować i obracać krótko, jak w krokach 4.7.1 i 4.7.2. Umieścić zawiesinę w stojaku magnetycznym i odpipetować roztwór zawierający RNA do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml przygotowanej w kroku 4.10.
  14. Eluować ponownie w kroku 4.13 w celu odzyskania resztkowego RNA z kulek i dodać eluowaną próbkę do probówki zawierającej pierwszą elucję z tych kulek.
  15. Usuń resztki kulek z eluowanego RNA, umieszczając próbkę z powrotem w stojaku magnetycznym i przenosząc płyn do świeżej, słabo wiążącej probówki wirówkowej o pojemności 0,5 ml.
  16. Wymieszać próbkę, a następnie wytrącić nsRNA, dodając 2,5 razy większą objętość (280 μl) etanolu i ponownie wymieszać. Pozostawić na 1 godzinę do nocy w temperaturze -20 °C. Wirować w schłodzonej wirówce (4 °C) przez 20 minut z maksymalną prędkością (co najmniej 13 000 x g).
  17. Dokładnie umyć 200 μl 70% etanolu w temperaturze -20 °C. Ponieważ resztkowe βME będą hamować dalsze zastosowania, wiruj na każdym kroku, aby usunąć jak najwięcej osadów; na końcu próbka nie powinna pachnieć βME.
  18. Ponownie rozpuścić się w 10−20 μl 1x TE poddanego działaniu DEPC z równoważnikiem 0,005 μl inhibitora RNazy.
    UWAGA: Wszystkie kolejne etapy powinny być wykonywane na lodzie.
  19. Zmierz stężenie i czystość RNA.
    1. Zmierzyć A260 i A225 w spektrofotometrze o małej objętości próbki.
      UWAGA: Maksimum absorbancji bliskie λ = 225 nm wynika z nieuniknionego zanieczyszczenia z kulek. W przypadku braku RNA sygnał od zanieczyszczenia spada do 35% przy λ = 260 nm. Dlatego rzeczywistą ilość RNA przybliża wzór: (A260-(A225*0,35))*40 ng / μL.
    2. Alternatywnie można przeanalizować próbkę w systemie elektroforezy mikroprzepływowej, takim jak bioanalizator.
      UWAGA: Ta analiza jest lepsza niż użycie spektrofotometru, ponieważ można ocenić integralność RNA, zanieczyszczenie nie zakłóca oceny ilościowej i wymagana jest mniejsza próbka.
  20. Analizuj nsRNA.
    UWAGA: Na przykład specyficzne RNA można określić ilościowo za pomocą standardowych technik qPCR z odwrotną transkryptazą. Tak przygotowane RNA jest kompatybilne z przygotowaniem biblioteki do sekwencjonowania RNA. Usunięcie rRNA nie jest konieczne w przypadku czasu znakowania krótszego niż 5 minut. Na tym RNA można również wykonać kodowanie SLAMseq14.

Wyniki

Typowe wydajności nsRNA odzyskanego przy użyciu tego protokołu ers4tU przedstawiono na Rysunku 1b; dane te zostały uzyskane za pomocą bioanalizatora, a wykres przedstawia wydajność RNA w zależności od wielkości (nukleotydy [nt]). Należy zauważyć, zarówno na zapisie z bioanalizatora, jak i na wykresie wstawkowym, że odzysk RNA z punktu czasowego 0 stanowi bardzo niewielką część ilości odzyskanej z późniejszych punktów czasowych – około 0,3 µg RNA odzyskanego z około 109 komórek w porównaniu z ponad dwukrotnie większą ilością po zaledwie 30 s znakowania (0,8 µg nsRNA) z tej samej liczby komórek. Odzysk RNA w 15 s jest bardziej zmienny, ponieważ niewielkie różnice w przeprowadzaniu pobierania próbek mają proporcjonalnie większy wpływ na odzysk RNA. Na zapisie z bioanalizatora prekursory rRNA są widoczne jako piki w pobliżu 1000 nt oraz dublet pików w zakresie 1700−1800 nt. Obfitość tych produktów pośrednich wzrasta w miarę trwania tiolacji.

Do ilościowego oznaczenia splicingu transkryptu ACT1 wykorzystano znakowanie tiolowe (Rysunek 3). Przeprowadzono tiolowanie i pobierano próbki w odstępach 15 s od rozpoczęcia znakowania tiolowego, monitorując przetwarzanie RNA ACT1 (Rysunek 3a,b). Jak widać, pre-mRNA (poprzez transkrypcję) oraz struktury lasso (poprzez pierwszy etap splicingu pre-mRNA) powstają już po zaledwie 15 s znakowania. Po około 45 s do 1 min ilości struktur lasso i pre-mRNA osiągają stan równowagi, w którym ilość tych form RNA wytwarzanych w procesie transkrypcji jest równa ilości przetwarzanej w wyniku splicingu.

Aby uzyskać dane przedstawione na Ryc. 3c, szczep poddano impulsowi 4tU przez 25 s, a następnie zastosowano wymywanie urydyną. Generowanie pre-mRNA i lariatu osiąga maksimum w 1 minucie. Wynik ten jest zgodny z Ryc. 3b; maksimum zostało osiągnięte po 45 s potrzebnych do osiągnięcia stanu równowagi oraz po 25 s znakowania. Po osiągnięciu szczytu poziomy spadają, gdy znakowane tio-RNA są usuwane w procesie splicingu.

Rycina 3d przedstawia deplecję czynnika splicingu białkowego i jej wpływ na metabolizm RNA z wykorzystaniem systemu β-est AID 4U6,7. W tym przypadku poziom białka Prp16p zostaje zredukowany z poziomu bliskiego fizjologicznemu do 5% tej wartości po 25 min deplekcji. Prp16p jest niezbędnym czynnikiem splicingu dla drugiego etapu splicingu15. Lariaty są usuwane podczas drugiego etapu splicingu (Rycina 3a), jednak w tym przypadku ich poziom wzrasta powyżej poziomu pre-mRNA w miarę, jak Prp16 staje się czynnikiem limitującym. W późniejszych odstępach czasu deplekcji, w wyniku efektów wtórnych, czynnikiem limitującym stają się inne białka, co prowadzi do spadku poziomu lariatów i wzrostu poziomu pre-mRNA. Poziom splicingowanego mRNA ulega obniżeniu.

Wpływ 4tU na wzrost drożdży; wykres słupkowy, wykres odzysku nsRNA w funkcji czasu tiolacji; analiza spektroskopowa.
Rycina 1: Wzrost w obecności 4tU i odzysk RNA. (a) 4-tiouracyl wpływa na wzrost. Zwiększenie stężenia 4tU w pożywce wzrostowej YMM drop-out bez uracylu zwiększa czas podwojenia liczby komórek S. cerevisiae (BY4741) niosących plazmid p4FuiΔPEST. Wzrost czterech kultur powtórzonych monitorowano w temperaturze 30 °C w urządzeniu Tecan Infinite Pro 200. Wszystkie kultury znajdowały się przez cały czas w fazie logarytmicznej, z OD600 w zakresie od 0,1 do 0,6. Mock to kultura kontrolna z dodatkiem równoważnej ilości NaOH, co samo w sobie nie zmienia tempa wzrostu. Wykres ten pokazuje, że znakowanie tiolowe stanowi kompromis pomiędzy szybkim znakowaniem a uszkodzeniem komórki. Słupki błędów przedstawiają błąd standardowy dla 4 powtórzeń. (b) Wydajność nsRNA rośnie liniowo od około 15 s znakowania. Główna rycina przedstawia ślady z bioanalizatora dla oczyszczonego nsRNA od 0 (nieznakowanego) do 2 min po dodaniu 4tU w odstępach 15 s. Należy zauważyć, że próbka z 15 s nie jest pokazana, ponieważ była nieodróżnialna od próbki nieznakowanej. Dwa duże piki odpowiadają rybosomalnym RNA (rRNAs). Prekursory i produkty pośrednie rRNA są widoczne jako kilka pików o większej masie cząsteczkowej niż dojrzałe rRNAs. Odzysk tych prekursorów i produktów pośrednich zwiększa się z czasem. Przedstawiono wyniki z jednego reprezentatywnego eksperymentu. Wykres wstawkowy pokazuje odzysk nsRNA wraz z wydłużeniem inkubacji z 4tU. Wydajność nsRNA rośnie wraz ze wzrostem czasu hodowli z 4tU. Odzysk jest niezwykle liniowy (R2 = 0,934) w całym przedziale czasowym tego eksperymentu i wykazuje niewielki wzrost ponad poziom tła nawet przy 15 s znakowania 4tU, mimo że na śladzie z bioanalizatora nie jest on odróżnialny od próbki nieznakowanej. Słupki błędów przedstawiają błąd standardowy dla trzech powtórzeń biologicznych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat procesu eksperymentalnego równowagi statycznej; przedstawia metodę hodowli z użyciem β-estradiolu, auksyny i 4tU.
Rysunek 2: Protokół graficzny β-est AID 4U β-est AID 4U. Graficzne podsumowanie protokołu β-est AID 4U. β-estradiol (β-est) promuje ekspresję systemu degronu indukowanego auksyną (AID), który z kolei powoduje usunięcie białka docelowego znakowanego AID*, szczegółowy protokół znajduje się u Barrass et al.7. W tym przypadku ekspresja systemu degronu jest inicjowana 25 min przed rozpoczęciem degradacji białka, a tiolacja w każdym punkcie czasowym trwa 1 min. Próbki są pobierane przed indukcją oraz co 2 minuty podczas procesu usuwania białek. Wersja animowana znajduje się w Rysunku dodatkowym 2. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat procesu splicingu RNA z wykresami przedstawiającymi poziomy prekursora RNA ACT1, produktów pośrednich i końcowych.
Rysunek 3: Prekursory i produkty pośrednie splicingu RNA ACT1. Splicing transkryptów pre-mRNA ACT1 monitorowano za pomocą ilościowej RT-PCR16. Poziomy prekursora ACT1 (pre-mRNA), produktu pośredniego w formie lariat-ekson 2 (Lariat) oraz produktu splicingu (mRNA) przedstawiono po normalizacji względem poziomu eksonu 2 ACT1 oraz poziomów stanu stacjonarnego tych RNA. (a) Położenie produktów qPCR na transkrypcie ACT1. Schemat rozmieszczenia produktów qPCR wykorzystanych do analizy poziomów prekursorów, produktów pośrednich i końcowych reakcji splicingu transkryptów ACT116. Eksony przedstawiono jako prostokąty, intron jako linię, a produkty qPCR jako linie z rombami na końcach; kolory odpowiadają tym zastosowanym na wykresach. PCR dla pre-mRNA jest specyficzny dla pre-mRNA, a nie dla produktów pośrednich splicingu, ponieważ produkt ten obejmuje punkt rozgałęzienia (branch point), który zostaje przerwany po pierwszym etapie splicingu. PCR dla lariatu wykryje produkt pierwszego etapu splicingu oraz wyciętego lariatu powstałego po drugim etapie. PCR dla mRNA jest specyficzny dla produktu splicingu, czyli mRNA. Wyników z PCR dla eksonu (obecnego we wszystkich prekursorach, produktach pośrednich i końcowych, z wyjątkiem wyciętego lariatu) nie przedstawiono na wykresach, ponieważ posłużyły one do normalizacji danych i w związku z tym są zawsze równe 1. (b) Ciągłe znakowanie tiolowe. Ilość pre-mRNA zwiększa się z czasem w miarę włączania 4tU podczas transkrypcji, a po krótkim czasie splicing przekształca go w produkt pośredni lariat-ekson 2 oraz produkty splicingu. Poziomy tych form pre-mRNA i lariatu są wykrywalne powyżej tła już po 15 s wzrostu z 4tU i osiągają maksimum po około 45 s ciągłego znakowania 4tU, kiedy to ich produkcja zostaje zrównoważona przez konwersję do mRNA i/lub degradację. Wartości znormalizowano do stanu stacjonarnego (punkt najbardziej po lewej na wykresie), a poziomy eksonu 2 przedstawiono, aby ukazać ich pojawianie się i przetwarzanie w porównaniu do transkrypcji eksonu 2. Ponieważ splicing RNA ACT1 zachodzi w dużej mierze ko-transkrypcyjnie4,17, splicowany mRNA szybko staje się najliczniejszą formą, a jego poziom jest zbliżony do poziomu eksonu 2. Błąd standardowy trzech powtórzeń biologicznych, z których każde analizowano w trzech powtórzeniach technicznych. (c) Pulse/chase. Puls tiolowania trwający 25 sekund, po którym nastąpił etap chase z urydyną. W porównaniu do poziomów stanu stacjonarnego tych RNA (punkt najbardziej po lewej), początkowo są one bardzo liczne w nowo syntetyzowanej puli. Poziomy stopniowo spadają w miarę przetwarzania do mRNA (lub degradacji), zbliżając się do poziomów stanu stacjonarnego po 5 min. Błąd standardowy trzech powtórzeń biologicznych, z których każde analizowano w trzech powtórzeniach technicznych. (d) Deplecja nsRNA i białka. Splicing transkryptów pre-mRNA ACT1 monitorowano za pomocą ilościowej RT-PCR, jak w panelu (a), po deplekcji białka Prp16 przy użyciu systemu degronu auksynowego, opisanego na Rysunku 2. Poziomy białka Prp16 przedstawiono również na wykresie na drugiej osi Y jako procent poziomu przed deplekcją auksyną. Prp16 jest kluczowym składnikiem splisomu, szczególnie ważnym dla drugiego etapu splicingu pokazanego w panelu (a), po którym lariaty ulegają degradacji. Gdy ten etap staje się ograniczający, początkowo dochodzi do akumulacji lariatów. W późniejszych punktach czasowych splicing całkowicie ustaje, lariaty nie są już produkowane, a poziomy pre-mRNA rosną. Słupki błędów reprezentują błąd standardowy trzech powtórzeń biologicznych, z których każde analizowano w trzech powtórzeniach technicznych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat przygotowania i biotynylacji RNA, przedstawiający etapy znakowania tio- i wirowania.
Rycina 4: Graficzne podsumowanie sekcji protokołu od 1 do 3. Komórki są tiolowane za pomocą 4tU i poddawane wzrostowi w celu włączenia zmodyfikowanego nukleotydu do RNA. Można dodać tiolowany standard wewnętrzny S. pombe, aby umożliwić normalizację pomiędzy punktami czasowymi i eksperymentami. Impuls 4tU można zastąpić nie-tiolowaną urydyną. Znakowanie może być przeprowadzane albo w sposób ciągły od momentu dodania 4tU lub zmiany warunków wzrostu, albo poprzez podzielenie hodowli i dodawanie 4tU do hodowli w zwiększających się odstępach czasu od zmiany warunków wzrostu, przy czym każde znakowanie trwa krótko. Komórki są zbierane, a z nich przygotowywane RNA, najlepiej przy użyciu homogenizatora i metod opartych na fenolu. RNA jest biotynylowane, a następnie biotynylowane RNA jest oczyszczane z niewłączonej biotynyy za pomocą kolumny do wykluczania wielkości. nsRNA jest teraz gotowe do oczyszczania za pomocą kulek ze streptawidyną (sekcja 4, Rycina 5). Numery na czerwono odpowiadają numerom kroków w protokole. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Proces oczyszczania RNA za pomocą kulek streptawidynowych; schemat szczegółowo przedstawiający przebieg eksperymentu.
Rysunek 5: Graficzne podsumowanie części 4 protokołu. Po wykonaniu etapów opisanych w sekcjach 1–3 (Rysunek 4), kulki streptawidynowe zostają zablokowane, a do przygotowanych kulek dodaje się próbkę biotynilowanego RNA. Biotynilowany RNA wiąże się z kulkami streptawidynowymi, a niebiotynilowany RNA zostaje usunięty i wypłukany. Biotynilowany RNA jest eluowany z kulek przy użyciu βME i wytrącony w celu dalszych badań. Numery zaznaczone na czerwono odpowiadają numerom kroków w protokole. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek uzupełniający 1: Poprawa odzysku nsRNA z komórek drożdży z i bez dodatkowych kopii importera po 1 i 3 minutach znakowania tio. Należy zauważyć, że Fui1 jest własnym promotorem drożdży ekspresowanym z plazmidu 2 µm. Genomowa kopia tego genu jest obecna w obu tych szczepach. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 2: Animowana wersja graficznego protokołu β-est AID 4U β-est AID 4U. Aby pobrać ten plik, kliknij tutaj.

Plik uzupełniający 1: 4tU_experiment_template.xltx. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Nazwa plazmiduImporter/permeazaMarkerKomentarz
p4FuiS. cerevisiae Fui1URA3Fui1 importuje uracyl i urydynę, co czyni go idealnym do eksperymentów typu pulse/chase.
pAT2S. cerevisiae Fui1LEU2
p4Fui-ΔPEST*S. cerevisiae* Fui1URA3Motyw PEST białka Fui1 został zdeaktywowany, dzięki czemu permeaza nie ulega degradacji w sytuacji, gdy wewnątrzkomórkowe stężenie uracylu jest wystarczające dla potrzeb komórki. Rozwiązanie to sprawdza się w eksperymentach z znakowaniem i poprawia efektywność badań metodą impuls-pogoń (pulse-chase).
p4FurS. cerevisiae Fur4URA3Permeaza uracylu
YEpEBI311H. sapiens ENT1LEU2Miller i wsp.11Zawiera również gen tymidynokinazy HSV.
(równowagowy transporter nukleozydów)
Wszystkie plazmidy są 2 µm oparte. Wszystkie plazmidy p4 i pAT są oparte na pRS16 seria plazmidów. FUI1 i FUR4 są ekspresjonowane z ich własnych, endogennych promotorów.

Tabela 1: Plazmidy użyte w tym protokole.

Dyskusja

W artykule przedstawiono protokół niezwykle szybkiego i swoistego znakowania 4tU, w celu odzyskania powstającego, nowo zsyntetyzowanego RNA z S. cerevisiae już po 15 s znakowania, przy bardzo niskim zanieczyszczeniu nieznakowanym RNA.

Użytkownik powinien zawsze dbać o zachowanie integralności RNA poprzez stosowanie niskich temperatur i odczynników poddanych działaniu DEPC. Oczyszczanie kulek streptawidyny jest ogólnie niezawodne; Jednak bufor koralików jest trudny w obsłudze; Musi być przygotowany na świeżo, z dodanymi składnikami w odpowiedniej kolejności, a nie schłodzony lub autoklawowany. Typowe wady obejmują niecałkowicie rozpuszczone RNA po etapach wytrącania, a więc albo nie jest biotynylowane, albo w inny sposób tracone podczas etapów przetwarzania. W materiałach uzupełniających znajduje się obszerna pomoc w rozwiązywaniu problemów.

Istnieją pewne ograniczenia, o których należy pamiętać w ers4tU. Jednym z już wspomnianych jest to, że 4tU spowalnia wzrost drożdży (ryc. 1a). Oprócz endogennie tiolowanych RNA9, tylko RNA, które zostały transkrybowane w okresie znakowania, mogą być oczyszczone tą metodą. Polimerazy zatrzymane na genach przez cały czas tiolowania nie wytworzą tiolowanych transkryptów, które można oczyścić, chociaż transkrypty, które są częściowo znakowane z powodu polimeraz wchodzących lub opuszczających stan wstrzymania podczas tiolacji, można odzyskać. Szczepy, które słabo transkrybują, czy to z powodu mutacji, czy warunków wzrostu, wytwarzają mało nsRNA, chociaż zastosowane tutaj techniki poprawią jednak regenerację nsRNA w porównaniu z innymi metodami. W tych szczepach i warunkach może być konieczne wydłużenie czasu i zwiększenie objętości hodowli. Należy pamiętać, że uracyl jest dobrym źródłem azotu, dlatego ta metoda powinna zostać wypróbowana przed zastosowaniem w badaniach obejmujących głód azotu.

Protokół ers4tU jest szczególnie przydatny do analizy krótkożyciowych RNA, z których wiele ulega tak szybkiej degradacji, że nie można ich zidentyfikować bez paraliżu maszynerii degradacji. Przykłady obejmują tajemnicze niestabilne transkrypty (CUT)4 i krótkie transkrypty powstałe w wyniku przedwczesnej terminacji lub promotora prokrotnego pauzy18 oraz transkrypcji antysensownej "upstream" od promotora (PROMPTs)19. Półprodukty wytwarzane podczas przetwarzania stabilnych gatunków RNA są również przejściowe, ale mogą być wzbogacone za pomocą transkrypcji ers4tU4. Protokół ers4tU jest zatem wyjątkowy, ponieważ pozwala na analizę i wychwytywanie wysoce przejściowych gatunków RNA w warunkach zbliżonych do fizjologicznych, co stanowi ogromną przewagę nad innymi metodami. Technika ta została wykorzystana do badania kinetyki transkrypcji i dalszego przetwarzania RNA w mutantach polimerazy RNA, które wydłużają się szybciej lub wolniej niż normalnie20.

Tiolacja jest również kompatybilna z RNA-seq i SLAM-seq21, co pozwala na scharakteryzowanie całego RNA wyprodukowanego w bardzo krótkim czasie.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca została wsparta przez fundusze Wellcome dla JB [104648]. Prace w Wellcome Centre for Cell Biology są wspierane przez Wellcome core funding [092076]. Autorzy dziękują za pomoc członkom laboratorium: Belli Maudlin, Emanueli Sani, Susannie De Lucas-Arias i Shiney George. Autorzy chcieliby również podziękować Patrickowi Cramerowi za plazmid YEpEBI31111.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
β-merkaptoetanol (β ME)Sigma-AldrichM3148UWAGA toksyczny. Roztwory podstawowe przyjmuje się około 14 M, przygotować w 1/20 do użycia
ChloroformSigma-Aldrich25668UWAGA toksyczny
pirowęglan dietylu (DEPC)Sigma-AldrichD5758dodać 1/1000 do roztworu, pozostawić w temperaturze pokojowej na 24 godziny, następnie autoklaw
DMF (N,N-dimetyloformamid)  Sigma-Aldrich227056UWAGA toksyczny
EDTASigma-Aldrich3609Zrobić 0,5 M i pH do 8,0 z wodorotlenkiem sodu
EtanolemSigma-Aldrich29221
EZ-link HPDP BiotynaThermo scientific21341Przechowywać chronić przed światłem. Rozpuścić całą zawartość fiolki w 22,7 ml DMF (w celu uzyskania 4 mM roztworu podstawowego). Przechowywać z dala od wody, w ciemności i w temperaturze -20 stopni Celsjusza. Przed użyciem należy sprawdzić roztwór, ponieważ niektóre partie HPDP wytrącają się podczas przechowywania; ciepło w 42 stopniach; C, aby ponownie zawiesić.
GlukozaFisher Scientific G/0500/60
Glikogen [20 mg/mL]Sigma-Aldrich10901393001Przechowywać w temperaturze -20 ° C
Immobilizowany żel redukujący dwusiarczek TCEPThermo Scientific77712Opcjonalnie
LiClSigma-Aldrich79362010 M roztwór. UWAGA: staje się bardzo gorący, gdy się rozpuszcza i może nawet wrzeć w temperaturze większej niż 100 oC, powoli dodawaj kryształy LiCl do wody.
Chlorek magnezu (MgCl2)Sigma-Aldrich630331 M roztwór. UWAGA: staje się bardzo gorący, gdy się rozpuszcza i może nawet wrzeć w temperaturze większej niż 100 oC, powoli dodawaj kryształy MgCl2 do wody.
MetanolFisher ScientificM/4000/PC17UWAGA Toksyczny i łatwopalny
NaH2PO4Sigma-AldrichS3139Przygotować 1 M roztwory każdego z nich i wymieszać w równej ilości, aby otrzymać roztwór o odpowiednim pH
Na2HPO4Sigma-AldrichS3264
NaClSigma-AldrichS9888-M5 M roztwór
fenol, niskie pH.  Sigma-AldrichP4682Przechowywać w ciemności w temperaturze 4 stopni Celsjusza. UWAGA toksyczny
Chloroform fenolowy 5:1 (125:24:1) niskie pH.Sigma-AldrichP1944Przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C. UWAGA
toksyczne kolumny Pierce Spin ThermoScientific69702Opcjonalna
pojedyncza kropla SCSM – uraFormedium 
Octan soduSigma-Aldrich32318-MPrzygotować 3 M roztwór i pH do 5,3 z kwasem octowym
Wodorotlenek soduSigma-Aldrich795429UWAGA
SDS (dodecylosiarczan sodu)Sigma-Aldrich436143UWAGA drażniący, nie wdychać
Streptawidyny Koraliki magnetyczneNEB1420SPrzechowywać w 4° C 
SUPERase-In, inhibitor RNazyTechnologie życia AM2696Sklep pod adresem -20° C
Tiolowany Schizosaccharomyces pombe dla kolcówPatrz sekcja 1.7 protokołu
4-tiouracyl (4tU) ACROS ORGANICS359930010Przechowywać w ciemności. Zrób 100 mM zapasów w 1M NaOH, przechowuj roztwory w temperaturze -20°C. 
Tris baseSigma-Aldrich933621 M roztwory o różnym pH
tRNASigma-Aldrich101095410015mg/ml, przechowywać w temperaturze -20° C
UrydynaSigma-AldrichU3750Przygotować 1 M roztwór w H2O. Podzielić na 2 ml porcji i przechowywać w temperaturze -20 C.
Drożdżowa baza azotowa bez aminokwasów  z siarczanem amonuFormediumCYN0410
Zeba Kolumny 0,5mlThermo Scientific89882Przechowywać w temperaturze 4 stopni; C 
Koraliki cyrkonoweThistle Scientific110791052
Equipment and Consumables
BeadbeaterBiospec112011EURMożna stosować inne homogenizatory; należy ustalić odpowiednie warunki dla każdego homogenizatora i szczepu.
Bioanalizator (Agilent) lub podobny do oceny jakości RNA. Jeśli nie jest to ważne, przydatny jest spektrofotometr do ilościowego określenia RNA.
Wirówka: zdolna do przędzenia kultur w temperaturze 4 & stopni; C i co najmniej 3000 g. Jeśli to możliwe, wstępnie schłodzić.
Wirówka: możliwość wirowania probówek o pojemności do 2 ml ze zmiennymi prędkościami do 13 000 g i do 1000 g 
Stojak magnetyczny do oddzielania kulek od próbki. Ten użyty w papierze jest wydrukowany w 3D, dostępny w Thingiverse (thing:3562952). Dostępne komercyjnie regały istnieją 
Maszyna do PCR z podgrzewaną pokrywką, która umożliwi inkubację w ciemności.
Obrotowe koło do obracania probówek 1,5 ml koniec nad końcem 
Zaleca się wytrząsanie bloku grzewczego (takiego jak Eppendorf Thermomixer) 
Probówki, wirówki, Niska retencja, bez RNaz 0,5 mlEppendorfH179467N
Probówki, wirówki, Niska retencja, bez RNaz 1,5 mLAmbionAM12350
Probówki, wirówka, 50 mL Sarstedt62.547.004Inne probówki wirówkowe nie są gazoszczelne, co pozwala CO2 rozpuścić się w metanolu, który energicznie wydostaje się z roztworu po dodaniu ciepłej kultury, co prowadzi do utraty próbki
Probówki wirówkowe, 15 mL Sarstedt62.554.001
Probówki, 2 mL, nakrętkaGreiner723361
Probówki 0,2 ml pasek po 8 sztuk ze zintegrowanymi pokrywkamiMarka781332
DSCS101

Bibliografia

  1. Duffy, E. E., Schofield, J. A., Simon, M. D. Gaining insight into transcriptome-wide RNA population dynamics through the chemistry of 4-thiouridine. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 10 (1), e1513(2018).
  2. Windhager, L., et al. Ultrashort and progressive 4sU-tagging reveals key characteristics of RNA processing at nucleotide resolution. Genome Research. 22, 2031-2042 (2012).
  3. Baptista, T., Devys, D. Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity. Journal of Visualized Experiments. (140), e57982(2018).
  4. Barrass, J. D., et al. Transcriptome-wide RNA processing kinetics revealed using extremely short 4tU labeling. Genome Biology. 16, 282(2015).
  5. Burger, K., et al. 4-thiouridine inhibits rRNA synthesis and causes a nucleolar stress response. RNA Biology. 10, 1623-1630 (2013).
  6. Mendoza-Ochoa, G. I., et al. A fast and tuneable auxin-inducible degron for depletion of target proteins in budding yeast. Yeast (Chichester England). 36 (1), 75-81 (2018).
  7. Barrass, J. D., Mendoza-Ochoa, G. I., Maudlin, I. E., Sani, E., Beggs, J. D. Tuning degradation to achieve specific and efficient protein depletion. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
  8. Hobro, A. J., Smith, N. I. An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging. Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).
  9. Gustilo, E. M., Vendeix, F. A. P., Agris, P. F. tRNA's Modifications Bring Order to Gene Expression. Current Opinion in Microbiology. 11, 134-140 (2008).
  10. Dolken, L., et al. High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay. RNA. 14, 1959-1972 (2008).
  11. Miller, C., et al. Dynamic transcriptome analysis measures rates of mRNA synthesis and decay in yeast. Molecular Systems Biology. 7, 458(2011).
  12. Schmitt, M. E., Brown, T. A., Trumpower, B. L. A rapid and simple method for preparation of RNA from Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research. 18, 3091-3092 (1990).
  13. Rädle, B., et al. Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA for High Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing and Decay in Cell Culture. Journal of Visualized Experiments. (78), e50195(2013).
  14. Herzog, V. A., et al. Thiol-linked alkylation of RNA to assess expression dynamics. Nature Methods. 14, 1198-1204 (2017).
  15. Ohrt, T., et al. Molecular dissection of step 2 catalysis of yeast pre-mRNA splicing investigated in a purified system. RNA. 19, 902-915 (2013).
  16. Alexander, R. D., et al. RiboSys, a high-resolution, quantitative approach to measure the in vivo kinetics of pre-mRNA splicing and 3′-end processing in Saccharomyces cerevisiae. RNA. 16, 2570-2580 (2010).
  17. Wallace, E. W. J., Beggs, J. D. Extremely fast and incredibly close: cotranscriptional splicing in budding yeast. RNA. 23, 601-610 (2017).
  18. Adelman, K., Lis, J. T. Promoter-proximal pausing of RNA polymerase II: emerging roles in metazoans. Nature Reviews Genetics. 13, 720-731 (2012).
  19. Preker, P., et al. RNA Exosome Depletion Reveals Transcription Upstream of Active Human Promoters. Science. 322, 1851-1854 (2008).
  20. Aslanzadeh, V., Huang, Y., Sanguinetti, G., Beggs, J. D. Transcription rate strongly affects splicing fidelity and cotranscriptionality in budding yeast. Genome Research. 28, 203-213 (2018).
  21. Schofield, J. A., Duffy, E. E., Kiefer, L., Sullivan, M. C., Simon, M. D. TimeLapse-seq: adding a temporal dimension to RNA sequencing through nucleoside recoding. Nature Methods. 15, 221-225 (2018).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Znakowanie 4 tiouracyllemmetabolizm RNAdro d e Saccharomyces cerevisiaeoczyszczanie poprzez biotinylacjkuleczki z streptawidynekstrakcja fenolowo chloroformowawytr canie chlorkiem lituRT qPCRanaliza RNA Seqtechnika SLAM seq
Niezwykle szybkie i swoiste znakowanie metaboliczne RNA in vivo za pomocą 4-tiouracylu (Ers4tU)
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.