Artykuł metodologiczny

Transformacja, edycja genomu i fenotypowanie tropikalnego drzewa Cannabaceae Parasponia andersonii wiążącego azot

DOI:

10.3791/59971

⸱

18 sierpnia 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Molecular Biology, Department of Plant Sciences, Wageningen University & Research, 2Center of Technology for Agricultural Production, Agency for the Assessment and Application of Technology (BPPT), 3Department of Ecological Science, Faculty of Earth and Life Sciences, Vrije Universiteit Amsterdam, 4Beijing Advanced Innovation Center for Tree Breeding by Molecular Design, Beijing University of Agriculture

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Parasponia andersonii to szybko rosnące drzewo tropikalne, które należy do rodziny konopi (Cannabaceae) i może tworzyć brodawki korzeniowe wiążące azot w połączeniu z rhizobium. W tym miejscu opisujemy szczegółowy protokół odwrotnych analiz genetycznych u P. andersonii w oparciu o stabilną transformację za pośrednictwem Agrobacterium tumefaciens i edycję genomu opartą na CRISPR/Cas9.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Parasponia andersonii to szybko rosnące drzewo tropikalne, które należy do rodziny konopi (Cannabaceae). Wraz z 4 dodatkowymi gatunkami tworzy jedyną znaną linię niestrączkową, która jest w stanie ustanowić symbiozę guzków wiążących azot z ryzobium. Badania porównawcze między roślinami strączkowymi a P. andersonii mogą dostarczyć cennych informacji na temat sieci genetycznych leżących u podstaw powstawania guzków korzeniowych. Aby ułatwić badania porównawcze, niedawno zsekwencjonowaliśmy genom P. andersonii i ustaliliśmy stabilną transformację za pośrednictwem Agrobacterium tumefaciens oraz edycję genomu opartą na CRISPR/Cas9. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy opis procedur transformacji i edycji genomu opracowanych dla P. andersonii. Ponadto opisujemy procedury kiełkowania nasion i charakterystyki fenotypów symbiotycznych. Korzystając z tego protokołu, stabilne transgeniczne linie mutantów mogą zostać wygenerowane w okresie 2-3 miesięcy. Rozmnażanie wegetatywne in vitro linii transgenicznych T0 pozwala na rozpoczęcie eksperymentów fenotypowania po 4 miesiącach od wspólnej hodowli A. tumefaciens. W związku z tym protokół ten trwa tylko nieznacznie dłużej niż przejściowa metoda transformacji korzeni oparta na Agrobacterium rhizogenes dostępna dla P. andersonii, chociaż oferuje kilka wyraźnych korzyści. Opisane tutaj procedury pozwalają na wykorzystanie P. andersonii jako modelu badawczego do badań mających na celu zrozumienie związków symbiotycznych, a także potencjalnie innych aspektów biologii tego tropikalnego drzewa.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Parasponia andersonii to tropikalne drzewo należące do rodziny konopiowatych (Cannabaceae) i pochodzi z Papui Nowej Gwinei oraz kilku wysp Pacyfiku1,2,3. Wraz z 4 dodatkowymi gatunkami Parasponia reprezentuje jedyną linię niezwiązaną z roślinami strączkowymi, która może ustanowić symbiozę guzków wiążących azot z rhizobią. Ta symbioza jest dobrze zbadana w modelach roślin strączkowych (Fabaceae) Medicago truncatula i Lotus japonicus, co zaowocowało zdobyciem szczegółowej wiedzy na temat molekularnej genetycznej natury powstawania i funkcjonowania guzków4. Dodatkowo wykazano, że symbioza guzków korzeniowych u roślin strączkowych opiera się na znacznie starszej i szeroko rozpowszechnionej symbiozie mikoryzowej arbuskularnej5. Porównania filogenomiczne sugerują, że symbiozy brodawek wiążących azot roślin strączkowych, Parasponia, a także tak zwanych gatunków roślin promieniowych, które są gospodarzami diazotroficznych bakterii Frankia, mają wspólne pochodzenie ewolucyjne6,7,8. Aby ustalić, czy geny zidentyfikowane jako zaangażowane w tworzenie guzków roślin strączkowych są częścią konserwatywnej podstawy genetycznej, niezbędne są badania na gatunkach innych niż rośliny strączkowe. W tym celu proponujemy wykorzystanie P. andersonii jako porównawczego modelu badawczego, obok roślin strączkowych, w celu zidentyfikowania podstawowych sieci genetycznych leżących u podstaw powstawania i funkcjonowania guzków korzeniowych.

P. andersonii to pionier, którego można znaleźć na zboczach wulkanicznych wzgórz. Może osiągnąć prędkość wzrostu 45 cm miesięcznie i długość do 10 metrów9. Drzewa P. andersonii są zapylane przez wiatr, co jest ułatwione przez tworzenie oddzielnych kwiatów męskich i żeńskich3,10. Niedawno zsekwencjonowaliśmy i oznaczyliśmy diploidalny genom (2n = 20; 560 Mb / 1C) P. andersonii i zebraliśmy szkice sekwencji genomu 2 dodatkowych gatunków Parasponia; P. rigida i P. rugosa6. Ujawniło to ~ 35 000 modeli genów P. andersonii, które można zgrupować w >20 000 ortogrup razem z genami M. truncatula, soi (Glycine max), Arabidopsis thaliana, truskawki leśnej (Fragaria vesca), Trema orientalis, czarnej topoli bawełnianej (Populus trichocarpa) i eukaliptusa (Eucalyptus grandis)6. Ponadto porównania transkryptomu między M. truncatula i P. andersonii zidentyfikowały zestaw 290 przypuszczalnych ortologów, które wykazują wzorzec ekspresji wzmocnionej guzkami w obu gatunkach6. Stanowi to doskonałe źródło do badań porównawczych.

Aby zbadać funkcję genu w korzeniach i guzkach P. andersonii, ustanowiono protokół transformacji korzeni za pośrednictwem Agrobacterium rhizogenes11. Korzystając z tego protokołu, rośliny złożone z korzeniami transgenicznymi mogą być generowane w stosunkowo krótkim czasie. Metoda ta jest również szeroko stosowana w badaniach nad symbiozą roślin strączkowych12,13,14. Jednak wadą tej metody jest to, że przekształcane są tylko korzenie, a każdy korzeń transgeniczny reprezentuje niezależne zdarzenie transformacji, co skutkuje znaczną zmiennością. Ponadto transformacja jest przejściowa i linie transgeniczne nie mogą być utrzymane. To sprawia, że transformacja korzeni oparta na A. rhizogenes jest mniej odpowiednia do edycji genomu za pośrednictwem CRISPR/Cas9. Dodatkowo, A. rhizogenes przenosi swoje geny locus indukujące korzenie (rol) do genomu rośliny, które po wyrażeniu zakłócają homeostazę hormonów15. To sprawia, że badanie roli hormonów roślinnych w korzeniach przekształconych przez A. rhizogenes jest wyzwaniem. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, niedawno opracowaliśmy protokół transformacji opartej na Agrobacterium tumefaciens i mutagenezie za pośrednictwem CRISPR/Cas9 P. andersonii10.

Tutaj podajemy szczegółowy opis procedury transformacji opartej na A. tumefaciens i linii odwrotnej genetyki opracowanej dla P. andersonii. Ponadto zapewniamy protokoły dalszego postępowania z sadzonkami transgenicznymi, w tym testy do badania interakcji symbiotycznych. Korzystając z opisanego tutaj protokołu, w ciągu 2-3 miesięcy można wygenerować wiele linii transgenicznych. W połączeniu z mutagenezą, w której pośredniczy CRISPR/Cas9, pozwala to na wydajne generowanie linii mutantów nokautujących. Te zmutowane linie mogą być rozmnażane wegetatywnie in vitro10,16,17, co pozwala na wygenerowanie materiału wystarczającego do rozpoczęcia charakterystyki fenotypowej po 4 miesiącach od rozpoczęcia procedury transformacji10. Łącznie ten zestaw procedur powinien pozwolić każdemu laboratorium na przyjęcie P. andersonii jako modelu badawczego do badań mających na celu zrozumienie związków ryzobialnych i mikoryzowych, a także potencjalnie innych aspektów biologii tego tropikalnego drzewa.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Uprawiaj drzewa P. andersonii w szklarni

  1. Kiełkowanie P. andersonii WU1 seeds18.
    1. Użyj świeżych jagód Parasponia lub namocz suszone jagody w wodzie przez 2 godziny, aby się nawodnić. Zmiażdż jagody na kawałku bibuły lub potrzyj o wnętrze sitka do herbaty, aby usunąć pestki.
    2. Zdezynfekuj nasiona za pomocą dostępnego w handlu wybielacza (~4% podchlorynu) przez 15-20 minut, a następnie umyj nasiona 6 razy sterylizowaną wodą.
    3. Przenieś nasiona do sterylnych probówek PCR o pojemności 200 μl. Napełnij probówki wysterylizowaną wodą, tak aby nasiona były całkowicie zanurzone. Inkubować probówki przez 10 dni w termocyklerze, uruchamiając następujący program: 30 cykli (7 °C przez 4 godziny, 28 °C przez 4 godziny). Nie używaj podgrzewanej pokrywki, ponieważ może to zabić nasiona.
    4. Przygotować płytki SH-0 (patrz Tabela 1). Przenieść nasiona na płytki SH-0 i inkubować w temperaturze 28 °C, 16 h:8 h dzień:noc. Zamknąć płytki 2 warstwami elastycznej folii uszczelniającej, aby zapobiec wysuszeniu podczas inkubacji w temperaturze 28 °C.
  2. Po tym, jak sadzonki rozwiną swój pierwszy zestaw prawdziwych liści (~ 3-4 tygodnie po inkubacji w temperaturze 28 °C), przenieś sadzonki do doniczek wypełnionych komercyjną ziemią doniczkową i przykryj sadzonki półprzezroczystym plastikowym kubkiem, aby zapobiec wysuszeniu. Umieść doniczki w pomieszczeniu lub szklarni o temperaturze 28 °C, ~85% wilgotności względnej, w reżimie 16 h:8 h dzień:noc.
  3. Po 1 tygodniu wyjmij półprzezroczysty plastikowy kubek. Podlewaj doniczki regularnie, a gdy drzewa rosną, uzupełniaj je nawozem, aby podtrzymać wzrost.

2. Klonowanie konstruktów do mutagenezy P. andersonii za pośrednictwem CRISPR/Cas9

UWAGA: Standardowe binarne wektory transformacji mogą być używane do stabilnej transformacji P. andersonii. Tutaj, jako przykład, jest procedura generowania konstrukcji dla mutagenezy za pośrednictwem CRISPR/Cas9 przy użyciu klonowania modułowego (np. Golden Gate)19.

  1. Zidentyfikuj docelowe sekwencje przewodnie RNA dla interesujących genów za pomocą oprogramowania bioinformatycznego z wbudowanym narzędziem do projektowania CRISPR. Wybierz przewodnie sekwencje RNA znajdujące się na końcu 5' sekwencji kodującej docelowego genu, aby zwiększyć szansę na uzyskanie pełnych nokautów. Upewnij się, że sprawdziłeś efekty niezgodne z celem, przeszukując genom P. andersonii6.
    UWAGA: Użyj 2 sgRNA na gen docelowy, najlepiej w odległości 200-300 pz od siebie. Może to powodować delecje, które można zidentyfikować za pomocą PCR, a następnie elektroforezy w żelu agarozowym.
  2. Generuj konstrukty Golden Gate poziomu 1 zawierające sekwencje sgRNA.
    1. Zaprojektuj startery do amplifikacji każdego pojedynczego sgRNA, wstawiając sekwencję prowadzącą 20 pz w pozycji N(20) w następującej sekwencji startera: 5'-TGTGGTCTCAATTGN(20) GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG-3'.
      UWAGA: Jeśli sekwencja prowadząca jest równa GN (19), usuń G na końcu 5' sekwencji prowadzącej przed włożeniem sekwencji startera.
    2. PCR amplifikuje sgRNA z pICH86966::AtU6p::sgRNA_PDS20 przy użyciu starterów do przodu zaprojektowanych w kroku 2.2.1 i uniwersalnego startera odwrotnego: 5'-TGTGGTCTCAAGCGTAATGCCAACTTTGTAC-3'. Użyj stabilnej termicznie polimerazy DNA o wysokiej wierności i następujących warunkach PCR: 98 °C przez 30 s; 30 cykli (98 °C przez 10 s; 53 °C przez 20 s; 72 °C przez 10 s); 72 °C przez 7 min. Udane reakcje PCR dają amplikon 165 pz.
    3. Oczyść kolumnowo amplikon PCR za pomocą komercyjnego zestawu do oczyszczania PCR. Następnie ustaw reakcje Golden Gate w celu sklonowania sgRNA za małym promotorem RNA Arabidopsis thaliana AtU6p: 10 ng amplikonu sgRNA PCR, 150 ng pICSL01009::AtU6p20, 60 ng odpowiedniego wektora akceptora poziomu 1, 2 μL buforu ligazy T4, 2 μL 0,1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA), 0,5 μL BsaI, 0,5 μl ligazy T4, napełnij do 20 μl ultraczystą wodą. Upewnij się, że wszystkie sgRNA są sklonowane w tej samej orientacji, aby zapobiec tworzeniu się spinki do włosów.
    4. Inkubować reakcje w termocyklerze działającym w następującym programie: 37 °C przez 20 s; 26 cykli (37 °C przez 3 min; 16 °C przez 4 min); 50 °C przez 5 min; 80 °C przez 5 min. Przekształć reakcje Golden Gate do Escherichia coli i płytkę na pożywce LB21 zawierającej ampicylinę (50 mg/L), X-Gal (200 mg/l) i IPTG (1 mM).
      UWAGA: Przygotować roztwory podstawowe IPTG i X-Gal odpowiednio w ultraczystej wodzie i dimetyloformamidzie. Przesączyć, wysterylizować roztwory podstawowe ampicyliny i IPTG i przechowywać wszystkie zapasy w temperaturze -20 °C. Podczas pracy z dimetyloformamidem należy nosić rękawice.
    5. Wybierz białe kolonie i wyizoluj plazmidy za pomocą komercyjnego zestawu do izolacji plazmidów. Zweryfikuj sekwencję izolowanych plazmidów przed kontynuowaniem montażu Golden Gate poziomu 2.
  3. Zbierz konstrukcje Golden Gate poziomu 2, aby dokonać stabilnej transformacji.
    1. Przeprowadź reakcję Golden Gate przy użyciu konstruktów AtU6p::sgRNA poziomu 1 (wygenerowanych zgodnie z sekcją 2.2), a także pICH47802::NPTII, pICH47742::35Spro::ΩNLS-aCas9::35Ster, akceptora poziomu 2 pICSL4723 i odpowiedniego łącznika końcowego (patrz Engler et al.22). Przeprowadź reakcje w następujący sposób: użyj ~100 fmol każdego wektora donorowego i ~20 fmol wektora akceptorowego i dodaj 2 μL buforu ligazy T4, 2 μL 0,1% BSA, 0,5 μL BpiI, 0,5 μL ligazy T4, napełnij do 20 μL ultraczystą wodą.
      UWAGA: Plazmidy poziomu 1 pICH47802::NPTII, pICH47742::35Spro::ΩNLS-aCas9::35Ster muszą być najpierw sklonowane (patrz Plik Uzupełniający 1), jak opisano dla sgRNA w sekcji 2.220,22,23.
    2. Przeprowadzić inkubację reakcji zgodnie z krokiem 2.2.4 i przekształcić się w E. coli. Płytka na podłożu LB zawierającym kanamycynę. Następnego dnia wybierz białe kolonie i wyizoluj plazmidy. Określ prawidłowe złożenie plazmidu za pomocą analizy trawienia restrykcyjnego.
  4. Przekształć konstrukty poziomu 2 w szczep Agrobacterium tumefaciens AGL124.

3. Stabilna transformacja P. andersonii

  1. Zaszczepić 2 płytki LB zawierające odpowiednie antybiotyki szczepem A. tumefaciens AGL1 przekształconym za pomocą interesującego konstruktu. Inkubować płytki w temperaturze 28 °C przez 2 dni.
  2. Zbieraj młode gałęzie z drzew uprawianych w szklarni. Do każdej transformacji użyj około 5 gałęzi o długości 5-8 cm. Upewnij się, że używasz tylko zdrowych, niezainfekowanych gałęzi. Usuń liście, przecinając je w taki sposób, aby na końcu każdego ogonka pozostało ~1cm2 tkanki liścia. Wyrzuć liście.
  3. Dezynfekuj tkankę przez 15 minut za pomocą komercyjnego wybielacza rozcieńczonego w stosunku 1:1 (~2% podchlorynu po rozcieńczeniu) zawierającego kilka kropli polisorbatu 20. Następnie spłucz tkankę 6 razy wodą z autoklawy.
    UWAGA: Ten krok, jak również następujące kroki, należy przeprowadzić w komorze z laminarnym przepływem w dół, aby utrzymać sterylność tkanek.
  4. Ponownie zawiesić komórki A. tumefaciens z 1-2 płytek w 25 ml pożywki infiltracyjnej (patrz Tabela 1) zawierającej acetosyringon (20 mg/L) i niejonowy środek powierzchniowo czynny (0,001% v/v), aby osiągnąć gęstość optyczną (OD600) ~5,
    UWAGA: Przygotować roztwór podstawowy acetosyringonu w 70% etanolu i przechowywać w temperaturze -20 °C. Niejonowy środek powierzchniowo czynny musi zostać wysterylizowany filtrem przed dodaniem do pożywki infiltracyjnej.
  5. Przeciąć zarówno tkankę łodygi, jak i ogonka liściowego na kawałki o długości ~1 cm wewnątrz zawiesiny A. tumefaciens, tworząc w ten sposób świeże rany po obu stronach. Pozostawić kawałki tkanek w zawiesinie A. tumefaciens na 10-30 min.
  6. Przygotować podłoże ukorzeniające (patrz Tabela 1) i dodać acetosyringon (20 mg/l) po sterylizacji w autoklawie. Wysuszyć kawałki tkanki na sterylnym kawałku bibuły filtracyjnej i umieścić je na pożywce (~10 eksplantatów/płytkę). Inkubować płytki w ciemności w temperaturze 21 °C przez 2 dni.
    UWAGA: Pozwól pożywce ostygnąć do ~60 °C przed dodaniem acetosyringonu.
  7. Po 2 dniach sprawdzić płytki pod kątem zanieczyszczenia grzybiczego lub oczywistego zanieczyszczenia bakteryjnego (bakterie inne niż A. tumefaciens). Zanieczyszczone płytki należy wyrzucić.
  8. Przygotować płynną pożywkę SH-10 (patrz Tabela 1). Po sterylizacji w autoklawie dodać polisorbat 20 (0,01%, v/v). Przenieść fragmenty tkanek do 10 ml SH-10 zawierającego polisorbat 20. Przez co najmniej 10 minut delikatnie mieszaj co 2-3 minuty, aby umyć chusteczkę.
  9. Przemyć jeszcze dwa razy świeżym SH-10 zawierającym polisorbat 20. W tych czasach wystarczy 2-3 minuty inkubacji na etap mycia.
  10. Przygotuj podłoże ukorzeniające (patrz Tabela 1). Po sterylizacji w autoklawie dodać cefotaksym (300 mg/l) i kanamycynę (50 mg/l) i wlać płytki. Do przemian wtórnych (przemian linii opornych na transgeniczną kanamycynę) należy zastosować selekcję higromycyny (15 mg/l).
  11. Wysuszyć kawałki tkanek na sterylnych kawałkach bibuły filtracyjnej. Następnie przenieść kawałki tkanek na płytki przygotowane w kroku 3.9.
  12. Inkubować płytki przez 7 dni w temperaturze 28 °C, 16 h: 8 h dzień: noc. Co 2 dni sprawdzaj płytki pod kątem zanieczyszczenia grzybiczego lub bakteryjnego i nadmiernego wzrostu A. tumefaciens. W przypadku zanieczyszczenia przenieś niezainfekowane kawałki na świeży talerz.
  13. Po 7 dniach przenieść fragmenty tkanek na pożywkę do rozmnażania (patrz Tabela 1) zawierającą cefotaksym (300 mg/l) i kanamycynę (50 mg/l). Inkubować płytki w temperaturze 28 °C, 16 h: 8 h dzień: noc. Odświeżaj talerze raz w tygodniu, aż rozwiną się pędy transgeniczne. Upewnij się, że na świeże płytki przenoszone są tylko niezakażone kawałki tkanki. Wyrzuć kawałki, które są przerośnięte przez A. tumefaciens.
  14. Gdy przypuszczalnie transgeniczne pędy osiągną ≥1 cm długości, należy je przyciąć i hodować niezależnie w pożywce rozmnożeniowej zawierającej cefotaksym (300 mg/l) i kanamycynę (50 mg/l). Aby upewnić się, że pędy reprezentują niezależne transformanty, weź tylko jeden pęd z każdej strony eksplantatu.
  15. Rozmnażaj wegetatywnie pędy przypuszczalnie transgeniczne, jak opisano w kroku 5.2.

4. Genotypowanie pędów przypuszczalnie transgenicznych

  1. Zaprojektuj startery obejmujące miejsce (miejsca) rozpoznawania sgRNA. Aby umożliwić sekwencjonowanie amplikonów PCR, wybierz startery w odległości 150-250 pz od miejsca (miejsc) rozpoznawania sgRNA.
  2. Odetnij końcówkę liścia (~5 mm) z każdego pędu transgenicznego, który ma zostać poddany genotypowi. Zbierz również próbkę kontrolną typu dzikiego.
  3. Wykonaj reakcje PCR o objętości 50 μl, używając starterów zaprojektowanych w kroku 4.1 i komercyjnego zestawu do bezpośredniej amplifikacji DNA z próbek roślinnych. Alternatywnie, reakcje PCR można przeprowadzić na oczyszczonym DNA przy użyciu polimerazy o wysokiej wierności.
  4. Oddziel amplikony PCR na 1,5-2% żelu agarozowym.
  5. Przeanalizuj wyniki elektroforezy żelowej. Sprawdź, czy w próbkach nie ma wielu prążków (więcej niż 1 allelu) i amplikonów PCR o rozmiarach innych niż typ dziki, co wskazuje na obecność średniej wielkości indeli.
  6. Sekwencjonuj amplikony PCR, aby zidentyfikować dokładne mutacje. W przypadku próbek, w których powstaje pojedynczy amplikon PCR, produkty PCR można sekwencjonować bezpośrednio. Próbki, które wytwarzają więcej niż 1 prążek po elektroforezie żelowej lub które wydają się być heterozygotyczne po bezpośrednim sekwencjonowaniu amplikonu PCR, muszą najpierw zostać sklonowane do wektora klonowania o końcu. Następnie sekwencjonuj wiele klonów dla każdej próbki, aby zidentyfikować wszystkie możliwe allele obecne w próbce.
  7. Dopasuj wyniki sekwencjonowania do genu będącego przedmiotem zainteresowania i sprawdź dopasowanie, aby sprawdzić, czy nie ma mutacji w pobliżu miejsca docelowego (miejsc) docelowego sgRNA. Następnie sprawdź, czy te mutacje tworzą przesunięcia ramek. Odrzuć linie z allelami > 2 i linie zawierające mutacje w ramce.
  8. Wybierz kilka wierszy do dalszej analizy.
  9. Propaguj wybrane linie zgodnie z opisem w kroku 5.2.
  10. Gdy linie rozwiną kilka nowych pędów, pobierz nowe próbki z ≥3 końcówek liści i powtórz kroki 4.3-4.7. Określ, czy mutacje obecne w każdej z próbek pochodzących z tej samej linii, jak również w oryginalnej próbce PCR, są identyczne. Linie, które dają te same mutacje we wszystkich próbkach, są jednorodnie zmutowane i mogą być wykorzystane do dalszych eksperymentów. Odrzuć linie, które nie dają takich samych wyników, jak te linie, które są chimeryczne.

5. Przygotowanie ukorzenionych sadzonek P. andersonii do eksperymentów

  1. Zainicjuj nową linię hodowli tkankowych P. andersonii.
    1. Zbieraj pąki pachowe, młode pędy przybyszowe lub tkankę liściową ze zdrowych drzew. Alternatywnie sadzonki mogą być używane jako materiał wyjściowy.
    2. Zdezynfekuj tkankę za pomocą dostępnego w 1:1 komercyjnego wybielacza (~2% podchlorynu po rozcieńczeniu) zawierającego kilka kropli polisorbatu 20 przez 15 min. Następnie spłucz tkankę 6 razy wodą w autoklawie.
      UWAGA: Ten krok, jak również następujące kroki, należy przeprowadzić w komorze z laminarnym przepływem zstępującym lub laminarnym przepływem krzyżowym, aby utrzymać sterylność tkanki.
    3. Przenieść tkankę na pożywkę do rozmnażania (patrz Tabela 1). Zamknąć płytki 2 warstwami elastycznej folii uszczelniającej i inkubować płytki w temperaturze 28 °C, 16 h: 8 h dzień: noc.
    4. Sprawdzaj płytki co kilka dni przez pierwsze 2 tygodnie, aby upewnić się, że tkanka jest wolna od zanieczyszczeń grzybiczych lub bakteryjnych.
  2. Rozmnażaj tkankę, umieszczając ~10 pędów na świeżej płytce pożywki rozmnożeniowej i zamknij płytkę 2 warstwami elastycznej folii uszczelniającej. Inkubować płytki w temperaturze 28 °C, 16 h: 8 h dzień: noc. Powtarzaj ten krok co 4 tygodnie.
  3. Gdy pędy osiągną długość >1 cm, należy je przyciąć u podstawy i umieścić na podłożu ukorzeniającym (patrz tabela 1). Na jednej płytce ukorzeniającej można umieścić około 10 pędów. Ustaw pędy w pozycji pionowej, wkładając podstawowy wierzchołek pędu do podłoża. Korzenie pojawiają się po 10-14 dniach od inkubacji płytek w temperaturze 28 °C, 16 h:8 h dzień:noc.
    UWAGA: Nie ukorzeniaj wszystkich pędów, ale zachowaj część do rozmnażania kultur tkankowych (patrz krok 5.2).

6. Brodawkowanie sadzonek P. andersonii w doniczkach

  1. Przygotować inokulum rhizobium.
    1. Zaszczepić 10 ml płynnej pożywki YEM (patrz Tabela 2) z pojedynczej kolonii Mesorhizobium plurifarium BOR26 i inkubować w temperaturze 28 °C przez 2 dni.
      UWAGA: M. plurifarium BOR2 jest preferowany, ponieważ skutecznie brodawkuje P. andersonii. Jednak inne szczepy rhizobium mogą być również używane do brodawkowania P. andersonii (np. Bradyrhizobium elkanii WUR325, Rhizobium tropici CIAT89926,27 lub Bradyrhizobium sp. Kelud2A4).
    2. Użyj 10 ml kultury, aby zaszczepić większą objętość płynnej pożywki YEM. Objętość tej kultury zależy od liczby doniczek, które należy zaszczepić.
    3. Przygotować płynną pożywkę EKM (patrz Tabele 3, Tabela 4). Odwirować kulturę bakteryjną przez 10 minut przy 3 500 x g w celu zebrania komórek. Następnie ponownie zawiesić osad bakteryjny w płynnym EKM (użyć w przybliżeniu tej samej objętości, co oryginalna hodowla YEM) i określić gęstość optyczną (OD600).
  2. Dla ~20 doniczek przygotuj 3 l płynnej pożywki EKM i zaszczepij zawiesiną ryzobialną przygotowaną w kroku 6.1.3, aby osiągnąć OD600 = 0,025.
  3. Zmieszaj 3 litry EKM zawierającego ryzobię z 1 250 g perlitu. Następnie dodaj 210 g tej mieszanki do sterylnych półprzezroczystych garnków polipropylenowych. Alternatywnie, zamiast perlitu, użyj piasku jako podłoża do testów nodulacji.
  4. Posadź 1-3 sadzonki P. andersonii w każdej doniczce. Przygotuj również kilka doniczek zawierających sadzonki P. andersonii przekształcone za pomocą konstruktu kontrolnego CRISPR (patrz Tabela Uzupełniająca 1). Zważ kilka doniczek, aby móc określić utratę wody podczas eksperymentu. Przykryj dno każdej doniczki, aby chronić korzenie przed światłem.
  5. Inkubować doniczki w klimatyzowanym pomieszczeniu do uprawy (28 °C, 16 h: 8 h dzień: noc) przez 4-6 tygodni. Raz w tygodniu zważ kilka doniczek, aby określić utratę wody. Jeśli utrata wody przekracza 10 ml, uzupełnij ją ultraczystą wodą, aby zrekompensować ubytek.
  6. Po 4-6 tygodniach oczyść korzenie z perlitu i określ liczbę guzków za pomocą lornetki, aby zbadać skuteczność guzków.

7. Nodulacja sadzonek P. andersonii na talerzach

  1. Przygotuj membrany celofanowe28.
    1. Wytnij membranę celofanową tak, aby zmieściła się w kwadratowej szalce Petriego o wymiarach 12 cm x 12 cm. Przytnij błony nieco krótsze u góry, aby zapewnić miejsce na wzrost pędów.
    2. Aby zwiększyć przepuszczalność membran celofanowych, gotuj membrany w roztworze EDTA (1 g/L) przez 20 minut. Następnie spłucz co najmniej 6x wodą demineralizowaną, aby usunąć EDTA.
      UWAGA: Ponieważ sucha membrana ma tendencję do marszczenia się w kontakcie z wodą, zanurzaj suche membrany jedna po drugiej w roztworze.
    3. Ułóż membrany poziomo w cienkiej warstwie wody na okrągłej szklanej płycie. Wysterylizuj membrany przez dwukrotne autoklawowanie.
  2. Umieścić 1 autoklawowaną membranę celofanową na kwadratowej szalce Petriego o wymiarach 12 x 12 cm zawierającej zestaloną pożywkę EKM zestaloną z agarem (patrz Tabela 3, Tabela 4). Umieść dwie 3-tygodniowe ukorzenione sadzonki P. andersonii (patrz sekcja 5) lub 4-tygodniowe siewki (patrz sekcja 1.1) na wierzchu błony. Upewnij się, że zbierasz tylko sadzonki lub sadzonki, których korzenie mają białe końcówki, co wskazuje, że te korzenie nadal rosną.
  3. Delikatnie przykryj korzenie drugą membraną celofanową, tworząc warstwę warstwową. Uszczelnij płytkę 3 warstwami elastycznej folii uszczelniającej. Owiń dolną połowę talerzy folią aluminiową, aby przykryć korzenie przed światłem.
  4. Inkubować płytki w klimatyzowanym pomieszczeniu do wzrostu (28 °C, 16 h: 8 h dzień: noc) przez 3-4 tygodnie. Zaznacz położenie końcówek korzeni, aby śledzić wzrost korzeni w czasie.
  5. Jeśli płytki EKM zaczną wysychać z powodu długotrwałej inkubacji, przenieś rośliny na świeże płytki EKM na kilka dni przed inokulacją bakterii.
  6. Przygotować inokulum bakteryjne zgodnie z opisem w kroku 6.1.
  7. Usuń górną membranę celofanową i nałóż 1 ml kultury rhizobium (OD600 = 0,025) na korzenie. Następnie umieść nową membranę celofanową na zaszczepionych korzeniach. Owiń zewnętrzną stronę talerza folią aluminiową, aby przykryć korzenie przed światłem.
  8. Po 4 tygodniach zbadaj liczbę guzków za pomocą lornetki, aby określić skuteczność guzków.

8. Nodulacja siewek P. andersonii w torebkach

  1. Kiełkować nasiona P. andersonii zgodnie z opisem w sekcji 1.1. Po całkowitym pojawieniu się liścieni (~12 dni na płytkach SH-0 w temperaturze 28 °C) przenieś sadzonki do torebek.
  2. Aby przygotować woreczki, oderwij zagiętą część papierowego i dodaj 7 ml zmodyfikowanego podłoża EKM (patrz Tabela 3, Tabela 4).
  3. Włóż 1 lub 2 sadzonki, umieszczając korzenie między obydwoma arkuszami papieru, które tworzą papierowy, a przednim plastikowym arkuszem torebki.
  4. Osłoń korzenie przed ekspozycją na światło, składając folię aluminiową wokół torebki. Zawieś woreczki w plastikowym pudełku przykrytym półprzezroczystą pokrywką, aby utrzymać wysoką wilgotność. Umieść pudełko w klimatyzowanym pomieszczeniu do uprawy (28 °C, 16 h:8 h dzień:noc).
  5. Skompensuj parowanie wody, dodając sterylną ultraczystą wodę, tak aby papierowy pozostał wilgotny (unikaj stojącej wody na dnie torebki). Po pierwszym tygodniu zwykle wymaga to dodawania 2-3 ml co 4 dni.
  6. Przygotować inokulum bakteryjne zgodnie z opisem w kroku 6.1.
  7. Po 10-12 dniach uprawy sadzonek w torebkach należy zaszczepić system korzeniowy 500 μl kultury ryzobium (OD600 = 0,025).
  8. Śledź tworzenie się guzków w czasie. Cztery tygodnie po inokulacji guzki można policzyć i zebrać w celu określenia skuteczności brodawki.

9. Analiza cytoarchitektury guzków

  1. Zebrać 10-15 guzków w probówce o pojemności 2 ml zawierającej utrwalacz (5% aldehydu glutarowego w 0,1 M buforze fosforanowym, pH 7,2). Stosować próżnię przez 1/2-1 godzinę i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C. W tym okresie próbki opadają na dno probówki.
    UWAGA: Roztwór utrwalający można przechowywać w temperaturze 4 °C przez ~2-4 tygodnie przed użyciem. Upewnij się, że nosisz rękawiczki podczas pracy z utrwalaczem tkankowym.
  2. Przemyć guzki 2x 0,1 M buforem fosforanowym o pH 7,2. Stosuj 10-minutowe odstępy między każdym etapem prania.
  3. Odwodnić próbki, a następnie inkubować je w 30%, 50%, 70% i 100% etanolu. Aby upewnić się, że cała woda została usunięta z próbek, powtórz krok 100% etanolu 3 razy. Stosuj 10-minutowe odstępy między każdym etapem odwadniania.
  4. Przygotować mieszaninę polimeryzacyjną I (PM-I), dodając 1 opakowanie utwardzacza I do 2,5 ml PEG400 zmieszanego ze 100 ml roztworu żywicy na bazie HEMA (metakrylanu 2-hydroksyetylu). Mieszaj roztwór przez ~15 minut, aby całkowicie rozpuścić utwardzacz I. Następnie przechowywać PM-I w temperaturze -20 °C.
  5. Usunąć etanol z kroku 9.3 i infiltrować próbki w następującej kolejności: PM-I: 100% etanolu (1:3, v/v), PM-I: 100% etanolu (1:1, v/v) i PM-I: 100% etanolu (3:1, v/v). Próbki należy inkubować w każdym roztworze w temperaturze pokojowej przez 1/2–1 godzinę lub do momentu, gdy próbki opadną na dno.
  6. Próbki inkubować przez noc w temperaturze 4 °C w 100% roztworze PM-I.
  7. Przygotować mieszaninę polimeryzacyjną II, mieszając PM-I i utwardzacz II w stosunku 15:1 (v/v). Napełnij plastikową formę roztworem polimeryzacyjnym, ustaw próbki poziomo na dnie formy i przykryj kawałkiem elastycznej folii uszczelniającej. Unikaj tworzenia się pęcherzyków powietrza.
    UWAGA: Ponieważ roztwór zaczyna polimeryzować po wystawieniu na działanie RT, należy starać się jak najszybciej zorientować próbki w plastikowym uchwycie. Polimeryzacja jest zakończona po całonocnej inkubacji w temperaturze pokojowej lub 1 godzinie w temperaturze 37 °C.
  8. Zdjąć osłonę z elastycznej folii uszczelniającej z kroku 9.7 i umieścić uchwyt na spolimeryzowanych próbkach. Aby zamontować uchwyt na próbkach, należy rozpuścić 10 ml proszku żywicy na bazie metakrylanu metylu w 5 ml roztworu żywicy na bazie metakrylanu metylu. Szybko dodaj roztwór do otworu w górnej części uchwytu.
    UWAGA: Wykonać etap polimeryzacji w dygestoriach (~30 min przy RT).
  9. Mikrotomowy przekrój próbki o grubości 4-5 μm. Umieścić szkiełko mikroskopowe na płycie grzejnej o temperaturze 58 °C i dodać dużą kroplę wody do każdego szkiełka. Umieść sekcje na wierzchu wody. Gdy woda odparuje, sekcje będą przylegać do zjeżdżalni.
  10. Barwienie szkiełkuje przez zanurzenie w 0,05 % (w/v) błękitu toluidynowym na 2 min. Następnie spłucz szkiełka 3x ultraczystą wodą. Szkiełka można obserwować za pomocą mikroskopu jasnego pola.

10. Mikoryzacja sadzonek P. andersonii

  1. Przygotować inokulum zarodników Rhizophagus irregularis
    1. Przygotuj stos filtrów poliestrowych o następujących rozmiarach (od góry do dołu): 210 μm, 120 μm i 36 μm.
    2. Odpipetować wymaganą ilość dostępnej w handlu zawiesiny zarodników na stos filtrów poliestrowych. Przepłucz filtry 3x 100 ml autoklawowanej wody demineralizowanej. Zarodniki są zatrzymywane na powierzchni filtra 36 μm.
      UWAGA: Przygotuj zawiesinę zarodników w komorze z laminarnym przepływem krzyżowym, aby zapobiec zanieczyszczeniu.
    3. Zdemontuj stos poliestru i zachowaj tylko filtr 36 μm. Powtórz etap mycia autoklawowaną wodą demineralizowaną przez co najmniej 6 razy.
    4. Umieść filtr na szalce Petriego i ponownie zawiesij zarodniki w autoklawowanej wodzie demineralizowanej. Użyć objętości wody równej objętości zawiesiny zarodników użytej w kroku 10.1.2. Przenieść zawiesinę zarodników do sterylnej probówki za pomocą pipetowania.
    5. Umieścić 5 kropli po 20 μl zawiesiny zarodników na szkiełku podstawowym i policzyć liczbę zarodników za pomocą mikroskopu jasnego pola. Przelicz liczbę zarodników na stosunek zarodników/ml i rozcieńcz zawiesinę zarodników, aż osiągnie 250 zarodników/ml. Zawiesinę zarodników przechowywać w temperaturze 4 °C.
  2. Wykonaj test mikoryzacji. W tym celu dodać 800 g autoklawizowanego piasku uzupełnionego 70 ml pożywki 1/2-Hoagland do sterylnych półprzezroczystych doniczek polipropylenowych (patrz tabele 5-6). Wymieszaj piasek i podłoże bezpośrednio w doniczce, energicznie wstrząsając.
  3. Umieść jedną sadzonkę P. andersonii w każdej doniczce i odpipetuj 1 ml zawiesiny zarodników bezpośrednio na korzeń sadzonki P. andersonii. Upewnij się, że dołączyłeś kilka doniczek zawierających sadzonki P. andersonii przekształcone za pomocą konstruktu kontrolnego CRISPR (patrz Tabela uzupełniająca 1).
  4. Inkubować doniczki w klimatyzowanym pomieszczeniu do uprawy (28 °C, 16 h: 8 h dzień: noc) przez 6 tygodni.
  5. Wyjmij rośliny z doniczek i umyj korzenie pod bieżącą wodą, aby usunąć jak najwięcej piasku.
  6. Pokrój korzenie na kawałki o długości 1 cm i gotuj je w 10% KOH (w/v) przez 20 minut w temperaturze 90 °C. Następnie ugotowane korzenie umieścić na sitku o rozmiarze oczek 100 μm i spłukać 3x 50 ml wody.
  7. Zabarwić korzenie 0,05% (w/v) błękitem trypanowym w laktoglicerolu (300 ml kwasu mlekowego, 300 ml glicerolu i 400 ml wody demineralizowanej) przez 5 minut w temperaturze 90 °C w łaźni wodnej lub bloku grzewczym. Następnie przenieś korzenie do 30% glicerolu. Próbki korzeni mogą być przechowywane w RT.
  8. Umieść 15-25 fragmentów korzeni na jednym szkiełku mikroskopowym. Dodaj 30% glicerolu i przykryj szklanką i dociśnij, aż kawałki korzeni staną się płaskie. Obserwuj fragmenty korzeni za pomocą mikroskopu jasnego pola i oceń kolonizację mikoryzową.
    UWAGA: Metoda oceny mikoryzacji jest opisana zgodnie z Trouvelot et al.29. Metoda ta wykorzystuje kilka klas (%F, %M i %A), co pozwala na szybkie oszacowanie poziomu kolonizacji mikoryzowej każdego fragmentu korzenia i obfitości arbusculi.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

P. andersonii trees mogą być uprawiane w klimatyzowanej szklarni w temperaturze 28 °C i wilgotności względnej ~85% (Rysunek 1A). W tych warunkach drzewa zaczynają kwitnąć po 6-9 miesiącach od posadzenia. Żeńskie kwiaty P. andersonii wytwarzają jagody, z których każda zawiera pojedyncze nasiono. Podczas dojrzewania jagody zmieniają kolor; najpierw od zielonego do białego, a następnie od białego do brązowego (Rysunek 1B). Nasiona wyekstrahowane z dojrzałych brązowych jagód dobrze kiełkują po 10-dniowym cyklu temperaturowym i 7-dniowej inkubacji na płytkach SH-0 (Rysunek 1C). Kiełkujące nasiona rozwijają się w młode siewki, które można wykorzystać do eksperymentów po ~4 tygodniach (Rysunek 1D).

Wcześniej pokazaliśmy, że ogonki liściowe i segmenty młodych łodyg P. andersonii mogą być efektywnie przekształcane za pomocą szczepu A. tumefaciens AGL110. Na początku procedury transformacji, eksplantaty tkankowe są współhodowane z A. tumefaciens przez 2 dni w temperaturze 21 °C (Rysunek 2A). Długotrwała kohodowla powoduje nadmierną kolonizację eksplantatów tkankowych przez A. tumefaciens i dlatego należy jej zapobiegać (Rysunek 2B). Po okresie wspólnej uprawy eksplantaty tkankowe są przenoszone na selektywne podłoża, co sprzyja wzrostowi przekształconej tkanki. Dwa do trzech tygodni później małe zielone mikro-kalusy są zazwyczaj obserwowane wzdłuż pierwotnej powierzchni rany (Ryc. 2C). Te kaliso powinny nadal rosnąć i rozwijać 1 lub więcej przypuszczalnie przekształconych pędów po 6-8 tygodniach od rozpoczęcia procedury transformacji (Rysunek 2D). Na tym etapie wydajność transformacji zwykle waha się od ~10 do 30% dla przemian zainicjowanych eksplantatami tkanek pobranymi z dojrzałych i częściowo zdrewniałych gałęzi (Tabela 7). Jeśli przemiany są inicjowane za pomocą eksplantatów pobranych z młodych i szybko rosnących końcówek gałęzi, które nie dają jeszcze kwiatów, można osiągnąć wydajność transformacji na poziomie ~65-75% (Tabela 7). Czasami białawe kalusy tworzą się po stronie eksplantatu, który nie ma kontaktu z podłożem i dlatego nie doświadczają selekcji kanamycyny. Te kalie często nie są transgeniczne, a wszelkie pędy utworzone z tych kalii na ogół bieleją i umierają po bezpośrednim kontakcie z podłożem zawierającym kanamycynę (Ryc. 2E). W przypadku, gdy szybkość przemiany jest niska i/lub materiał wyjściowy był nieoptymalny, kawałki tkanek mogą stać się brązowe ( Rysunek 2F) i cierpieć z powodu nadmiernej proliferacji przez A. tumefaciens (Figura 2G). Aby zapobiec rozprzestrzenianiu się A. tumefaciens i zarastaniu pobliskich eksplantatów, wymagane jest regularne odświeżanie podłoża i usuwanie silnie zainfekowanych eksplantatów. Po umieszczeniu pojedynczych pędów transgenicznych w pożywce rozmnożeniowej, nadmierna proliferacja przez A. tumefaciens na ogół już nie występuje (Rysunek 2H). Pędy transgeniczne mogą być rozmnażane poprzez rozmnażanie in vitro, co da początek dziesiątkom pędów w okresie jednego miesiąca (Rysunek 3A-B). Pędy te można umieścić na podłożu ukorzeniającym, które powinno wywołać ukorzenienie po ~2 tygodniach (Rysunek 3C-D). Ukorzenione sadzonki można następnie wykorzystać do eksperymentów.

Aby stworzyć linie mutantów nokautujących, używamy mutagenezy za pośrednictwem CRISPR/Cas9. W tym celu wykorzystujemy wektor binarny zawierający gen oporności na kanamycynę NPTII, sekwencję kodującą Cas9 sterowaną przez promotor CaMV35S i 2 sgRNA na gen docelowy, które ulegają ekspresji z małego promotora RNA AtU6p20. Graficzna reprezentacja konstruktu używanego do mutagenezy P. andersonii za pośrednictwem CRISPR/Cas9 znajduje się w Rysunek 4A. Korzystając z tej metody, edycję genomu obserwuje się w ~40% przypuszczalnie przekształconych pędów10. Aby zidentyfikować zmutowane linie, przypuszczalnie przekształcone pędy są genotypowane pod kątem mutacji w miejscu docelowym sgRNA przy użyciu starterów obejmujących region docelowy. Przykład oczekiwanych wyników znajduje się w Rysunek 4. Jak widać na zdjęciu wykonanym po elektroforezie żelowej, w kilku próbkach powstaje amplikon PCR o wielkości podobnej do typu dzikiego (Rysunek 4B). Rośliny te mogą zawierać małe indele, których nie można uwidocznić za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym lub pozostają nieedytowane przez enzym Cas9. Dodatkowo, kilka próbek daje pasma, które różnią się rozmiarem od typu dzikiego (np. linie 2, 4, 7 i 8 w Rysunek 4B). W tych liniach 1 (linie 4, 7 i 8) lub oba (linia 2) allele zawierają większe indele, które można łatwo zwizualizować. Dokładny charakter mutacji w miejscu docelowym (miejscach docelowych) ujawnia się po sekwencjonowaniu amplikonów PCR. Jak widać z Rysunek 4C, zarówno małe indele 1-4 pz, jak i większe delecje można uzyskać po mutagenezie CRISPR/Cas9. W Rysunek 4C, sekwencja linii 1 jest identyczna jak w przypadku dzikiego typu, co wskazuje, że ta linia nie została edytowana i dlatego powinna zostać odrzucona. Wśród linii, które zawierają mutacje, można zidentyfikować mutanty heterozygotyczne, homozygotyczne i bi-alleliczne (Rysunek 4C). Jednak heterozygotyczne mutanty są na ogół rzadkie10. Homozygotyczne lub bi-alleliczne mutanty nokautujące mogą być rozmnażane wegetatywnie w celu uzyskania wystarczającego materiału do analizy fenotypowej. Ponieważ analiza fenotypowa jest przeprowadzana w pokoleniu T0, ważne jest, aby sprawdzić, czy zmutowane linie mogą być chimeryczne. W tym celu genotypowanie należy powtórzyć na co najmniej 3 różnych próbkach pobranych z każdej linii mutantów. Jeśli wyniki genotypowania są identyczne ze sobą i z oryginalną próbką genotypowania (np. linia 8 w Rysunek 4D), linia jest jednorodnie zmutowana i może być wykorzystana do dalszej analizy. Jeśli jednak wyniki genotypowania różnią się między niezależnymi próbkami (np. linia 4 w Rysunek 4D), zmutowana linia jest chimeryczna i należy ją odrzucić.

Inokulacja P. andersonii M. plurifarium BOR2 powoduje powstawanie guzków korzeniowych (Rysunek 5). Jak widać na Rysunek 5A, guzki te są rozmieszczone wzdłuż systemu korzeniowego. Guzki P. andersonii są koloru jasnobrązowego, ale można je łatwo odróżnić od tkanki korzenia na podstawie ich kształtu (Ryc. 5B). Eksperymenty z inokulacją w doniczkach i późniejszy wzrost przez 4-6 tygodni zazwyczaj skutkują powstaniem ~10-30 guzków (Rysunek 6A). Podobna liczba guzków powstaje po inokulacji sadzonek P. andersonii uprawianych na płytkach EKM po 4 tygodniach od inokulacji (Ryc. 6A). W torebkach siewki P. andersonii zazwyczaj tworzą ~ 5-15 guzków po 5 tygodniach od zaszczepienia (Rysunek 5C-D, 6A). Aby przeanalizować cytoarchitekturę guzków, guzki można podzielić i obserwować za pomocą mikroskopii jasnego pola. Rysunek 6B pokazuje przykład przekroju podłużnego przez środek guzka P. andersonii. Ta sekcja pokazuje centralny pęczek naczyniowy guzka P. andersonii, który jest otoczony płatami guzków zawierającymi zakażone komórki (Ryc. 6B).

Sadzonki P. andersonii mogą być również mikoryzowane. Po 6 tygodniach od inokulacji R. irregularis, częstość kolonizacji mikoryzowej zwykle osiąga > 80% (Ryc. 6C). W tym momencie zazwyczaj ~30% komórek zawiera arbuskule (Rysunek 6C). Reprezentatywny obraz segmentu korzenia P. andersonii zawierającego arbuscles pokazano na Rysunek 6D.

figure-results-1
Rysunek 1: Reprezentatywne zdjęcia drzewa P. andersonii, nasion i siewek. (A) Sześciomiesięczne drzewo P. andersonii rosnące w glebie doniczkowej w szklarni kondycjonowanej w temperaturze 28 °C. (B) Reprezentatywne zdjęcie przedstawiające jagody P. andersonii na różnych etapach dojrzewania. Młode jagody P. andersonii (niedojrzałe) po dojrzewaniu zmieniają kolor z zielonego na biały i ostatecznie na brązowy (dojrzały). (C) Nasiona P. andersonii inkubowane na pożywce SH-0 przez 1 tydzień. Czarne kółko oznacza kiełkującą sadzonkę. (D) Czterotygodniowe siewki P. andersonii uprawiane na podłożu SH-0. Paski skali są równe 25 cm cala (A) i 1 cm cala (BD). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Reprezentatywne obrazy eksplantatów na różnych etapach procedury stabilnej transformacji. (A) Eksplant uprawiany wspólnie z A. tumefaciens. (B) Eksplantat zarośnięty przez A. tumefaciens w ciągu pierwszych 2 tygodni po transformacji. (C) Transgeniczny mikrokalus utworzony w pobliżu miejsca rany eksplantatu po 2,5 tygodnia od kohodowli. (D) Reprezentatywne zdjęcie eksplantacji po 6 tygodniach od kouprawy, pokazujące pojawienie się pędów z (transgenicznych) kalii. (E) Reprezentatywny obraz pędu, który staje się białawy i ostatecznie obumiera w bezpośrednim kontakcie z podłożem zawierającym kanamycynę. Ten pęd jest najprawdopodobniej nietransgeniczny i uciekł przed selekcją kanamycyny, gdy jest przyczepiony do eksplantatu. (F) Reprezentatywny obraz nieudanego eksplantatu. (G) Reprezentatywny obraz nieudanego transformatora przerastającego A. tumefaciens. (H) Pojedynczy pęd transgeniczny wyhodowany na pożywce rozmnożeniowej po 8 tygodniach od kouprawy z A. tumefaciens. Podziałka wynosi 2,5 mm. Pola zawierające zielone znaczniki wyboru lub czerwone krzyżyki oznaczają, odpowiednio, udaną lub nieudaną transformację eksplantatów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Reprezentatywne obrazy rozmnażania in vitro. (A) Pędy wyhodowane na pożywce rozmnożeniowej. Zdjęcie zostało wykonane 1 tydzień po odświeżeniu płyt. (B) Pędy wyhodowane na podłożu rozmnożeniowym. Zdjęcie zostało wykonane 4 tygodnie po odświeżeniu płyt. (C) Świeżo ścięte pędy umieszczone na podłożu ukorzeniającym. (D) Pędy inkubowane na podłożu ukorzeniającym przez 2 tygodnie. Zwróć uwagę na obecność korzeni. Podziałka skali jest równa 2,5 cm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Reprezentatywne wyniki po genotypowaniu transgenicznych linii mutantów P. andersonii T0 CRISPR/Cas9. (A) Reprezentatywna mapa wektora binarnego używanego do mutagenezy P. andersonii za pośrednictwem CRISPR/Cas9. (B) Reprezentatywny wynik po genotypowaniu opartym na PCR potencjalnych linii mutantów CRISPR/Cas9 przy użyciu starterów obejmujących miejsce docelowe (miejsca) docelowe sgRNA. Pokazany jest obraz po elektroforezie amplikonów w żelu agarozowym. Próbki pobrane z poszczególnych linii transgenicznych są oznaczone numerami. Typ dziki (WT) i brak kontroli szablonowej (NTC) wskazują pasy, na których znajdują się odpowiednio kontrole dodatnie i ujemne. (C) Schematyczne przedstawienie zmutowanych alleli uzyskanych po edycji genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9. Na niebiesko i czerwono zaznaczone są odpowiednio miejsca docelowe sgRNA i sekwencje PAM. (D) Reprezentatywny wynik po badaniach przesiewowych opartych na PCR pod kątem potencjalnych linii zmutowanych chimerycznych. Pokazano obraz po elektroforezie w żelu agarozowym 3 pojedynczych próbek pobranych z linii 4 i 8 mutanta. Zauważ, że transgeniczna zmutowana linia 4 jest chimeryczna. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rycina 5: Reprezentatywne obrazy testów guzkowania na płytkach i torebkach. (A) Brodulacja na płytkach zawierających zestaloną pożywkę EKM zestaloną z agarem i inokulowana M. plurifarium BOR2 przez 4 tygodnie. (B) Reprezentatywny obraz guzka korzeniowego P. andersonii. Zdjęcie zostało wykonane 4 tygodnie po inokulacji M. plurifarium BOR2. (C) Brodawkowanie w torebkach zawierających płynną pożywkę EKM. Sadzonki zaszczepiono preparatem Bradyrhizobium sp. Kelud2A4 przez 5 tygodni. (D) Reprezentatywny obraz kompletnego zestawu używanego do brodawkowania w torebkach. Paski skali są równe 2,5 cm cala (A,C), 1 mm cala (B) i 5 cm cala (D). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 6: Reprezentatywne wyniki testów guzkowania i mikoryzacji. (A) Reprezentatywny wykres słupkowy przedstawiający liczbę guzków utworzonych na roślinę po 4 tygodniach od inokulacji M. plurifarium BOR2 w doniczkach lub na płytkach oraz po 5 tygodniach od inokulacji Bradyrhizobium sp. Kelud2A4 w woreczkach. Dane reprezentują średnią ± SD (n = 10). (B) Reprezentatywny obraz przekroju podłużnego przez guzek utworzony po 4 tygodniach od inokulacji M. plurifarium BOR2. Przekrój jest zabarwiony błękitem toluidyny. (C) Reprezentatywny wykres słupkowy przedstawiający kwantyfikację mikoryzacji. Zmienne określone ilościowo zgodnie z Trouvelot et al.29 to F, częstotliwość analizowanych fragmentów korzeni, które są mikoryzowane; M, intensywność infekcji; A, obfitość dojrzałych arbuskul w całym systemie korzeniowym. Mikoryzację określono ilościowo po 6 tygodniach od inokulacji R. irregularis (szczep DAOM197198). Dane reprezentują średnią ± SD (n = 10). (D) Reprezentatywny obraz dojrzałych arbuskul obecnych w komórkach korowych korzenia P. andersonii po 6 tygodniach od inokulacji R. irregularis. Podziałka skali wynosi 75 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

powiedział: podstawowe
związekSH-0Zobacz materiał SH-10Pożywka propagacyjnaPodłoże ukorzeniającePodłoże infiltracyjne
SH-podłoże solne3,2 grama3,2 grama3,2 grama3,2 grama3,2 grama
Mieszanina witamin SH1 gramów1 gramów1 gramów1 gramów1 gramów
sacharoza-10 gramów20 gramów10 gramów10 gramów
BAP (1 mg/ml)--1 ml (4,44 μM)--
IBA (1 mg/ml)--100 μL (0,49 μM)1 ml (4,92 μM)-
NAA (1 mg/ml)---100 μL (0,54 μM)-
1 M MES pH=5,83 ml3 ml3 ml3 ml3 ml
1 mln KOHDostosuj pH do 5,8Dostosuj pH do 5,8Dostosuj pH do 5,8Dostosuj pH do 5,8Dostosuj pH do 5,8
Agar Daishin8 gramów-8 gramów8 gramów-

Tabela 1: Skład pożywki opartej na Schenk-Hildebrandt30 używanych do hodowli siewek P. andersonii, stabilnej transformacji i rozmnażania in vitro. Rozpuść związki stałe w 750 ml ultraczystej wody przed dodaniem płynnych bulionów. Następnie napełnić całe podłoże do 1 l. Przygotować zapasy BAP, IBA, NAA w 0,1 M KOH i przechowywać w temperaturze -20 oC.

Przed autoklawowaniem:
związekIlość na litrKońcowe stężenie
Mannitol5 gramów27,45 mln
Na-glukonian5 gramów22,92 mln
Ekstrakt drożdżowy0,5 grama-
MgSO4·7H2O0,2 grama0,81 mM
Zawartość NaCl0,1 grama1,71 mln
K2HPO40,5 grama2,87 mln
Po sterylizacji w autoklawie:
związekIlość na litrKońcowe stężenie
1,5 m CaCl21 ml1,5 mM

Tabela 2: Skład pożywki drożdżowo-mannitolowej (YEM) używanej do uprawy rhizobium. Dostosuj pH do 7,0 i napełnij ultraczystą wodą do 1 l. Aby przygotować zestaloną pożywkę YEM z agarem, dodaj 15 g mikroagaru przed autoklawowaniem.

Przed autoklawowaniem:
związekKoncentracja zapasówIlość na litr podłożaKońcowe stężenie
KH2PO40,44 mlnDodaj 2 ml0,88 mM
K2HPO41,03 mlnDodaj 2 ml2,07 mln
500-krotny roztwór podstawowy dla mikroelementów-Dodaj 2 ml-
MES pH=6,61 mlnDodaj 3 ml3 mM
Hcl1 mlnDostosuj pH do 6,6-
Ultra czysta woda-Napełnij do 990 ml-
Po autoklawowaniu:
związekKoncentracja zapasówIlość na litr podłożaKońcowe stężenie
MgSO4·7H2O1,04 mln2 ml2,08 mln
Na2SO40,35 mln2 ml0,70 mM
NH4NR30,18 mln2 ml0,36 mM
CaCl2·2H2O0,75 mln2 ml1,5 mM
Cytrynian Fe(III)27 mM2 ml54 μM

Tabela 3: Skład 1 L zmodyfikowanego podłoża EKM 31 użytego do testu nodulacji P. andersonii. Skład roztworu podstawowego 500x mikroelementów podano w Tabeli 4. Aby przygotować 2% zestalone agar podłoże EKM, dodaj 20 g agaru Daishin przed autoklawowaniem. W autoklawie należy umieścić MgSO4·7H2O, Na2SO4, CaCl2·2H2O, cytrynianu Fe(III) i Fe(III) w celu sterylizacji. Filtruj wysterylizuj roztwór podstawowy NH4NO3 do sterylizacji.

związekIlość na litrKoncentracja zapasów
MnSO4500 mg tabletki powlekania3,31 mln
ZnSO4·7H2O125 mg tabletki powlekania0,43 mM
CuSO4·5H2O125 mg tabletki powlekania0,83 mM
H3BO3125 mg tabletki powlekania2,02 mln
Na2MoO4·2H2O50 mg tabletki powlekania0,21 mM

Tabela 4: Skład 500-krotnego roztworu podstawowego mikroelementów użytego do przygotowania zmodyfikowanej pożywki EKM. Przechowywać roztwór podstawowy mikroelementów w temperaturze 4 °C.

ZwiązkiKoncentracja zapasówIlość na litr podłożaKońcowe stężenie
K2HPO420 mM1 ml0,2 mM
NH4NR30,28 mln10 ml2,8 mM
MgSO440 mM10 ml0,4 mM
K2SO440 mM10 ml0,4 mM
Fe(II)-EDTA9 mM10 ml0,9 mM
CaCl280 mM10 ml0,8 mM
50-krotny roztwór podstawowy dla mikroelementów-10 ml-

Tabela 5: Skład pożywki 1/2-Hoagland32 używanej do testów mikoryzacyjnych. Skład roztworu podstawowego 50x mikroelementów przedstawiono w Tabeli 6. Przygotować roztwór Fe(II)-EDTA, łącząc FeSO4·7H2O (9 mM) i Na2·EDTA (9 mM) w 1 roztworze podstawowym i przechowywać w temperaturze 4 °C. Dostosować pH pożywki do 6,1 za pomocą 1 M KOH i napełnić ultraczystą wodą do 1 l.

ZwiązkiIlość na litrKoncentracja zapasów
H3BO371,1 mg tabletki powlekania1,15 mM
MnCl2·4H2O44,5 mg tabletki powlekania0,22 mM
CuSO4·5H2O3,7 mg tabletki powlekania23,18 μM
ZnCl210,2 mg tabletki powlekania74,84 μM
Na2MoO4·2H2O1,2 mg tabletki powlekania4,96 μM

Tabela 6: Skład 50-krotnego roztworu podstawowego mikroelementów użytego do przygotowania pożywki 1/2-Hoaglanda.

Wiek eksplantatówEfektywność transformacji
młody69,4 ± 6,2% (n = 2)
dojrzały18,3 ± 10,2% (n = 15)

Tabela 7: Efektywność transformacji P. andersonii. Tutaj wydajność przemiany definiuje się jako procent eksplantatów, które tworzą co najmniej 1 transgeniczny kalus lub pęd. Efektywność transformacji została oceniona po 6 tygodniach od transformacji i jest przedstawiona jako średnia ± SD. n wskazuje liczbę eksperymentów transformacyjnych, z których określono efektywność transformacji.

Plik uzupełniający 1: Przegląd konstrukcji poziomu 1 i poziomu 2 używanych do mutagenezy CRISPR/Cas9. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rośliny strączkowe i daleko spokrewniony rodzaj Cannabaceae Parasponia reprezentują jedyne dwa klady gatunków roślin, które są w stanie ustanowić endosymbiotyczny związek z ryzobiami wiążącymi azot i tworzyć guzki korzeniowe. Badania porównawcze między gatunkami obu kladów są bardzo istotne, aby zapewnić wgląd w podstawowe sieci genetyczne umożliwiające tę symbiozę. Obecnie badania genetyczne wykonuje się głównie na roślinach strączkowych; zwłaszcza dwa gatunki modelowe M. truncatula i L. japonicus. Aby zapewnić dodatkową platformę doświadczalną i ułatwić badania porównawcze z guzkującym roślinem niestrączkowym, opisujemy tutaj szczegółowy protokół stabilnej transformacji i odwrotnych analiz genetycznych u P. andersonii. W przedstawionym protokole wykorzystano namnażanie in vitro transgenicznych linii T0 P. andersonii , co pozwala na rozpoczęcie analizy fenotypowej w ciągu 4 miesięcy od wspólnej hodowli A. tumefaciens . Jest to znacznie szybsze niż obecne protokoły, które zostały ustanowione w celu stabilnej transformacji roślin strączkowych33. To sprawia, że P. andersonii jest atrakcyjnym modelem badawczym.

Opisany tutaj protokół zawiera kilka krytycznych kroków. Pierwsza z nich dotyczy kiełkowania nasion. Aby przygotować nasiona P. andersonii do kiełkowania, nasiona należy odizolować od jagód. Odbywa się to poprzez pocieranie jagód o kawałek bibuły lub o wnętrze sitka do herbaty. Tę procedurę należy wykonać delikatnie, aby zapobiec uszkodzeniu okrywy nasiennej. Jeśli okrywa nasienna zostanie uszkodzona, wybielacz może dostać się do nasion podczas sterylizacji, co zmniejsza żywotność nasion. Aby przerwać spoczynek nasion, nasiona poddawane są 10-dniowemu cyklowi temperaturowemu. Jednak pomimo tego zabiegu kiełkowanie nie jest do końca zsynchronizowane. Ogólnie rzecz biorąc, pierwsze nasiona wykazują pojawienie się korzonków po 7 dniach, ale inne mogą potrzebować kilku dni dłużej, aby wykiełkować.

Punkty krytyczne w procedurze przekształcania dotyczą wyboru materiału wyjściowego i czasu trwania etapu wspólnej uprawy. Aby osiągnąć efektywną transformację, jako materiał wyjściowy najlepiej jest używać zdrowych i młodych łodyg lub ogonków liściowych niesterylnych roślin uprawianych w szklarniach. W celu pobudzenia wzrostu młodych gałęzi zaleca się przycinanie drzew Parasponia co 2-3 miesiące i odświeżanie drzew raz w roku. Dodatkowo etap wspólnej uprawy musi być wykonywany tylko przez 2 dni. Długotrwała kohodowla sprzyja nadmiernej kolonizacji eksplantatów tkankowych przez A. tumefaciens i ogólnie zmniejsza wydajność transformacji. Aby zapobiec nadmiernej kolonizacji przez A. tumefaciens , ważne jest również regularne odświeżanie talerzy, na których uprawiane są eksplantaty. W przypadku wystąpienia nadmiernej kolonizacji, eksplantaty tkanek można umyć (patrz sekcja 3.8) w celu usunięcia komórek A. tumefaciens . Zalecamy dodanie wybielacza do roztworu SH-10 używanego do prania (końcowe stężenie: ~2% podchlorynu). Ważne jest, aby pamiętać, że ten dodatkowy etap mycia może nie działać w przypadku silnie zainfekowanych eksplantatów (rysunek 2B). W przypadku, gdy transformacja za pomocą konstruktu CRISPR/Cas9 daje tylko ograniczoną liczbę przypuszczalnie przekształconych pędów lub jeśli oczekuje się, że mutageneza określonego genu spowoduje problemy z regeneracją, zaleca się włączenie pustego konstruktu kontrolnego wektora jako kontroli pozytywnej. Wreszcie, ważne jest, aby upewnić się, że wszystkie wybrane linie transgeniczne są wynikiem niezależnych zdarzeń integracji T-DNA. Dlatego instruujemy, aby wziąć tylko jeden przypuszczalnie transgeniczny pęd z każdej strony eksplantatu. Zdajemy sobie jednak sprawę, że zmniejsza to potencjalną liczbę niezależnych linii. Jeśli potrzebnych jest wiele linii, naukowcy mogą zdecydować się na oddzielenie przypuszczalnie przekształconych kalii od oryginalnych eksplantatów, gdy te kaliby mają rozmiar ≥2 mm i hodować je niezależnie. W ten sposób można wyizolować wiele linii z każdego eksplantatu, co zwiększa liczbę potencjalnych linii transgenicznych.

W obecnym protokole linie transgeniczne P. andersonii są rozmnażane wegetatywnie poprzez rozmnażanie in vitro. Zaletą tego rozwiązania jest to, że wiele sadzonek transgenicznych może zostać wygenerowanych w stosunkowo krótkim czasie. Jednak ta metoda ma również kilka ograniczeń. Po pierwsze, utrzymanie linii transgenicznych T0 poprzez rozmnażanie in vitro jest pracochłonne i może skutkować niepożądanymi zmianami genetycznymi lub epigenetycznymi34,35. Po drugie, linie T0 nadal zawierają kopię T-DNA, w tym kasetę oporności na antybiotyki. Ogranicza to liczbę możliwych ponownych przekształceń, ponieważ dla każdej ponownej transformacji wymagane są różne znaczniki wyboru. Obecnie testowaliśmy tylko transformację przy użyciu selekcji kanamycyny lub higromycyny (dane nie pokazane). Co więcej, obecność sekwencji kodującej Cas9 i sgRNA w liniach transgenicznych T0 komplikuje badania komplementacji. Testy komplementacji są możliwe, ale wymagają mutacji miejsca docelowego (miejsc) docelowych sgRNA w taki sposób, aby zapobiec edycji genów konstruktu komplementacji. Po trzecie, wadą pracy z liniami T0 jest to, że mutanty CRISPR/Cas9 mogą być chimeryczne. Aby zapobiec analizie fenotypowej chimerycznych linii zmutowanych, zalecamy powtórzenie analizy genotypowania po rozmnażaniu in vitro na co najmniej 3 różnych pędach. Chociaż liczba chimerycznych mutantów uzyskanych przy użyciu opisanego tutaj protokołu jest ograniczona, czasami obserwuje się je10. Aby przezwyciężyć ograniczenia związane z pracą z liniami T0, linie mutantów P. andersonii mogą być rozmnażane generatywnie. Drzewa P. andersonii są dwupienne i zapylane przez wiatr2. Oznacza to, że każda linia transgeniczna musi być manipulowana w taki sposób, że kwiaty męskie i żeńskie są wytwarzane na jednym osobniku, a następnie uprawiane w taki sposób, aby nie doszło do zapylenia krzyżowego. Ponieważ P. andersonii jest szybko rosnącym drzewem, wymaga znacznej ilości miejsca w tropikalnej szklarni (28 °C, ~85% wilgotności względnej). Dlatego, choć technicznie możliwe, generatywne rozmnażanie linii transgenicznych P. andersonii jest logistycznie trudne.

W sekcji protokołu opisaliśmy 3 metody guzkowania P. andersonii. Zaletą systemów płytek i torebek jest to, że korzenie są łatwo dostępne, co może umożliwić punktowe zaszczepianie bakterii i śledzenie tworzenia się guzków w czasie. Jednak system płytek jest dość pracochłonny, co sprawia, że mniej nadaje się do eksperymentów z nodulacją na dużą skalę. Wadą systemu woreczków jest to, że trudno jest zapobiec zanieczyszczeniu grzybiczemu. Woreczki nie są sterylne, dlatego często obserwuje się wzrost grzybów w górnej połowie torebki. Nie wpływa to jednak na wzrost P. andersonii , a zatem nie zakłóca testów guzkowych. Dodatkowo system woreczków nadaje się tylko do sadzonek. Pomimo kilku prób nie udało nam się wyhodować sadzonek uzyskanych w wyniku rozmnażania in vitro w torebkach.

Opisana tutaj linia genetyki odwrotnej P. andersonii oferuje znaczną poprawę w porównaniu z istniejącą metodą transformacji korzeni opartą na A. rhizogenes 11. Korzystając z opisanych procedur, można efektywnie generować stabilne linie transgeniczne i utrzymywać je poprzez rozmnażanie in vitro. Natomiast transformacja A. rhizogenes jest przejściowa i prowadzi jedynie do powstania korzeni transgenicznych. Ponieważ każdy korzeń transgeniczny powstaje w wyniku niezależnej transformacji, testy oparte na transformacji A. rhizogenes cierpią ze względu na znaczną zmienność fenotypową. Zmienność ta jest znacznie mniejsza w przypadku stabilnych linii, chociaż rozmnażanie in vitro również tworzy pewien poziom zmienności. Ze względu na tę zmniejszoną zmienność i fakt, że wiele sadzonek może być fenotypowanych dla każdej stabilnej linii, stabilne linie są bardziej odpowiednie do testów ilościowych w porównaniu z korzeniami przekształconymi przez A. rhizogenes. Dodatkowo, stabilna przemiana nie zależy od wprowadzenia locus indukującego korzeń A. rhizogenes (rol), który wpływa na endogenną równowagę hormonalną15. Dlatego stabilne linie lepiej nadają się do odwrotnej analizy genetycznej genów zaangażowanych w homeostazę hormonalną w porównaniu z korzeniami przekształconymi przez A. rhizogenes. Bardziej ogólną zaletą P. andersonii jako modelu badawczego jest to, że nie doświadczył on niedawnej duplikacji całego genomu (WGD). Podrodzina roślin strączkowych Papilionoideae, która obejmuje modelowe rośliny strączkowe M. truncatula i L. japonicus, a także Salicaceae (rząd Malpighiales), która obejmuje drzewo modelowe Populus trichocarpa, doświadczyła WGD ~65 milionów lat temu36,37. Wiele paralogicznych kopii genów powstałych w wyniku tych WGD jest zatrzymywanych w genomach M. truncatula, L. japonicus i P. trichocarpa 37,38,39, co powoduje redundancję, która może komplikować odwrotne analizy genetyczne. Ponieważ P. andersonii nie doświadczył niedawnego WGD, odwrotne analizy genetyczne P. andersonii mogą być mniej dotknięte nadmiarowym funkcjonowaniem paralogicznych kopii genów.

Podsumowując, przedstawiamy szczegółowy protokół odwrotnej analizy genetycznej u P. andersonii. Korzystając z tego protokołu, pojedyncze linie mutantów mogą być efektywnie generowane w ramach czasowych 2-3 miesięcy10. Protokół ten można rozszerzyć w celu stworzenia mutantów wyższego rzędu poprzez multipleksowanie sgRNA ukierunkowanych na różne geny jednocześnie, jak pokazano dla innych gatunków roślin 40,41,42. Dodatkowo, opisana tutaj procedura stabilnej transformacji nie ogranicza się do celowania w geny CRISPR/Cas9, ale może być również wykorzystana do wprowadzenia innych typów konstruktów (np. do testów promotor-reporter, ekspresji ektopowej lub transkomplementacji). Ustaliliśmy P. andersonii jako model badań porównawczych do badania wzajemnych symbioz z ryzobiami wiążącymi azot lub grzybami endomikoryzowymi. Jednak opisane tutaj protokoły dostarczają również narzędzi do badania innych aspektów biologii tego tropikalnego drzewa, takich jak tworzenie drewna, rozwój biseksualnych kwiatów lub biosynteza metabolitów wtórnych specyficznych dla Cannabaceae.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują Markowi Youlesowi, Sophien Kamoun i Sylvestre Marillonnet za udostępnienie części do klonowania Golden Gate za pośrednictwem bazy danych Addgene. Dodatkowo chcielibyśmy podziękować E. Jamesowi, P. Hadobasowi i T. J. Higgensowi za nasiona P. andersonii. Prace te były wspierane przez Holenderską Organizację Badań Naukowych (grant NWO-VICI 865.13.001; Grant NWO-Open Competition 819.01.007) oraz Ministerstwo Badań, Technologii i Szkolnictwa Wyższego Republiki Indonezji (grant RISET-PRO 8245-ID).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Sigma-AldrichN0640NAA
Duchefa BiochemieM1503.0250MES
Sigma-AldrichD134406Acetosyringone
Duchefa BiochemieX1402.1000X-Gal
Merck101236Do żelu
-materiał pudełka na woreczki, wieszaki
Merck101188NH4NO3
Sigma-AldrichB3408-1GBAP
Merck100156H3BO3
Thermo-FisherER1011Używany jako enzym restrykcyjny w zespole
Thermo-Fisher15561020Używany w zespole
Merck137101CaCl2· 2H2O
Duchefa BiochemieC0111.0025C16H16N5O7S2Na
Thermo-FisherK1231Służy do klonowania tępo zakończonych amplikonów PCR w procedurze
AgronutritionAP2011Zawierający Rhizophagus irregularis DAOM 197198 (1,000 zarodników/ml), używany do oznaczania
Merck102790CuSO4· 5H2O
Duchefa BiochemieD1004.1000Używany do hodowli tkanek roślinnych pożywka
Merck105101K2HPO4
VWR Chemicals20302.293Na2· EDTA
Duchefa BiochemieM0803.1000C6H14O6
Thermo-FisherER0291Stosowany jako enzym restrykcyjny w zespole
Merck100983C2H5OH
VWR ChemicalsBDH9232-500GEDTA
Sigma-AldrichZ377600-1PAKcelofanowa
Biomatters, Ltd.R9 lub wyższyOprogramowanie bioinformatyczne do klonowania in silico i projektowania sgRNA
MegaInternational-Informacjetechniczne w https://mega-international.com/tech-info/
Sigma-Aldrich65882Służy do mocowania tkanek
VWR Chemicals24385.295-Vink
219341Woreczki materiał pudełka, dno część
Leica Biosystems14702218311Używany jako szablon do osadzania
Merck100317HCl
Sigma-AldrichI5386-1GIBA
Merck103862C6H5FeO7
Merck103965FeSO4O· 7H2O
Duchefa BiochemieI1401.0005IPTG
Duchefa BiochemieK0126.0010 
Sigma-AldrichL2000 
Merck105886MgSO4O· 7H2O
Merck105934MnCl2· 4H2O
Merck102786MnSO4O
Duchefa BiochemieM1002.1000Stosowany do hodowli bakteryjnych pożywki
Manutan92007687Materiał woreczków
Paraxisdienst130774Elastyczna folia
Pull RhenenAgra-Perlite No.3Stosowany jako podłoże do uprawy w doniczkach do oznaczania
VWR Chemicals391-0581Używany jako pojemnik na membrany
Thermo-FisherF130WHDo genotypowania linii
Addgene 50337Terminator poziomu 0, 3' UTR, 35s (wirus mozaiki kalafiora)
Addgene 48017Łącznik końcowy 2 do montażu 2 części poziomu jednego w akceptor
Addgene 48018Łącznik końcowy 3 do montażu części poziomu 3 poziomu pierwszego w akceptor
Addgene 48001Akceptor poziomu 1. Pozycja 5. Orientacja
Addgene 48007Akceptor poziomu 1. Pozycja 1. Odwrotna orientacja
Promotor Addgene 50268poziomu 0 (0,4 kb), 35s (wirus mozaiki kalafiora) + 5' UTR, Ω (wirus mozaiki tytoniu)
Addgene 46966Używany do projektowania modułu
Addgene 46968Używany do projektowania modułu
Addgene 50334Poziom 0 Kaseta oporności na kanamycynę/neomycynę/paromomycynę
Duchefa BiochemieE1674.0001Doniczki do uprawy Parasponia sadzonki/sadzonki
Merck104871KH2PO4
Merck105033KOH
Merck105153K2SO4O
Van Leusden b.v. -Stosowany jako podłoże do uprawy do testu
Duchefa BiochemieS0225.0050SH-podłoże soli
Duchefa BiochemieS0411.0250Mieszanina
Lehle SeedsVIS-02Stosowany jako niejonowy środek powierzchniowo czynny w etapie płukania stabilnej przemiany
Merck137017NaCl
VWR Chemicals89230-072C6H11NaO7
Merck106521 Na2MoO4· 2H2O
Merck106574Na2HPO4· 7H2O
Merck567549NaH2PO4· H2O
Sigma-Aldrich239313Na2SO4O
Duchefa BiochemieS0809.5000C12H22O11
Thermo-FisherB69Używany w zespole
Gate Thermo-FisherEL0013Używany w zespole
Kulzer-Mitsui Chemicals Group64708806Żywica na bazie metakrylanu metylu w proszku
Kulzer-Mitsui Chemicals Group64709003Roztwór żywicy na bazie HEMA (metakrylanu 2-hydroksyetylu)
 
Acros189350250 
VWR Chemicals663684BPolysorbate 20
z pleksiglasumateriał pudełka, pokrywa
Duchefa BiochemieY1333.1000 
Merck108816ZnCl2
Alfa Aesar33399ZnSO4O· 7H2O
do elektroforezy kwasów nukleinowychklonowania Golden Gateklonowania Golden Gategenotypowaniamichorryzacjina bazie agarudo klonowania Golden Gate Membrana guzkówtworzyw sztucznychna bazie agaruuszczelniającanodulacjicelofanowetransgenicznychpoziomu 2poziomu 2do przoduCRISPR/Cas9CRISPR/Cas9 Topzeven-Używany jako filtry do płukania zawiesiny zarodników Sigma-Aldrich 8.17003 PEG400 michorryzacjibazalnejSH-witaminklonowania Goldenklonowania Golden Gate Kulzer-Mitsui Chemicals Group 66022678 Roztwór żywicy na bazie metakrylanu metylu Merck 1159300025 Stout Woreczki,

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Clason, E. W. THE VEGETATION OF THE UPPER-BADAK REGION OF MOUNT KELUT (EAST JAVA). Bulletin du Jardin Botanique de Buitenzorg. Serie III, 509-518 (1936).
  2. Soepadmo, E. Ulmaceae. Flora Malesiana-Series 1, Spermatophyta. 8, 31-76 (1974).
  3. Becking, J. H. The Rhizobium symbiosis of the nonlegume Parasponia. Biological Nitrogen Fixation. , 497-559 (1992).
  4. Oldroyd, G. E. D. Speak, friend, and enter: signalling systems that promote beneficial symbiotic associations in plants. Nature Reviews Microbiology. 11, 252-263 (2013).
  5. Gutjahr, C., Parniske, M. Cell and developmental biology of arbuscular mycorrhiza symbiosis. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 593-617 (2013).
  6. van Velzen, R., et al. Comparative genomics of the nonlegume Parasponia reveals insights into evolution of nitrogen-fixing rhizobium symbioses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, E4700-E4709 (2018).
  7. van Velzen, R., Doyle, J. J., Geurts, R. A Resurrected Scenario: Single Gain and Massive Loss of Nitrogen-Fixing Nodulation. Trends in Plant Science. 24, 49-57 (2019).
  8. Griesmann, M., et al. Phylogenomics reveals multiple losses of the nitrogen-fixing root nodule symbiosis. Science. 1743, eaat1743(2018).
  9. Becking, J. H. Root-Nodule Symbiosis Between Rhizobium And Parasponia (Ulmaceae). Plant and Soil. 51, 289-296 (1979).
  10. van Zeijl, A., et al. CRISPR/Cas9-Mediated Mutagenesis of Four Putative Symbiosis Genes of the Tropical Tree Parasponia andersonii Reveals Novel Phenotypes. Frontiers in Plant Science. 9, 284(2018).
  11. Cao, Q., et al. Efficiency of Agrobacterium rhizogenes–mediated root transformation of Parasponia and Trema is temperature dependent. Plant Growth Regulation. 68, 459-465 (2012).
  12. Limpens, E., et al. RNA interference in Agrobacterium rhizogenes-transformed roots of Arabidopsis and Medicago truncatula. Journal of Experimental Botany. 55, 983-992 (2004).
  13. Boisson-Dernier, A., et al. Agrobacterium rhizogenes-Transformed Roots of Medicago truncatula for the Study of Nitrogen-Fixing and Endomycorrhizal Symbiotic Associations. Molecular Plant-Microbe Interactions. 14, 695-700 (2001).
  14. Kumagai, H., Kouchi, H. Gene Silencing by Expression of Hairpin RNA in Lotus japonicus Roots and Root Nodules. Molecular Plant-Microbe Interactions. 16, 663-668 (2003).
  15. Nilsson, O., Olsson, O. Getting to the root: The role of the Agrobacterium rhizogenes rol genes in the formation of hairy roots. Physiologia Plantarum. 100, 463-473 (1997).
  16. Davey, M. R., et al. Effective Nodulation of Micro-Propagated Shoots of the Non-Legume Parasponia andersonii by Bradyrhizobium. Journal of Experimental Botany. 44, 863-867 (1993).
  17. Webster, G., Poulton, P. R., Cocking, E. C., Davey, M. R. The nodulation of micro-propagated plants of Parasponia andersonii by tropical legume rhizobia. Journal of Experimental Botany. 46, 1131-1137 (1995).
  18. Op den Camp, R., et al. LysM-type mycorrhizal receptor recruited for rhizobium symbiosis in nonlegume Parasponia. Science. 331, 909-912 (2011).
  19. Weber, E., Engler, C., Gruetzner, R., Werner, S., Marillonnet, S. A Modular Cloning System for Standardized Assembly of Multigene Constructs. PLOS ONE. 6, e16765(2011).
  20. Nekrasov, V., Staskawicz, B. J., Weigel, D., Jones, J. D. G., Kamoun, S. Targeted mutagenesis in the model plant Nicotiana benthamiana using Cas9 RNA-guided endonuclease. Nature Biotechnology. 31, 691-693 (2013).
  21. Bertani, G. Studies On Lysogenesis. I. The Mode Of Phage Liberation By Lysogenic Escherichia Coli. Journal of Bacteriology. 62, 293-300 (1951).
  22. Engler, C., et al. A Golden Gate modular cloning toolbox for plants. ACS Synthetic Biology. 3, 839-843 (2014).
  23. Fauser, F., Schiml, S., Puchta, H. Both CRISPR/Cas-based nucleases and nickases can be used efficiently for genome engineering in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 79, 348-359 (2014).
  24. Lazo, G. R., Stein, P. A., Ludwig, R. A. A DNA Transformation-Competent Arabidopsis Genomic Library in Agrobacterium. Biotechnology. 9, 963-967 (1991).
  25. Op den Camp, R. H. M., et al. N Nonlegume Parasponia andersonii Deploys A Broad Rhizobium Host Range Strategy Resulting in Largely Variable Symbiotic Effectivenes. Molecular Plant-Microbe Interactions. 25, 954-963 (2012).
  26. Graham, P. H., Viteri, S. E., Mackie, F., Vargas, A. T., Palacios, A. Variation in acid soil tolerance among strains of Rhizobium phaseoli. Field Crops Research. 5, 121-128 (1982).
  27. Martinez-Romero, E., et al. Rhizobium tropici, A Novel Species Nodulating Phaseolus vulgaris L. Beans and Leucaena sp. Trees. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 41, 417-421 (1991).
  28. Felten, J., et al. The Ectomycorrhizal Fungus Laccaria bicolor Stimulates Lateral Root Formation in Poplar and Arabidopsis through Auxin Transport and Signaling. Plant Physiology. 151, 1991-2005 (1991).
  29. Trouvelot, A., Kough, J. L., Gianinazzi-Pearson, V. Mesure du taux de mycorhization VA d’un systeme radiculaire. Recherche de methods d’estimation ayant une signification fonctionnelle. Aspects Physiologiques et Genetiques des Mycorhizes. , 217-221 (1986).
  30. Schenk, R. U., Hildebrandt, A. C. Medium and techniques for induction and growth of monocotyledonous and dicotyledonous plant cell cultures. Canadian Journal of Botany. 50, 199-204 (1972).
  31. Becking, J. H. The Parasponia parviflora - Rhizobium symbiosis. Host specificity, growth and nitrogen fixation under various conditions. Plant and Soil. 75, 309-342 (1983).
  32. Hoagland, D. R., Arnon Revised, D. I., Arnon, D. I. The Water-Culture Method for Growing Plants without Soil. Circular California Agricultural Experiment Station. 347, 1-32 (1950).
  33. Wang, K. Methods in Molecular Biology: Agrobacterium Protocols. 1, Humana Press. (2015).
  34. Smulders, M. J. M., de Klerk, G. J. Epigenetics in plant tissue culture. Plant Growth Regulation. 63, 137-146 (2011).
  35. Larkin, P. J., Scowcroft, W. R. Somaclonal variation — a novel source of variability from cell cultures for plant improvement. Theoretical and Applied Genetics. 60, 197-214 (1981).
  36. Cannon, S. B., et al. Legume genome evolution viewed through the Medicago truncatula and Lotus japonicus genomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 14959-14964 (2006).
  37. Tuskan, G. A., et al. The Genome of Black Cottonwood, Populus trichocarpa (Torr. & Gray). Science. 313, 1596-1604 (2006).
  38. Young, N. D., et al. The Medicago genome provides insight into the evolution of rhizobial symbioses. Nature. 480, 520(2011).
  39. Sato, S., et al. Genome Structure of the Legume, Lotus japonicus. DNA Research. 15, 227-239 (2008).
  40. Xing, H. L., et al. A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing in plants. BMC Plant Biology. 14, 327(2014).
  41. Lowder, L. G., et al. A CRISPR/Cas9 Toolbox for Multiplexed Plant Genome Editing and Transcriptional Regulation. Plant Physiology. 169, 971(2015).
  42. van Zeijl, A. Dissecting Hormonal Pathways in Nitrogen-Fixing Rhizobium Symbioses. , Wageningen University. (2017).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Transformacja Agrobacteriumedycja genomu CRISPRsymbioza wi ca azottworzenie guzk w korzeniowychrozmna anie metod kultur tkankowychprotok kie kowania nasioninokulacja Rhizobiumgenerowanie linii transgenicznychrozmna anie in vitro

Powiązane artykuły