Wykorzystanie zamrożonej tkanki w teście komety do oceny uszkodzeń DNA

Podsumowanie

Ten protokół opisuje kilka procedur przygotowania wysokiej jakości zamrożonych próbek tkanek podczas sekcji zwłok do użycia w teście kometarnym do oceny uszkodzeń DNA: 1) zmielona tkanka, 2) zeskrobane komórki nabłonkowe z przewodu pokarmowego, oraz 3) sześcienne próbki tkanek, wymagające homogenizacji za pomocą urządzenia do mielenia tkanek.

Streszczenie

Test kometarny zyskuje na popularności jako metoda oceny uszkodzeń DNA w hodowanych komórkach i tkankach, szczególnie po ekspozycji na chemikalia lub inne stresory środowiskowe. Wykorzystanie testu komety w badaniach regulacyjnych potencjału genotoksycznego u gryzoni było możliwe dzięki przyjęciu w 2014 r. wytycznych Organizacji Współpracy Gospodarczej i Rozwoju (OECD) dotyczących badań. Szkiełka testowe komety są zwykle przygotowywane ze świeżej tkanki w czasie sekcji zwłok; Jednak zamrażanie próbek tkanek pozwala uniknąć wyzwań logistycznych związanych z jednoczesnym przygotowywaniem preparatów z wielu narządów na zwierzę i z wielu zwierząt na badanie. Zamrażanie umożliwia również wysyłkę próbek z zakładu naświetlania do innego laboratorium w celu analizy, a przechowywanie zamrożonej tkanki ułatwia odroczenie decyzji o wygenerowaniu danych o uszkodzeniach DNA dla danego narządu. Alkaliczny test komet jest przydatny do wykrywania związanych z ekspozycją pęknięć podwójnej i pojedynczej nici DNA, zmian alkaliczno-labilnych oraz pęknięć nici związanych z niepełną naprawą wycięcia DNA. Jednak uszkodzenie DNA może również wynikać z mechanicznego ścinania lub niewłaściwych procedur przetwarzania próbki, co zakłóca wyniki testu. Powtarzalność w pobieraniu i przetwarzaniu próbek tkanek podczas sekcji zwłok może być trudna do kontrolowania ze względu na zmienny personel laboratoryjny o różnym poziomie doświadczenia w pobieraniu tkanek do testu komety. Zwiększenie spójności poprzez szkolenia odświeżające lub rozmieszczenie mobilnych jednostek obsadzonych doświadczonym personelem laboratoryjnym jest kosztowne i nie zawsze jest wykonalne. Aby zoptymalizować spójne generowanie wysokiej jakości próbek do analizy komet, oceniono metodę homogenizacji szybko zamrożonych kostek tkanek przy użyciu dostosowanego urządzenia do mielenia tkanek. Próbki przygotowane do testu komety tą metodą wypadały korzystnie w porównaniu ze świeżymi i mrożonymi próbkami tkanek przygotowanymi przez mielenie podczas sekcji zwłok. Co więcej, niskie wyjściowe uszkodzenia DNA mierzono w komórkach z zamrożonych kostek tkanki po długotrwałym przechowywaniu.

Wprowadzenie

Test kometarny jest coraz częściej używany jako metoda oceny uszkodzeń DNA w hodowanych komórkach i tkankach narażonych na działanie substancji chemicznych lub innych stresorów środowiskowych¹. Test może wykryć pęknięcia podwójnej i pojedynczej nici DNA, zmiany alkaliczno-labilne oraz pęknięcia pojedynczej nici związane z niepełną naprawą DNA. Wytyczne Międzynarodowej Rady ds. Harmonizacji Wymagań Technicznych dla Produktów Leczniczych Stosowanych u Ludzi (ICH) dotyczące badań farmaceutycznych zalecają test pękania nici DNA, taki jak test kometowy, jako drugi test uzupełniający test mikrojądrowy erytrocytów gryzoni do oceny genotoksyczności in vivo oraz jako test uzupełniający do oceny sposobu działania indukcji nowotworu w narządach docelowych². Europejski Urząd ds. Bezpieczeństwa Żywności (EFSA) zaleca test komet in vivo jako odpowiedni test uzupełniający w celu zbadania znaczenia pozytywnego wyniku w teście genotoksyczności in vitro³. W 2014 r. zatwierdzono wytyczne OECD dotyczące badań na gryzoniach kometowych, zwiększając tym samym dopuszczalność testu do stosowania w regulacyjnych badaniach potencjału genotoksycznego. Test opiera się na elektroforetycznym rozdzielaniu zrelaksowanych pętli i fragmentów DNA, które migrują z nukleoidów lizowanych komórek. Zasadniczo pojedyncze komórki są osadzone w agarozie, która została nałożona na szkiełka mikroskopowe. Szkiełka są następnie zanurzane w buforze do lizy, a następnie w roztworze alkalicznym (pH > 13), który pozwala ciasno zwiniętemu jądrowemu DNA na rozluźnienie i odwijanie. Szkiełka są następnie umieszczane w polu elektrycznym, które stymuluje migrację ujemnie naładowanego DNA w kierunku anody, tworząc obrazy przypominające komety; względna ilość DNA w warkoczu komety w porównaniu z głową komety jest wprost proporcjonalna do stopnia uszkodzenia DNA; Zawartość DNA w ogonie jest zwykle określana ilościowo za pomocą oprogramowania do obrazowania cyfrowego.

Ponieważ test kometarny wykrywa fragmentaryczne DNA, dokładna kwantyfikacja uszkodzeń DNA wywołanych ekspozycją może być zakłócona przez fragmentację chromatyny związaną z nekrozą lub apoptozą, wynikającą z cytotoksyczności lub stresu wywołanego leczeniem. Ponadto uszkodzenie DNA może wystąpić w wyniku mechanicznego ścinania lub niewłaściwej obróbki próbki⁴. Znaczenie utrzymania pobranej tkanki w stanie schłodzonym przed przygotowaniem preparatu w celu zminimalizowania wyjściowego poziomu uszkodzenia DNA zostało już wcześniej wykazane^5,6. Wiele laboratoriów przygotowuje preparaty do oznaczania komet ze świeżych tkanek; Może to być jednak logistycznie trudne w przypadku przygotowywania preparatów z wielu typów tkanek na zwierzę w badaniu z dużą liczbą zwierząt. Co więcej, stanowi to problem, gdy przygotowanie i analiza preparatów ma odbywać się w odległym laboratorium, co wymaga wysyłki próbek. Na przykład amerykański Narodowy Program Toksykologiczny włącza test kometa jako składnik swojego programu badań toksykologicznych genetycznych (https://ntp.niehs.nih.gov/testing/types/genetic/index.html), a czasami włącza test do 28 lub 90-dniowych badań toksyczności dawki powtórzonej; Wymaga to pobrania tkanek przez laboratorium w trakcie eksploatacji i przeniesienia próbek do innego laboratorium w celu analizy. Aby to osiągnąć, kawałki tkanek są mielone i/lub komórki nabłonkowe przewodu pokarmowego są zeskrobywane, a zawiesiny komórkowe są błyskawicznie zamrażane i przechowywane w zamrażarce w celu późniejszej wysyłki i przechowywania przez laboratorium odbiorcze do czasu analizy⁷. Właściwe obchodzenie się z próbkami ma kluczowe znaczenie dla uzyskania wysokiej jakości danych z wykorzystaniem zamrożonych tkanek; Jednak powtarzalna manipulacja próbkami tkanek podczas sekcji zwłok przeprowadzanych przez ciągle zmieniający się personel jest trudna do kontrolowania, zwłaszcza w laboratoriach, które nie pobierają rutynowo tkanek do testu komety. Szkolenie odświeżające dla personelu przeprowadzającego sekcję zwłok lub korzystanie z mobilnej jednostki obsługiwanej przez doświadczony personel laboratoryjny do pobierania świeżych lub mrożonych próbek tkanek jest często zbyt kosztowne, niewykonalne lub po prostu niedoceniane.

Aby lepiej zapewnić spójne generowanie wysokiej jakości próbek tkanek do transferu do odległego miejsca w celu analizy testów komet, zbadano użyteczność opublikowanej metody⁶ konserwacji tkanek z błyskawicznie zamrożonych kostek tkanki. W tej metodzie zamrożone kostki tkanki są ładowane do urządzenia do mielenia tkanek ze stali nierdzewnej (Rysunek 1), które jest umieszczane w probówce mikrowirówki zawierającej zimny bufor. Kostka tkanki jest następnie przepychana przez siatkę o małej grubości na końcu urządzenia. Wielokrotne przetłaczanie zawiesiny tkankowej przez sito siatkowe w obu kierunkach kilkakrotnie skutkuje stosunkowo jednolitą zawiesiną jednokomórkową. Próbki przygotowane tą metodą wypadły korzystnie pod względem jakości zarówno ze świeżymi, jak i mrożonymi próbkami tkanek przygotowanymi przez mielenie. Dodatkową korzyścią jest to, że w przeciwieństwie do próbek mielonych, kostki tkankowe mogą być przechowywane w stanie zamrożonym przez dłuższy czas i nadal dają wysokiej jakości wyniki w teście komet.

Protokół

Tkanki zostały pobrane podczas przeprowadzania badań przeprowadzonych w obiektach akredytowanych przez AAALAC w laboratoriach kontraktowych NTP zgodnie z przepisami Dobrej Praktyki Laboratoryjnej (21 CFR Part 58) i protokołami użytkowania zwierząt zatwierdzonymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) w każdym laboratorium.

1. Pobieranie i przetwarzanie tkanek

UWAGA: Warto przygotować duplikaty probówek z próbkami (np. wątroba) lub przenieść około połowy próbki do innej probówki (np. dwunastnicy, żołądka), aby umożliwić ponowną analizę, jeśli to konieczne. Aby zminimalizować potencjalną zmienność między próbkami dla tkanek przewodu pokarmowego, zaleca się ostrożność w pobieraniu próbek z tego samego obszaru tkanki względem żołądka dla każdego zwierzęcia i podzielenie próbki w celu wygenerowania zduplikowanych próbek. Kleszcze plastikowe są zalecane do przenoszenia lepkich tkanek, takich jak mózg. Opcjonalnie, rozdrobnione, zeskrobane lub homogenizowane preparaty tkankowe mogą być filtrowane w celu uzyskania jednorodnych zawiesin jednokomórkowych za pomocą sitka o wielkości 40 μm przymocowanego do stożkowej rurki.

1. Usuń wszelkie przyczepione tkanki łączące, narządy i zanieczyszczenia z narządów będących przedmiotem zainteresowania. Natychmiast po usunięciu energicznie przetrzyj narząd w średniej wielkości łodzi wagowej zawierającej ~ 7 ml zimnego, świeżo przygotowanego roztworu do mielenia mięsa (Mg⁺⁺, Ca ⁺⁺ i fenol bez czerwieni fenolu Zbilansowany roztwór soli Hanka, 10% v/v DMSO i 20 mM EDTA pH 7,5) w celu usunięcia resztek krwi i zanieczyszczeń.
2. Przenieś każdy narząd do innej czystej łodzi wagowej zawierającej wystarczającą ilość (~ 7 ml) zimnego roztworu do mielenia, aby utrzymać tkankę zanurzoną w lodzie do czasu dalszego przetwarzania.
3. Usuń fragment każdego interesującego go narządu i umieść go w kasecie do osadzania. Utrwal w 10% neutralnej buforowanej formalinie, ścinku i parafinie zgodnie ze standardowymi procedurami laboratorium w celu ewentualnej przyszłej oceny histopatologicznej.
4. W przypadku wątroby odetnij 5 mm podłużny odcinek lewego płata i delikatnie przetrzyj ~ 7 ml zimnego roztworu do mielenia. Umieść pasek tkanki w czystej, średniej wielkości łodzi wagowej zawierającej ~ 7 ml zimnego roztworu do mielenia mięsa i trzymaj na lodzie, aż będzie gotowy do dalszego przetwarzania (krok 1.8 lub 1.11).
5. W przypadku dwunastnicy należy wyciąć 10 mm część dwunastnicy proksymalnie do żołądka. Za pomocą igły 21–25 G spłucz w celu usunięcia zanieczyszczeń i bakterii.
   1. Włóż igłę do jednego końca dwunastnicy i przepłucz 1 ml zimnego roztworu do mielenia mięsa.
   2. Przepłucz w przeciwnym kierunku, odwracając dwunastnicę i powtarzając z kolejnym 1 ml roztworu do mielenia. Wyrzucić igłę.
   3. Rozetnij dwunastnicę i opłucz ją w ~ 7 ml roztworu do mielenia mięsa przed włożeniem do średniej wielkości łodzi wagowej zawierającej ~ 7 ml czystego roztworu do mielenia mięsa; trzymaj na lodzie, aż będzie gotowa do dalszego przetwarzania (krok 1.8 lub 1.11).
6. W przypadku mózgu przydatne może być najpierw podzielenie mózgu na dwie półkule; jedną z nich można zachować na potrzeby ewentualnej histopatologii (patrz krok 1.2).
   1. Wypreparuj obszar (y) mózgu i delikatnie przemyj ~ 7 ml zimnego roztworu do mielenia.
   2. Przenieś tkankę (tkanki) do czystej, średniej wielkości łodzi wagowej zawierającej ~ 7 ml zimnego roztworu do mielenia mięsa i trzymaj na lodzie, aż będą gotowe do dalszego przetwarzania (krok 1.8 lub 1.11; należy pamiętać, że małe obszary, takie jak móżdżek i hipokamp, mogą nie wymagać dalszego przycinania).
7. Na żołądek
   1. Usuń i wyrzuć przedni żołądek. Rozetnij żołądek gruczołowy i umyj go z jedzenia za pomocą ~ 7 ml zimnego buforu do mielenia mięsa w średniej wielkości łodzi do ważenia.
   2. Usunąć 5-milimetrowy pasek gruczołowego żołądka proksymalnie do dwunastnicy w celu ustabilizowania w celu ewentualnej oceny histopatologicznej (patrz krok 1.2).
   3. Umieść pozostały żołądek w ~ 7 ml zimnego buforu do mielenia mięsa w średniej wielkości łodzi wagowej i inkubuj na lodzie przez 15–30 min.
      nuta: Ten etap inkubacji może nie być konieczny; ten krok został uwzględniony w protokole walidacji JaCVAM, ale nie jest wymieniony w wytycznych OECD dotyczących testów^8,9.
   4. Przenieś żołądek do czystego kawałka parafiny (lub szalki Petriego lub łodzi wagowej) i delikatnie zeskrob nabłonek powierzchniowy dwa lub więcej razy za pomocą ostrza skalpela lub skrobaka z politetrafluoroetenu (PTFE) w celu usunięcia zanieczyszczeń. Zebrać błonę śluzową żołądka za pomocą kleszczy i spłukać 1 ml zimnego buforu do mielenia za pomocą pipety. Przenieś tkankę żołądka na czystą powierzchnię lub naczynie.
   5. Ostrożnie zeskrob nabłonek żołądka 4-5 razy (więcej, jeśli to konieczne) w roztworze do mielenia (zwykle 250 μl / mysz lub 500-1,000 μl / szczur) grzbietem ostrza skalpela lub skrobaka PTFE, aby uwolnić komórki. Opcjonalnie spłucz tkankę mniej więcej równą objętością roztworu do mielenia, aby odzyskać więcej komórek. Zebrać roztwór do mielenia mięsa zawierający uwolnione komórki za pomocą pipety i przenieść do probówki do mikrowirówki na lodzie.
8. W przypadku mielenia próbek tkanek należy wyciąć 3–4 mm odcinek wątroby lub tkanki mózgowej lub ~5 mm dwunastnicy i przenieść do oznakowanej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 lub 2,0 ml zawierającej 1 ml zimnego roztworu do mielenia mięsa. Szybko zmielić (≤30 s) nożyczkami do mielenia mięsa, aż do drobnego rozproszenia, utrzymując próbkę w niskiej temperaturze. Próbka powinna wyglądać na lekko mętną; Jednak często zdarza się, że niektóre kawałki pozostają, które osiądą na dnie rurki.
9. Aby użyć świeżej tkanki, utrzymuj probówki zawierające tkankę mieloną lub zeskrobane komórki nabłonkowe na lodzie; użyj tkanki do przygotowania szkiełka kometarnego w ciągu około 1 godziny od pobrania (opisanego w sekcji 2).
10. Do zamrażania próbek tkanek, bezpośrednio po rozdrobnieniu lub pobraniu zeskrobanych komórek nabłonka
    1. Zabezpieczyć pokrywę probówki i wrzucić probówkę do kolby Dewara zawierającej ciekły azot; probówki mogą być utrzymywane w ciekłym azocie przez czas sekcji zwłok (≤3 godziny).
    2. Wyjmij probówki za pomocą chochli i umieść na suchym lodzie w celu posortowania. Przenieś probówki do zamrażarki na suchym lodzie i przechowuj w zamrażarce o temperaturze -80 °C.
11. Aby przygotować zamrożone kostki tkanki, pokrój kilka małych kawałków tkanki (≤4 mm średnicy i ~6 mm długości; Rysunek 1).
    1. Pojedynczo wrzuć je bezpośrednio do średniej wielkości łodzi wagowej lub innego odpowiedniego naczynia zawierającego ciekły azot.
    2. Odczekaj kilka sekund, aż kawałki całkowicie zamarzną i przenieś pojedyncze zamrożone kostki tkanki do oznakowanej probówki do mikrowirówki lub krioprobówki utrzymywanej na suchym lodzie; nie pozwól, aby kawałki zlepiły się ze sobą podczas procesu zamrażania.
    3. Przenieś probówki do zamrażarki na suchym lodzie i przechowuj w zamrażarce o temperaturze -80 °C.

2. Przygotowanie slajdów

1. Do tkanek mielonych/zeskrobanych
   1. Probówki zawierające świeże chusteczki należy przechowywać na mokrym lodzie.
   2. Umieść probówki z zamrożoną tkanką w łaźni wodnej o temperaturze pokojowej, aż próbki zostaną całkowicie rozmrożone, upewniając się, że są utrzymywane w niskiej temperaturze. Natychmiast przenieś probówki na lód.
   3. Bezpośrednio przed pobraniem komórek w celu przeniesienia do agarozy (krok 2.3) należy delikatnie wymieszać zawiesinę każdej komórki; w przypadku próbek niefiltrowanych pozostawić duże kawałki na dnie probówki. Utrzymuj wszystkie probówki na lodzie do momentu, gdy zostaną przygotowane szkiełka dla wszystkich próbek.
2. Do tkanek ułożonych w kostkę
   1. Wyjąć probówki zawierające kostki tkanek z zamrażarki o temperaturze 80 °C i przechowywać na suchym lodzie do czasu przygotowania szkiełek.
   2. Porcję 1 ml pożywki Merchanta (0,14 M NaCl, 1,47 mM KH₂PO₄, 2,7 mM KCl, 8,1 mM Na₂HPO₄, 10 mM NaEDTA, pH 7,4) lub roztworu do mielenia do oznakowanej 1,7 ml probówki mikrowirówkowej dla każdej próbki i przechowywać na lodzie.
   3. Pracując szybko, aby uniknąć rozmrażania tkanek, umieść kostkę tkanki w otwartym końcu urządzenia do mielenia tkanek o temperaturze pokojowej (Rysunek 1). Można użyć wielu fragmentów tkanki; W razie potrzeby zamrożoną tkankę można pociąć lub rozbić na mniejsze kawałki za pomocą zimnego moździerza i tłuczka, aby zmniejszyć rozmiar kostki, aby zmieściła się w urządzeniu.
   4. Szybko włóż dopasowany do rozmiaru tłok strzykawki do urządzenia, aby wepchnąć tkankę do końca siatki, który następnie należy umieścić w probówce mikrowirówki zawierającej zimny roztwór do mielenia; unikaj zmuszania płynu do przelania się przez rurkę. Zanurz siatkowy koniec urządzenia na około 5-10 s w zimnym roztworze do mielenia, aby umożliwić całkowite rozmrożenie tkanki.
   5. Całkowicie wciśnij tłok, aż zobaczysz, że komórki wystają przez pory siatki. Następnie pociągnąć tłok do góry o około 2,5 cm i ponownie całkowicie wcisnąć; Powtórz ten proces kilka razy, aż roztwór do mielenia stanie się mętny.
   6. W razie potrzeby próbkę można zagęścić w celu zwiększenia gęstości komórek poprzez wirowanie z chłodzeniem przez 5 minut przy 1100 obr./min i usunięcie części supernatantu.
   7. Powtórzyć ten proces dla wszystkich próbek, używając czystego urządzenia do mielenia tkanek dla każdej próbki.
3. Przenieść 50 μl zawiesiny komórek do probówki zawierającej 450 μl 0,5% agarozy o niskiej temperaturze topnienia w temperaturze 37 °C.
   nuta: Objętość można regulować, ale ilość agarozy powinna wynosić ≤1%.
4. Przygotuj i oceń slajdy zgodnie z wcześniejszym opisem^10,11.

Wyniki

Badanie 1
Wątroba została pobrana od dwóch kohort samców szczurów Sprague Dawley, którym podawano olej kukurydziany przez 4 dni, rozłożone w czasie o tydzień. Preparaty przygotowano ze świeżo zmielonej tkanki, zamrożonej tkanki mielonej i zamrożonej tkanki pokrojonej w kostkę przetworzonej w pożywce Merchanta lub roztworze do mielenia mięsa za pomocą urządzenia do mielenia tkanek. Zamrożone tkanki uzyskane od zwierząt z pierwszej kohorty oceniano po przechowywaniu w zamrażarce przez ~3,5 miesiąca. Za...

Dyskusja

Jak wykazano wcześniej ^7,12,13, prawidłowo zamrożona tkanka mielona zapewnia dobre wyniki w teście komet. W rzeczywistości wyjściowe wartości % ogonowego DNA dla mrożonej mielonej wątroby szczura i myszy przygotowanej w naszym laboratorium wynoszą zazwyczaj ≤6%, zgodnie z zaleceniami wytycznej OECD dotyczącej badań⁹ dla świeżo rozdrobnionych próbek wątroby szczura. Dobre wyniki uzyskano w wielu laboratori...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Cryovials	Corning Costar	430488
Arkusze wosku dentystycznego	Mikroskopia elektronowa Nauki	72670
Mikronożyczki do preparowania (mielenia)	Fisher Scientific	08-953-1B
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
Zrównoważony roztwór soli Hanka	Gibco	14175-079
KCl	Teknova	P0315-10
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P9791
niskiej temperaturze topnienia Agarose	Lonza	50081
(1,7 mL)	Corning	3207
Na2EDTA	Sigma-Aldrich	E5134
Na2 HPO4	Sigma-Aldrich	S7907
NaCl	Sigma-Aldrich	S6191
Neutralnie buforowana formalina	Leica	600
Ostrza skalpela	Miltex	4-110
(1 ml)	Fisher Scientific lub Vitality Medical	14-826-88; 8881901014	Strzykawka tuberkulinowa Becton Dickinson lub Monoject
Urządzenie do mielenia tkanek	NorGenoTech (Oslo, Norwegia)	Brak	Zaobserwowano niewielką zmienność średnicy, która może wpływać na szczelność tłoka.
Pęsety z tworzyw sztucznych	Wiatry handlowe Bezpośrednie	DF8088N	Wzmocniony nylon, niesterylny, końcówka, autoklawowalny; tradewindsdirect.com
Łodzie wagowe	Krackler Scientific/Heathrow Scientific	6290-14251B