Artykuł metodologiczny

Genotypowanie i kwantyfikacja barwienia hybrydyzacji in situ u danio pręgowanego

12K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59956

⸱

28 stycznia 2020

 ,  , 
1MRC Molecular Haematology Unit, MRC Weatherall Institute of Molecular Medicine, John Radcliffe Hospital, University of Oxford, 2BHF Centre of Research Excellence, 3Institute of Cancer and Genomic Sciences, University of Birmingham

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Technologie edycji genów umożliwiły badaczom generowanie mutantów danio pręgowanego w celu zbadania funkcji genów ze względną łatwością. W tym miejscu przedstawiamy przewodnik do przeprowadzania równoległego genotypowania zarodków i kwantyfikacji sygnałów hybrydyzacji in situ u danio pręgowanego. To bezstronne podejście zapewnia większą dokładność analiz fenotypowych opartych na hybrydyzacji in situ.

Streszczenie

Hybrydyzacja in situ (ISH) jest ważną techniką, która umożliwia badaczom badanie dystrybucji mRNA in situ i jest krytyczną techniką w biologii rozwojowej od dziesięcioleci. Tradycyjnie, większość badań nad ekspresją genów opierała się na wizualnej ocenie sygnału ISH, metodzie, która jest podatna na stronniczość, szczególnie w przypadkach, gdy tożsamość próbki jest znana a priori. Wcześniej informowaliśmy o metodzie obejścia tego błędu i zapewnienia dokładniejszej kwantyfikacji sygnałów ISH. Tutaj przedstawiamy prosty przewodnik, jak zastosować tę metodę do ilościowego określenia poziomów ekspresji genów będących przedmiotem zainteresowania w zarodkach barwionych ISH i skorelowania tego z odpowiadającymi im genotypami. Metoda ta jest szczególnie przydatna do ilościowego określania ograniczonych przestrzennie sygnałów ekspresji genów w próbkach o mieszanych genotypach i stanowi bezstronną i dokładną alternatywę dla tradycyjnych metod oceny wizualnej.

Wprowadzenie

Wprowadzenie technologii edycji genomu (ZFN, TALENs, a ostatnio CRISPR/Cas9) doprowadziło do ogromnego wzrostu liczby laboratoriów na całym świecie, które wykorzystują te systemy do badania funkcji określonych genów in vivo. W szczególności danio pręgowany jest podatny na manipulacje genetyczne, a w niedalekiej przeszłości powstało wiele mutantów1,2. Dla biologów rozwojowych jedną z najczęstszych metod oceny fenotypowych konsekwencji mutacji genów w rozwoju embrionalnym jest hybrydyzacja in situ (ISH). Przy braku oczywistych wad morfologicznych, które oddzielają homozygotyczne mutanty od ich dzikiego typu lub heterozygotycznego rodzeństwa, niezbędna jest możliwość prawidłowej dokładnej identyfikacji różnych genotypów.

Klasyczny ISH opiera się na jakościowych analizach intensywności sygnału, aby wyciągnąć wnioski na temat interakcji regulacyjnych między interesującym genem a wybranymi genami markerowymi. Chociaż analizy te są przydatne, są one zróżnicowane pod względem technicznym i mogą być zniekształcone przez oczekiwania badaczy. W związku z tym opracowano metodę ilościowego określania ekspresji genów po obrazowaniu zarodków barwionych ISH, bez wcześniejszej wiedzy na temat odpowiedniego genotypu. Następnie przeprowadzono wydajną ekstrakcję DNA i genotypowanie, które pozwoliło nam ilościowo skorelować genotyp z ekspresją genów3. Podczas gdy genotypowanie zarodków po ISH było już wcześniej stosowane4,5, kwantyfikacja wzorców ISH na podstawie obrazów nie była szeroko stosowana, z wyjątkiem kilku badań6,7. Najpopularniejsze alternatywy opierają się na wizualnej ocenie lub liczeniu komórek wybarwionych ISH8,9,10, oba podatne na słabą odtwarzalność i stronniczość badacza. Metoda ta jest szczególnie przydatna do badania zmian w genach o wzorcach ekspresji, które są ograniczone przestrzennie, takich jak runx1 lub gata2b, oba ulegające ekspresji w ograniczonym podzbiorze komórek dna aorty zwanym hemogennym śródbłonkiem 11,12.

Tutaj staramy się dostarczyć praktyczny przewodnik po implementacji kwantyfikacji poprzez analizę obrazu przy użyciu Fiji13, a także protokół ekstrakcji DNA i genotypowania. Ma to na celu wizualne zilustrowanie naszej wcześniej opublikowanej metody3. Nasza metoda pozwala na dokładne odwzorowanie zmienności ekspresji genów wykrytej przez ISH i bezstronne przypisanie poziomów ekspresji genów do określonych genotypów.

Protokół

Procedury dotyczące zwierząt są regulowane przez Ustawę o zwierzętach (procedury naukowe) z 1986 roku i zostały zatwierdzone przez Ministerstwo Spraw Wewnętrznych oraz lokalny Organ ds. Dobrostanu Zwierząt i Oceny Etycznej.

1. Obraz zarodków barwionych ISH

  1. Przygotuj roztwór glicerolu (50%-80% w 1x buforze PBS) i wymieszaj w celu homogenizacji roztworu (np. pozostaw w wałku na co najmniej 5 minut). Roztwór ten można przechowywać przez wiele miesięcy w temperaturze pokojowej.
  2. Po hybrydyzacji in situ14,15,16,17, przenieś zarodki do roztworu glicerolu za pomocą 3 ml pipety Pasteura i pozostaw na co najmniej 5 minut. W przypadku obrazowania zarodków starszych niż 24 hpf (godziny po zapłodnieniu) można je wybielić zgodnie z opisem18.
    1. Przygotuj i oznacz wystarczającą ilość probówek PCR, aby przenieść zarodki barwione ISH po obrazowaniu.
  3. Dodaj 100% glicerolu na dno studzienki w szklanym szkiełku wgłębieniowym za pomocą pipety Pasteura o pojemności 3 ml.
  4. Za pomocą pipety Pasteura o pojemności 3 ml przenieś pojedynczy zarodek zabarwiony przez ISH na szklane szkiełko podstawowe i ustaw go zgodnie z wymaganiami pod mikroskopem stereoskopowym wyposażonym w kamerę cyfrową oraz oświetlenie dolne i górne.
    UWAGA: Użyj końcówek pipet z żelem, aby ustawić zarodki do obrazowania, ale inne narzędzia (np. kleszcze, igła do preparacji) będą równie wystarczające.
  5. Używając pierwszego zarodka, dostosuj oświetlenie i czas ekspozycji na żądane powiększenie. Użyj tych warunków dla WSZYSTKICH zarodków w tym samym eksperymencie (tj. jeśli obrazujesz 40 zarodków z heterozygotycznego mutanta, upewnij się, że oświetlenie, czas ekspozycji i powiększenie są takie same dla wszystkich).
  6. Wyobraź sobie tyle zarodków, ile jest to wymagane. Oznacz każdy obraz unikalnym numerem. Po obrazowaniu przenieś zarodek do probówki/płytki PCR oznaczonej tym samym numerem.
    UWAGA: Obrazy powinny być zapisywane jako pliki TIF, ale inne formaty są również odpowiednie.
    1. W razie potrzeby usuń nadmiar glicerolu z probówek/płytek PCR.
      UWAGA: W tym momencie zarodki mogą być przechowywane w probówkach PCR przez kilka tygodni w temperaturze pokojowej.

2. Ekstrakcja DNA i genotyp zarodków barwionych ISH

UWAGA: Tutaj użyj niezawodnej i niedrogiej metody izolacji genomowego DNA opartej na metodzie HoTSHOT19 o wydajności ekstrakcji DNA 95%-100%3.

  1. Po zakończeniu obrazowania dodaj 40-75 μl alkalicznego buforu do lizy (np. HoTSHOT) do każdej probówki.
  2. Inkubować w temperaturze 95 °C przez około 30 minut i schłodzić probówki do temperatury 4 °C przed dodaniem równej objętości buforu neutralizującego. Nocna inkubacja w temperaturze 4 °C może poprawić skuteczność PCR.
    UWAGA: W tym momencie genomowe DNA może być wykorzystane do genotypowania lub przechowywane w temperaturze -20 °C do czasu, gdy będzie to wymagane.
  3. Próbki genotypu z odpowiednią metodą (np. HRMA, RFLP)3,20,21 zgodnie z wymaganiami dla mutacji będącej przedmiotem zainteresowania.
  4. Zanotuj genotyp odpowiadający każdej próbce (np. za pomocą arkusza kalkulacyjnego).

3. Ilościowe określenie intensywności pikseli zarodków barwionych metodą ISH (analiza obrazu za pomocą oprogramowania Fiji)

  1. Aby określić ilościowo intensywność sygnału barwienia hybrydyzacji in situ (ISH), przekonwertuj wszystkie obrazy na 8-bitową skalę szarości zgodnie z opisem3. Jeśli obrazy zostały zapisane jako . TIF, użyj makra Fiji do konwersji wsadowej3. Alternatywnie przekonwertuj obrazy w innych formatach (np. .JPG) na . TIF za pomocą odpowiedniego oprogramowania, a następnie konwertować do 8-bitowej skali szarości za pomocą Fidżi. Dla wygody, oto procedura krok po kroku, która została opublikowana wcześniej3, z pewnymi zmianami.
  2. Otwórz obrazy na Fidżi i odwróć obraz za pomocą opcji Edytuj > Odwróć. Następnie zmień typ obrazu na 8-bitowy (Typ > obrazu > 8-bitowy).
  3. Korzystając z narzędzia do zaznaczania wielokątów, ręcznie narysuj obszar zainteresowania (ROI) na obrazie wokół obszaru zawierającego sygnał.
  4. Naciśnij t, aby otworzyć menedżera ROI. Użyj polecenia Zmierz menedżera ROI, aby zmierzyć intensywność ROI. Skopiuj średnią wartość z okna Wyniki do arkusza kalkulacyjnego.
  5. Przenieś ten sam zwrot z inwestycji, zapewniając ten sam rozmiar i kształt, co oryginalny region, do obszaru danio pręgowanego, który nie zawiera żadnych zanieczyszczeń. Powtórz krok 3.4, aby zmierzyć tło.
  6. Aby uzyskać średnią intensywność pikseli sygnału ISH, odejmij średnią wartość intensywności obszaru tła od wartości barwionego obszaru dla każdego zarodka.
  7. Przypisz każdą wartość intensywności do genotypu (od kroku 2.3).

4. Przeanalizuj wyniki za pomocą odpowiednich testów statystycznych

  1. Wykreśl wszystkie wartości na jednym wykresie Q-Q, aby zidentyfikować wszelkie odchylenia od rozkładu normalnego.
    UWAGA: Rozkład normalny można również zweryfikować za pomocą testu Kołmogorowa-Smirnowa lub testu Shapiro-Wilka. Jednak w przypadku dużych prób istnieje wysokie ryzyko wyników fałszywie dodatnich w tych testach.
  2. Jeśli występują duże odchylenia od rozkładu normalnego, przed kontynuowaniem przekształć wszystkie wartości (za pomocą funkcji ln lub sqrt), aby upewnić się, że mają rozkład normalny
    3. .
  3. Przeanalizuj różnice między wartościami (przekształconymi w razie potrzeby) przypisanymi do każdego genotypu (wt vs. heterozygota vs. mutant) z 2-stronną ANOVA z 95% poziomem ufności, uwzględniając równość wariancji z testem Levene'a i poprawką Welcha. Do porównań parami między każdą parą genotypów należy użyć testu post-hoc Tukeya (równe wariancje) lub Gamesa-Howella (nierówne wariancje).
    1. Jeśli wartości nie mają rozkładu normalnego pomimo transformacji, należy użyć testu nieparametrycznego (Kruskalla-Wallisa) do analizy różnic między wartościami rangowymi oraz testu wielokrotnych porównań Dunna post-hoc z poprawką Bonferroniego dla porównań parami.
  4. Wykreśl nieprzekształcone wartości (z kroku 3.6) jako wykresy kropkowe, aby uzyskać najlepszą reprezentację wyników.

Wyniki

W niniejszym rozdziale opisujemy praktyczne zastosowanie procedury kwantyfikacji obrazów i genotypowania embrionów, opublikowanej w innym opracowaniu3. Schemat tej metody przedstawiono na Ryc. 1. Aby zilustrować sposób zastosowania tej metody, przeprowadzono hybrydyzację in situ (ISH) dla dnmt3bb.1 w embrionach o wieku 3 hpf z krzyżówki wewnątrzrasowej runx1W84X/+ 22 (Ryc. 2). Wykonano obrazowanie 130 embrionów, stosując te same warunki oświetlenia, które szczegółowo opisano w protokole, i nadano im unikalne numery. Po obrazowaniu każdy embrion przeniesiono do probówki PCR w celu genotypowania. Następnie przeprowadzono analizę obrazów, aby przypisać wartość intensywności pikseli do każdego zdjęcia. Genotyp przypisano do odpowiadającego mu obrazu, a wartości intensywności pikseli pogrupowano zgodnie z genotypem w celu przeprowadzenia analizy statystycznej. Wykryto spadek ekspresji dnmt3bb.1 u mutantów runx1W84X/W84X (Ryc. 2A,B)3, co jest zgodne z wcześniejszymi obserwacjami5. Co ciekawe, embriony heterozygnotyczne runx1W84X/+ nie wykazały istotnych różnic w ekspresji dnmt3bb.1 (Ryc. 2A,B) w porównaniu z rodzeństwem o genotypie dzikim, co sugeruje, że jedna kopia Runx1 jest wystarczająca do utrzymania ekspresji dnmt3bb.1 na odpowiednim poziomie.

Wiele mutantów rybek danio nie wykazuje fenotypu embrionalnego, który można wykryć za pomocą innych technologii utraty funkcji, takich jak oligonukleotydy morfolino (MO). Rozbieżność ta może wynikać z szeregu przyczyn, w tym efektów poza docelowych (off-target), kompensacji białek matczynych, obecności allelu hypomorficznego23 lub niedawno odkrytego zjawiska kompensacji genetycznej24,25,26,27. W tym przykładzie badaliśmy, czy ekspresja runx1 była zmniejszona lub utracona u mutantów lmo4auob10, ponieważ wcześniej opublikowane dane z użyciem MO przeciwko lmo4a sugerowały, że poziom runx1 jest obniżony u morfantów lmo4a28. Tutaj analiza nie wykazała istotnych różnic w ekspresji runx1 pomiędzy typem dzikim a homozygotycznymi mutantami lmo4auob103 (Rysunek 3A,B). Dalsza analiza za pomocą qPCR pojedynczych embrionów wykazała niewielki, ale istotny spadek ekspresji runx1 u mutantów lmo4auob10 (Rysunek 3C). Zatem możliwe jest, że kwantyfikacja obrazowa może nie być w stanie wykryć niewielkich różnic w poziomach ekspresji. Alternatywnie, brak różnic między genotypami, który stwierdziliśmy, jest rzeczywisty, a eksperymenty qPCR wykrywają zmiany w ekspresji runx1 w innych tkankach, takich jak telencefalon, gdzie ekspresowane są zarówno lmo4a, jak i runx1. Badacze powinni zawsze weryfikować swoje wyniki niezależną metodą, taką jak qPCR, najlepiej poprzedzając ją np. wzbogaceniem frakcji interesującej tkanki za pomocą cytometrii przepływowej.

W rzadkich przypadkach, gdy ISH wykazuje wysokie tło (Rycyna 3D), wartość intensywności pikseli w tym obszarze jest tak wysoka, że odjęcie jej od wartości sygnału daje liczbę ujemną; w takich sytuacjach te embriony zostają wykluczone z analizy. W naszym doświadczeniu zdarzyło się to w około 0,4% embrionów badanych sondą runx13, jednak odsetek ten może różnić się w zależności od eksperymentów, sond lub partii odczynników. Choć może to stanowić ograniczenie metody, niska częstotliwość występowania wysokiego tła jest bardzo mało prawdopodobna, aby wpłynęła na ogólne wyniki.

Aby przetestować wpływ wyboru różnych obszarów do korekcji tła, zmierzyliśmy najpierw intensywność pikseli sygnału ISH dla runx1 w embrionach w 28 hpf, wykorzystując różne regiony do korekcji tła (Rycyna 4). Wybrano cztery różne regiony: dwa w obszarze tułowia (R1 i R2), jeden w obszarze żółtka (niebarwiony, ale prawdopodobnie akumulujący barwienie tła) oraz mniejszy obszar przed ROI (R4, Rycyna 4B). Pomiar intensywności pikseli w tych regionach wykazał relatywnie stabilną różnicę w intensywności między ROI a dowolnym obszarem tła (Rycyna 4C). Jednak region R3 zawsze wykazywał bardzo wysokie wartości (powyżej tych w ROI). Po inwersji i konwersji do formatu 8-bitowego obszar żółtka wydaje się bardzo jasny, a zatem nie nadaje się do użytku w korekcji tła. R2 znajdował się bliżej ROI, ale zawierał częściowo sygnał ISH, a jego użycie do korekcji obniżyło średnią intensywność pikseli w porównaniu z regionem R1 (znajdującym się dalej grzbietowo, z dala od sygnału ISH) lub R4. Zatem zarówno R1, jak i R4 są odpowiednimi obszarami, które można wykorzystać do korekcji tła (mimo że powierzchnia R4 jest mniejsza niż R1). Następnie chcieliśmy porównać, w jaki sposób użycie R1 lub R4 wpływa na wyniki przy porównywaniu ekspresji runx1. W tym celu przeprowadziliśmy krzyżowanie heterozygotów dll4+/-29 i przeanalizowaliśmy ekspresję runx1 w losowo wybranych embrionach typu dzikiego oraz dll4-/- (Rycyna 4E). Chociaż użycie R1 lub R4 do korekcji tła wpłynęło na wartości indywidualne, średnie intensywności pikseli w obrębie tego samego genotypu nie różniły się istotnie (Rycyna 4E). Co więcej, porównanie ekspresji runx1 nadal daje podobne średnie wartości intensywności między genotypami przy użyciu obszarów R1 lub R4 jako korekcji tła (odpowiednio µR1=16.3 i µR4=18.2). Podsumowując, stwierdziliśmy, że choć wybór obszaru tła jest ważny, głównym kryterium jest to, aby nie obejmował on obszarów żółtka (podatnych na akumulację barwienia tła) oraz aby nie zawierał żadnego (specyficznego) barwienia, które mogłoby zafałszować wartości intensywności pikseli tła.

Hybrydyzacja in situ u rybek zebrafish; obrazowanie, ekstrakcja DNA, analiza korelacji genotypu.
Rysunek 1: Schemat procedury równoległego oznaczania ilościowego obrazów i genotypowania. Zarodki pobrane z inbreedingu ryb heterozygotycznych pod względem allelu mutacyjnego poddaje się hybrydyzacji in situ (ISH) w celu wykrycia mierzonego genu zgodnie ze standardowym protokołem ISH. Po obrazowaniu izoluje się DNA genomowe zgodnie z protokołem HotSHOT, dodając bufor lizujący bezpośrednio do zarodka w probówce PCR o pojemności 0,2 ml, a następnie inkubując przez 30 min w temperaturze 95 °CWyizolowane DNA jest wykorzystywane do genotypowania embrionów za pomocą metody PCR, PCR i polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP), testów KASP lub każdej innej odpowiedniej metody. Równolegle obrazy każdego embrionu są odwracane i konwertowane do 8-bitowej skali szarości. Ręcznie wybierane i mierzone są obszary zainteresowania (ROI) o identycznym kształcie i rozmiarze, zawierające sygnał ISH (żółty) oraz tło (niebieskie). Pomiary przypisane do odpowiednich genotypów są poddawane analizie statystycznej. Rysunek zaadaptowany z Dobrzycki et al.3 Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Hybrydyzacja in situ ekspresji dnmt3bb.1 u danio pręgowanego; wykres porównania intensywności pikseli.
Rysunek 2: Ilościowa analiza obrazów w runx1 mutanty wykazują obniżone poziomy dnmt3bb.1 ekspresja metodą ISH. (A) Przykładowe obrazy ISH w embrionach typu dzikiego w 3 hpf (niebieski), runx1+/W84X (zielony) i runx1W84X/W84X zarodki (pomarańczowe), wykazujące dnmt3bb.1 ekspresja w aorcie grzbietowej. (B) Wartości intensywności pikseli dnmt3bb.1 mRNA w runx1W84X/W84Xliczba zarodków (n=36) jest istotnie mniejsza w porównaniu do typów dzikich (n=32) oraz heterozygot (n=62) (ANOVA, p < 0,01). Współczynnikiy zmienności wynoszą odpowiednio 24%, 2% i 21% dla grup typu dzikiego, heterozygnot i mutantów. Niebieskie, zielone i pomarańczowe punkty danych odpowiadają przykładowym obrazom z panelu A. Słupki reprezentują średnią ± odchylenie standardowe (s.d.). ***p<0,01 (test post-hoc Gamesa-Howella). Rysunek zaadaptowano z Dobrzycki i wsp.3 Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

schemat analizy ekspresji genu runx1; zarodki ryb danio pręgowanego, dane qPCR i porównanie intensywności pikseli.
Rycina 3: Pomiar runx1 poziomy ekspresji metodą ISH w lmo4auob100mutanty. (A) Reprezentatywne obrazy ISH dla runx1 w 28 hpf typu dzikiego (niebieski), heterozygoty (zielony) oraz lmo4auob10/uob10 (pomarańczowe) embriony, wykazujące ekspresję w aorcie grzbietowej. (B) Ilościowe oznaczenie runx1 sygnał mRNA, wykryty za pomocą ISH, z embrionów typu dzikiego (n=15) i heterozygot w 28 hpf lmo4a+/- (het) (n=34) i lmo4auob10/uob10 zarodki mutanty (n=18) z jednego cyklu nie wykazują istotnych różnic w runx1 intensywność pikseli pomiędzy różnymi genotypami (ANOVA,> p 0,6). Niebieskie, zielone i pomarańczowe punkty danych odpowiadają przykładowym obrazom z panelu A. Słupki reprezentują średnią ± odchylenie standardowe (s.d.C) Wykresy pudełkowe przedstawiające znormalizowane runx1 poziomy mRNA (2-ΔCt) u pojedynczych osobników typu dzikiego (kolor niebieski; n=12) oraz lmo4auob100/uob10 zarodki (mut, pomarańczowe; n=12), w których pomiarom qRT-PCR towarzyszył spadek poziomu runx1 u mutantów w porównaniu z typem dzikim.p < 0.05 (t test). (D) Przykład eksperymentu ISH na embrionie w 28 hpf (barwionym na runx1, żółte groty strzałek) wykazujące wysokie tło. Rysunek zaadaptowano z pracy Dobrzycki i wsp.3 Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

analiza ekspresji runx1; intensywność pikseli ROI; odwrócony obraz i wyniki na wykresie; dane statystyczne.
Rycina 4: Wpływ korekty natężenia tła na wyniki pomiarów. (A) Reprezentatywny obraz runx1 Barwienie ISH w embrionie typu dzikiego w 28. godzinie po zapłodnieniu (hpf).B) Ten sam obraz po inwersji i konwersji do formatu 8-bitowego. Obszar zainteresowania (ROI) zaznaczono kolorem zielonym, a cztery różne obszary wykorzystane do korekcji tła (R1-R4) zaznaczono kolorem żółtym. (C) Pomiary surowej intensywności pikseli we wszystkich obszarach przedstawionych na panelu B. Zwróć uwagę, że intensywność w R3 (żółtko) jest konsekwentnie wyższa niż rzeczywisty sygnał ISH w ROI (n=1). (D) Runx1 poziomy ekspresji w ROI z wykorzystaniem obszarów tła R1, R2 i R4. Powierzchnie dla ROI, R1, R2 i R3 wyniosły ok. 28 50 pikseli; R4 ok. 850 pikseli. Należy zauważyć, że tło R3 nie zostało użyte do tego porównania, ponieważ korekcja tła (ROI-R3) konsekwentnie dawała wartości ujemne. (E) Runx1 poziomy ekspresji w typie dzikim i dll4-/- mutanty, wykorzystując R1 lub R4 do korekcji tła (n=10 dla każdej próbki). Analiza statystyczna w panelach D i E została przeprowadzona przy użyciu nieparametrycznego testu Kruskala-Wallisa, przy założeniu, że wartości intensywności pikseli nie mają rozkładu normalnego. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Podczas stosowania tej metody do ilościowego określania ekspresji genów należy wziąć pod uwagę kilka czynników. Warunki obrazowania muszą być utrzymane przez cały czas trwania eksperymentu (na przykład oświetlenie, czas ekspozycji i umiejscowienie zarodka) w celu zmniejszenia zmienności między pomiarami. Krytycznym punktem jest unikanie nadmiernego barwienia próbek, ponieważ różnice w barwieniu między próbkami mogą być zamaskowane. Na przykład spadek ekspresji VegfA przy braku Eto2 w zarodkach Xenopus laevis 30 można było wykryć tylko poprzez dokładne monitorowanie barwienia przez okres 24 godzin. Dlatego dobrą praktyką jest empiryczne określenie odpowiednich poziomów barwienia dla każdego genu, które najlepiej reprezentują jego ekspresję, bez osiągania nasycenia. Nadmierne barwienie spowoduje również sztuczne zwiększenie intensywności pikseli tła w przekonwertowanych 8-bitowych obrazach w skali szarości i zniekształcenie wyników kwantyfikacji. W skrajnych przypadkach poziom tła w tkankach embrionalnych może być wyższy niż sygnał ISH w wybranym ROI i próbki te powinny zostać wyłączone z analizy. Podobne zjawisko zaobserwowano, gdy testowaliśmy przydatność niebarwionego żółtka do korekcji tła (ryc. 4). Po odwróceniu i konwersji do 8-bitowej ciemniejsze piksele w obszarze żółtka stają się jaśniejsze niż sygnał ISH w zarodku i powodują, że skorygowane wartości tła są ujemne. Dlatego unikaj używania żółtka do korekcji tła. Pomiar sygnału tła w pigmentowanych obszarach zarodka (np. oczach lub grzbietowej części tułowia od 26/28 hpf wzwyż) w równym stopniu zniekształci wyniki ilościowe i również należy tego unikać. Dostępne są protokoły wybielania zarodków danio pręgowanego, zarówno przed, jak i po ISH18 , a także wybielania zarodków starszych niż 24 hpf przed obrazowaniem.

Ponieważ metoda ta opiera się na pomiarze intensywności pikseli w określonym obszarze na tle intensywności pikseli w równoważnym niebarwionym obszarze, nie jest odpowiednia do ilościowego oznaczania wszechobecnych lub prawie wszechobecnych genów w takiej postaci, w jakiej jest. Zamiast tego dobrze nadaje się do pomiaru ekspresji genów o ograniczonym przestrzennie rozmieszczeniu, gdzie można łatwo zidentyfikować obszar do pomiaru intensywności pikseli tła. Nasza dodatkowa analiza sugeruje teraz, że użycie mniejszego obszaru (3-4 razy mniejszego) do korekcji tła daje podobne wyniki, jak przy użyciu obszaru równoważnego z obszarem zwrotu z inwestycji. Rozszerza to możliwość zastosowania metody do genów ulegających ekspresji w szerszych domenach przestrzennych (a tym samym wymagających większych zwrotów z inwestycji do pomiarów intensywności), o ile można użyć wyraźnie niebarwionych obszarów zarodka do korekcji tła.

Na koniec sugerujemy, aby genotypowanie było wykonywane równolegle lub po kwantyfikacji obrazu, aby zminimalizować stronniczość eksperymentatora. Poproszenie drugiego eksperymentatora o powtórzenie oceny ilościowej na anonimowych próbkach i porównanie z pierwszym zestawem pomiarów również pomoże zmniejszyć stronniczość eksperymentatora. Jeżeli obrazy, które mają być określone ilościowo, pochodzą z porównania między zabiegami, które nie wymagają genotypowania (np. typ dziki kontra inhibitor chemiczny lub typ dziki kontra MO knockdown), eksperymentator wykonujący pomiary powinien być ślepy na tożsamość próbki.

Oświadczenia

Autorzy deklarują, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować personelowi Służb Biomedycznych w Oksfordzie i Birmingham za doskonałą hodowlę danio pręgowanego. T.D. został ufundowany przez Wellcome Trust Chromosome and Developmental Biology PhD Scholarship (#WT102345/Z/13/Z). R.M. i M.K. zostali ufundowani przez British Heart Foundation (BHF IBSR Fellowship FS/13/50/30436) i jesteśmy wdzięczni za ich hojne wsparcie. R.M. dziękuje za wsparcie ze strony Centrum Doskonałości Badawczej BHF (RE/13/1/30181), Oxford.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówki PCR 0,2 ml (8 pasków z pokrywkami)StarLabA1402-3700są równie odpowiednie do przenoszenia próbek, ale należy uważać na zanieczyszczenie krzyżowe między
próbkami Pipety Pasteura 3 mlAlpha LaboratoriesLW4114
Szkiełka wnękoweMarkaBR475535-50EA
Aparat cyfrowy (Qimaging Micropublisher 5.0)Qimaging
Końcówki Eppendorf MicroloaderEppendorf10289651końcówki służą do orientacji zarodków do obrazowania w glicerolu
Excel
F3000 Światłowodowe źródło zimnego światłaPhotonic
Fiji
GlycerolSigmaG5516-1L
Graphpad Prism 8.01Oprogramowanie GraphPadInc.wolimy używać Graphpad, ale odpowiednie są również inne pakiety oprogramowania statystycznego (np. SigmaPlot lub SPSS)
Bufor do lizy alkalicznejHotSHOT 25 mM NaOH, 0,2 mM EDTA disodowe, pH 12
Nikon
TermocyklerThermofisher
Płytki 96-dołkowe Microsoft Bufor neutralizacyjny HotSHOT Tris HCl 40 mM, pH 5 PBS (10X) pH 7,4 Termofisher 70011044 Mikroskop stereoskopowy ze statywem oświetleniowym (Nikon SMZ800N)

Bibliografia

  1. Varshney, G. K., et al. High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9. Genome Research. 25 (7), 1030-1042 (2015).
  2. Varshney, G. K., et al. CRISPRz: a database of zebrafish validated sgRNAs. Nucleic Acids Research. 44 (D1), D822-D826 (2016).
  3. Dobrzycki, T., Krecsmarik, M., Bonkhofer, F., Patient, R., Monteiro, R. An optimised pipeline for parallel image-based quantification of gene expression and genotyping after in situ hybridisation. Biology Open. 7 (4), bio031096(2018).
  4. Bresciani, E., et al. CBFbeta and RUNX1 are required at 2 different steps during the development of hematopoietic stem cells in zebrafish. Blood. 124 (1), 70-78 (2014).
  5. Gore, A. V., et al. Epigenetic regulation of hematopoiesis by DNA methylation. Elife. 5, e11813(2016).
  6. Fan, Y., et al. Tissue-Specific Gain of RTK Signalling Uncovers Selective Cell Vulnerability during Embryogenesis. PLoS Genetics. 11 (9), e1005533(2015).
  7. Wen, B., et al. GATA5 SUMOylation is indispensable for zebrafish cardiac development. Biochimica et Biophysica Acta. 1861 (7), 1691-1701 (2017).
  8. Espin-Palazon, R., et al. Proinflammatory signaling regulates hematopoietic stem cell emergence. Cell. 159 (5), 1070-1085 (2014).
  9. Peterkin, T., Gibson, A., Patient, R. Redundancy and evolution of GATA factor requirements in development of the myocardium. Developmental Biology. 311 (2), 623-635 (2007).
  10. Genthe, J. R., Clements, W. K. R-spondin 1 is required for specification of hematopoietic stem cells through Wnt16 and Vegfa signaling pathways. Development. 144 (4), 590-600 (2017).
  11. Kalev-Zylinska, M. L., et al. Runx1 is required for zebrafish blood and vessel development and expression of a human RUNX1-CBF2T1 transgene advances a model for studies of leukemogenesis. Development. 129 (8), 2015-2030 (2002).
  12. Butko, E., et al. Gata2b is a restricted early regulator of hemogenic endothelium in the zebrafish embryo. Development. 142 (6), 1050-1061 (2015).
  13. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  14. Lleras Forero, L., et al. Segmentation of the zebrafish axial skeleton relies on notochord sheath cells and not on the segmentation clock. Elife. 7, (2018).
  15. Jowett, T., Yan, Y. L. Double fluorescent in situ hybridization to zebrafish embryos. Trends in Genetics. 12 (10), 387-389 (1996).
  16. Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature Protocols. 3 (1), 59-69 (2008).
  17. Narayanan, R., Oates, A. C. Detection of mRNA by Whole Mount in situ Hybridization and DNA Extraction for Genotyping of Zebrafish Embryos. Bio-protocol. , e3193(2019).
  18. Monteiro, R., Pouget, C., Patient, R. The gata1/pu.1 lineage fate paradigm varies between blood populations and is modulated by tif1gamma. EMBO JOURNAL. 30 (6), 1093-1103 (2011).
  19. Truett, G. E., et al. Preparation of PCR-quality mouse genomic DNA with hot sodium hydroxide and tris (HotSHOT). Biotechniques. 29 (1), 52-54 (2000).
  20. Wilkinson, R. N., Elworthy, S., Ingham, P. W., van Eeden, F. J. A method for high-throughput PCR-based genotyping of larval zebrafish tail biopsies. Biotechniques. 55 (6), 314-316 (2013).
  21. Parant, J. M., George, S. A., Pryor, R., Wittwer, C. T., Yost, H. J. A rapid and efficient method of genotyping zebrafish mutants. Developmental Dynamics. 238 (12), 3168-3174 (2009).
  22. Jin, H., et al. Definitive hematopoietic stem/progenitor cells manifest distinct differentiation output in the zebrafish VDA and PBI. Developement. 136 (4), 647-654 (2009).
  23. Stainier, D. Y. R., et al. Guidelines for morpholino use in zebrafish. PLoS Genetics. 13 (10), e1007000(2017).
  24. El-Brolosy, M. A., Stainier, D. Y. R. Genetic compensation: A phenomenon in search of mechanisms. PLoS Genetics. 13 (7), e1006780(2017).
  25. Rossi, A., et al. Genetic compensation induced by deleterious mutations but not gene knockdowns. Nature. 524 (7564), 230-233 (2015).
  26. Ma, Z., et al. PTC-bearing mRNA elicits a genetic compensation response via Upf3a and COMPASS components. Nature. 568 (7751), 259-263 (2019).
  27. El-Brolosy, M. A., et al. Genetic compensation triggered by mutant mRNA degradation. Nature. 568 (7751), 193-197 (2019).
  28. Meier, N., et al. Novel binding partners of Ldb1 are required for haematopoietic development. Development. 133 (24), 4913-4923 (2006).
  29. Kettleborough, R. N., et al. A systematic genome-wide analysis of zebrafish protein-coding gene function. Nature. 496 (7446), 494-497 (2013).
  30. Leung, A., et al. Uncoupling VEGFA functions in arteriogenesis and hematopoietic stem cell specification. Developmental Cell. 24 (2), 144-158 (2013).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Zarodki rybek danio ostrobramkowychilo ciowe oznaczanie genotypowaniaanaliza obrazu w programie Fijikorekcja t abufor do lizy alkalicznejroztw r gliceroluprzenoszenie do prob wek PCRrednia intensywno pikseliobszar zainteresowania
Genotypowanie i kwantyfikacja barwienia hybrydyzacji in situ u danio pręgowanego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.