Artykuł metodologiczny

Identyfikacja mutacji poprzez topnienie w wysokiej rozdzielczości w populacji ryżu uprawianej metodą TILLING

DOI:

10.3791/59960

⸱

2 września 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1National Key Laboratory of Rice Biology, Zhejiang Provincial Key Laboratory of Crop Genetic Resources, Institute of Crop Science, Zhejiang University, 2Jiaxing Academy of Agricultural Sciences, 3Institute of Nuclear Agricultural Sciences, Zhejiang University, 4The New Countryside Development Institute at Zhejiang University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym artykule prezentujemy protokół, który jest opisany jako analiza topnienia w wysokiej rozdzielczości (HRM) oparta na docelowych lokalnych zmianach w genomach (TILLING). Metoda ta wykorzystuje zmiany fluorescencji podczas topnienia dupleksu DNA i nadaje się do wysokoprzepustowych badań przesiewowych zarówno insercji/delecji (Indel), jak i substytucji pojedynczej zasady (SBS).

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Target Induced Local Lesions In Genomes (TILLING) to strategia genetyki odwrotnej do wysokoprzepustowego badania przesiewowego indukowanych mutacji. Jednak system TILLING ma mniejsze zastosowanie w wykrywaniu indukcji/delecji (Indel), a tradycyjne TILLING wymaga bardziej złożonych etapów, takich jak trawienie nukleazy CEL I i elektroforeza żelowa. Aby poprawić przepustowość i efektywność selekcji oraz umożliwić przesiewanie zarówno indeli, jak i substytucji pojedynczej zasady (SBS), opracowano nowy system TILLING oparty na topnieniu w wysokiej rozdzielczości (HRM). W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół HRM-TILLING i pokazujemy jego zastosowanie w badaniach przesiewowych w kierunku mutacji. Metoda ta może analizować mutacje amplikonów PCR, mierząc denaturację dwuniciowego DNA w wysokich temperaturach. Analiza HRM jest wykonywana bezpośrednio po PCR bez dodatkowego przetwarzania. Co więcej, prosta, bezpieczna i szybka metoda ekstrakcji DNA (SSF) jest zintegrowana z HRM-TILLING w celu identyfikacji zarówno Indeli, jak i SBS. Jego prostota, solidność i wysoka przepustowość sprawiają, że jest potencjalnie przydatny do skanowania mutacji w ryżu i innych uprawach.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mutanty są ważnymi zasobami genetycznymi dla badań nad genomiką funkcjonalną roślin i hodowli nowych odmian. Podejście oparte na genetyce przyszłościowej (tj. od selekcji mutantów do klonowania genów lub rozwoju odmian) było główną i jedyną metodą stosowania mutacji indukowanych około 20 lat temu. Opracowanie nowatorskiej metody genetyki odwrotnej, TILLING (Targeting Induced Local Lesions In Genomes) przez McCallum et al.1 otworzyło nowy paradygmat i od tego czasu jest ono stosowane u wielu gatunków zwierząt i roślin2. Uprawa roli jest szczególnie przydatna w przypadku cech hodowlanych, które są technicznie trudne lub kosztowne do określenia (np. odporność na choroby, zawartość minerałów).

TILLING został początkowo opracowany do badania przesiewowego mutacji punktowych wywołanych przez chemiczne mutageny (np. EMS1,3). Obejmuje on następujące etapy: ustanowienie populacji (populacji) uprawy; Przygotowanie DNA i łączenie poszczególnych roślin; Amplifikacja PCR docelowego fragmentu DNA; tworzenie heterodupleksów przez denaturację i wyżarzanie amplikonów PCR oraz rozszczepianie przez nukleazę CEL I; oraz identyfikacja zmutowanych osobników i ich specyficznych zmian molekularnych3,4. Jednak ta metoda jest nadal stosunkowo złożona, czasochłonna i ma niską przepustowość. Aby uczynić go bardziej wydajnym i o większej przepustowości, opracowano wiele zmodyfikowanych metod TILLING, takich jak usuwanie TILLING (De-TILLING) (Tabela 1)1,3,5,6,7,8,9,10,11,12.

Analiza krzywej HRM, która opiera się na zmianach fluorescencji podczas topnienia dupleksu DNA, jest prostą, opłacalną i wysokoprzepustową metodą badania przesiewowego mutacji i genotypowania13. HRM jest już szeroko stosowany w badaniach roślin, w tym w HRM BASED TILLING (HRM-TILLING) do badań przesiewowych mutacji SBS indukowanych przez mutagenezę EMS14. W tym miejscu przedstawiliśmy szczegółowe protokoły HRM-TILLING do badań przesiewowych mutacji (zarówno Indel, jak i SBS) indukowanych przez promienie gamma (γ) w ryżu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowania

  1. Rozwój populacji mutagenizowanych γ-promieniami
    1. Około 20 000 suszonych nasion ryżu (o wilgotności ok. 14%) z linii ryżu japonica (np. DS552) należy poddać działaniu promieni gamma o sile 137Cs przy ciśnieniu 100 Gy (1 Gy/min) w urządzeniu do napromieniania γ (np. komórce gamma).
      UWAGA: Nasiona użyte do zaprawiania powinny charakteryzować się wysoką żywotnością (np. o zdolności kiełkowania >85%). Dawka napromieniowania ryżu indica może zostać zwiększona do 150 Gy.
    2. Napromieniowane nasiona po wykiełkowaniu wysiewać na rozsadce i przesadzać siewki pojedynczo na pole ryżowe i wyrastać na populację M1.
      UWAGA: Bezpośredni siew roślin M1 rzadko może być również stosowany w celu obniżenia kosztów pracy. Zapobiegać krzyżowaniu roślinM1 z innymi odmianami ryżu za pomocą środków izolacji fizycznej lub biologicznej.
    3. Zbieraj luzem nasiona M2 z roślin M1, z 1-2 nasionami z każdej paniki M1, aby utworzyć populację M2.
      UWAGA: W praktyce i dla uproszczenia należy zebrać wszystkie nasiona roślin M1, a po całkowitym wymieszaniu pobiera się próbkę z porcji, aby utworzyć populację M2.
    4. Namocz około 5,000 M2 nasiona w wodzie przez 24 (ryż indica)-36 (ryż japonica) h w temperaturze pokojowej. Następnie pozwól nasionom wykiełkować w temperaturze 37 °C przez 2 dni na wilgotnej bibule filtracyjnej na szalkach Petriego.
      UWAGA: Można wykiełkować więcej nasionM2 do analizy, aby zwiększyć prawdopodobieństwo identyfikacji mutantów.
    5. Umieść kiełkujące nasiona na panelach wysiewających z małymi otworami i hoduj je hydroponicznie przez 3-4 tygodnie w roztworze kulturowym zmodyfikowanym przez Yoshida et al.15 w szklarni z 12-godzinnym fotoperiodem [dzień (30±2) °C i noc (24±2) °C].
  2. Pobieranie próbek tkanek liści: Wyciąć jeden krążek (Φ ~ 2 mm) z całkowicie wysuniętego liścia każdego siewu w tej samej pozycji za pomocą dziurkacza.
  3. Przygotowanie roztworów do ekstrakcji DNA
    1. Bufor A: Dodaj 2 ml 5 M NaOH i 10 ml 20% Tween 20, aby uzyskać końcową objętość 50 ml. Świeżo przygotować bufor A przed ekstrakcją DNA.
    2. Bufor B: Dodaj 20 ml 1 M Tris-HCl (pH 8,0) i 80 μl 0,5 M EDTA, aby uzyskać końcową objętość 100 ml.
  4. Startery PCR
    1. Podstawy do analizy HRM: Zaprojektuj startery do amplifikacji sekwencji docelowej za pomocą oprogramowania (np. Primer Premier5) i zsyntetyzuj je przez firmę komercyjną.
      UWAGA: Ponieważ HRM ma mniejsze zastosowanie do analizy długich fragmentów, a zatem amplikony powinny być mniejsze niż 400 pz. Fragmenty o zbyt wysokiej (>75%) lub zbyt niskiej (<25%) zawartości GC również nie nadają się do analizy HRM.
    2. Startery do kontroli jakości: Użyj 24 markerów SSR rozmieszczonych na 12 chromosomach ryżu z Peng et al.16.

2. Ekstrakcja DNA

  1. Umieścić 4 krążki liściowe w każdym dołku 96-dołkowej płytki PCR, dodać roztwór buforu A (50 ml / dołek). Zamrażaj talerz w zamrażarce w temperaturze -80 °C przez 10 minut.
  2. Rozmrozić płytkę w temperaturze pokojowej, a następnie inkubować w temperaturze 95 °C przez 10 minut.
  3. Dodać 50 μl buforu B do każdej studzienki i dobrze wymieszać przez wirowanie.
  4. Odwirować płytkę przez 1 minutę przy 1 500 x g. Supernatant jest gotowy do PCR.

3. Amplifikacja PCR

  1. Optymalizacja PCR
    1. Dodać następujące odczynniki do każdego dołka PCR: 1 μL DNA (supernatant w kroku 2.4), 5 μL 2x Master Mix (zawierający 2x bufor PCR, 4 mmol/L MgCl2, 0,4 mmol/L trifosforany 2'-deoksyrybonukleozydów (dNTP) i 50 U/ml polimerazy DNA Taq, po 0,2 μl starterów 10 μmol/L, i uzupełnić końcową objętość do 10 μl, używając wody wolnej od nukleaz.
    2. Użyj gradientowego bloku termicznego, aby określić optymalną temperaturę wyżarzania dla każdego fragmentu docelowego przy użyciu następującego programu PCR: 5 minut w temperaturze 94 °C, następnie 40 cykli po 30 s w temperaturze 94 °C, 30 s w temperaturze 52-62 °C (temperatura gradientu) i 30 s w temperaturze 72 °C, z końcowym przedłużeniem w temperaturze 72 °C przez 8 minut i zatrzymaniem w temperaturze 16 °C.
    3. Zbadaj amplikony na 1% żelach agarozowych w celu określenia optymalnej temperatury wyżarzania.
      UWAGA: Optymalna temperatura wyżarzania powinna umożliwiać specyficzne amplifikacje docelowego fragmentu, bez niespecyficznego amplifikacji i dimeryzacji startera.
  2. PCR do analizy HRM
    UWAGA: Do PCR stosuje się płytki kompatybilne z HRM i DNA sadzonekM2 wyekstrahowanych zgodnie z opisem w kroku 2.4.
    1. Wykonać PCR w końcowej objętości 10 μl, z 1 μl DNA (supernatant), 5 μl 2x Master Mix, po 0,2 μl starterów 10 μmol/l i 1 μl 10x barwnika fluorescencyjnego. Na każdej płytce należy umieścić jedną próbkę rodzicielską typu dzikiego (WT) i jedną ujemną (bez DNA) kontrolę.
    2. Dodaj kroplę oleju mineralnego do każdej studzienki, aby zapobiec parowaniu.
    3. Uszczelnić płytkę folią samoprzylepną i odwirować przy 1 000 x g przez 1 min.
    4. Uruchom PCR przy użyciu zoptymalizowanej temperatury wyżarzania.
      UWAGA: W niektórych przypadkach barwnik fluorescencyjny może wpływać na amplifikację PCR, stąd barwnik dodaje się po zakończeniu PCR. W takich przypadkach barwnik jest wprowadzany do nici DNA przez denaturację i wyżarzanie po PCR.

4. Skanowanie HRM i potwierdzenie mutacji

  1. Usuń folię samoprzylepną z płyty i włóż płytkę do maszyny HRM.
  2. Wybierz opcję New Run (Nowy przebieg) z menu plików lub naciśnij przycisk Run (Uruchom) u góry ekranu.
  3. Określić temperaturę początkową i końcową stopu od 55 °C do 95 °C.
    UWAGA: Po pierwszym przebiegu można określić zakres temperatur topnienia dla konkretnego fragmentu; W związku z tym temperaturę topnienia można dostosować do późniejszej analizy tego samego fragmentu, aby zaoszczędzić czas.
  4. Wybierz próbki do analizy topnienia w wysokiej rozdzielczości, wyklucz próbki podobne do kontroli ujemnej.
  5. Znormalizuj krzywe topnienia, aby miały tę samą początkową i końcową fluorescencję. Wizualnie potwierdź, że kursory Dolne Min i Dolne maksimum temperatury znajdują się w regionie krzywych.
  6. Utrzymuj poziom ∆F (różnica fluorescencji) na domyślnym ustawieniu 0,05.
  7. Z listy wyboru Standardy wybierz opcję Wspólna a Wariant i wybierz opcję Normalna czułość.
  8. Użyć WT jako kontroli; próbki o wartości ∆F ≥0,05 z WT uważa się za zawierające zmutowaną roślinę.
  9. Identyfikacja i potwierdzenie zmutowanych roślin.
    1. Zidentyfikuj cztery rośliny, z których zbudowano każdą pulę zmutowanych zwierząt.
    2. Wyekstrahuj DNA z każdej z tych roślin za pomocą metody CTAB zgodnie z Allen et al.17 z pewnymi modyfikacjami.
      UWAGA: RNaza wolna od DNaz i NaAc nie są używane podczas ekstrakcji DNA metodą CTAB opisaną przez Allena i wsp.17, ponieważ jakość DNA jest wystarczająco dobra do dalszej amplifikacji PCR. Dostosuj DNA do końcowego stężenia ~25 ng / μL po ilościowym określeniu za pomocą spektrofotometru.
    3. Amplifikuj fragment docelowy za pomocą starterów PCR i zaprogramuj tak samo, jak w przypadku analizy HRM.
    4. Identyfikacja specyficznych zmian molekularnych za pomocą sekwencjonowania amplikonów metodą Sangera.
      UWAGA: Po zakończeniu amplifikacji PCR wyślij amplikony do firmy w celu sekwencjonowania Sangera. Zmianę molekularną można zidentyfikować, porównując sekwencje między roślinąM2 a WT.

5. Kontrola jakości wybranych mutantów z markerami molekularnymi

  1. Przeprowadzić PCR dla 24 markerów SSR w końcowej objętości 10 μL z 25 ng genomowego DNA (ekstrahowanego przy użyciu protokołu CCAB), 5 μL 2x mieszanki głównej, 0,2 μL każdego z 10 μM starterów SSR.
  2. Uruchomić PCR za pomocą następującego programu: 5 minut w temperaturze 94 °C, następnie 30 cykli po 30 s w temperaturze 94 °C, 30 s w temperaturze 55 °C i 30 s w temperaturze 72 °C, z końcowym przedłużeniem w temperaturze 72 °C przez 7 minut.
  3. Oddziel amplikony na 8% żelach poliakryloamidowych i odkryj polimorfizm amplifikowanych fragmentów za pomocą barwienia srebrem18.
  4. Porównaj haplotypy SSR wybranych wariantów i WT.
    UWAGA: Indukowane mutanty często mają haplotypy SSR identyczne z ich WT, jeśli więcej niż jeden marker SSR różni się między wariantem a WT, istnieje duże prawdopodobieństwo, że wariant jest zanieczyszczeniem genetycznym (np. mieszaniną lub rośliną skrzyżowaną), a nie indukowanym mutantem18.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Skanowanie i analiza HRM

W sumie wyprodukowano 1 140 zbiorczych próbek DNA z 4 560 sadzonek M2 i poddano je amplifikacji PCR. Dwa fragmenty o wielkości 195 pz i 259 pz amplifikowano odpowiednio dla OsLCT1 i SPDT (tab. 2). Większość próbek miała krzywe topnienia nieróżniące się istotnie od WT (ΔF < 0,05). Krzywe HRM znacznie różniące się od WT (ΔF > 0,05) zostały pogrupowane według oprogramowania według kolorów różniących się ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Projekt TILLING okazał się potężnym narzędziem genetyki odwrotnej do identyfikacji indukowanych mutacji na potrzeby analizy funkcjonalnej genów i hodowli roślin. W przypadku niektórych cech, które nie są łatwe do zaobserwowania lub określenia, TILLING z wysokoprzepustowym wykrywaniem mutacji opartym na PCR może być przydatną metodą uzyskiwania mutantów dla różnych genów. Metoda HRM-TILLING została zastosowana w mutagenizowanych EMS populacjach pomidora12, pszenicy11 i winor...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie ma dla nich konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Narodowy Kluczowy Program Badawczo-Rozwojowy Chin (nr 2016YFD0102103) oraz Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (nr 31701394).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2 razy; Taq plus PCR Master MixTiangen, ChinyKT201Bufor PCR, dNTP i polimeraza do amplifikacji PCR
96-dołkowa płytkaBio-rad, AmerykaMSP-9651Specyficzna płytka do PCR w analizie HRM
Mastercycler nexusEppendorf, niemiecki6333000073amplifikacji PCR
LightScannerIdaho Technology, USALCSN-ASY-0011Do pobierania próbek fluorescencji i przetwarzanie
CALL-IT 2.0Idaho Technology, USADo analizy zmiany fluorescencji
EvaGreenBiotium, USA31000-TBarwnik fluorescencyjny HRM
Nanodrop 2000Thermo Scientific, USAND2000Do kwantyfikacji DNA

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. McCallum, C. M., Comai, L., Green, E. A., Henikoff, S. Targeting induced local lesions IN genomes (TILLING) for plant functional genomics. Plant Physiology. 123, 439-442 (2000).
  2. Taheri, S., Abdullah, T. L., Jain, S. M., Sahebi, M., Azizi, P. TILLING, high-resolution melting (HRM), and next-generation sequencing (NGS) techniques in plant mutation breeding. Molecular Breeding. 37 (3), 40(2017).
  3. Till, B. J., et al. Large-scale discovery of induced point mutations with high throughput TILLING. Genome Research. 13 (3), 524-530 (2003).
  4. Comai, L., Henikoff, S. TILLING: practical single nucleotide mutation discovery. The Plant Journal. 45 (4), 684-694 (2006).
  5. Comai, L., et al. Efficient discovery of DNA polymorphisms in natural populations by Ecotilling. The Plant Journal. 37, 778-786 (2004).
  6. Rogers, C., Wen, J., Chen, R., Oldroyd, G. Deletion-based reverse genetics in Medicagotruncatula. Plant Physiology. 151 (3), 1077(2009).
  7. Bush, S. M., Krysan, P. J. ITILLING: a personalized approach to the identification of induced mutations in arabidopsis. Physiology. 154 (1), 25-35 (2010).
  8. Colasuonno, P., et al. DHPLC technology for high-throughput detection of mutations in a durum wheat TILLING population. BMC Genetics. 17 (1), 43(2016).
  9. Tsai, H., et al. Discovery of rare mutations in populations: TILLING by sequencing. Plant Physiology. 156, 1257-1268 (2011).
  10. Kumar, A. P. K., et al. TILLING by Sequencing (TbyS) for targeted genome mutagenesis in crops. Molecular Breeding. 37, 14(2017).
  11. Dong, C., Vincent, K., Sharp, P. Simultaneous mutation detection of three homoeologous genes in wheat by High Resolution Melting analysis and Mutation Surveyor. BMC Plant Biology. 9, 143(2009).
  12. Gady, A. L., Herman, F. W., Wal, M. H. V. D., Loo, E. N. V., Visser, R. G. Implementation of two high through-put techniques in a novel application: detecting point mutations in large EMS mutated plant populations. Plant Methods. 5 (41), 6974-6977 (2009).
  13. Ririe, K. M., Rasmussen, R. P., Wittwer, C. T. Product differentiation by analysis of DNA melting curves during the polymerase chain reaction. Analytical Biochemistry. 245, 154-160 (1997).
  14. Lochlainn, S. O., et al. High resolution melt (HRM) analysis is an efficient tool to genotype EMS mutants in complex crop genomes. Plant Methods. 7, 43(2011).
  15. Yoshida, S., Forno, D. A., Cock, J. H., Gomez, K. A. Laboratory manual for physiological rice. The International Rice Research Institute. , Manila, the Philippines. (1976).
  16. Peng, S. T., Zhuang, J. Y., Yan, Q. C., Zheng, K. L. SSR markers selection and purity detection of major hybrid rice combinations and their parents in China. Chinese Journal of Rice Science. 17, 1-5 (2003).
  17. Allen, G. C., Flores-Vergara, M. A., Krasynanski, S., Kumar, S., Thompson, W. F. A modified protocol for rapid DNA isolation from plant tissues using cetyltrimethymmonium bromide. Nature. 1 (5), 2320-2325 (2006).
  18. Fu, H. W., Li, Y. F., Shu, Q. Y. A revisit of mutation induction by gamma rays in rice (Oryza sativa L.): implications of microsatellite markers for quality control. Molecular Breeding. 22 (2), 281-288 (2008).
  19. Li, S., Liu, S. M., Fu, H. W., Huang, J. Z., Shu, Q. Y. High-resolution melting-based tilling of γ ray-induced mutations in rice. Journal of Zhejiang University-Science B. 19 (8), 620-629 (2018).
  20. Acanda, Y., Óscar, M., Prado, M. J., González, M. V., Rey, M. EMS mutagenesis and qPCR-HRM prescreening for point mutations in an embryogenic cell suspension of grapevine. Cell Reports. 33 (3), 471-481 (2014).
  21. Si, H. J., Wang, Q., Liu, Y. Y., Huang, J. Z., Shu, Q. Y., Tan, Y. Y. Development and application of an HRM-based, safe and high-throughput genotyping system for photoperiod sensitive genic male sterility gene in rice. Journal of Nuclear Agricultural Sciences. 31 (11), 2081-2086 (2017).
  22. Li, S., Zheng, Y. C., Cui, H. R., Fu, H. W., Shu, Q. Y., Huang, J. Z. Frequency and type of inheritable mutations induced by γ rays in rice as revealed by whole genome sequencing. Journal of Zhejiang University-Science B. 17 (12), 905(2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Przesiewanie mutacjiekstrakcja DNAoptymalizacja PCRanaliza HRMelektroforeza w elusekwencjonowanie metod Sangerauprawy ry udetekcja indeli

Powiązane artykuły