Mapowanie genetyczne różnic w termotolerancji między gatunkami drożdży Saccharomyces za pomocą analizy wzajemnej hemizygotyczności całego genomu

Podsumowanie

Wzajemna hemizygotyczność poprzez sekwencjonowanie (RH-seq) to nowa, potężna metoda mapowania genetycznych podstaw różnic między gatunkami. Pule hemizygot są generowane przez mutagenezę transpozonów, a ich sprawność jest śledzona poprzez wzrost konkurencyjności przy użyciu sekwencjonowania o wysokiej długości czasu. Analiza uzyskanych danych wskazuje geny leżące u podstaw tej cechy.

Streszczenie

Głównym celem współczesnej genetyki jest zrozumienie, jak i dlaczego organizmy żyjące na wolności różnią się fenotypem. Do tej pory dziedzina ta poczyniła postępy w dużej mierze dzięki metodom mapowania powiązań i asocjacji, które śledzą związek między wariantami sekwencji DNA a fenotypem w rekombinowanym potomstwie z krzyżowania się osobników gatunku. Podejścia te, choć skuteczne, nie są dobrze dostosowane do różnic w cechach między gatunkami izolowanymi reprodukcyjnie. W tym miejscu opisujemy nową metodę analizy zmienności cech naturalnych w całym genomie, którą można łatwo zastosować do niekompatybilnych gatunków. Nasza strategia, RH-seq, polega na wdrożeniu testu wzajemnej hemizygoty w całym genomie. Wykorzystaliśmy go do zidentyfikowania genów odpowiedzialnych za uderzająco wysoki wzrost temperatury drożdży Saccharomyces cerevisiae w stosunku do ich siostrzanego gatunku S. paradoxus. RH-seq wykorzystuje mutagenezę transpozonów do stworzenia puli wzajemnych hemizygot, które są następnie śledzone przez konkurencję w wysokiej temperaturze za pomocą sekwencjonowania o wysokiej przepustowości. Nasz przepływ pracy RH-seq, jak opisano tutaj, zapewnia rygorystyczny, bezstronny sposób analizowania starożytnych, złożonych cech w pączkującym kladzie drożdży, z zastrzeżeniem, że potrzebne jest głębokie sekwencjonowanie wymagające dużej ilości zasobów, aby zapewnić pokrycie genomu do mapowania genetycznego. Wraz ze spadkiem kosztów sekwencjonowania, podejście to jest bardzo obiecujące pod względem przyszłego zastosowania u eukariontów.

Wprowadzenie

Od zarania tej dziedziny, głównym celem genetyki było zrozumienie mechanistycznych podstaw zmienności wśród dzikich osobników. Gdy mapujemy loci leżące u podstaw interesującej nas cechy, pojawiające się geny mogą być natychmiast wykorzystane jako cele w diagnostyce i lekach, a także mogą rzucić światło na zasady ewolucji. Standardem branżowym w tym celu jest testowanie związku między genotypem a fenotypem w całej populacji poprzez powiązanie lub asocjację¹. Choć podejścia te są potężne, mają jedno kluczowe ograniczenie - opierają się na dużych panelach rekombinowanego potomstwa z krzyżówek między osobnikami interpłodnymi. Nie są one przydatne w badaniach nad gatunkami, które nie mogą łączyć się w pary, aby stworzyć potomstwo. W związku z tym dziedzina ta ma niewielkie możliwości bezstronnej analizy różnic cech między gatunkami izolowanymi reprodukcyjnie².

W tej pracy przedstawiamy techniczne podstawy nowej metody, RH-seq³, do badań w skali genomu genetycznych podstaw zmienności cech między gatunkami. To podejście jest masowo równoległą wersją testu wzajemnej hemizygoty^4,5, który został po raz pierwszy pomyślany jako sposób oceny fenotypowych skutków różnic allelicznych między dwoma genetycznie odrębnymi tłami w określonym locus (Rysunek 1A). W tym schemacie dwa rozbieżne osobniki są najpierw łączone, aby utworzyć hybrydę, której połowa genomu pochodzi od każdego z odpowiednich rodziców. W tym tle generowanych jest wiele szczepów, z których każdy zawiera przerwaną lub usuniętą kopię allelu locus każdego z rodziców. Szczepy te są hemizygotyczne, ponieważ pozostają diploidalne w całym genomie, z wyjątkiem miejsca zainteresowania, gdzie są uważane za haploidalne, i są określane jako wzajemne, ponieważ każdy z nich nie ma tylko allelu jednego rodzica, a pozostały allel pochodzi od drugiego rodzica. Porównując fenotypy tych wzajemnych szczepów hemizygoty, można wywnioskować, czy warianty sekwencji DNA w manipulowanym locus przyczyniają się do cechy będącej przedmiotem zainteresowania, ponieważ warianty w locus są jedyną różnicą genetyczną między wzajemnymi szczepami hemizygoty. W ten sposób możliwe jest powiązanie różnic genetycznych między gatunkami z różnicą fenotypową między nimi w dobrze kontrolowanym układzie eksperymentalnym. Do tej pory zastosowania tego testu były w ramach genu kandydującego - to znaczy przypadków, w których istnieje już hipoteza, że naturalna zmienność w locus kandydata może wpływać na cechę.

W dalszej części przedstawiamy protokół badania przesiewowego wzajemnej hemizygotyczności w skali genomu, używając drożdży jako systemu modelowego. Nasza metoda tworzy genomowe uzupełnienie mutantów hemizygoty, generując żywotne, sterylne hybrydy F1 między gatunkami i poddając je mutagenezie transpozonów. Łączymy hemizygoty, mierzymy ich fenotypy w testach opartych na sekwencjonowaniu i testujemy różnice w częstości występowania między klonami puli zawierającymi allele dwojga rodziców danego genu. Rezultatem jest katalog loci, w których warianty między gatunkami wpływają na cechę będącą przedmiotem zainteresowania. Wdrażamy przepływ pracy RH-seq, aby wyjaśnić genetyczne podstawy różnic w termotolerancji między dwoma pączkującymi gatunkami drożdży, Saccharomyces cerevisiae i S. paradoxus, które rozdzieliły się ~5 milionów lat temu⁶.

Protokół

1. Przygotowanie plazmidu zawierającego piggyBac do transformacji

1. Umieść na pojedynczych koloniach szczep E. coli zawierający plazmid pJR487 na płytce agarowej LB + karbenicyliny. Inkubować przez 1 noc w temperaturze 37 °C lub do momentu pojawienia się pojedynczych kolonii.
   UWAGA: Opis tego, jak sklonowano plazmid pJR487, można znaleźć w naszym poprzednim work³.
2. Zaszczepić 1 l LB + karbenicyliny w stężeniu 100 μg/ml pojedynczą kolonią E. coli zawierającą pJR487 w szklanej kolbie o pojemności 2 l. Rosnąć przez noc w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min, aż do nasycenia (OD₆₀₀ ≥ 1,0).
3. Oczyść plazmidowe DNA z hodowli za pomocą zestawu do przygotowania plazmidu na dużą skalę, zgodnie z instrukcjami w opublikowanym protokole producenta (szczegółowe informacje znajdują się w Tabeli materiałów). Eluować DNA po 10-minutowej inkubacji z 5 ml buforu elucyjnego ogrzanego do temperatury 37 °C.
4. Zmierz ilość i jakość plazmidowego DNA za pomocą spektrofotometru (szczegółowe informacje znajdują się w Tabeli materiałów).
5. Powtarzaj kroki 1.2 – 1.4, aż zostanie wyizolowany łącznie co najmniej 11 mg plazmidowego DNA w stosunku A₂₆₀:A₂₈₀ wynoszącym co najmniej 1,8. Może to zająć kilka przygotowań, w zależności od wydajności.
6. Wymieszaj wszystkie preparaty plazmidowe razem w jednej probówce i zwiększ całkowitą objętość do 20 ml za pomocą buforu elucyjnego lub wody. Ponownie zmierz końcową ilość i jakość za pomocą spektrofotometru. Stężenie plazmidu powinno wynosić co najmniej 538 ng/μl w tych ostatnich 20 ml objętości. Jeśli stężenie jest wyższe niż 538 ng/μl, należy rozcieńczyć plazmid buforem elucyjnym lub wodą do 538 ng/μl. Plazmid można przechowywać w temperaturze 4 °C do kilku tygodni przed użyciem.

2. Tworzenie puli nieukierunkowanych wzajemnych hemizygot w całym genomie

1. Przygotowanie hybrydowych komórek drożdży do transformacji
   1. Usuń JR507 ze szczepu wyjściowego do zamrażania w temperaturze -80 °C do pojedynczych kolonii na płytce agarowej YPD. Inkubować w temperaturze 26 °C przez 2 dni lub do momentu pojawienia się kolonii.
      UWAGA: JR507 to szczep hybrydowy powstały w wyniku krzyżowania pojedynczych komórek haploidalnych zarodników S. cerevisiae DBVPG1373 i S. paradoxus Z1 (przy użyciu mikroskopu tetradowego)³.
   2. Zaszczepić 100 ml płynnego YPD w szklanej kolbie o pojemności 250 ml pojedynczą kolonią JR507 i wstrząsać w temperaturze 28 °C, 200 obr./min przez 24 godziny lub do osiągnięcia fazy stacjonarnej.
   3. Następnego dnia zmierz gęstość optyczną przy 600 nm (OD₆₀₀) nocnej hodowli. Stwórz nową kulturę, rozcieńczając wstecznie część nocnej kultury ze świeżą płynną YPD do nowej szklanej kolby o pojemności 1 l do OD₆₀₀ 0,2 i objętości 500 ml.
      UWAGA: Przykładowe obliczenie rozcieńczenia wstecznego, jeśli kultura przez noc ma OD₆₀₀ równe 5,0, gdzie C to gęstość optyczna, a V to objętość:
      
      W ten sposób 20 ml nasyconej kultury przez noc zostanie dodane do 480 ml płynnego YPD, aby uzyskać w sumie 500 ml kultury przy OD₆₀₀ 0,2.
   4. Powtórzyć krok 2.1.3 jeszcze trzy razy, aby uzyskać w sumie cztery kultury o pojemności 500 ml przy średnicy_{zewnętrznej 600} wynoszącej 0,2 w czterech szklanych kolbach o pojemności 1 l, stosując tę samą kulturę przez noc dla wszystkich czterech nowych kultur. Inkubować je wszystkie w temperaturze 28 °C przez 6 godzin (2-3 pokolenia), wytrząsając z prędkością 200 obr./min.
   5. Połącz dwie z 500 ml kultur, aby stworzyć kulturę o pojemności 1 l. Połącz pozostałe dwie kultury o pojemności 500 ml, aby utworzyć kolejną kulturę o pojemności 1 l. W tym momencie istnieją dwie kultury 1 L. Każda z tych kultur 1 L zostanie poddana transformacji za pomocą pJR487 w kolejnych krokach.
2. Transformacja pJR487 w hybrydowe komórki drożdży
   1. Podziel każdą z 1 l kultur na dwadzieścia 50 ml porcji w 20 plastikowych stożkowych probówkach, co daje w sumie 40 probówek. Odłóż na bok 20 probówek i wykonuj następujące czynności na 20 probówkach na raz.
   2. Odwirować każdą z dwudziestu probówek przez 3 minuty przy 1,000 x g, aby osadzać komórki drożdży. Odrzucić supernatant.
   3. Zawiesić każdą osadkę w 25 ml sterylnego_H2Oprzez wirowanie. Wirować przez 3 minuty przy 1 000 x g. Odrzucić supernatant.
   4. Ponownie zawiesić każdą granulkę z 5 ml buforu 1x TE, 0,1 M LiOAc przez wirowanie. Wirować przez 3 minuty przy 1 000 x g. Odrzucić supernatant.
   5. Powtórz krok 2.2.4. Podczas wirowania komórek przygotuj co najmniej 120 ml roztworu 39,52% glikolu polietylenowego, 0,12 M LiOAc i 1,2x buforu Tris-EDTA (12 mM Tris-HCl i 1,2 mM EDTA). Przechowywać na lodzie.
   6. Aby przygotować plazmidowe DNA do transformacji, najpierw gotuje się 4 ml DNA plemników łososia w temperaturze 100 °C przez 5 minut i natychmiast schładza je na lodzie przez 5 minut. Następnie zmieszać 20 ml pJR487 (otrzymanego w sekcji 1) o stężeniu 538 ng/μl z 4 ml schłodzonego DNA plemników łososia, aby uzyskać całkowitą objętość 24 ml. Trzymaj na lodzie do czasu użycia.
   7. Dodaj 600 μl plazmidowego DNA zmieszanego z DNA plemników łososia na wierzch każdej osadki komórkowej. Nie należy jeszcze ponownie zawieszać.
   8. Dodać 3 ml roztworu PEG-LiOAc-TE wykonanego w kroku 2.2.5 do każdej granulki. Zawiesić osad, pipetując w górę i w dół oraz wirując.
   9. Inkubować każdą probówkę przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
   10. Szok cieplny każdej probówki przez 26 minut w łaźni wodnej ustawionej na 39 °C.
       UWAGA: Co kilka minut odwróć każdą probówkę, aby zapobiec osadzaniu się komórek na dnie probówki.
   11. Odwirować każdą probówkę przez 3 minuty przy 1 000 x g. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić każdą osadkę w 10 ml YPD przez wirowanie. Połączyć wszystkie dwadzieścia probówek w nowej szklanej kolbie. Całkowita objętość komórek powinna wynosić ~200 ml.
   12. Przenieść 66,6 ml komórek do nowej szklanej kolby o pojemności 1 l i uzupełnić do objętości 500 ml płynnym YPD. Powtórz jeszcze dwa razy, aby wykorzystać całe 200 ml przekształconych komórek. Zmierz OD₆₀₀ każdej nowej hodowli 500 ml (spodziewaj się OD₆₀₀ ~0,35-4).
   13. Wytrząsać wszystkie trzy kolby w temperaturze 28 °C przez 2 godziny do odzyskania (<1 generacji) przy 200 obr./min.
   14. Dodać 0,5 ml 300 mg/ml G418 do każdej z trzech kolb, do końcowego stężenia 300 μg/ml G418 i ponownie przetrząsnąć w temperaturze 28 °C, 200 obr./min.
       UWAGA: Przed tym etapem przekształcone komórki hybrydowe odzyskiwały siły po transformacji. Po dodaniu G418 selekcjonuje się obecność plazmidu pJR487. Wszelkie komórki, które nie wchłonęły plazmidu podczas transformacji, zaczną umierać.
   15. Powtórz kroki 2.2.2 – 2.2.14 z pozostałymi 20 stożkowymi rurkami komórek. W tym miejscu powinno znajdować się sześć szklanych kolb o pojemności 1 l, każda z 500 ml komórek z dodatkiem G418.
   16. Inkubować wszystkie sześć kolb komórek w temperaturze 28 °C, wytrząsając z prędkością 200 obr./min, przez około 2 dni lub do momentu osiągnięcia OD₆₀₀ ~2,3 w każdej kolbie. Połącz ze sobą wszystkie sześć kolb, aby stworzyć jedną kulturę.
       UWAGA: Chociaż wszystkie komórki w tej kulturze nie będą używane w dalszych krokach, celem użycia tak dużych objętości było stworzenie jak największej liczby unikalnych zdarzeń transformacji i znormalizowanie wszelkich odchyleń w pojedynczej transformacji poprzez zebranie ich wszystkich razem.
   17. Użyć kultury utworzonej w 2.2.16 do zaszczepienia dwóch nowych kolb o pojemności 1 litra 500 ml YPD + G418 (300 μg/ml) do OD₆₀₀ 0,2. Pozostaną resztki kultury, które można wyrzucić.
   18. Inkubować obie kolby o pojemności 1 l w temperaturze 28 °C przez noc, wytrząsając przy 200 obr./min, aż każda z nich osiągnie OD₆₀₀ ~2,2 (~3,5 pokolenia). Połącz obie kultury w jedną kulturę i ponownie zmierz OD₆₀₀ połączonej kultury.
       UWAGA: W tym momencie hodowla powinna prawie w całości składać się z komórek zawierających plazmid pJR487. W części populacji komórek transpozon PiggyBac zostanie przetransponowany z plazmidu do genomu przez transpozazę ulegającą ekspresji z plazmidu. Jednak ciągła ekspresja transpozazy może prowadzić do transpozycji w trakcie selekcji, co zaciemniłoby związek między genotypem a fenotypem. Celem kilku następnych kroków jest przeprowadzenie kontrselekcji przeciwko obecności plazmidu, aby upewnić się, że nie ma już ekspresji transpozazy. Otrzymana pula jest mieszanką komórek z transpozonem lub bez niego zintegrowanych z genomem, ale tylko komórki zawierające transpozon są wykrywane podczas kolejnych etapów mapowania. Czas w transformacji, podczas którego transpozaza ulega ekspresji, zanim kodowanie plazmidu zostanie utracone, może decydować o prawdopodobieństwie, że dany klon po mutagenezie zawiera więcej niż jedną insercję transpozonu. Częstość występowania tych mutacji, które objawiają się jako "wtórne" mutacje w analizie dowolnego genu na raz, można oszacować, ustawiając określoną liczbę kolonii po mutagenezie, a następnie łącząc ich DNA i sekwencję - potwierdzając liczbę niezależnych pozycji insercji w puli.
   19. Odwirować 25 ml tej kultury przez 3 minuty przy 1,000 x g. Oblicz liczbę całkowitych jednostek OD₆₀₀ komórek, które znajdują się w 25 ml (patrz przykładowe obliczenia poniżej). Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić w wystarczającej ilości_H2O, aby utworzyć zawiesinę komórek 1,85 OD₆₀₀/ml przez wirowanie.
       UWAGA: Przykładowe obliczenia dla ponownego zawieszenia komórek w wodzie, jeśli OD₆₀₀ w połączonej hodowli wynosił 2,2:
       
       Tak więc, po odwirowaniu 25 ml hodowli komórkowej i odrzuceniu supernatantu, dodaj tyle_H2Odo komórek, aby całkowita objętość komórek i wody wzrosła do ~ 29,7 ml (ponieważ osad komórkowy również będzie miał objętość, dodaj mniej niż 29,7 ml H₂O).
   20. Za pomocą szklanych kulek nałóż 1 ml zawieszonych komórek w wodzie na każdą z 12 dużych kwadratowych, kompletnych syntetycznych płytek agarowych z 5-FOA. Inkubować każdą płytkę w temperaturze 28 °C przez 1-2 dni lub do momentu, gdy na płytce utworzy się trawnik.
   21. Za pomocą małych sterylnych rakli zeskrob komórki z każdej z 6 płytek do probówki z 35 ml sterylnej wody. Powtórz z pozostałymi 6 płytkami, w sumie dwie probówki z komórkami i wodą. Połącz wszystkie zawiesiny komórkowe w jednej probówce. Zmierzyć średnicę zewnętrzną₆₀₀ tej zawiesiny, używając wody jako ślepej próby. Doprowadzić stężenie OD₆₀₀/ml komórek do 44.4 OD₆₀₀ jednostek/ml za pomocą wody. Z naszego doświadczenia wynika, że wydajność transpozycji (proporcja komórek KAN+, które są URA-) wynosi średnio 50%.
   22. Określić liczbę komórek do przechowywania w zamrażarce w temperaturze -80 °C. Każda porcja może być użyta w przyszłości w pojedynczym eksperymencie.
       UWAGA: Biorąc pod uwagę, jak czasochłonne jest generowanie puli, należy przechowywać wiele fiolek na wypadek przypadkowego niewłaściwego użycia lub do przeprowadzenia eksperymentów replikowanych. 20-30 akcji to rozsądna liczba.
   23. Każdy zapas zamrażarki będzie zawierał 40 OD₆₀₀ jednostek komórek w 1 ml 10% DMSO. Dodaj 900 μl komórek do 100 μl DMSO. Powtórz te czynności dla całkowitej liczby utworzonych zapasów zamrażarki. Przechowywać każdy w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości.

3. Wybór wzajemnych hemizygot w formacie zbiorczym

1. Rozmrozić w zamrażarce o temperaturze -80 °C pojedynczą porcję połączonych wzajemnych hemizygot z sekcji 2 w temperaturze pokojowej.
   UWAGA: Nie pozwól, aby podwielokrotność pozostała długo w temperaturze pokojowej po rozmrożeniu, użyj jej natychmiast.
2. Użyć całej 1 ml podwielokrotności do zaszczepienia 150 ml płynnego YPD w szklanej kolbie o pojemności 250 ml. Zmierz OD₆₀₀ tej kultury, a następnie inkubuj w temperaturze 28 °C, wstrząsając z prędkością 200 obr./min, przez ~ 7 godzin lub do momentu, gdy kultura przejdzie przez 2-3 podwojenia populacji. W tym momencie kultura jest gotowa do użycia do zaszczepienia kultur poddawanych selekcji.
   UWAGA: Przykładowe obliczenie: Jeśli OD₆₀₀ oryginalnej kolby mierzy 0,25, inkubować kulturę, aż osiągnie OD₆₀₀ co najmniej 1,0. Jeśli w "czasie zerowym" (T-0) pożądane są jakiekolwiek punkty próbkowania, jako sposób na zbadanie populacji hemizygoty przed selekcją, osady komórkowe można teraz pobrać przez odwirowanie 5-10 ml kultury na osad przy 1000 x g przez 3 minuty, odrzucając supernatant i zamrażając w temperaturze -80 °C.
3. Wykorzystaj wyhodowaną pulę hemizygot do zaszczepienia kultur do selekcji w odpowiednim schemacie replikacji, zarówno w wysokiej temperaturze (39 °C), jak i w temperaturze dopuszczalnej (28 °C). Należy utworzyć co najmniej trzy biologiczne kultury selekcyjne replik w każdej temperaturze, co daje w sumie sześć kultur selekcyjnych.
   1. Stwórz każdą kulturę selekcyjną o całkowitej objętości 500 ml w szklanej kolbie o pojemności 2 litrów z płynnym YPD i zaszczepij do OD₆₀₀ 0,02. Potrząsaj każdą kulturą selekcyjną z prędkością 100 obr./min w temperaturze 28 °C lub 39 °C, aż nastąpi 6-7 podwojeń populacji (co odpowiada OD₆₀₀ ~1,28-2,56). Postaraj się jak najdokładniej dopasować ostateczną wartość OD₆₀₀ ze wszystkich kultur selekcji.
      UWAGA: Kultury selekcyjne w temperaturze 28 °C będą rosły szybciej niż kultury selekcyjne w temperaturze 39 °C. W związku z tym kultury selekcyjne w temperaturze 39 °C spędzą dłuższy czas w inkubatorze. Postępuj zgodnie z poniższymi krokami z każdą kolbą, gdy staje się gotowa, niezależnie od całkowitej liczby godzin spędzonych w inkubatorze. Z naszego doświadczenia wynika, że hodowle w temperaturze 28 °C lub 39 °C potrzebowały odpowiednio ~12 lub ~18 godzin, aby osiągnąć OD ~2,0. Długie selekcje mogą mieć tę zaletę, że wzmacniają niewielkie efekty dopasowania, ale także pozwalają na powstawanie mutacji tła de novo, które wprowadziłyby szum do końcowego rozkładu dopasowań wśród mutantów transpozonów w dowolnym genie/allelu. W związku z tym ważne jest, aby ograniczyć czas selekcji w eksperymencie RH-seq.
4. Zbierz granulki komórkowe z każdej kultury selekcyjnej. Obliczyć objętość wymaganą do otrzymania 7 OD₆₀₀ jednostek komórek i odwirować przy 1 000 x g przez 3 minuty co najmniej cztery granulki tej objętości z każdej kultury selekcyjnej jako kontrpróby techniczne do przygotowania biblioteki i sekwencjonowania (patrz sekcje 4 i 5 poniżej). Odrzucić supernatant i przechowywać w temperaturze -80 °C.
   UWAGA: Przykład, jeśli kolba selekcyjna ma końcową średnicę zewnętrzną₆₀₀ równą 2,0:
   

4. Budowa biblioteki Tn-seq i sekwencjonowanie Illumina w celu określenia obfitości transpozonów zmutowanych hemizygot

1. Rozmrozić na lodzie każdą komórkę z sekcji 3, która ma być sekwencjonowana.
2. Wyizoluj całkowite genomowe DNA (gDNA) z każdej osadki komórkowej za pomocą zestawu do oczyszczania gDNA drożdży, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Zawiesić DNA w 50 μl buforu elucyjnego ogrzanego do temperatury 65 °C.
3. Określ ilościowo ilość gDNA z każdej osadki za pomocą fluorymetru. Minimalna całkowita ilość gDNA wymagana dla każdej osadu komórkowego do utworzenia biblioteki sekwencjonowania nowej generacji (NGS) dla sekwencjonowania Tn przy użyciu następującej procedury wynosi 1 μg.
   UWAGA: Mniej niż 1 μg gDNA można użyć do stworzenia biblioteki, ale ucierpi na tym ostateczna ilość i jakość biblioteki.
4. Postępuj zgodnie z ustalonym protokołem tworzenia bibliotek Tn-seq⁷. Zwróć uwagę na następujące istotne informacje, które są unikalne dla tego protokołu:
   1. Po ścinaniu gDNA, naprawie końca i ligacji adaptera, amplifikuj gDNA zawierające transpozon za pomocą PCR. Do tego PCR użyj następującego startera do przodu i do tyłu, które są specyficzne odpowiednio dla transpozonu PiggyBac i adapterów NGS:
      Naprzód (N – losowy nukleotyd)
      5' ATGATACGGCGACCGAGATCTACTACACTCTTTCCCTACACGACG
      CTCTTCCGATCTNNNNNNNAGCAATATTTCAAGAATGCATGCGTCAAT 3'
      Odwrotny (odcinek Ns reprezentuje unikalny indeks 6 pz używany do multipleksowania. Więcej informacji na temat indeksów)
      5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGTGACTGGAGTTCAG
      ACGTGTGCTCTTCCGATCT 3'
   2. Użyj dołączonych kroków czyszczenia za pomocą koralików o selektywnym rozmiarze, aby zminimalizować odsetek sklonowanych fragmentów w końcowej bibliotece, które byłyby zbyt krótkie, aby uwzględnić mapowalną sekwencję genomową.
      UWAGA: Przestrzegając dotychczasowych minimalnych wymagań dotyczących powtórzeń dla kultur selekcyjnych, do sekwencjonowania zostaną wykorzystane 24 indywidualne próbki gDNA. Biorąc pod uwagę obecny koszt sekwencjonowania, jest mało prawdopodobne, aby każda próbka została przeprowadzona samodzielnie. Aby połączyć próbki na tym samym torze, utwórz wiele odwróconych starterów, z których każdy ma unikalny indeks 6 par zasad. Próbki o różnych indeksach mogą być łączone w ten sam tor sekwencjonowania, a następnie rozdzielane obliczeniowo.
5. Sekwencja pojedynczych końcówek 150 bp odczytuje z każdej biblioteki przy użyciu technologii NGS na ośmiu liniach.
   UWAGA: Wymagana liczba odczytów sekwencjonowania zależy w dużym stopniu od jakości bibliotek przygotowanych w poprzednim kroku (tj. proporcji DNA w bibliotece faktycznie zawierającej transpozonowe DNA, reprezentującej DNA pochodzące z wzajemnych hemizygot). Przyczyniają się do tego dwa główne czynniki. Po pierwsze, ponieważ komórki bez zintegrowanego transpozonu nie są przeciwselekcjonowane podczas tworzenia puli, każda hodowla będzie mieszanką komórek z transpozonem i bez niego. Po drugie, nawet w obrębie genomów wzajemnych hemizygot zawierających transpozony, większość genomu nie jest sekwencją zawierającą transpozon, a to gDNA nieuchronnie będzie częścią przygotowania biblioteki. Celem końcowej amplifikacji PCR DNA zawierającego transpozon jest zwiększenie stosunku DNA zawierającego transpozon do tych dwóch źródeł tła gDNA. Im bardziej wydajne jest to wzmocnienie, tym większa część odczytów będzie mogła być wykorzystana w dalszej analizie. Im niższa jakość bibliotek, tym więcej sekwencjonowania będzie musiało zostać wykonane, ponieważ coraz większa część odczytów nie będzie zawierała transpozonu DNA i nie będzie użyteczna. Biorąc pod uwagę powyższe ograniczenia, osiem ścieżek sekwencjonowania było w stanie śledzić obfitość wzajemnych hemizygot w rozsądnym stopniu. Dokładniejsze sekwencjonowanie pozwoliłoby na głębszą analizę.

5. Mapowanie lokalizacji indukcji transpozonów i analiza sekwencyjna RH-seq

UWAGA: Poniższa analiza danych została przeprowadzona za pomocą niestandardowych skryptów Pythona (dostępnych online na https://github.com/weiss19/rh-seq), ale mogła być przeprowadzona przy użyciu innych języków skryptowych. Poniżej przedstawiono główne kroki w tym procesie. Wykonaj następujące kroki dla każdego pojedynczego replikowanego pliku odczytu, chyba że zauważono, że należy je połączyć.

1. Przytnij sekwencje adaptera z odczytów i oddziel odczyty każdej repliki zgodnie z indeksem.
2. Znajduje odczyty zawierające połączenia transpozon-genom. Aby to osiągnąć, wyszukaj w każdym odczycie ostatnie 20 par zasad transpozonu, CAGACTATCTTTCTAGGGTTAA. Odrzuć wszystkie odczyty, które nie zawierają tej sekwencji.
   UWAGA: Z naszego doświadczenia wynika, że proporcja odczytów mapujących do końca transpozonu wynosi 83-95%.
3. Przytnij pozostałe odczyty zawierające transpozon tak, aby zawierały tylko sekwencję za końcem transpozonu 3'. Mapując tę sekwencję do genomu drożdży, określ kontekst genomowy insercji transpozonu dla każdego odczytu (krok 5.4 poniżej).
4. Użyj BLAT lub równoważnego narzędzia do mapowania, aby zmapować sekwencję za transpozonem do hybrydowego genomu S. cerevisiae DBVPG1373 x S. paradoxus Z1 (nazwa skryptu: map_and_pool_BLAT.py).
   1. Odrzuć wszystkie odczyty, dla których istnieje mniej niż 50 par zasad użytecznej sekwencji za końcem 3' transpozonu. Krótkie sekwencje są trudne do odwzorowania w unikalny sposób.
   2. W przypadku korzystania z BLAT użyj następujących parametrów: tożsamość = 95, rozmiar kafelka = 12.
   3. Stwórz podstawowy genom hybrydowy do wykorzystania do mapowania, łącząc najnowsze wersje genomów referencyjnych S. cerevisiae S288c i S. paradoxus CBS432.
      UWAGA: Podstawowy plik adnotacji opisujący granice genomowe poszczególnych genów w genomie hybrydowym można znaleźć w repozytorium Github wymienionym powyżej (nazwa pliku: YS2+CBS432+plasmid_clean). Należy używać tylko odczytów, które mapują się do jednego miejsca w genomie hybrydowym (tj. są unikalne dla S. cerevisiae lub S. paradoxus). Oczekuje się jednolitej częstotliwości zdarzeń insercji w całym genomie; Rozkład pozycji insercji w genomach jest podawany w innym miejscu3.
5. Zlicz całkowitą liczbę odczytów mapujących do każdego unikalnego miejsca insercji transpozonu, z których wnioskujemy, że wszystkie pochodzą z komórek pojedynczego klonu zmutowanego transpozonu. Suma wszystkich takich wartości z pojedynczej biblioteki jest określana jako łączna liczba zmapowanych odczytów dla tej biblioteki.
6. W przypadkach, gdy istnieje wiele wstawienia mapujących w 3 parach zasad od siebie, połącz je wszystkie w jednym punkcie wstawiania, przypisując wszystkie odczyty do jednej lokalizacji o największej liczbie odczytów. Ta wartość,_{n insert}, reprezentuje obfitość tego klonu insercji w osadzie komórki, z której zsekwencjonowano gDNA. W tym momencie pojawią się listy n_wstawień, z których każda będzie obfitością unikalnej zmapowanej insercji transpozonu, jedna lista dla każdej sekwencjonowanej pastylki komórki.
   UWAGA: Transpozon PiggyBac wstawia sekwencje TTAA w genomie, sekwencję składającą się z 4 par zasad. W związku z tym wnioskujemy, że odwzorowanie insercji w obrębie 3 par zasad musiało pochodzić z tego samego miejsca TTAA.
7. Ponieważ będzie nieco inna łączna liczba odczytów pochodzących z każdej sekwencjonowanej biblioteki, znormalizuj n wartości_wstawiania we wszystkich plikach, jeśli mają być one porównywane. Zrób to, zestawiając w tabeli całkowitą liczbę zmapowanych odczytów z każdej pojedynczej biblioteki, n_granulacji, i weź średnią wszystkich n_granulacji ze wszystkich bibliotek, granul>. Pomnóż każdą_{n wstawek} w danych indywidualnej biblioteki przez stosunek granulek> / n_granulek, aby obliczyć_wstawkę, znormalizowaną obfitość danego klonu insercji transpozonu.
   
   Alternatywnie, rozmiar biblioteki można oszacować za pomocą dostępnych narzędzi, takich jak DESeq2⁸ (nazwa skryptu: total_reads_and_normalize.py).
8. Tabelaryzuje zestaw wszystkich wstawień odwzorowanych we wszystkich bibliotekach. W przypadku wstawień znalezionych w niektórych bibliotekach, ale nie w innych, ustaw_insert = 1 dla obliczeń podrzędnych.
9. Przefiltruj odczyty, aby znaleźć te insercje, które mieszczą się w genach zgodnie z plikiem adnotacji (nazwa skryptu: remove_NC_and_plasmid_inserts.py).
10. Dla każdej unikalnej insercji oblicz średnią liczebność wśród powtórzeń technicznych każdej selekcji (każda kultura w temperaturze 28 °C lub 39 °C), insert>_technical (Nazwa skryptu: combine_tech_reps_V2.py).
11. Dla każdej niepowtarzalnej insercji należy obliczyć średnią liczebność w powtórzeniach biologicznych każdej temperatury, <_insercji>_całkowitej, biorąc średnią wszystkich <>_technicznych w każdej temperaturze. W tym samym czasie oblicz współczynnik zmienności dla każdej intentacji,_{CV insert,total} across the insert>_technical (Nazwa skryptu: combine_bio_reps.py).
    UWAGA: W tym momencie, dla każdej temperatury, 28 °C i 39 °C, znajduje się lista unikalnych insercji transpozonów, ich średnia obfitość oraz współczynnik zmienności między kontrpróbami biologicznymi dla każdej z nich. Te dane dla naszego eksperymentu są raportowane gdzie indziej³.
12. Przefiltruj listę wszystkich wstawek pod kątem tych, które mają, w temperaturze 28 °C lub 39 °C, insert>_total > 1.1 i_{CV insert,total} ≤ 1.5 (Nazwa skryptu: filter_inserts.py).
13. Dla każdego unikalnego wstawienia oblicz logarytm₂(wkładka>_{całunkowa,28 °C} / inert>_{całkowita,39 °C}). Wartość ta reprezentuje "tolerancję termiczną" danego zmutowanego klonu z insercją transpozonu (nazwa skryptu: fitness_ratios.py).
14. Posortuj wszystkie unikalne insercje według genu i allelu (S. cerevisiae lub S. paradoxus) i zetrzyj tabelę liczby insercji w każdym allelu. Przefiltruj geny tak, aby analizowane były tylko geny, które mają co najmniej 5 insercji w każdym allelu (nazwa skryptu: organize_and_filter_genes.py).
    UWAGA: Wiele unikalnych insercji w każdym allelu pozwala na dokładniejszy pomiar tolerancji termicznej tej wzajemnej hemizygoty. Obniżenie liczby insercji wymaganych na allel jest możliwe, ale zagrozi dokładności tego pomiaru i zwiększy obciążenie związane z wielokrotnymi testami, umożliwiając testowanie większej liczby genów. Dodatkowo, odfiltrowanie genów ze zbyt małą liczbą insercji na allel pomoże zmniejszyć wpływ na wyniki testów każdego pojedynczego klonu hemizygoty zawierającego mutację w miejscu wtórnym, która nadaje bardzo zróżnicowany fenotyp.
15. Dla każdego genu pozostałego w zestawie danych po powyższym filtrowaniu porównaj tolerancje termiczne (stosunki logarytmu₂) wszystkich insercji w allelu S. cerevisiae z tymi w allelu S. paradoxus za pomocą testu U Manna-Whitneya. Alternatywnie można zaimplementować model regresji, zaadaptowany z DESeq2⁸ (nazwa skryptu: mann_whitney_u.py).
16. Korygować wartości p dla wielokrotnych testów przy użyciu metody Benjaminiego-Hochberga.
17. Geny o znaczących wartościach p (powiedzmy ≤ 0,01) są kandydatami na geny ważne dla różnic w tolerancji termicznej między tymi dwoma gatunkami.

Wyniki

Skrzyżowaliśmy S. cerevisiae i S. paradoxus, tworząc sterylną hybrydę, którą poddaliśmy mutagenezie transpozonów. Każdy mutagenizowany klon był hemizygotą, diploidalną hybrydą, w której jeden allel jednego genu jest zakłócony (Ryc. 1A, Ryc. 2). Rywalizowaliśmy hemizygoty ze sobą poprzez wzrost w temperaturze 39 °C i, w oddzielnym eksperymencie jako kontrola, w temperaturze 28 °C (Rysunek 1B) i wyizolowaliśmy DNA z każdej kultur...

Dyskusja

Przewaga RH-seq nad dotychczasowymi metodami statystyczno-genetycznymi jest kilkukrotna. W przeciwieństwie do analizy sprzężeń i asocjacji, RH-seq zapewnia rozdzielczość mapowania pojedynczego genu; W związku z tym będzie prawdopodobnie bardzo przydatny nawet w badaniach nad zmiennością cech u osobników danego gatunku, a także różnicami międzygatunkowymi. Ponadto wcześniejsze próby analizy wzajemnej hemizygotyczności całego genomu wykorzystywały zbiory mutantów delecji genów, z których niektóre zawierają wtórne mutacje, ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1-2 plazmidowe zestawy Gigaprep	Zymo Research	D4204	Liczba wymaganych zestawów zależy od tego, jak wydajne są twoje przygotowania w każdym zestawie. Ten zestaw jest dostarczany z 5 indywidualnymi kolumnami do przygotowania plazmidu. Przepuść 1 l nasyconej kultury E. coli przez każdą kolumnę przygotowawczą, ponieważ użycie więcej niż 1 l na kolumnę może spowodować zatkanie filtra przygotowawczego, prowadząc do niskiej wydajności i niskiej jakości DNA.
10X bufor Tris-EDTA (TE) (100 mM Tris-HCl i 10 mM EDTA)	Dowolny	N / A	sterylizuje przez 0,22 μ m filtr przed użyciem.
1M LiOAc	Dowolny	N/A	sterylizuje przez 0,22 μ m filtr przed użyciem.
300 mg/ml Geneticin (G418)	Gibco	11811023
52% glikol polietylenowy (PEG) 3350	Sigma	1546547	Rozpuść w wodzie i przefiltruj sterylizować przez 0,22 μ m filtr przed użyciem. 1X trafo mix: 228 uL 52% PEG, 36 uL 1M LiOAc, 36 uL 10X TE
buffer Autoklawizowany płynny bulion LB	BD Difco	244620	Przygotuj płynny bulion LB przy użyciu proszku dowolnej marki i wody miliQ. Autoklawuj go przed użyciem.
Zapas karbenicyliny w wodzie (100 mg / ml)	Dowolny	N / A	sterylizować przez 0,22 μ m filtr przed użyciem.
Kompletne syntetyczne płytki agarowe (24,1 cm x 24,1 cm) z kwasem 5-fluoroorotycznym (5-FOA) [0,2% mieszanka aminokwasów drop-out bez uracylu lub drożdżowej zasady azotowej (YNB), 0,005% uracylu, 2% D-glukozy, 0,67% YNB bez aminokwasów, 0,075% 5-FOA]	5-FOA: Zymo Research, Drop-out mix: US Biological, Uracil: Sigma, D-glukoza: Sigm), YNB: Difco	5-FOA: F9001-5, Drop-out mix: D9535, Uracyl: U0750, D-glukoza: G8270, YNB: DF0919
DMSO	Dowolny	N/A
E. COLI przenoszący pJR487 (plazmid zawierający piggyBac) CEN-/ARS+ N		/A	Prośba z laboratorium Brem.
Hybrydowy szczep drożdży JR507 (S. cerevisiae DBVPG1373 x S. paradoxus Z1, URA-/URA-)	N/A	N/A	Zapytanie z laboratorium Brem.
Illumina Hiseq 2500			używany do odczytów SE-150
Duże inkubatory z wytrząsaniem ze zmiennymi ustawieniami temperatury	Dowolne	N/A
LB + karbenicylina (100 μ g / mL)	Agar: BD Difco	Agar: 214010	Ułóż płytki agarowe LB jak zwykle i dodaj karbenicylinę do 100 μ g/ml przed suszeniem.
Spektrofotometr Nanodrop	Thermo Scientific	ND-2000
Fluorymetr kubitowy	Thermo Scientific	Q33240
DNA plemników łososia	Invitrogen	15632011
Łaźnia wodna w temperaturze 39& C	Dowolna	Nie dotyczy
Zestaw do przygotowania gDNA grzybów drożdżowych	Zymo Research	D6005
Płynne podłoże dekstrozy peptonu drożdżowego (YPD) Pepton	BD Difco	Pepton: 211677, Ekstrakt drożdżowy: 212750	Dodaj sterylizowaną filtrem D-glukozę do 2% po autoklawowaniu.
Płytki agarowe YPD + G418 (300 μ g / mL)	Agar: BD Difco	Agar: 214010	Zrób płytki agarowe YPD jak zwykle i dodaj G418 do 300 μ g/ml przed suszeniem.
Płytki agarowe YPD	Agar: BD Difco	Agar: 214010