Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ilościowe podejścia do badania struktur komórkowych i morfologii organelli u Caenorhabditis elegans

9.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59978

⸱

5 lipca 2019

 ,  ,  , 
1Neuroscience Program, Monash Biomedicine Discovery Institute and Department of Anatomy and Developmental Biology, Monash University, Melbourne VIC 3800, Australia.

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

To badanie przedstawia ilościowe pomiary wielkości i lokalizacji synaptycznej, morfologii mięśni i kształtu mitochondriów u C. elegans przy użyciu swobodnie dostępnych narzędzi do przetwarzania obrazów. Takie podejście pozwala przyszłym badaniom nad C. elegans na ilościowe porównanie zakresu zmian strukturalnych tkanek i organelli w wyniku mutacji genetycznych.

Streszczenie

Zdefiniowanie mechanizmów komórkowych leżących u podstaw choroby jest niezbędne do opracowania nowych metod leczenia. Strategią często stosowaną w celu rozwikłania tych mechanizmów jest wprowadzenie mutacji w genach kandydujących i jakościowe opisanie zmian w morfologii tkanek i organelli komórkowych. Jednak opisy jakościowe mogą nie oddawać subtelnych różnic fenotypowych, mogą błędnie przedstawiać różnice fenotypowe między osobami w populacji i często są oceniane subiektywnie. W tym miejscu opisano podejścia ilościowe do badania morfologii tkanek i organelli nicieni Caenorhabditis elegans przy użyciu laserowej skaningowej mikroskopii konfokalnej w połączeniu z dostępnym na rynku oprogramowaniem do przetwarzania bioobrazów. Przeprowadzono analizę ilościową fenotypów wpływających na integralność synaps (wielkość i zintegrowane poziomy fluorescencji), rozwój mięśni (wielkość komórek mięśniowych i długość włókien miozyny) oraz morfologię mitochondriów (kolistość i wielkość), aby zrozumieć wpływ mutacji genetycznych na te struktury komórkowe. Te podejścia ilościowe nie ograniczają się do opisanych tutaj zastosowań, ponieważ można je łatwo wykorzystać do ilościowej oceny morfologii innych tkanek i organelli w nicieniach, a także w innych organizmach modelowych.

Wprowadzenie

Nicień Caenorhabditis elegans (C. elegans) jest coraz częściej wykorzystywany jako system modelowy do odkrywania biologicznych i molekularnych procesów związanych z chorobami ludzkimi. Dorosły nicień ma długość ciała nieco ponad 1 mm i może wyprodukować duży lęg do 300 jaj1. Po wykluciu C. elegans potrzebuje tylko 3-4 dni, aby osiągnąć dorosłość i żyje około 2 do 3 tygodni2. Ze względu na łatwość hodowli, C. elegans jest obecnie jednym z najbardziej poszukiwanych modeli zwierzęcych in vivo do przeprowadzania opłacalnych, szybkich badań przesiewowych leków w celu zidentyfikowania środków terapeutycznych stosowanych w chorobach u ludzi. Dodatkowo, jego ochrona genetyczna, dobrze zdefiniowane paradygmaty behawioralne, przezroczysty korpus do fluorescencji lub mikroskopii świetlnej oraz łatwość manipulacji genetycznej sprawiają, że badanie komórkowych i molekularnych konsekwencji mutacji genetycznych jest łatwo osiągalne3. Genom C. elegans ma około 60-80% wspólnej ortologii z ludzkimi genami, a około 40% tych genów jest znanych jako związane z chorobą. Niektóre z chorób ludzkich, które zostały modelowane i badane u C. elegans, obejmują zaburzenia neurodegeneracyjne (choroba Alzheimera, choroba Parkinsona, stwardnienie zanikowe boczne, choroba Charcota-Mariego-Tootha), choroby związane z mięśniami (dystrofia mięśniowa Duchenne'a) i choroby metaboliczne (hiperglikemia)2,4. W większości zaburzeń u ludzi dochodzi do indukowanej chorobą lokalizacji komórkowej i organelli oraz zmian morfologicznych, które można łatwo ocenić w modelu nicieni.

Markery fluorescencyjne są powszechnie używane do oznaczania tkanek i organelli do dynamicznej wizualizacji pod mikroskopem. Jednak u C. elegans konwencjonalne metody, które oceniają nieprawidłowości morfologiczne spowodowane mutacjami genetycznymi, w dużej mierze opierały się na opisach wizualnych. Podczas gdy oceny jakościowe mogą obejmować szerszy zakres opisów fenotypowych (morfologia synaptyczna, zlepianie się GFP, specyficzny kształt aksonów, grubość włókien mięśniowych itp.) i zapewniać spojrzenie z lotu ptaka na zmiany morfologiczne, są one mniej odpowiednie do porównywania małych różnic w różnych grupach. Ponadto oceny jakościowe opierają się na wizualnej, subiektywnej ocenie, co może prowadzić do przeszacowania lub niedoszacowania nieprawidłowości morfologicznych. Wreszcie, obserwacje jakościowe mogą się również znacznie różnić między osobami, co stwarza trudności z replikacją danych.

W ostatnich latach opracowano szereg przyjaznych dla użytkownika, łatwo dostępnych algorytmów obliczeniowych, które mogą analizować ilościowo obrazy. Jednak wykorzystanie takiego oprogramowania do analizy obrazu w niektórych badaniach morfologicznych, zwłaszcza w odniesieniu do mięśni ścian ciała i mitochondriów, w badaniach nad C. elegans pozostaje w tyle. Aby udoskonalić podstawową analizę strukturalną u C. elegans, przetestowano niektóre z łatwo dostępnych programów do analizy obrazów typu open source w celu ilościowego porównania wpływu mutacji genetycznych na mitochondria mięśniowe, mięśnie ścian ciała i morfologię synaptyczną. Te procedury eksperymentalne szczegółowo opisują, w jaki sposób te programy (Fiji, ilastik, CellProfiler, SQUASSH) mogą być wykorzystywane do oceny zmian w wielkości synaps i lokalizacji białek synaptycznych, powierzchni mięśni ściany ciała i długości włókien oraz wielkości i kolistości mitochondriów w wyniku mutacji genetycznych w nicieniach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Wzrost i utrzymanie szczepów C. elegans

  1. Pożywka do wzrostu nicieni nasiennych (NGM, patrz tabela materiałów) płytki agarowe z 300 μl wolno rosnącego szczepu E. coli OP50 w komorze z przepływem laminarnym.
  2. Pozostaw płytki agarowe NGM w komorze z przepływem laminarnym do wyschnięcia.
    UWAGA: W przypadku braku komory z przepływem laminarnym płyty można pozostawić do wyschnięcia na stole, ale są one bardziej podatne na zanieczyszczenie.
  3. Przenieś co najmniej 20 zwierząt na każdą z dwóch płytek agarowych NGM z nasionami OP50, aby uzyskać zapasy robocze. Istnieją dwa główne sposoby przenoszenia zwierząt.
    1. Zbieranie: Delikatnie podnieś zwierzęta za pomocą sterylizowanego termicznie kilofa. Ta metoda jest skuteczna w przypadku selekcji pojedynczych lub wielu zwierząt z płytki agarowej. Niewielkie zadrapanie bakterii na końcówce podczas zbioru pomaga w przenoszeniu.
      UWAGA: Szpikulec jest wykonany z małego kawałka drutu platynowego o długości około 4 cm, który jest osadzony w szklanej pipecie, z końcówką drutu spłaszczoną tak, aby była "podobna do włóczni". Sterylizuj termicznie pick między zbiorami, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu.
    2. Chunking: Za pomocą wysterylizowanej szpatułki wytnij mały kwadrat agaru zawierający zwierzęta z jednego talerza i przenieś do góry nogami na nowy talerz.
      UWAGI: Ta metoda jest ogólnie przydatna do przenoszenia dużej liczby robaków i do usuwania zanieczyszczeń z płytek poprzez wiele rund kawałkowania nieskażonego agaru. Unikaj zanieczyszczenia krzyżowego, paląc szpatułkę przez kilka sekund i zanurzając szpatułkę w 100% etanolu między transferami. Przenoszenie z wygłodzonych płytek nie jest zalecane, ponieważ głód i przeludnienie mogą wpływać na zdrowie i morfologię struktur komórkowych i subkomórkowych.
  4. Utrzymuj robaki w standardowej temperaturze wzrostu (20 °C). Aby zapewnić ciągłe dostarczanie dobrze odżywionych robaków, należy je przenosić na nowe płytki z nasionami OP50 co 2 do 3 dni.

2. C. elegans synchronizujący wiek

  1. Utrzymuj robaki na płytach 3-4 NGM, aż populacja będzie zatłoczona, ale nie głodna.
  2. Delikatnie zmyj robaki z płytki NGM roztworem M9. Jaja pozostaną na talerzu, ponieważ przyklejają się do E. coli OP50. Powtórz z czterema dodatkowymi krokami mycia, aby usunąć wszystkie wyklute zwierzęta.
  3. Pozwól robakom wykluć się przez 40 minut.
  4. Dodaj 1-2 ml roztworu M9 do płytki i delikatnie zamieszaj, aby poluzować niedawno wyklute robaki.
  5. Zebrać roztwór M9 z niedawno urodzonymi robakami i przenieść roztwór z robakami na świeżą płytkę NGM.
  6. Pozwól, aby roztwór M9 odparował, wystawiając płytkę NGM na działanie powietrza. Zrób to w pobliżu otwartego ognia, aby uniknąć zanieczyszczenia płytki NGM.
  7. Hodować robaki przez 27 godzin w temperaturze 20 °C, aby umożliwić rozwój do trzeciego stadium larwalnego (L3). W przypadku zsynchronizowanych 3-dniowych dorosłych zwierząt robaki są zbierane w stadium larwalnym 4 i hodowane przez kolejne 3 dni, aby osiągnąć 3-dniowe stadium dorosłe.

3. Przygotowanie preparatów do obrazowania

  1. Przygotuj 3-4% w/v bulionu agarozowego w butelce nadającej się do kuchenki mikrofalowej (3-4 g w 100 ml ultraczystej wody).
    UWAGA: Agar może być stosowany zamiast agarozy w tym samym stężeniu.
  2. Ostrożnie rozpuść agarozę w kuchence mikrofalowej, uważając, aby nie przegotować, aż cała agaroza się rozpuści (klarowny roztwór). Roztwór należy przechowywać w temperaturze 70 °C, aby zapobiec krzepnięciu.
    UWAGA: Wywar z agarozy można stosować wielokrotnie. Podgrzej ponownie przed użyciem, jeśli agaroza zastygła.
  3. Za pomocą pipety Pasteura umieść kroplę stopionej agarozy na szkiełku mikroskopowym.
    UWAGA: Unikaj pęcherzyków powietrza w kropli agaru, ponieważ naruszają one integralność podkładki.
  4. Natychmiast dociśnij kroplę agarozy innym szkiełkiem mikroskopowym, delikatnie spłaszczając agarozę w podkładkę między dwoma szkiełkami.
    UWAGA: Na tym etapie należy usunąć wszelkie resztki bąbelków. Jeśli nie, należy wykonać nowe zjeżdżalnie, ponieważ zwierzęta mogą łatwo utknąć w bąbelkach. Unikaj przelewania się agaru na bok podczas naciskania na szkiełko.
  5. Pozostaw agarozę do wyschnięcia na 1 minutę.
  6. Ostrożnie oddziel oba szkiełka, aby uniknąć uszkodzenia agarozy, pozostawiając zestaloną podkładkę na jednym ze szkiełek.
    UWAGA: Preparaty z wacikami agarozowymi powinny być zawsze przygotowywane świeże tuż przed eksperymentem, ponieważ mogą wyschnąć. Upewnij się, że podkładka agarozowa ma stałą grubość. W podkładce nie powinno być pęcherzyków powietrza ani pęknięć, ponieważ może to zakłócać obrazowanie.
  7. Dodaj małą kroplę (5-10 μl) 0,05% chlorowodorku tetramizolu (środka znieczulającego) do środka wacika agarozowego.
  8. Za pomocą sterylizowanego termicznie kilofa szybko przenieś około 10 – 15 zwierząt z talerza podstawowego do kropli znieczulającej, zanim roztwór wyschnie. Unikaj przenoszenia zbyt dużej ilości bakterii OP50, ponieważ powoduje to zmętnienie roztworu, co może zakłócać obrazowanie.
    UWAGA: Jeśli roztwór znieczulający wyschnie podczas zbierania, po prostu odpipetuj drugą kroplę 0,05% chlorowodorku tetramizolu na zwierzęta. Zwierzęta mają tendencję do leżenia na boku w roztworze znieczulającym.
  9. Nałóż szkiełko nakrywkowe, umieszczając je tuż nad podkładką agarozową i delikatnie upuszczając w dół. Zapobiegnie to tworzeniu się pęcherzyków. Nie należy wywierać nacisku na szkiełko nakrywkowe, ponieważ może to zmiażdżyć zwierzęta.
  10. Oznacz slajdy nazwą szczepu.

4. Ocena morfologii synaps

UWAGA: Wpływ nadekspresji MEC-17 na integralność synaps w neuronach receptora dotyku tylnego bocznego mikrotubuli (PLM) był badany poprzez ilościowe określenie wielkości i lokalizacji synapsy za pomocą mikroskopii konfokalnej ze skanowaniem liniowym. Neurony PLM (w tym regiony synaptyczne) zostały zwizualizowane za pomocą transgenu uIs115(Pmec-17::tagRFP) (szczep: TU40655), a region synaptyczny został specjalnie oznaczony za pomocą jsIs37(Pmec-7::snb-1::GFP) (szczep: NM6646). Badanie to przeprowadzono na zsynchronizowanych nietransgenicznych i transgenicznych zwierzętach L3 z nadekspresją pozachromosomalnego szczepu nadekspresji MEC-17 BXN507 [cjnEx036(Pmec-4::mec-17, Pmyo-2::mCherry); jsIs37; uIs115]7. Pełna lista szczepów wykorzystanych w tym badaniu znajduje się w Tabeli 1.

  1. Obrazowanie konfokalne synaps neuronów receptora dotyku
    1. Aby zobrazować obszary synaptyczne, użyj liniowego skaningowego mikroskopu konfokalnego sprzężonego z optycznie pompowanym półprzewodnikowym laserem diodowym o długości fali 488 nm i 552 nm i wyposażonego w oprogramowanie do przechwytywania obrazu.
    2. Zlokalizuj robaki, używając najmniejszego powiększenia.
    3. Gdy zwierzętom uda się umiejscowić, przełącz się na 40-krotne powiększenie i zastosuj medium immersyjne (w tym badaniu: użyto wielofunkcyjnego obiektywu 40X/1,10 HC PL APO CS2 z zanurzeniem w wodzie).
    4. Wizualizuj region synaptyczny poprzez wzbudzanie fluoroforów laserem o długości fali 488 nm (2% mocy) dla fluoroforu GFP i 552 nm (1% mocy) dla fluoroforu tagRFP.
    5. Określ optymalną ramkę x i y, aby uchwycić cały region synaptyczny. Upewnij się, że przy wyborze ramki bierzesz pod uwagę optymalny rozmiar w pikselach. W tym badaniu uzyskano stały rozmiar piksela 56 nm.
    6. Uchwyć obrazy za pomocą hybrydowego fotodetektora i ustaw wzmocnienia, aby zapobiec prześwietleniu fluoroforów (100% dla wzbudzenia 488 nm i 15% dla wzbudzenia 552 nm).
    7. Zbierz obrazy z-stack, aby pokryć całą synapsę, używając optymalnego rozmiaru z-step w zależności od konkretnego użytego obiektywu. W tym badaniu zastosowano optymalny rozmiar kroku z wynoszący 0,211 nm.
      UWAGA: Upewnij się, że wszystkie obrazy są wykonywane w rygorystycznych warunkach, aby umożliwić zintegrowaną kwantyfikację i porównanie fluorescencji. Można to osiągnąć, utrzymując identyczne parametry mikroskopii na wszystkich zarejestrowanych obrazach (tj. ustawienia lasera i detektora, rozmiar piksela, szybkość skanowania i optymalny rozmiar kroku z). Optymalne ustawienia zależą od celu i można je obliczyć za pomocą dostępnych programów bioinformatycznych, takich jak kalkulator Nyquista (https://svi.nl/NyquistCalculator). Systematycznie oznaczaj obrazy, będzie to przydatne podczas korzystania z oprogramowania bioinformatycznego, które będzie organizować i przetwarzać pliki na podstawie nazwy pliku.
  2. Kwantyfikacja regionu synaptycznego
    1. Aby przeanalizować region synaptyczny, wyeksportuj obrazy jako pliki TIFF. Można użyć oprogramowania do przetwarzania obrazowania opartego na języku Java, takiego jak ImageJ (w tym badaniu użyto makra konwersji obrazu MRI w ImageJ).
    2. Wielkość i zintegrowane poziomy intensywności fluorescencji synaps mierzono na podstawie sumy intensywności otrzymanych stosów z za pomocą CellProfiler-3.1.5. Załaduj obrazy do oprogramowania CellProfiler 3.1.5. W razie potrzeby obrazy można filtrować na podstawie nazw plików obrazów.
    3. Skonfiguruj moduł Nazwa i typ. Opcjonalnie wyodrębnij metadane z etykiety obrazu, aby odpowiednio uporządkować obliczone dane.
    4. Określ region synaptyczny przez ręczną definicję tego regionu za pomocą rozproszonego tagRFP wyrażonego z transgenu uIs115 (Pmec-17::tagRFP). Można to zrobić, dodając odpowiedni moduł do potoku CellProfiler-3.1.5.
    5. Aby zmierzyć rozmiar i fluorescencję synapsy zdefiniowanej przez dłoń, dodaj do potoku moduły Zmierz rozmiar i kształt obiektu oraz Zmierz intensywność obiektu.
    6. Oblicz względną zintegrowaną intensywność fluorescencji, dodając moduł Oblicz matematykę. Podziel zintegrowane jednostki intensywności uzyskane z jsIs37(Pmec-7::snb-1::GFP) przez zintegrowane jednostki otrzymane dla uIs115(Pmec-17::tagRFP).
    7. Eksport pomiarów i obliczeń.

5. Kwantyfikacja struktury mięśniowej ściany ciała

  1. Obrazowanie fluorescencyjne struktury mięśniowej ściany ciała
    1. Uzyskaj szczep (na przykład RW1596) przenoszący transgen stEx30(Pmyo-3::gfp::myo-3 + rol-6(su1006))8, który oznacza włókna miozyny GFP.
      UWAGA: Wprowadzenie transgenu do organizmu zwierząt można osiągnąć poprzez skrzyżowanie interesującego szczepu ze zwierzętami, które już wykazują ekspresję transgenu, lub mikrowstrzyknięcie DNA do dystalnego ramienia gonady. Fenotyp "toczenia" indukowany przez mutację rol-6 w tym transgenie ułatwia wizualizację mięśni. Mięśnie ściany ciała biegną wzdłuż strony grzbietowej i brzusznej, które zwykle są niewidoczne u zwierząt typu dzikiego, ponieważ zwykle leżą na jednej z bocznych stron. Allel rol-6 (su1006) indukuje skręcanie zwierząt, odsłaniając w ten sposób niektóre komórki mięśniowe do obrazowania.
    2. Zobrazuj zwierzęta za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego sprzężonego z kamerą ze sprzężonym urządzeniem o wysokiej rozdzielczości (CCD), obiektywem 40X lub wyższym, filtrem GFP i oprogramowaniem do akwizycji.
    3. Dostosuj czas ekspozycji i intensywność oświetlenia, aby zapobiec przesyceniu obrazów.
    4. Przechwytywanie i zapisywanie obrazów mięśni (powiększenie 400X) z części zwierzęcia zawierającej co najmniej jedną widoczną widoczną komórkę mięśnia skośnego. Unikaj obszarów z pojedynczą komórką mięśniową, która jest niekompletna lub sekcji, które są nieostre. Wyklucz również obrazy ze skrajnych przednich i tylnych obszarów oraz obszarów przylegających do sromu.
      UWAGA: Jeśli zwierzę nie ma ani jednej widocznej pełnej komórki mięśniowej, delikatnie przesuń szkiełko nakrywkowe, aby obrócić zwierzę tak, aby odsłonić całą komórkę.
  2. Pomiar powierzchni komórek mięśniowych
    1. Otwórz obraz w Fidżi software9 (w tym badaniu użyto wersji 2.0.0).
    2. Użyj zaznaczenia wielokąta, aby ostrożnie obrysować pojedynczą ukośną komórkę mięśniową. Dostosuj linię wielokąta na końcu, przeciągając kropkę zakotwiczenia, aby poprawić obrysowywanie.
    3. Przejdź do zakładki Analizuj w górnej części oprogramowania i kliknij Zmierz, aby obliczyć obszar zaznaczenia. Zostanie wyświetlona oddzielna tabela wyników zawierająca powierzchnię i inne pomiary. Jeśli w tabeli wyników brakuje pomiaru powierzchni, przejdź do opcji Ustaw pomiary na karcie Analiza i sprawdź, czy pole obszaru jest zaznaczone. Podobnie odznacz inne pomiary, które nie są potrzebne.
    4. W przypadku komórek mięśniowych ze zdegenerowanym/brakującym regionem prześledź brakujący obszar za pomocą narzędzia do zaznaczania wielokątów i ponownie kliknij przycisk Zmierz. Jeśli w komórce jest wiele przerw, prześledź każdą przerwę osobno.
    5. Oblicz stosunek powierzchni przerwy do całej pojedynczej komórki mięśniowej. Wysoki współczynnik wskazuje na większy stopień zwyrodnienia mięśni z powodu dużych luk w komórce. Jeśli nie ma brakujących regionów, jak to często obserwuje się u zwierząt typu dzikiego, współczynnik zostanie obliczony jako zero.
      UWAGA: Jako kontrolę, oceń również wizualnie defekty struktury mięśniowej i porównaj wyniki z pomiarem ilościowym. Jest to szczególnie przydatne, jeśli szczep jest badany po raz pierwszy w laboratorium. W przypadku oceny fenotypowej należy ocenić zwierzęta jako wadliwe lub niewadliwe na podstawie integralności włókien. Na przykład zwierzęta z utratą wyraźnych prążków włókien, zbrylaniem się GFP lub lukami w komórkach mięśniowych z powodu rozpadu strukturalnego, zostałyby ocenione jako wadliwe.
  3. Segmentacja i kwantyfikacja długości włókien miozyny
    1. W razie potrzeby najpierw przekonwertuj pliki na format . tif za pomocą Fidżi lub innego pakietu oprogramowania. Zapisz pliki TIFF w żądanej lokalizacji.
    2. Otwórz ilastik10 (darmowe oprogramowanie, wersję 1.3.2 można pobrać z https://www.ilastik.org/).
    3. W ilastik wybierz opcję Klasyfikacja pikseli w obszarze Utwórz nowy projekt. Oprogramowanie poprosi o zapisanie projektu. Zmień nazwę projektu i zapisz go w wybranej lokalizacji.
      UWAGA: Nowy projekt wystarczy utworzyć tylko raz. Późniejsza segmentacja może być wykonana przy użyciu tego samego projektu. Aby użyć tych samych ustawień projektu, przejdź do zakładki Projekt u góry i kliknij Otwórz projekt, aby uzyskać dostęp do pliku projektu.
    4. Na lewym panelu powinno znajdować się 5 zakładek (Dane wejściowe, Wybór funkcji, Szkolenie, Eksport predykcji i Przetwarzanie wsadowe). Na karcie Dane wejściowe kliknij Dodaj nowy, a następnie Dodaj oddzielne obrazy. Skieruj wyskakujące okienko do folderu zawierającego pliki TIFF i wybierz obraz, który chcesz otworzyć.
    5. W następnej zakładce poniżej (Wybór funkcji) kliknij Wybierz funkcje, aby wybrać wszystkie cechy pikseli, oznaczone zielonymi polami wyboru. Zaznaczenie pikseli w tym kroku służy do rozróżniania różnych klas pikseli w następnym kroku.
      UWAGA: Wybór funkcji pikseli zależy od rozdzielczości obrazu. Dlatego programiści sugerują wybranie wszystkich lub jak największej liczby funkcji, jeśli pozwala na to moc obliczeniowa i czas.
    6. Poniższy panel Trening umożliwia klasyfikację różnych klas obiektów na podstawie pikseli. W tym przypadku dwie klasy to pojedyncze włókna miozyny wykazujące ekspresję GFP oraz niepożądane tło lub rozmyte krawędzie. Kliknij Dodaj etykietę, aby mieć pierwszą etykietę. Nabazgraj kilka włókien, aby rozpocząć szkolenie klasyfikatora.
      UWAGA: Dwukrotne kliknięcie etykiety pozwala na zmianę nazwy (na przykład zmianę nazwy "etykieta 1" na "filament"). Dwukrotne kliknięcie kolorowego pola umożliwia zmianę kolorów wyświetlania rysunku i prawdopodobieństwa. Domyślny rozmiar pędzla to 1, chociaż można go zwiększyć do 61. Jeśli został narysowany niewłaściwy piksel, po prostu użyj narzędzia do wymazywania, aby usunąć rysunek. Elementy sterujące klawiatury (-) i (Shift +) mogą być używane odpowiednio do powiększania i pomniejszania obrazu. strzałek służą do poruszania się po obrazie.
    7. Dodaj drugą etykietę i zmień jej nazwę na Tło. Nabazgraj niechciane tła i przestrzenie między włóknami.
    8. Kliknij Live Update i upewnij się, że klasyfikacja została poprawnie wykonana przez oprogramowanie. Dodaj więcej bazgrołów i w razie potrzeby dostosuj szkolenie.
      UWAGA: Na tym etapie ważne jest, aby zwracać uwagę na połączone włókna i rozmyte krawędzie (takie jak linia ciała). Popraw prognozę tak bardzo, jak to możliwe, aby zwiększyć dokładność pomiarów. Dokładność przewidywania zależy również od rozdzielczości obrazu, ponieważ piksele na obrazach o niskiej jakości są trudniejsze do rozdzielenia. Jest to również opcjonalne, ale zalecane, aby uruchomić metodę filtrowania w funkcji Sugeruj funkcje obok kontrolki Live Update.
    9. Po odpowiednim wykonaniu klasyfikatora treningowego przejdź do panelu Eksport predykcji. Kliknij Wybierz ustawienia eksportu obrazu z prawdopodobieństwami jako źródłem.
    10. Użyj następujących ustawień. Wycięte podregiony x i y są zaznaczone, a c niezaznaczone. Wartości początkowe i końcowe dla c powinny wynosić odpowiednio 0 i 1. Zaznacz i przekonwertuj typ danych w obszarze Przekształcenia na niepodpisany 8-bitowy, zaznacz opcję znormalizuj ponownie [min, max] i użyj wartości domyślnych. Zmień format wyjściowego pliku wideo na PNG i zmień nazwę pliku i katalogu zgodnie z potrzebami.
    11. Zamknij okno ustawień eksportu i wyeksportuj określony obraz, który właśnie został podzielony na segmenty.
    12. Otwórz zapisany obraz PNG w oprogramowaniu Fidżi. Obraz powinien być czarno-biały.
    13. Dostosuj próg obrazu przy użyciu ustawień domyślnych.
    14. Zastosuj wtyczkę szkieletyzacji (Skeletonize 2D/3D, a następnie Analyze Skeleton). Zostanie wyświetlona osobna tabela wyników, która zawiera długość gałęzi. Długość gałęzi reprezentuje długość włókna. Przydatne mogą być również inne dane zawarte w wynikach, takie jak odległość euklidesowa.
      UWAGA: Pomiń włókna o długości 0 μm lub większej niż 250 μm, ponieważ te rozmiary nie są fizjologicznie możliwe.

6. Kwantyfikacja morfologii mitochondriów

UWAGA: Do ilościowego określenia morfologii mitochondriów, w tym badaniu użyto BXN0387 szczepu zawierającego uIs115(Pmec-17::tagRFP)5 transgen do wizualizacji neuronów PLM oraz jsIs609(Pmec-4::MLS::GFP)11 do wizualizacji mitochondriów specyficznie w neuronach PLM. Badanie to zostało przeprowadzone na zsynchronizowanych 3-dniowych dorosłych robakach, ale z powodzeniem przeprowadzono je w innym wieku, a także w innych tkankach7.

  1. Obrazowanie fluorescencyjne mitochondriów w obrębie neuronów PLM
    1. Aby zmierzyć zmiany wielkości i kształtu mitochondriów w neuronach PLM, wizualizuj zarówno neuron tła, jak i mitochondria za pomocą transgenów fluorescencyjnych.
    2. Aby zobrazować neuron PLM, użyj mikroskopu konfokalnego sprzężonego z optycznie pompowanym półprzewodnikowym laserem diodowym o długości fali 488 nm i 552 nm i wyposażonego w oprogramowanie do przechwytywania obrazu.
    3. Zobrazuj robaka zgodnie z krokami 4.1.1-4.1.4 powyżej, zapewniając warunki ekspozycji bez nasycenia.
    4. Aby zobrazować cały neuron, może być potrzebny obraz kafelkowy. Aby to osiągnąć, użyj oprogramowania z opcją skanowania kafelków, aby zlokalizować i upuścić znacznik w jednym rogu neuronu, a następnie zlokalizuj przeciwległy koniec i upuść drugi znacznik. Oprogramowanie obliczy optymalną liczbę kafelków potrzebnych do uchwycenia wymaganego obszaru.
      UWAGA: Aby skrócić czas skanowania, często łatwiej jest zlokalizować neurony, które podążają za jedną płaszczyzną, co skutkuje mniejszą liczbą kafelków.
    5. Aby połączyć skanowanie kafelków ze stosem Z, ustaw dolny i górny limit przed rozpoczęciem skanowania kafelków i upewnij się, że ustawiony jest optymalny rozmiar kafelka
      6. .
    6. Upewnij się, że rozdzielczość jest zoptymalizowana, ponieważ segmentacja będzie bardziej doprecyzowana przy wyższych rozdzielczościach (w tym przypadku użyto rozdzielczości 3224 x 3224 pikseli).
      UWAGA: Podczas gdy transgen uIs115(Pmec-17::tagRFP) jest używany do oznaczania PLM i pomyślnego pozycjonowania kamery, niekoniecznie musi być obrazowany ze względu na niewielką fluorescencję tła obserwowaną przez transgen jsIs609(Pmec-4::MLS::GFP) w samym aksonie PLM. W ten sposób czas skanowania i obrazowania można skrócić, usuwając filtr 552 nm z eksperymentu.
  2. Segmentacja obiektów za pomocą SQUASSH
    1. Konwertuj pliki obrazów na obrazy .tiff i generuj projekcje maksymalnej intensywności ze stosów Z za pomocą oprogramowania do obrazowania Fidżi. Przycinaj obrazy do minimalnego rozmiaru, zachowując jednocześnie cały neuron, aby zmniejszyć obciążenie obliczeniowe i zredukować szum tła.
      UWAGA: Aby uzyskać reprezentatywne wyniki, uwzględniono tylko mitochondria w obrębie długich procesów aksonalnych, więc ciało komórki i wszelkie mitochondria w jej obrębie zostały wykluczone z każdego obrazu.
    2. Korzystając z makra SQUASSH pakietu Mosaic Suite dla ImageJ, wykonaj segmentację Split Bregmana12 na maksymalnych rzutach. Szczegółowy przewodnik po instalacji i zastosowaniu tego makra jest dostępny na stronie internetowej Mosaic (http://mosaic.mpi-cbg.de/) i opisany przez Rizk et al. 201413. Proces segmentacji obrazu jest opisany w skrócie poniżej.
      UWAGA: Ta segmentacja identyfikuje obiekty (w tym przypadku pojedyncze mitochondrium) powyżej progu intensywności fluorescencji, co pozwala na dokładny pomiar rozmiaru i kształtu każdego pojedynczego obiektu.
    3. Usuń szum tła z obrazu za pomocą metody toczącej się kuli, w której okno zdefiniowane przez użytkownika przesuwa się po obrazie, przypisując lokalne oszacowanie intensywności tła na podstawie najczęściej występującej intensywności w każdym oknie. Koryguje to nierówną intensywność tła.
    4. Wykrywanie obiektów służy do zgrubnego znajdowania obszarów obrazu, które zawierają interesujące nas obiekty (mitochondria) na podstawie intensywności fluorescencji i liczby pikseli. Parametry, które rządzą tym krokiem, to regularyzacja i minimalna intensywność obiektu.
      UWAGA: Regularyzacja służy do unikania segmentacji o małej intensywności, pików wywołanych hałasem, a minimalny próg intensywności obiektu pomaga zdefiniować organelle subkomórkowe na podstawie fluorescencji tkanek tła. Są to dwa główne parametry, którymi manipuluje się w celu znalezienia optymalnej segmentacji mitochondriów, a proces optymalizacji polega zwykle na próbach i błędach różnych parametrów dla obrazu testowego, po którym następuje ręczna kontrola.
    5. Użyj oprogramowania, aby oszacować lokalne natężenie tła wokół każdego obiektu, aby pomóc w obliczeniach optymalnej segmentacji.
    6. Mierz poszczególne obiekty pod kątem rozmiaru, obwodu, długości za pomocą liczby pikseli, a także intensywności sygnału i lokalizacji x/y na obrazie. Aby obliczyć wymiary w rozmiarze (nm), należy wziąć pod uwagę rozmiar oryginalnego obrazu w pikselach.
      UWAGA: Dla każdego eksperymentu należy najpierw obliczyć optymalne parametry. Aby zapewnić dokładność segmentacji, zaleca się przeprowadzenie analizy SQUASSH na obrazie testowym i ręczne sprawdzenie dokładności segmentacji. Makro udostępnia pliki wyjściowe pokazujące poszczególne obiekty, które zostały zidentyfikowane na oryginalnym obrazie, a dokładne ich sprawdzenie i dostosowanie parametrów do nich zapewni dokładną segmentację. Zdefiniowane parametry muszą być następnie wykorzystane w całym eksperymencie w celu zapewnienia porównywalności. Parametry zastosowane do uzyskania reprezentatywnych wyników przedstawiono w tabeli 2.
    7. Otwórz oprogramowanie do analizy Fiji lub ImageJ, przejdź do kontenera makr Mosaic i otwórz menu SQUASSH.
      1. Otwórz podmenu Odejmowanie tła i upewnij się, że zaznaczona jest opcja Usuń tło?. Domyślny rozmiar okna to 10.
      2. Ustaw żądane wartości Regularyzacja i Minimalna intensywność obiektu, kanał 1, aby jak najlepiej identyfikować i segmentować obiekty (patrz krok 6.2.4). Wartości kanału 2 nie są konieczne dla obiektów oznaczonych pojedynczym transgenem.
      3. Kliknij właściwości Oszacuj PSF na podstawie obiektywu, aby oszacować funkcję rozproszenia punktów na podstawie charakterystyki mikroskopu. Pomaga to w segmentacji blisko położonych obiektów, uwzględniając wpływ każdego piksela na sąsiedni piksel.
        UWAGA: Segmentacja subpikseli nie została użyta w tym eksperymencie ze względu na zwiększone obciążenie mocy obliczeniowej komputera. Nie stosowano również masek komórkowych, ponieważ akson jest łatwy do zdefiniowania. Te ustawienia są przydatne w przypadku bardziej złożonych tkanek i do definiowania obiektów dla poszczególnych komórek.
      4. Aby uzyskać informacje o opcjach wizualizacji, upewnij się, że zaznaczone są opcje Kontury obiektów i Zapisz charakterystykę obiektu i obrazu. Do późniejszego wykorzystania w oprogramowaniu graficznym i statystycznym upewnij się, że wprowadzono prawidłową liczbę warunków.
    8. Zlokalizuj folder z .tiff obrazami i uruchom makro. Proces ten można przeprowadzić na pojedynczym obrazie lub na partii obrazów na genotyp znajdujących się w folderze. Pliki wyjściowe będą znajdować się w folderze wraz z oryginalnymi obrazami.
  3. Analiza i pomiary kształtu
    1. Użyj danych wyjściowych z SQUASSH, aby dostarczyć szczegółowy plik .csv danych obiektu, który zawiera każdy pojedynczy obiekt w wierszu, w tym jego pomiary, jak opisano powyżej.
      UWAGA: Chociaż ten proces makro automatyzuje pomiary obiektów, zawsze ważne jest, aby ręcznie sprawdzić obrazy wyjściowe po segmentacji SQUASSH, aby upewnić się, że makro prawidłowo zidentyfikowało mitochondria.
    2. Aby przeanalizować kształt każdego mitochondria, użyj dwuwymiarowej miary sferyczności, Kolistości, aby oszacować odchylenie obiektu od idealnego koła.
      UWAGA: Kołowość jest funkcją pola i obwodu (Okrągłość = (4 x π) x (Powierzchnia/Obwód2), gdzie 1 = idealne koło, a 0 = linia prosta. Można to osiągnąć za pomocą wzoru w oprogramowaniu graficznym i statystycznym.
    3. Aby określić wariancję wielkości i kształtu w całej puli mitochondriów, oblicz histogramy i dopasowany rozkład Gaussa za pomocą grafiki i oprogramowania statystycznego, z przedziałami 0,2 μm dla wielkości mitochondriów i 0,05 dla cyrkularności mitochondriów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

C. elegans jest idealnym organizmem modelowym do badania morfologii różnych tkanek i organelli ze względu na swoją prostotę, znaną linię komórkową, przezroczystość oraz dostępne narzędzia. W niniejszym materiale przedstawiamy ilościowe podejścia do badania organelli (np. mitochondriów) oraz tkanek, w tym synaps i mięśni, z wykorzystaniem obrazowania fluorescencyjnego żywych organizmów oraz bezpłatnego oprogramowania do przetwarzania obrazów biologicznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Różnice morfologiczne często oceniano poprzez ręczne liczenie zauważalnych różnic lub przy użyciu arbitralnych progów w celu określenia wad w porównaniu z fenotypem typu dzikiego. Ostatnio jednak metody ilościowe zostały wykorzystane do porównawczych badań morfologii, aby dokładnie zmierzyć i opisać zmiany na poziomie komórkowym i subkomórkowym w bezstronny sposób. Zdolność do identyfikowania subtelnych, ale biologicznie istotnych różnic między fenotypami jest potężnym sposobem na zrozumienie podstawowych mechanizmów mol...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają sprzecznych interesów.

Podziękowania

Dziękujemy członkom laboratorium Neumanna za cenne dyskusje i wkład. Niektóre szczepy zostały dostarczone przez CGC, które jest finansowane przez Biuro Programów Infrastruktury Badawczej NIH (P40 OD010440). Autorzy dziękują firmie WormBase za bogactwo informacji na temat C. elegans i dziękują firmie Monash Micro Imaging z Uniwersytetu Monash za dostarczenie oprzyrządowania, szkolenia i wsparcie techniczne. Prace te były wspierane przez granty badawcze CMTAA (2015 i 2018) oraz granty projektowe NHMRC 1101974 i 1099690 przyznane B.N.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Agar-agarMerck1.01614.1000
AgaroseInvitrogen16500-500
Mikroskop konfokalnyLeicaTCS SP8Odwrócona platforma
Mikroskop fluorescencyjnyCarl Zeiss AGZeiss Axio Imager M2
Szkiełka nakrywkowe szklane #1Thermo scientifiqueMENCS22221GP
Szkło Szkiełka nakrywkowe #1.5Zeiss474030-9000-000Wykonane przez SCHOTT
Szkiełkaszklane Thermo scientifiqueMENS41104A/40
Light LEDSchottKL 300 LED
OlympusSZ51
Trypton (pepton z kazeiny)Merck107213Składniki bulionu lizogennego (LB) średni
ekstrakt drożdżowyMerck103753Składniki na bulion lizogeniczny (LB) podłoże
Chlorek soduMerck106404Składniki na bulion lizogeniczny (LB) średni
pepton (pepton z mięsa)Merck107214Składniki na pożywkę wzrostową nicieni (NGM) agar
AgarSigmaA1296Składniki na pożywkę wzrostową nicieni (NGM) agar
ChloreksoduMerck106404Składniki na pożywkę wzrostu nicieni (NGM) agar
CholesterolSigmaC8667-25GSkładniki na pożywkę wzrostu nicieni (NGM) agar
Chlorek wapniaMerck102382Składniki na pożywkę wzrostu nicieni (NGM) agar
Siarczan magnezu105886 MerckSkładniki na podłoże wzrostu nicieni (NGM) agar
Fosforan dipotasowyMerck105101Składniki na pożywkę do wzrostu nicieni (NGM) agar
Diwodorofosforan potasuMerck104873Składniki na podłoże wzrostu nicieni (NGM) agar
Fosforan disodowyMerck106586Składniki na bufor M9
Chlorek soduMerck106404Składniki na bufor M9
DiwodorofosforanpotasuMerck104873Składniki na bufor M9
Siarczan magnezuMerck105886Składniki na bufor M9
Pipeta PasteuraCorningCLS7095D5X-200EA
Szalki PetriegoCorningCLS430589-500EA
Drut platynowySigma267201-2G
SzpatułkaMet-app2616
Chlorowodorek tetraizoluSigmaL9756-5G
Mikroskop stereoskopowy

Bibliografia

  1. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. , (1974).
  2. Markaki, M., Tavernarakis, N. Modeling human diseases in Caenorhabditis elegans. Biotechnology Journal. 5 (12), 1261-1276 (2010).
  3. Laranjeiro, R., Harinath, G., Burke, D., Braeckman, B. P., Driscoll, M. Single swim sessions in C. elegans induce key features of mammalian exercise. BMC Biology. , (2017).
  4. Alexander, A. G., Marfil, V., Li, C. Use of C. elegans as a model to study Alzheimer's disease and other neurodegenerative diseases. Frontiers in Genetics. , (2014).
  5. Zheng, C., Jin, F. Q., Chalfie, M. Hox Proteins Act as Transcriptional Guarantors to Ensure Terminal Differentiation. Cell Reports. 13 (7), 1343-1352 (2015).
  6. Koushika, S. P., et al. Mutations in Caenorhabditis elegans cytoplasmic dynein components reveal specificity of neuronal retrograde cargo. Journal of Neuroscience. 24 (16), 3907-3916 (2004).
  7. Byrne, J. J., et al. Disruption of mitochondrial dynamics affects behaviour and lifespan in Caenorhabditis elegans. Cellular and Molecular Life Sciences. , (2019).
  8. Campagnola, P. J., et al. Three-Dimensional High-Resolution Second-Harmonic Generation Imaging of Endogenous Structural Proteins in Biological Tissues. Biophysical Journal. 82 (1), 493-508 (2002).
  9. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  10. Sommer, C., Straehle, C., Kothe, U., Hamprecht, F. A. Ilastik: Interactive learning and segmentation toolkit. 2011 IEEE International Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro. , (2011).
  11. Mondal, S., Ahlawat, S., Koushika, S. P. Simple microfluidic devices for in vivo imaging of C. elegans, Drosophila and zebrafish. Journal of Visualized Experiments. , (2012).
  12. Paul, G., Cardinale, J., Sbalzarini, I. F. Coupling image restoration and segmentation: A generalized linear model/bregman perspective. International Journal of Computer Vision. , (2013).
  13. Rizk, A., et al. Segmentation and quantification of subcellular structures in fluorescence microscopy images using Squassh. Nature Protocols. 9, 586-586 (2014).
  14. Akella, J. S., et al. MEC-17 is an alpha-tubulin acetyltransferase. Nature. 467 (7312), 218-222 (2010).
  15. Neumann, B., Hilliard, M. A. Loss of MEC-17 leads to microtubule instability and axonal degeneration. Cell Reports. 6 (1), 93-103 (2014).
  16. Shida, T., Cueva, J. G., Xu, Z., Goodman, M. B., Nachury, M. V. The major alpha-tubulin K40 acetyltransferase alphaTAT1 promotes rapid ciliogenesis and efficient mechanosensation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21517-21522 (2010).
  17. Teoh, J. -S., Wang, W., Chandhok, G., Pocock, R., Neumann, B. Development and maintenance of synaptic structure is mediated by the alpha-tubulin acetyltransferase MEC-17/αTAT1. bioRxiv. 84, 522904-522904 (2019).
  18. Bird, T. D. Charcot-Marie-Tooth Neuropathy Type 2. , GeneReviews [Internet]. Seattle (WA): University of Washington, Seattle; 1993-2019. [Updated 2016 Apr 14] Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1285/ (1998).
  19. Chandhok, G., Lazarou, M., Structure Neumann, B. Structure, function, and regulation of mitofusin-2 in health and disease. Biological Reviews. 93 (2), 933-949 (2018).
  20. Soh, M. S., Cheng, X., Liu, J., Neumann, B. Disruption of genes associated with Charcot-Marie-Tooth type 2 lead to common behavioural, cellular and molecular defects in Caenorhabditis elegans. bioRxiv. , 605584(2019).
  21. Kamerkar, S. C., Kraus, F., Sharpe, A. J., Pucadyil, T. J., Ryan, M. T. Dynamin-related protein 1 has membrane constricting and severing abilities sufficient for mitochondrial and peroxisomal fission. Nature Communications. , (2018).
  22. Zhu, P. -P., et al. Intra- and Intermolecular Domain Interactions of the C-terminal GTPase Effector Domain of the Multimeric Dynamin-like GTPase Drp1. Journal of Biological Chemistry. 279 (34), 35967-35974 (2004).
  23. Osellame, L. D., et al. Cooperative and independent roles of the Drp1 adaptors Mff, MiD49 and MiD51 in mitochondrial fission. Journal of Cell Science. , (2016).
  24. Dima, A. A., et al. Comparison of segmentation algorithms for fluorescence microscopy images of cells. Cytometry Part A. 79 (7), 545-559 (2011).
  25. Trevisan, T., et al. Manipulation of Mitochondria Dynamics Reveals Separate Roles for Form and Function in Mitochondria Distribution. Cell Reports. , (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Mikroskopia konfokalnaanaliza ilościowaocena morfologicznaintegralność synapsrozwój mięśnimorfologia mitochondriówoprogramowanie do przetwarzania obrazówCellProfileroprogramowanie Fiji
Ilościowe podejścia do badania struktur komórkowych i morfologii organelli u Caenorhabditis elegans
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.