Method Article

Genotypowanie i kwantyfikacja barwienia hybrydyzacji in situ u danio pręgowanego

DOI:

10.3791/59956

⸱

January 28th, 2020

 ,  , 
1MRC Molecular Haematology Unit, MRC Weatherall Institute of Molecular Medicine, John Radcliffe Hospital, University of Oxford, 2BHF Centre of Research Excellence, 3Institute of Cancer and Genomic Sciences, University of Birmingham

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Technologie edycji genów umożliwiły badaczom generowanie mutantów danio pręgowanego w celu zbadania funkcji genów ze względną łatwością. W tym miejscu przedstawiamy przewodnik do przeprowadzania równoległego genotypowania zarodków i kwantyfikacji sygnałów hybrydyzacji in situ u danio pręgowanego. To bezstronne podejście zapewnia większą dokładność analiz fenotypowych opartych na hybrydyzacji in situ.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hybrydyzacja in situ (ISH) jest ważną techniką, która umożliwia badaczom badanie dystrybucji mRNA in situ i jest krytyczną techniką w biologii rozwojowej od dziesięcioleci. Tradycyjnie, większość badań nad ekspresją genów opierała się na wizualnej ocenie sygnału ISH, metodzie, która jest podatna na stronniczość, szczególnie w przypadkach, gdy tożsamość próbki jest znana a priori. Wcześniej informowaliśmy o metodzie obejścia tego błędu i zapewnienia dokładniejszej kwantyfikacji sygnałów ISH. Tutaj przedstawiamy prosty przewodnik, jak zastosować tę metodę do ilościowego określenia poziomów ekspresji genów będących przedmiotem zainteresowania w zarodkach barwionych ISH i skorelowania tego z odpowiadającymi im genotypami. Metoda ta jest szczególnie przydatna do ilościowego określania ograniczonych przestrzennie sygnałów ekspresji genów w próbkach o mieszanych genotypach i stanowi bezstronną i dokładną alternatywę dla tradycyjnych metod oceny wizualnej.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wprowadzenie technologii edycji genomu (ZFN, TALENs, a ostatnio CRISPR/Cas9) doprowadziło do ogromnego wzrostu liczby laboratoriów na całym świecie, które wykorzystują te systemy do badania funkcji określonych genów in vivo. W szczególności danio pręgowany jest podatny na manipulacje genetyczne, a w niedalekiej przeszłości powstało wiele mutantów1,2. Dla biologów rozwojowych jedną z najczęstszych metod oceny fenotypowych konsekwencji mutacji genów w rozwoju embrionalnym jest hybrydyzacja in situ (ISH). Przy braku oczywistych wad morfologicznych, które oddzielają homozygotyczne mutanty od ich dzikiego typu lub heterozygotycznego rodzeństwa, niezbędna jest możliwość prawidłowej dokładnej identyfikacji różnych genotypów.

Klasyczny ISH opiera się na jakościowych analizach intensywności sygnału, aby wyciągnąć wnioski na temat interakcji regulacyjnych między interesującym genem a wybranymi genami markerowymi. Chociaż analizy te są przydatne, są one zróżnicowane pod względem technicznym i mogą być zniekształcone przez oczekiwania badaczy. W związku z tym opracowano metodę ilościowego określania ekspresji genów po obrazowaniu zarodków barwionych ISH, bez wcześniejszej wiedzy na temat odpowiedniego genotypu. Następnie przeprowadzono wydajną ekstrakcję DNA i genotypowanie, które pozwoliło nam ilościowo skorelować genotyp z ekspresją genów3. Podczas gdy genotypowanie zarodków po ISH było już wcześniej stosowane4,5, kwantyfikacja wzorców ISH na podstawie obrazów nie była szeroko stosowana, z wyjątkiem kilku badań6,7. Najpopularniejsze alternatywy opierają się na wizualnej ocenie lub liczeniu komórek wybarwionych ISH8,9,10, oba podatne na słabą odtwarzalność i stronniczość badacza. Metoda ta jest szczególnie przydatna do badania zmian w genach o wzorcach ekspresji, które są ograniczone przestrzennie, takich jak runx1 lub gata2b, oba ulegające ekspresji w ograniczonym podzbiorze komórek dna aorty zwanym hemogennym śródbłonkiem 11,12.

Tutaj staramy się dostarczyć praktyczny przewodnik po implementacji kwantyfikacji poprzez analizę obrazu przy użyciu Fiji13, a także protokół ekstrakcji DNA i genotypowania. Ma to na celu wizualne zilustrowanie naszej wcześniej opublikowanej metody3. Nasza metoda pozwala na dokładne odwzorowanie zmienności ekspresji genów wykrytej przez ISH i bezstronne przypisanie poziomów ekspresji genów do określonych genotypów.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Procedury dotyczące zwierząt są regulowane przez Ustawę o zwierzętach (procedury naukowe) z 1986 roku i zostały zatwierdzone przez Ministerstwo Spraw Wewnętrznych oraz lokalny Organ ds. Dobrostanu Zwierząt i Oceny Etycznej.

1. Obraz zarodków barwionych ISH

  1. Przygotuj roztwór glicerolu (50%-80% w 1x buforze PBS) i wymieszaj w celu homogenizacji roztworu (np. pozostaw w wałku na co najmniej 5 minut). Roztwór ten można przechowywać przez wiele miesięcy w temperaturze pokojowej.
  2. Po hybrydyzacji in situ14,15,16,17, przenieś zarodki do roztworu glicerolu za pomocą 3 ml pipety Pasteura i pozostaw na co najmniej 5 minut. W przypadku obrazowania zarodków starszych niż 24 hpf (godziny po zapłodnieniu) można je wybielić zgodnie z opisem18.
    1. Przygotuj i oznacz wystarczającą ilość probówek PCR, aby przenieść zarodki barwione ISH po obrazowaniu.
  3. Dodaj 100% glicerolu na dno studzienki w szklanym szkiełku wgłębieniowym za pomocą pipety Pasteura o pojemności 3 ml.
  4. Za pomocą pipety Pasteura o pojemności 3 ml przenieś pojedynczy zarodek zabarwiony przez ISH na szklane szkiełko podstawowe i ustaw go zgodnie z wymaganiami pod mikroskopem stereoskopowym wyposażonym w kamerę cyfrową oraz oświetlenie dolne i górne.
    UWAGA: Użyj końcówek pipet z żelem, aby ustawić zarodki do obrazowania, ale inne narzędzia (np. kleszcze, igła do preparacji) będą równie wystarczające.
  5. Używając pierwszego zarodka, dostosuj oświetlenie i czas ekspozycji na żądane powiększenie. Użyj tych warunków dla WSZYSTKICH zarodków w tym samym eksperymencie (tj. jeśli obrazujesz 40 zarodków z heterozygotycznego mutanta, upewnij się, że oświetlenie, czas ekspozycji i powiększenie są takie same dla wszystkich).
  6. Wyobraź sobie tyle zarodków, ile jest to wymagane. Oznacz każdy obraz unikalnym numerem. Po obrazowaniu przenieś zarodek do probówki/płytki PCR oznaczonej tym samym numerem.
    UWAGA: Obrazy powinny być zapisywane jako pliki TIF, ale inne formaty są również odpowiednie.
    1. W razie potrzeby usuń nadmiar glicerolu z probówek/płytek PCR.
      UWAGA: W tym momencie zarodki mogą być przechowywane w probówkach PCR przez kilka tygodni w temperaturze pokojowej.

2. Ekstrakcja DNA i genotyp zarodków barwionych ISH

UWAGA: Tutaj użyj niezawodnej i niedrogiej metody izolacji genomowego DNA opartej na metodzie HoTSHOT19 o wydajności ekstrakcji DNA 95%-100%3.

  1. Po zakończeniu obrazowania dodaj 40-75 μl alkalicznego buforu do lizy (np. HoTSHOT) do każdej probówki.
  2. Inkubować w temperaturze 95 °C przez około 30 minut i schłodzić probówki do temperatury 4 °C przed dodaniem równej objętości buforu neutralizującego. Nocna inkubacja w temperaturze 4 °C może poprawić skuteczność PCR.
    UWAGA: W tym momencie genomowe DNA może być wykorzystane do genotypowania lub przechowywane w temperaturze -20 °C do czasu, gdy będzie to wymagane.
  3. Próbki genotypu z odpowiednią metodą (np. HRMA, RFLP)3,20,21 zgodnie z wymaganiami dla mutacji będącej przedmiotem zainteresowania.
  4. Zanotuj genotyp odpowiadający każdej próbce (np. za pomocą arkusza kalkulacyjnego).

3. Ilościowe określenie intensywności pikseli zarodków barwionych metodą ISH (analiza obrazu za pomocą oprogramowania Fiji)

  1. Aby określić ilościowo intensywność sygnału barwienia hybrydyzacji in situ (ISH), przekonwertuj wszystkie obrazy na 8-bitową skalę szarości zgodnie z opisem3. Jeśli obrazy zostały zapisane jako . TIF, użyj makra Fiji do konwersji wsadowej3. Alternatywnie przekonwertuj obrazy w innych formatach (np. .JPG) na . TIF za pomocą odpowiedniego oprogramowania, a następnie konwertować do 8-bitowej skali szarości za pomocą Fidżi. Dla wygody, oto procedura krok po kroku, która została opublikowana wcześniej3, z pewnymi zmianami.
  2. Otwórz obrazy na Fidżi i odwróć obraz za pomocą opcji Edytuj > Odwróć. Następnie zmień typ obrazu na 8-bitowy (Typ > obrazu > 8-bitowy).
  3. Korzystając z narzędzia do zaznaczania wielokątów, ręcznie narysuj obszar zainteresowania (ROI) na obrazie wokół obszaru zawierającego sygnał.
  4. Naciśnij t, aby otworzyć menedżera ROI. Użyj polecenia Zmierz menedżera ROI, aby zmierzyć intensywność ROI. Skopiuj średnią wartość z okna Wyniki do arkusza kalkulacyjnego.
  5. Przenieś ten sam zwrot z inwestycji, zapewniając ten sam rozmiar i kształt, co oryginalny region, do obszaru danio pręgowanego, który nie zawiera żadnych zanieczyszczeń. Powtórz krok 3.4, aby zmierzyć tło.
  6. Aby uzyskać średnią intensywność pikseli sygnału ISH, odejmij średnią wartość intensywności obszaru tła od wartości barwionego obszaru dla każdego zarodka.
  7. Przypisz każdą wartość intensywności do genotypu (od kroku 2.3).

4. Przeanalizuj wyniki za pomocą odpowiednich testów statystycznych

  1. Wykreśl wszystkie wartości na jednym wykresie Q-Q, aby zidentyfikować wszelkie odchylenia od rozkładu normalnego.
    UWAGA: Rozkład normalny można również zweryfikować za pomocą testu Kołmogorowa-Smirnowa lub testu Shapiro-Wilka. Jednak w przypadku dużych prób istnieje wysokie ryzyko wyników fałszywie dodatnich w tych testach.
  2. Jeśli występują duże odchylenia od rozkładu normalnego, przed kontynuowaniem przekształć wszystkie wartości (za pomocą funkcji ln lub sqrt), aby upewnić się, że mają rozkład normalny
    3. .
  3. Przeanalizuj różnice między wartościami (przekształconymi w razie potrzeby) przypisanymi do każdego genotypu (wt vs. heterozygota vs. mutant) z 2-stronną ANOVA z 95% poziomem ufności, uwzględniając równość wariancji z testem Levene'a i poprawką Welcha. Do porównań parami między każdą parą genotypów należy użyć testu post-hoc Tukeya (równe wariancje) lub Gamesa-Howella (nierówne wariancje).
    1. Jeśli wartości nie mają rozkładu normalnego pomimo transformacji, należy użyć testu nieparametrycznego (Kruskalla-Wallisa) do analizy różnic między wartościami rangowymi oraz testu wielokrotnych porównań Dunna post-hoc z poprawką Bonferroniego dla porównań parami.
  4. Wykreśl nieprzekształcone wartości (z kroku 3.6) jako wykresy kropkowe, aby uzyskać najlepszą reprezentację wyników.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy praktyczne zastosowanie potoku do ilościowego oznaczania obrazów i genotypowania zarodków, jak opublikowano gdzie indziej3. Przebieg pracy dla metody jest pokazany w Rysunek 1. Aby zilustrować, jak korzystać z tej metody, ISH wykonano dla dnmt3bb.1 na 33 zarodkach hpf z runx1W84X/+ 22 incross (Rysunek 2). 130 embrionów zobrazowano przy użyciu tych samych warunków oświetlenia, jakie opisano w protokole i oznaczono je unikalnym numerem. Po obrazowaniu każdy zarodek został przeniesiony do probówki PCR w celu genotypowania. W tym momencie przeprowadzono analizę obrazu w celu przypisania wartości intensywności pikseli do każdego obrazu. Genotyp został następnie przypisany do odpowiadającego mu obrazu, a wartości intensywności pikseli pogrupowane zgodnie z ich genotypem w celu analizy statystycznej. Spadek wyrażenia dnmt3bb.1 wykryto u mutantów runx1W84X/W84X (Rysunek 2A,B)3, zgodnie z wcześniejszymi obserwacjami5. Co ciekawe, heterozygotyczne zarodki runx1W84X/+ nie wykazywały znaczących różnic w wyrażeniu dnmt3bb.1 (Rysunek 2A,B) w porównaniu z jego dzikim rodzeństwem, co sugeruje, że jedna kopia Runx1 jest wystarczająca do utrzymania ekspresji dnmt3bb.1 na odpowiednich poziomach.

Wiele mutantów danio pręgowanego nie wykazuje fenotypu embrionalnego, który mógłby być wykryty za pomocą innych technologii utraty funkcji, takich jak oligonukleotydy morfolinooligonukleotydów (MO). Ta rozbieżność może być przypisana wielu przyczynom, w tym efektom off-target, kompensacji białek matczynych, allelowi hipomorficznemu23 lub niedawno odkrytemu zjawisku kompensacji genetycznej24,25,26,27. W tym przykładzie zapytaliśmy, czy wyrażenie runx1 zostało zmniejszone lub utracone w mutantach lmo4auob100, ponieważ wcześniej opublikowane dane przy użyciu MO lmo4a sugerowały, że runx1 jest zmniejszony w lmo4a morphants28. W tym przypadku analiza nie wykazała istotnych różnic w ekspresji runx1 między homozygotycznymi mutantami typu dzikiego i lmo4auob1003 (Rysunek 3A,B). Dalsza analiza za pomocą qPCR pojedynczego zarodka wykazała, że nastąpił niewielki, ale znaczący spadek ekspresji runx1 w mutantach lmo4auob100 (Figura 3C). W związku z tym możliwe jest, że kwantyfikacja obrazu może nie być w stanie wykryć niewielkich różnic w poziomach ekspresji. Alternatywnie, brak różnic między genotypami, które wykryliśmy, jest rzeczywisty, a eksperymenty qPCR wykrywają zmiany w ekspresji runx1 w innych tkankach, takich jak telenchefalon, gdzie ulegają ekspresji zarówno lmo4a, jak i runx1. Badacze powinni zawsze weryfikować swoje wyniki za pomocą niezależnej metody, takiej jak qPCR, ale najlepiej wzbogacającej dla interesującej tkanki, na przykład za pomocą cytometrii przepływowej.

W rzadkich przypadkach, gdy ISH ma wysokie tło (Rysunek 3D), wartość intensywności pikseli w tym obszarze jest tak wysoka, że odjęcie od wartości sygnału daje liczbę ujemną i w takich przypadkach te zarodki zostałyby wykluczone z analizy. Z naszego doświadczenia wynika, że wystąpiło to w około 0,4% embrionów z sondą runx1 classs3, ale może się różnić w zależności od eksperymentów, sond lub partii odczynników. Chociaż może to być ograniczenie metody, jest bardzo mało prawdopodobne, aby niska częstotliwość występowania wysokiego tła wpłynęła na ogólne wyniki.

Aby przetestować efekt wyboru różnych obszarów do korekty tła, najpierw zmierzyliśmy intensywność pikseli sygnału runx1 ISH w 28 zarodkach hpf, używając różnych regionów do korekcji tła (Rysunek 4). Wybrano cztery różne regiony: dwa w regionie tułowia (R1 i R2), jeden w regionie żółtka (niebarwione, ale prawdopodobnie gromadzą się barwienie tła) i mniejszy obszar przed ROI (R4, Rysunek 4B). Pomiar intensywności pikseli w tych obszarach wykazał stosunkowo stabilną różnicę w intensywności między ROI a dowolnym obszarem tła (Rysunek 4C). Jednak R3 zawsze wykazywał bardzo wysokie wartości (powyżej tych w ROI). Po odwróceniu i konwersji do 8-bitowej obszar żółtka wydaje się bardzo jasny i dlatego nie nadaje się do użycia jako korekcja tła. R2 był bliższy ROI, ale zawierał trochę sygnału ISH, a użycie go do korekcji zmniejszyło średnią intensywność pikseli w porównaniu z R1 (zlokalizowanym dalej grzbietowo, z dala od sygnału ISH) lub R4. W związku z tym zarówno R1, jak i R4 są odpowiednimi obszarami, które można wykorzystać do korekcji tła (mimo że obszar R4 jest mniejszy niż obszar R1). Następnie chcieliśmy porównać, jak użycie R1 lub R4 wpłynęło na wyniki podczas porównywania wyrażenia runx1. W tym celu skrzyżowaliśmy heterozygoty dll4 +/- 29 i przeanalizowaliśmy wyrażenie runx1 w losowo wybranych zarodkach typu dzikiego i dll4-/- (Rysunek 4E). Chociaż użycie R1 lub R4 do korekcji tła wpłynęło na poszczególne wartości, średnie intensywności pikseli w obrębie tego samego genotypu nie różniły się znacząco (Rysunek 4E). Co więcej, porównanie ekspresji runx1 nadal daje podobne średnie wartości intensywności między genotypami przy użyciu obszarów R1 lub R4 jako korekcji tła (odpowiednioμ R1 = 16,3 i μR4 = 18,2). Podsumowując, doszliśmy do wniosku, że chociaż wybór obszaru tła jest ważny, głównym kryterium jest to, że nie obejmuje on obszarów żółtka (podatnych na gromadzenie się przebarwień tła) i że nie powinien zawierać żadnych (specyficznych) zabarwień, które mogłyby zniekształcić wartości intensywności pikseli tła.

Proces hybrydyzacji in situ: obrazowanie, ekstrakcja DNA, genotypowanie; diagram analizy obrazu.
Rysunek 1: Przebieg pracy protokołu oceny ilościowej i genotypowania obrazu równoległego. Zarodki pobrane z krzyżówki ryb heterozygotycznych pod kątem zmutowanego allelu są badane pod kątem mierzonego genu za pomocą standardowego protokołu ISH. Po zobrazowaniu genomowe DNA ekstrahuje się przy użyciu protokołu HotSHOT poprzez dodanie buforu do lizy bezpośrednio do zarodka w probówce PCR o pojemności 0,2 ml, a następnie 30-minutową inkubację w temperaturze 95 °C. To DNA jest wykorzystywane do genotypowania zarodków za pomocą PCR, PCR i polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP), testów KASP lub innej odpowiedniej metody. Równolegle obrazy dla każdego zarodka są odwracane i konwertowane do 8-bitowej skali szarości. Zwroty akcji o identycznym kształcie i rozmiarze, zawierające sygnał ISH (żółty) i tło (niebieski), są ręcznie wybierane i mierzone. Pomiary, przypisane do odpowiednich genotypów, są analizowane statystycznie. Rysunek zaczerpnięty z Dobrzycki et al.3 Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ekspresja dnmt3bb.1 danio pręgowanego w mutantach typu dzikiego, heterozygotycznego i runx1; wykres intensywności.
Rysunek 2: Kwantyfikacja obrazu w mutantach runx1 ujawnia obniżone poziomy ekspresji dnmt3bb.1 przez ISH. (A) Przykładowe obrazy ISH w zarodkach 33 hpf typu dzikiego (niebieski), runx1+/W84X (zielony) i runx1W84X/W84X (pomarańczowy), pokazujące ekspresję dnmt3bb.1 w aorcie grzbietowej. (B) Wartości intensywności pikseli mRNA dnmt3bb.1 w zarodkach runx1W84X / W84X(n = 36) są znacznie zmniejszone w porównaniu z typami dzikimi (n = 32) i heterozygotami (n = 62) (ANOVA, p < 0,001). Współczynniki zmienności wynoszą odpowiednio 24%, 22% i 21% dla grup typu dzikiego, heterozygoty i mutantów. Niebieski, zielony i pomarańczowy punkt danych odpowiadają przykładowym obrazom z panelu A. Słupki reprezentują średnią ± s.d. ***p<0,001 (test post-hoc Gamesa-Howella). Rysunek zaczerpnięty z Dobrzycki et al.3 Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Analiza ekspresji genów danio pręgowanego; wyrażenie runx1; wykres pudełkowy qPCR; Diagram intensywności pikseli.
Rysunek 3: Pomiar poziomów ekspresji runx1 przez ISH w mutantach lmo4auob100. (A) Reprezentatywne obrazy ISH dla runx1 w 28 zarodkach typu dzikiego (niebieskiego), heterozygotycznego (zielonego) i lmo4auob100/uob100 (pomarańczowego) typu dzikiego, pokazujące ekspresję w aorcie grzbietowej. (B) Kwantyfikacja sygnału mRNA runx1, wykrytego przez ISH, z 28 zarodków typu dzikiego (n = 15), heterozygotycznego lmo4a+/- (het) (n = 34) i lmo4auob100 / uob100 (n = 18) z jednego lęgu nie wykazuje istotnej różnicy w intensywności piksela runx1 między różnymi genotypami (ANOVA,> p 0.6). Niebieski, zielony i pomarańczowy punkt danych odpowiada przykładowym obrazom z panelu A. Słupki reprezentują średnią ± s.d. (C) Wykresy skrzynkowe przedstawiające znormalizowane poziomy mRNA runx1 (2-ΔCt) w pojedynczym dzikim typie (niebieski; n = 12) i lmo4auob100 / uob100 (mut, pomarańczowy; n = 12) zarodki, mierzone za pomocą qRT-PCR, wykazujące obniżone poziomy runx1 w mutantach w porównaniu z typem dzikim. *p < 0,05 (test t). (D) Przykład eksperymentu ISH na zarodku o mocy 28 hpf (barwionym na runx1, żółte groty strzał) pokazującym wysokie tło. Rysunek zaczerpnięty z Dobrzycki et al.3 Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ekspresja genów danio pręgowanego; eksperyment, wykresy danych porównujące intensywność Runx1 za pomocą analizy obrazu.
Rysunek 4: Wpływ korekcji intensywności tła na wyniki pomiarów. (A) Reprezentatywny obraz barwienia runx1 ISH w zarodku typu dzikiego przy 28 hpf. (B) Ten sam obraz po odwróceniu i konwersji do 8-bitowej. Obszar zainteresowania (ROI) jest podświetlony na zielono, a cztery różne obszary używane do korekcji tła (R1-R4) są podświetlone na żółto. (C) Surowe pomiary intensywności pikseli we wszystkich obszarach pokazanych w panelu B. Zauważ, że intensywność w R3 (żółtku) jest konsekwentnie wyższa niż rzeczywisty sygnał ISH w ROI (n = 11). (D) Poziomy wyrażenia Runx1 w ROI przy użyciu obszarów tła R1, R2 i R4. Obszary ROI, R1, R2 i R3 ~ 28500 pikseli; R4 ~ 8500 pikseli. Należy zauważyć, że tło R3 nie zostało użyte w tym porównaniu, ponieważ korekcja tła (ROI-R3) konsekwentnie dawała wartości ujemne. (E) Poziomy ekspresji Runx1 w mutantach typu dzikiego i dll4-/- przy użyciu R1 lub R4 do korekcji tła (n = 10 dla każdej próbki). Analizę statystyczną w panelach D i E przeprowadzono za pomocą nieparametrycznego testu Kruskala-Wallisa, przy założeniu, że wartości intensywności pikseli nie mają rozkładu normalnego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podczas stosowania tej metody do ilościowego określania ekspresji genów należy wziąć pod uwagę kilka czynników. Warunki obrazowania muszą być utrzymane przez cały czas trwania eksperymentu (na przykład oświetlenie, czas ekspozycji i umiejscowienie zarodka) w celu zmniejszenia zmienności między pomiarami. Krytycznym punktem jest unikanie nadmiernego barwienia próbek, ponieważ różnice w barwieniu między próbkami mogą być zamaskowane. Na przykład spadek ekspresji VegfA przy braku Eto2 w zarodkach Xenopus laevis 30 można było wykryć tylko poprzez dokładne monitorowanie barwienia przez okres 24 godzin. Dlatego dobrą praktyką jest empiryczne określenie odpowiednich poziomów barwienia dla każdego genu, które najlepiej reprezentują jego ekspresję, bez osiągania nasycenia. Nadmierne barwienie spowoduje również sztuczne zwiększenie intensywności pikseli tła w przekonwertowanych 8-bitowych obrazach w skali szarości i zniekształcenie wyników kwantyfikacji. W skrajnych przypadkach poziom tła w tkankach embrionalnych może być wyższy niż sygnał ISH w wybranym ROI i próbki te powinny zostać wyłączone z analizy. Podobne zjawisko zaobserwowano, gdy testowaliśmy przydatność niebarwionego żółtka do korekcji tła (ryc. 4). Po odwróceniu i konwersji do 8-bitowej ciemniejsze piksele w obszarze żółtka stają się jaśniejsze niż sygnał ISH w zarodku i powodują, że skorygowane wartości tła są ujemne. Dlatego unikaj używania żółtka do korekcji tła. Pomiar sygnału tła w pigmentowanych obszarach zarodka (np. oczach lub grzbietowej części tułowia od 26/28 hpf wzwyż) w równym stopniu zniekształci wyniki ilościowe i również należy tego unikać. Dostępne są protokoły wybielania zarodków danio pręgowanego, zarówno przed, jak i po ISH18 , a także wybielania zarodków starszych niż 24 hpf przed obrazowaniem.

Ponieważ metoda ta opiera się na pomiarze intensywności pikseli w określonym obszarze na tle intensywności pikseli w równoważnym niebarwionym obszarze, nie jest odpowiednia do ilościowego oznaczania wszechobecnych lub prawie wszechobecnych genów w takiej postaci, w jakiej jest. Zamiast tego dobrze nadaje się do pomiaru ekspresji genów o ograniczonym przestrzennie rozmieszczeniu, gdzie można łatwo zidentyfikować obszar do pomiaru intensywności pikseli tła. Nasza dodatkowa analiza sugeruje teraz, że użycie mniejszego obszaru (3-4 razy mniejszego) do korekcji tła daje podobne wyniki, jak przy użyciu obszaru równoważnego z obszarem zwrotu z inwestycji. Rozszerza to możliwość zastosowania metody do genów ulegających ekspresji w szerszych domenach przestrzennych (a tym samym wymagających większych zwrotów z inwestycji do pomiarów intensywności), o ile można użyć wyraźnie niebarwionych obszarów zarodka do korekcji tła.

Na koniec sugerujemy, aby genotypowanie było wykonywane równolegle lub po kwantyfikacji obrazu, aby zminimalizować stronniczość eksperymentatora. Poproszenie drugiego eksperymentatora o powtórzenie oceny ilościowej na anonimowych próbkach i porównanie z pierwszym zestawem pomiarów również pomoże zmniejszyć stronniczość eksperymentatora. Jeżeli obrazy, które mają być określone ilościowo, pochodzą z porównania między zabiegami, które nie wymagają genotypowania (np. typ dziki kontra inhibitor chemiczny lub typ dziki kontra MO knockdown), eksperymentator wykonujący pomiary powinien być ślepy na tożsamość próbki.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować personelowi Służb Biomedycznych w Oksfordzie i Birmingham za doskonałą hodowlę danio pręgowanego. T.D. został ufundowany przez Wellcome Trust Chromosome and Developmental Biology PhD Scholarship (#WT102345/Z/13/Z). R.M. i M.K. zostali ufundowani przez British Heart Foundation (BHF IBSR Fellowship FS/13/50/30436) i jesteśmy wdzięczni za ich hojne wsparcie. R.M. dziękuje za wsparcie ze strony Centrum Doskonałości Badawczej BHF (RE/13/1/30181), Oxford.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Probówki PCR 0,2 ml (8 pasków z pokrywkami)StarLabA1402-3700są równie odpowiednie do przenoszenia próbek, ale należy uważać na zanieczyszczenie krzyżowe między
próbkami Pipety Pasteura 3 mlAlpha LaboratoriesLW4114
Szkiełka wnękoweMarkaBR475535-50EA
Aparat cyfrowy (Qimaging Micropublisher 5.0)Qimaging
Końcówki Eppendorf MicroloaderEppendorf10289651końcówki służą do orientacji zarodków do obrazowania w glicerolu
Excel
F3000 Światłowodowe źródło zimnego światłaPhotonic
Fiji
GlycerolSigmaG5516-1L
Graphpad Prism 8.01Oprogramowanie GraphPadInc.wolimy używać Graphpad, ale odpowiednie są również inne pakiety oprogramowania statystycznego (np. SigmaPlot lub SPSS)
Bufor do lizy alkalicznejHotSHOT 25 mM NaOH, 0,2 mM EDTA disodowe, pH 12
Nikon
TermocyklerThermofisher
Płytki 96-dołkowe Microsoft Bufor neutralizacyjny HotSHOT Tris HCl 40 mM, pH 5 PBS (10X) pH 7,4 Termofisher 70011044 Mikroskop stereoskopowy ze statywem oświetleniowym (Nikon SMZ800N)

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9. Genome Research. 25 (7), 1030-1042 (2015).">Varshney, G. K., et al. High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9. Genome Research. 25 (7), 1030-1042 (2015).
  2. CRISPRz: a database of zebrafish validated sgRNAs. Nucleic Acids Research. 44 (D1), D822-D826 (2016).">Varshney, G. K., et al. CRISPRz: a database of zebrafish validated sgRNAs. Nucleic Acids Research. 44 (D1), D822-D826 (2016).
  3. An optimised pipeline for parallel image-based quantification of gene expression and genotyping after in situ hybridisation. Biology Open. 7 (4), bio031096(2018).">Dobrzycki, T., Krecsmarik, M., Bonkhofer, F., Patient, R., Monteiro, R. An optimised pipeline for parallel image-based quantification of gene expression and genotyping after in situ hybridisation. Biology Open. 7 (4), bio031096(2018).
  4. CBFbeta and RUNX1 are required at 2 different steps during the development of hematopoietic stem cells in zebrafish. Blood. 124 (1), 70-78 (2014).">Bresciani, E., et al. CBFbeta and RUNX1 are required at 2 different steps during the development of hematopoietic stem cells in zebrafish. Blood. 124 (1), 70-78 (2014).
  5. Epigenetic regulation of hematopoiesis by DNA methylation. Elife. 5, e11813(2016).">Gore, A. V., et al. Epigenetic regulation of hematopoiesis by DNA methylation. Elife. 5, e11813(2016).
  6. Tissue-Specific Gain of RTK Signalling Uncovers Selective Cell Vulnerability during Embryogenesis. PLoS Genetics. 11 (9), e1005533(2015).">Fan, Y., et al. Tissue-Specific Gain of RTK Signalling Uncovers Selective Cell Vulnerability during Embryogenesis. PLoS Genetics. 11 (9), e1005533(2015).
  7. GATA5 SUMOylation is indispensable for zebrafish cardiac development. Biochimica et Biophysica Acta. 1861 (7), 1691-1701 (2017).">Wen, B., et al. GATA5 SUMOylation is indispensable for zebrafish cardiac development. Biochimica et Biophysica Acta. 1861 (7), 1691-1701 (2017).
  8. Proinflammatory signaling regulates hematopoietic stem cell emergence. Cell. 159 (5), 1070-1085 (2014).">Espin-Palazon, R., et al. Proinflammatory signaling regulates hematopoietic stem cell emergence. Cell. 159 (5), 1070-1085 (2014).
  9. Redundancy and evolution of GATA factor requirements in development of the myocardium. Developmental Biology. 311 (2), 623-635 (2007).">Peterkin, T., Gibson, A., Patient, R. Redundancy and evolution of GATA factor requirements in development of the myocardium. Developmental Biology. 311 (2), 623-635 (2007).
  10. R-spondin 1 is required for specification of hematopoietic stem cells through Wnt16 and Vegfa signaling pathways. Development. 144 (4), 590-600 (2017).">Genthe, J. R., Clements, W. K. R-spondin 1 is required for specification of hematopoietic stem cells through Wnt16 and Vegfa signaling pathways. Development. 144 (4), 590-600 (2017).
  11. Runx1 is required for zebrafish blood and vessel development and expression of a human RUNX1-CBF2T1 transgene advances a model for studies of leukemogenesis. Development. 129 (8), 2015-2030 (2002).">Kalev-Zylinska, M. L., et al. Runx1 is required for zebrafish blood and vessel development and expression of a human RUNX1-CBF2T1 transgene advances a model for studies of leukemogenesis. Development. 129 (8), 2015-2030 (2002).
  12. Gata2b is a restricted early regulator of hemogenic endothelium in the zebrafish embryo. Development. 142 (6), 1050-1061 (2015).">Butko, E., et al. Gata2b is a restricted early regulator of hemogenic endothelium in the zebrafish embryo. Development. 142 (6), 1050-1061 (2015).
  13. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).">Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  14. Segmentation of the zebrafish axial skeleton relies on notochord sheath cells and not on the segmentation clock. Elife. 7, (2018).">Lleras Forero, L., et al. Segmentation of the zebrafish axial skeleton relies on notochord sheath cells and not on the segmentation clock. Elife. 7, (2018).
  15. Double fluorescent in situ hybridization to zebrafish embryos. Trends in Genetics. 12 (10), 387-389 (1996).">Jowett, T., Yan, Y. L. Double fluorescent in situ hybridization to zebrafish embryos. Trends in Genetics. 12 (10), 387-389 (1996).
  16. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature Protocols. 3 (1), 59-69 (2008).">Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature Protocols. 3 (1), 59-69 (2008).
  17. Detection of mRNA by Whole Mount in situ Hybridization and DNA Extraction for Genotyping of Zebrafish Embryos. Bio-protocol. , e3193(2019).">Narayanan, R., Oates, A. C. Detection of mRNA by Whole Mount in situ Hybridization and DNA Extraction for Genotyping of Zebrafish Embryos. Bio-protocol. , e3193(2019).
  18. The gata1/pu.1 lineage fate paradigm varies between blood populations and is modulated by tif1gamma. EMBO JOURNAL. 30 (6), 1093-1103 (2011).">Monteiro, R., Pouget, C., Patient, R. The gata1/pu.1 lineage fate paradigm varies between blood populations and is modulated by tif1gamma. EMBO JOURNAL. 30 (6), 1093-1103 (2011).
  19. Preparation of PCR-quality mouse genomic DNA with hot sodium hydroxide and tris (HotSHOT). Biotechniques. 29 (1), 52-54 (2000).">Truett, G. E., et al. Preparation of PCR-quality mouse genomic DNA with hot sodium hydroxide and tris (HotSHOT). Biotechniques. 29 (1), 52-54 (2000).
  20. A method for high-throughput PCR-based genotyping of larval zebrafish tail biopsies. Biotechniques. 55 (6), 314-316 (2013).">Wilkinson, R. N., Elworthy, S., Ingham, P. W., van Eeden, F. J. A method for high-throughput PCR-based genotyping of larval zebrafish tail biopsies. Biotechniques. 55 (6), 314-316 (2013).
  21. A rapid and efficient method of genotyping zebrafish mutants. Developmental Dynamics. 238 (12), 3168-3174 (2009).">Parant, J. M., George, S. A., Pryor, R., Wittwer, C. T., Yost, H. J. A rapid and efficient method of genotyping zebrafish mutants. Developmental Dynamics. 238 (12), 3168-3174 (2009).
  22. Definitive hematopoietic stem/progenitor cells manifest distinct differentiation output in the zebrafish VDA and PBI. Developement. 136 (4), 647-654 (2009).">Jin, H., et al. Definitive hematopoietic stem/progenitor cells manifest distinct differentiation output in the zebrafish VDA and PBI. Developement. 136 (4), 647-654 (2009).
  23. Guidelines for morpholino use in zebrafish. PLoS Genetics. 13 (10), e1007000(2017).">Stainier, D. Y. R., et al. Guidelines for morpholino use in zebrafish. PLoS Genetics. 13 (10), e1007000(2017).
  24. Genetic compensation: A phenomenon in search of mechanisms. PLoS Genetics. 13 (7), e1006780(2017).">El-Brolosy, M. A., Stainier, D. Y. R. Genetic compensation: A phenomenon in search of mechanisms. PLoS Genetics. 13 (7), e1006780(2017).
  25. Genetic compensation induced by deleterious mutations but not gene knockdowns. Nature. 524 (7564), 230-233 (2015).">Rossi, A., et al. Genetic compensation induced by deleterious mutations but not gene knockdowns. Nature. 524 (7564), 230-233 (2015).
  26. PTC-bearing mRNA elicits a genetic compensation response via Upf3a and COMPASS components. Nature. 568 (7751), 259-263 (2019).">Ma, Z., et al. PTC-bearing mRNA elicits a genetic compensation response via Upf3a and COMPASS components. Nature. 568 (7751), 259-263 (2019).
  27. Genetic compensation triggered by mutant mRNA degradation. Nature. 568 (7751), 193-197 (2019).">El-Brolosy, M. A., et al. Genetic compensation triggered by mutant mRNA degradation. Nature. 568 (7751), 193-197 (2019).
  28. Novel binding partners of Ldb1 are required for haematopoietic development. Development. 133 (24), 4913-4923 (2006).">Meier, N., et al. Novel binding partners of Ldb1 are required for haematopoietic development. Development. 133 (24), 4913-4923 (2006).
  29. A systematic genome-wide analysis of zebrafish protein-coding gene function. Nature. 496 (7446), 494-497 (2013).">Kettleborough, R. N., et al. A systematic genome-wide analysis of zebrafish protein-coding gene function. Nature. 496 (7446), 494-497 (2013).
  30. Uncoupling VEGFA functions in arteriogenesis and hematopoietic stem cell specification. Developmental Cell. 24 (2), 144-158 (2013).">Leung, A., et al. Uncoupling VEGFA functions in arteriogenesis and hematopoietic stem cell specification. Developmental Cell. 24 (2), 144-158 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

In Situ HybridizationZebrafish EmbryosGenotyping QuantificationImage Analysis FijiBackground CorrectionAlkaline Lysis BufferGlycerol SolutionPCR Tube TransferMean Pixel IntensityRegion Of Interest

Related Articles