Artykuł metodologiczny

Wykorzystanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych do wytwarzania limfocytów T specyficznych dla antygenu nowotworowego

DOI:

10.3791/59997

⸱

24 października 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Surgery Branch, National Cancer Institute, NIH, 2Center for Cell-Based Therapy, National Cancer Institute, NIH, 3Laboratory of Immunology, Institute for Frontier Life and Medical Sciences, Kyoto University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł opisuje metodę generowania funkcjonalnych, specyficznych dla antygenu nowotworowego, indukowanych, indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących z CD8αβ+ dodatnich limfocytów T przy użyciu systemu kohodowli OP9/DLL1.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Generowanie i rozszerzanie funkcjonalnych limfocytów T in vitro może prowadzić do szerokiego zakresu zastosowań klinicznych. Jednym z takich zastosowań jest leczenie pacjentów z zaawansowanym rakiem. Wykazano, że adoptywny transfer limfocytów T (ACT) wysoce wzbogaconych limfocytów T specyficznych dla antygenu nowotworowego powoduje trwałą regresję raka z przerzutami u niektórych pacjentów. Jednak podczas ekspansji komórki te mogą ulec wyczerpaniu lub starzeniu się, co ogranicza ich funkcję efektorową i trwałość in vivo. Technologia indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) może przezwyciężyć te przeszkody, prowadząc do generowania in vitro dużej liczby mniej zróżnicowanych limfocytów T specyficznych dla antygenu nowotworowego. Ludzkie iPSC (hiPSC) mają zdolność różnicowania się w dowolny typ komórki somatycznej, w tym limfocyty, które zachowują pierwotną rearanżację genomową receptora komórek T (TCR), gdy komórka T jest używana jako komórka wyjściowa. Dlatego przeprogramowanie ludzkich limfocytów T specyficznych dla antygenu nowotworowego na hiPSC, a następnie redyferencjacja do linii limfocytów T ma potencjał do wytworzenia odmłodzonych limfocytów T specyficznych dla antygenu nowotworowego. Opisano tutaj metodę generowania specyficznych dla antygenu nowotworowego pojedynczych dodatnich (SP) limfocytów T CD8αβ + z hiPSC przy użyciu systemu kohodowli OP9 / DLL1. Metoda ta jest potężnym narzędziem do generowania linii limfocytów T in vitro i ułatwi rozwój limfocytów T pochodzących z in vitro do zastosowania w medycynie regeneracyjnej i terapiach komórkowych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oprócz fizjologicznych zalet, limfocyty T mają wiele potencjalnych zastosowań terapeutycznych. Wytwarzanie i namnażanie limfocytów T in vitro może być wykorzystywane do modelowania chorób i walidacji terapeutycznej, a także jako źródło leczenia dziedzicznych i nabytych stanów niedoboru odporności (tj. wirusowych niedoborów odporności i limfodeplecji wtórnej do chemioterapii lub przeszczepu) oraz do zwalczania raka. Ta ostatnia cecha doprowadziła do opracowania adoptywnego transferu limfocytów T (ACT) do leczenia pacjentów z zaawansowanym rakiem1.

ACT polega na wycięciu guza pacjenta, ekstrakcji limfocytów naciekających nowotwór (TIL), ekspansji TIL ex vivo, a następnie ponownym wprowadzeniu rozszerzonych komórek do pacjenta2. Wykazano, że jest to skuteczna metoda leczenia u niektórych pacjentów z rakiem z przerzutami. Niestety, nie wszyscy pacjenci reagują na tę terapię. Poprzednie raporty wykazały, że stan różnicowania przenoszonych komórek3,4,5,6,7,8,9, wykorzystanie dużej liczby wysoce wzbogaconych limfocytów T specyficznych dla antygenu nowotworowego10 oraz trwałość limfocytów T po transferze11,12 są skorelowane z bardziej trwałymi odpowiedziami13,14. Dlatego, gdy ACT nie wywołuje odpowiedzi przeciwnowotworowej, może to być częściowo spowodowane niską wydajnością limfocytów T specyficznych dla antygenu nowotworowego, nieefektywną ekspansją ex vivo prowadzącą do wyczerpania i utraty reaktywnych klonów lub brakiem trwałości po transferze4. Postuluje się, że przeszkody te mogą zostać pokonane poprzez generowanie dużej liczby mniej zróżnicowanych limfocytów T specyficznych dla antygenu nowotworowego in vitro15,16.

Hematopoetyczne komórki macierzyste/progenitorowe (HSPCs) są konwencjonalnym źródłem do generowania limfocytów T in vitro, chociaż ta metoda jest ograniczona przez małą liczbę komórek, które można odzyskać od jednego dawcy1. Wykazano również, że embrionalne komórki macierzyste (ESC) wytwarzają limfocyty T, ale z niską wydajnością17, co czyni je nieefektywnymi w zastosowaniach klinicznych. Ponadto, ponieważ komórki linii T doświadczają stochastycznej rekombinacji genetycznej receptorów komórek T (TCR) we wczesnych stadiach rozwoju, nie jest możliwe użycie HSPC lub ESC do wygenerowania czystej populacji limfocytów T specyficznych dla antygenu bez dalszych modyfikacji genomowych, takich jak transdukcja genu TCR.

Jednym z podejść do przezwyciężenia tych zastrzeżeń jest przeprogramowanie TIL na ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC), które mogą stanowić nieograniczone źródło do generowania komórek T in vitro. Wykazano, że TIL specyficzne dla antygenu nowotworowego mogą być przeprogramowane w hiPSC i ponownie różnicowane do linii limfocytów T, która zachowuje tę samą rearanżację genu receptora limfocytów T (TCR) co oryginalna limfocyt T18,19. Ten szczegół jest ważny dla ACT, ponieważ poszczególne guzy pacjentów mają unikalne profile mutacji i wykazano, że bardzo niewiele antygenów nowotworowych jest wspólnych dla pacjentów20. W związku z tym wykorzystanie specyficznych dla antygenu nowotworowego TIL jako źródła do wytwarzania in vitro limfocytów T pochodzących z hiPSC może zapewnić nową strategię spersonalizowanego leczenia pacjentów z rakiem z przerzutami.

Szczegółowo przedstawiony jest tutaj protokół różnicowania komórek linii T pochodzących z hiPSC na funkcjonalne specyficzne dla antygenu pojedyncze dodatnie (SP) limfocyty T CD8αβ+ przy użyciu systemu kohodowli OP9/DLL1. Metoda ta jest potężnym narzędziem do różnicowania in vitro limfocytów T hiPSC, krwiotwórczych komórek progenitorowych i embrionalnych komórek macierzystych, a także ich dalszych zastosowań w medycynie regeneracyjnej i terapiach komórkowych.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hodowla ludzkich iPSC (hiPSC) na mysich fibroblastach embrionalnych (MEF)

UWAGA: Alternatywne metody hodowli hiPSC mogą być również stosowane, w tym, ale nie ograniczając się do: wysiewu na 6-dołkową płytkę wstępnie pokrytą żelatyną, galaretowatą mieszanką białek, rekombinowaną lamininą 511 lub jakąkolwiek inną macierzą zewnątrzkomórkową używaną do ekspansji hiPSC, i hodowaną przy użyciu zdefiniowanych pożywek specjalnie opracowanych dla hodowli ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych.

  1. Hodowla MEF
    1. Pokryć 10-centymetrową szalkę Petriego z hodowli komórkowej 4 ml 0,1% żelatyny i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
    2. Fiolkę z 4 x 106 napromieniowanymi MEF szybko rozmrozić w 10 ml pożywki MEF o temperaturze 37 °C (DMEM + 10% FBS + 1x penicylina-streptomycyna + 1x suplement L-glutaminy). Wirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 9 ml pożywki MEF.
    3. Wyjąć naczynie pokryte żelatyną z inkubatora. Odessać żelatynę i dodać 7 ml pożywki MEF. Umieścić 3 ml zawiesiny MEF (od kroku 1.1.2) na szalce pokrytej żelatyną. Kołysz naczyniem na boki i od przodu do tyłu, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie MEF na naczyniu. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 8-36 godzin.
  2. Przejście hiPSC na MEF
    UWAGA:     Dane zostały wygenerowane przy użyciu MART-1 iPSC pochodzącego z długotrwałej hodowli czerniaka TIL, które w szczególności rozpoznają peptyd MART-1 w kontekście HLA-A*02:01, jak opisano wcześniej18.
    1. Przejście hiPSC, gdy kolonie mają średnicę od 0,8 do 1,2 mm. Przed pasażowaniem należy sprawdzić kolonie hiPSC w stereomikroskopie i usunąć wszelkie obszary różnicowania z kultury za pomocą plastikowej krawędzi końcówki o pojemności 200 μl.
    2. Odessać zużyte pożywki i dodać 10 ml pożywki hiPSC (pożywki hodowlane dla ludzi ES [tabela materiałów] + 10 ng/ml ludzkiego podstawowego czynnika wzrostu fibroblastów [hbFGF]) uzupełnionych inhibitorem 10 μM ROCK.
    3. Trzymaj naczynie do hodowli komórkowej w jednej ręce i przetocz jednorazowe narzędzie do pasowania komórek po całym naczyniu w jednym kierunku. Zastosuj wystarczający nacisk, aby całe ostrze rolki dotykało naczynia hodowlanego i utrzymywało równomierny nacisk podczas toczenia.
    4. Obrócić naczynie hodowlane o 90° i powtórzyć krok 1.2.3. Zobacz płytkę w mikroskopie, aby wizualnie potwierdzić prawidłowe cięcie kolonii, które powinny wyglądać na w kratkę. Odłącz pocięte kolonie poprzez delikatne płukanie mechaniczne za pomocą pipety o pojemności 200 μl.
      nuta: Odrywanie pociętych kolonii przez mechaniczne spłukiwanie należy wykonać natychmiast po przecięciu kolonii wałkiem, ponieważ po 3 minutach pocięte kolonie zaczną ponownie przyczepiać się do szalki, a oderwanie kolonii o jednorodnej wielkości przez spłukiwanie stanie się trudne.
    5. Przenieść 350 - 600 kęp pociętych kolonii na nową 10-centymetrową szalkę MEF (posianą 8 - 36 godzin przed pasażką hiPSC) z 10 ml świeżej pożywki hiPSC uzupełnionej inhibitorem 10 μM ROCK. Inkubować w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: 600 grudek reprezentuje około 1,0 x 106 MART-1 iPSC i da 0,5-1,0 x 106 komórek DP w 35 dniu. Jednak oczekiwane liczby będą się różnić w zależności od siły wyjściowej linii komórkowej i warunków hodowli.
    6. Następnego dnia odessać zużytą pożywkę i dodać 10 ml świeżej pożywki hiPSC. Zmieniaj pożywkę hiPSC co 1-2 dni w zależności od tempa wzrostu hiPSC.

2. Przygotowanie komórek OP9/DLL1 do kohodowli z hiPSC

  1. Hodowla komórek OP9/DLL1 w pożywce OP9 [α-minimum pożywka niezbędna (α-MEM) + 20% płodowa surowica bydlęca (FBS) + 1x penicylina-streptomycyna] w temperaturze 37 °C. Gdy komórki OP9 / DLL1 osiągną zbieg, odessać pożywkę i przemyć raz 5 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) bez magnezu, wapnia i fenolu.
  2. Odessać PBS i dodać 2 ml 0,05% trypsyny-EDTA. Inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C. Następnie dodaj 4 ml pożywki OP9 i mechanicznie zdysocjuj warstwę komórkową przez pipetowanie, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową.
  3. Przenieś zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 50 ml przez sitko o wielkości 100 μm, aby uniknąć zbrylania komórek. Wirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odessać supernatant i ponownie zawiesić w 12 ml pożywki OP9.
  4. Dodać 8 ml pożywki OP9 do każdej z sześciu nowych 10-centymetrowych szalek Petriego do hodowli komórkowych. Płytkę 2 ml zawiesiny komórek OP9/DLL1 z kroku 2.3 na każdą nową 10-centymetrową szalkę. Kołysz naczyniem na boki, a następnie od przodu do tyłu, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie OP9/DLL1 na talerzu.
  5. Inkubować w temperaturze 37 °C. Powtarzać pasaż co 2-3 dni, gdy komórki osiągną zlew.
    nuta: Ważne jest, aby przygotować wystarczającą ilość zamrożonych ogniw OP9/DLL1 i rozmrażać nowy zapas co 4-6 tygodni.

3. Różnicowanie in vitro hiPSC na pojedyncze dodatnie (SP) limfocyty T CD8αβ+

  1. Przygotuj zżelatynizowane naczynia OP9/DLL1 na tydzień przed współhodowlą z hiPSC. Aby przygotować 0,1% roztwór żelatyny, dodaj 5 ml podstawowego roztworu żelatyny o temperaturze pokojowej (RT) do 500 ml PBS.
    1. Pokryć 3 nowe 10-centymetrowe płytki Petriego z hodowlą komórkową, dodając 4 ml na szalkę 0,1% żelatyny. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
    2. Odessać żelatynę i dodać 8 ml pożywki OP9 do każdej potrawy. Przełóż jedno zlejące się naczynie OP9/DLL1 (jak to zrobiono w sekcji 2 powyżej) do trzech wstępnie pokrytych żelatyną naczyń.
  2. Po 4 dniach dodaj 10 ml pożywki OP9 do każdej 10 cm pożywki OP9/DLL1 na żelatynie, co daje w sumie 20 ml pożywki na miskę.
  3. Po 7 - 8 dniach rozpocznij kohodowlę hiPSC na zlewających się naczyniach OP9/DLL1 (dzień różnicowania 0).
    1. Odessać zużyte pożywki z konfluentnego 10-centymetrowego naczynia hiPSC na MEF. Dodać 10 ml pożywki OP9. Wyciąć i odłączyć kolonie hiPSC za pomocą jednorazowego narzędzia do pasażowania komórek, jak to opisano w krokach 1.2.3 i 1.2.4.
    2. Przenieść 350 - 600 grudek pociętych kolonii na 10 cm wstępnie zżelowane naczynie OP9/DLL1 (krok 3.1) z 10 ml świeżej pożywki OP9 za pomocą pipety o pojemności 200 μl. Rozbujaj naczynie hodowlane na boki, a następnie od przodu do tyłu, aby zapewnić równomierne rozmieszczenie kolonii.
      UWAGA: Alternatywnie można użyć wstępnie uformowanych ciał zarodkowych hiPSC (EBs) lub zawiesiny o małych grudkach. Jednak w celu wytworzenia grudek hiPSC o jednolitej wielkości preferowane jest użycie jednorazowego narzędzia do pasażowania komórek lub systemu tworzenia EB.
  4. W pierwszym dniu odessać zużytą pożywkę i zastąpić ją 20 ml świeżej pożywki OP9. Grudki hiPSC współhodowane na OP9 / DLL1 przez 1 dzień pojawią się jako małe okrągłe kolonie jednowarstwowe (ryc. 1).
  5. W 5 dniu odessać 10 ml zużytej pożywki i dodać 10 ml świeżej pożywki OP9. Kolonie hiPSC zaczną różnicować się w prymitywną mezodermę, która charakteryzuje się wielowarstwowym ciemnym środkiem.
  6. W dniu 9 odessać 10 ml zużytej pożywki i dodać 10 ml świeżej pożywki OP9. W tym momencie wielowarstwowe struktury centralne przekształcą się w kształty przypominające kopułę, a obszar przypominający sieć peryferyjną zacznie być widoczny.
  7. W 13 dniu należy pobrać krwiotwórcze komórki progenitorowe (HPC) (ryc. 1). Struktury pochodzące z hiPSC w dniu 13 charakteryzują się ciemnym centralnym organoidem otoczonym siecią obszarów przypominających kopułę, reprezentatywnych dla stref krwiotwórczych (HZ), o których wcześniej informowano, że otaczają ludzkich embrionalnych komórek progenitorowych pochodzących z komórek macierzystych krwiotwórczych21.
    UWAGA:     Obecność struktur przypominających kopułę wskazuje na udany proces nawet przy braku ciemnych centrów. Niezdolność do wytwarzania HPC może być spowodowana niską jakością OP9/DLL1, jakością partii FBS, zbiegiem grudek iPSC wysianych na OP9/DLL1 (optymalna jest 350-600 grudek) i/lub różnicami w potencji linii iPSC do produkcji prekursorów krwiotwórczych.
    1. Odessać zużyte podłoże i przemyć 1x 5 ml 1x fenolowego roztworu soli Hanksa bez czerwieni modyfikowanego wapniem i magnezem (HBSS).
    2. Odessać HBSS i dodać 250 μl 5000 jednostek/ml kolagenazy IV w 10 ml HBSS. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 45 minut. Odessać HBSS kolagenazą dożylnie i przemyć raz 5 ml PBS.
    3. Odessać PBS i dodać 5 ml 0,25% trypsyny-EDTA. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 20 minut. Następnie dodaj 4 ml pożywki OP9 i zdysocjuj warstwę komórkową przez pipetowanie, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową.
    4. Przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 50 ml przez sitko do komórek o pojemności 100 μm. Wirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odessać supernatant i ponownie zawiesić w 10 ml pożywki OP9.
    5. Zawiesinę komórek płytki na nowej, zżelowanej, 10 cm szalce Petriego do hodowli komórkowej (patrz kroki 3.1.1 i 3.1.2). Inkubować w temperaturze 37 °C przez 45 minut. Następnie należy zebrać nieprzylegające komórki za pomocą delikatnego pipetowania.
    6. Przenieść zawiesinę pobranych komórek do stożkowej probówki o pojemności 50 ml przez sitko do komórek o pojemności 100 μm. Wirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odessać supernatant i ponownie zawiesić w 10 ml pożywki różnicującej [pożywka OP9 z czynnikiem ludzkich komórek macierzystych 5 ng/ml (hSCF), 5 ng/ml ludzki ligand Flt3 (hFLT3L), i 5 ng/ml ludzkiej interleukiny 7 (hIL-7)].
    7. Umieść zawiesinę komórek na nowej 10-centymetrowej naczyniu zlewającej się OP9/DLL1.
  8. W dniu 16 przejdź przez komórki.
    1. Mechanicznie odłącz nieprzylegające komórki za pomocą delikatnego pipetowania i przefiltruj przez sitko o wielkości 100 μm. Wirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odessać supernatant i ponownie zawiesić w 10 ml pożywki różnicującej.
    2. Umieść zawiesinę komórek na nowej 10-centymetrowej naczyniu zlewającej się OP9/DLL1.
  9. Kontynuuj pasażowanie nieprzylegających komórek co 5-7 dni, powtarzając krok 3.8.
  10. W 35 dniu wzbogać podwójnie dodatnią populację CD4 + CD8 + (DP) i stymulować do produkcji limfocytów T CD8αβ + SP (Figura 2).
    1. Mechanicznie odłącz nieprzylegające komórki za pomocą delikatnego pipetowania i przefiltruj przez sitko o wielkości 100 μm, aby usunąć grudki komórek. Wzbogać populację komórek CD4+ poprzez izolację kulek magnetycznych CD4 zgodnie z protokołem producenta.
      UWAGA: Uzasadnieniem dla stosowania kulek magnetycznych CD4 jest usunięcie komórek CD4-CD8-DN z hodowli, ponieważ wykazano, że powodują one bezpośrednie zabijanie komórek CD4 + CD8 + DP po stymulacji22.
    2. Policz żywe komórki wzbogacone w CD4 za pomocą hemocytometru Neubauera i niebieskiego barwnika trypanowego. Zawiesić w pożywce OP9 o całkowitym stężeniu 0,5 x 106 komórek/ml. Podwielokrotność 1 ml zawiesiny komórkowej (0,5 x 106 komórek) do każdej studzienki 24-dołkowej płytki z płaskim dnem 24-dołkowym zlewającej się OP9/DLL1.
    3. Dodać 100 j.m. ludzkiej interleukiny 2 (hIL-2), 5 ng/ml hIL-7, 500 ng/ml przeciwciała anty-ludzkiego CD3 i 2 μg/ml przeciwciała anty-ludzkiego CD28, a następnie posiewać w temperaturze 37 °C.
    4. W dniach 4 - 7 po stymulacji zbierz komórki do analizy molekularnej (ryc. 3) lub wspólnej hodowli z komórkami prezentującymi antygen impulsowy peptydowo (APC).

4. Pomiar swoistości antygenowej limfocytów T CD8αβ+ SP pochodzących z hiPSC

UWAGA: Rodzaj APC, które mają być użyte do tego doświadczenia, zależy od ograniczenia MHC limfocytów T pochodzących z hiPSC. Tutaj wykorzystywana jest linia komórkowa T2, która jest hybrydą linii komórkowych limfoblastoidów T i B. Komórki T2 wyrażają HLA-A*02:0123, który jest rozpoznawany przez komórki JKF6, z których wyprowadzono MART1-iPSC18. Ta linia komórkowa T2 może być rozwijana w RPMI 1640 + 20% FBS + 1x penicylina-streptomycyna i ulega pasażowaniu, gdy komórki osiągną gęstość 5 x 105 komórek / ml.

  1. Policz żywe komórki hybrydowe limfoblastoidalne T2 HLA-A*02:01+ T-B za pomocą hemocytometru Neubauera i niebieskiego barwnika trypana. Inkubować APC na 24-dołkowej płytce do hodowli tkankowej z 1 μg/ml peptydu MART-1 przez 2 godziny w temperaturze 37 °C.
    nuta: Optymalne stężenie peptydów jest zmienne, w zależności od specyficzności linii komórkowej i antygenu.
  2. Zbierz APC i przemyj 2x 10 ml PBS, aby usunąć nadmiar peptydu.
  3. Policz APC i zawiesij w 2 – 5 x 105 komórek/ml w pożywce OP9 ze 100 IU IL-2 i 5 ng / ml IL-7. Porcję 100 μl zawiesiny komórek (2-5 x 104 komórki) do każdego dołka na 96-dołkowej płytce o bardzo niskim przyłączeniu U lub bezpośrednio do wstępnie powlekanej płytki ELISpot.
  4. Sortuj limfocyty T CD8αβ + SP pochodzące z hiPSC (1 tydzień po stymulacji przeciwciałami anty-ludzkimi CD3 / CD28) za pomocą sortera komórek i zawieś w pożywce 1 x 106 komórek / ml w pożywce OP9 ze 100 IU IL-2 i 5 ng / ml IL-7. Porcję 100 μl zawiesiny komórkowej (1 x 105 komórek) do każdej studzienki APC i hodowli przez 16-20 godzin w temperaturze 37 °C.
  5. Po 16 - 20 godzinach przeanalizuj profil wydzielania cytokin za pomocą testu ELISpot zgodnie z protokołem producenta (ryc. 4).

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Po 13 dniach wspólnej hodowli hiPSC z OP9/DLL1, pojawiły się krwiotwórcze komórki progenitorowe CD34+CD43+ (Rysunek 1). Po dodatkowych 22 dniach hodowli na nieżelatynizowanym OP9 / DLL1 w obecności hSCF, hFLT3L i hIL-7, krwiotwórcze komórki progenitorowe różnicowały się w podwójnie dodatnie (DP) komórki linii T CD3 + CD7 + CD4 + CD8 +, z których większość wyrażała TCR specyficzny dla epitopu MART-1 (tetrameru) (Figura 2).

Wcześniej wykazano, że limfocyty T CD8+ SP mogą być indukowane z limfocytów T CD4+CD8+ DP poprzez sygnalizację TCR za pomocą peptydu agonistycznego lub stymulacji TCR sterowanej przeciwciałami24,25. Dlatego w 35 dniu hodowli limfocyty T CD4 + CD8 + DP pochodzące z hiPSC stymulowano przeciwciałami anty-ludzkimi CD3 i anty-ludzkimi CD28 w obecności hIL-7 i hIL-2. Cztery dni po stymulacji liczba komórek CD3 + CD8αβ + SP dramatycznie wzrosła i pozostała specyficzna dla epitopu MART-1, potwierdzając zachowanie ich dziedzicznej swoistości antygenowej (Figura 3).

Aby określić funkcjonalne właściwości limfocytów T CD8αβ+ SP pochodzących z hiPSC, analizowano zależną od antygenu aktywację i wydzielanie interferonu gamma (IFN-γ). Po stymulacji przeciwciałami anty-ludzkimi CD3 i anty-ludzkimi przeciwciałami CD28 przez 1 tydzień, limfocyty T CD8αβ + SP pochodzące z hiPSC izolowano za pomocą sortera komórek i hodowano wspólnie z linią komórkową T2 eksprymującą HLA-A*02:01 z pokrewnym peptydem MART1 lub bez niego przez 16 - 20 godzin. Test ELISpot wykazał, że limfocyty T CD8αβ+ SP pochodzące z hiPSC wydzielają większe ilości IFN-γ w porównaniu z limfocytami T CD8αα+ SP, gdy są hodowane w obecności peptydu MART-1. Ekspresja IFN-γ była zerowa dla samych limfocytów T i APC, co pokazuje, że ludzkie limfocyty T pochodzące z T-iPSC są specyficzne dla antygenu i funkcjonalne (Figura 4).

figure-results-1
Rycina 1: Generowanie hematopoetycznych komórek progenitorowych pochodzących z hiPSC. (A) Schematyczny przegląd różnicowania hiPSC do linii krwiotwórczej przy użyciu kokultury OP9/DLL1. (B) Pojawienie się struktur pochodzących z hiPSC w dniach 1 (lewy górny róg), 3 (prawy górny róg), 7 (lewy dolny róg) i 13 (prawy dolny róg). Paski skali = 100 μm. (C) Analiza cytometryczna przepływowa hematopoetycznych komórek progenitorowych CD34 + CD43 + pochodzących z hiPSC w dniu 13. Dane są reprezentatywne dla sześciu niezależnych eksperymentów (n = 1 do 2). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rycina 2: różnicowanie hiPSC do limfocytów T Mart1 + CD4 + CD8αβ + DP. (A) Schematyczny przegląd różnicowania linii krwiotwórczej pochodzącej z hiPSC do niedojrzałych limfocytów T przy użyciu kohodowli OP9/DLL1. (B) Analiza cytometrii przepływowej CD4 vs. CD8α, CD3 vs. CD8β i ekspresji tetrameru MART-1 w limfocytach T pochodzących z hiPSC w dniu 35. Bramkowany na limfocytach, pojedyncze komórki, PI ujemne. Dane są reprezentatywne dla trzech niezależnych eksperymentów (n = 3 - 8). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rycina 3: Indukcja fenotypu limfocytów T CD8αβ+ SP. Analiza cytometryczna przepływowa limfocytów T pochodzących z CD4-hiPSC 4 dni po stymulacji ludzkimi przeciwciałami anty-CD3 i ludzkimi przeciwciałami anty-CD28. Bramkowane na limfocytach, pojedyncze komórki, PI ujemne (n = 4). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Ryc. 4: Swoistość antygenowa limfocytów T CD8αβ + SP pochodzących z hiPSC. Wydzielanie IFN-γ za pomocą testu ELISpot CD8αβ + SP pochodzących z hiPSC, CD8αα + SP i limfocytów T luzem po 20 godzinach kohodowli z komórkami T2 lub bez nich pulsowanych (lub nie) peptydem MART-1. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kohodowla mysich komórek zrębowych OP9 jest dobrze ugruntowanym systemem do generowania in vitro limfocytów (tj. komórek NK, B i T) z HSPC i pluripotencjalnych komórek macierzystych. Sygnalizacja Notch jest wymagana do indukowania zaangażowania linii T i może być osiągnięta przez ektopową ekspresję liganda Notch DLL1 lub DLL4, które mają porównywalną skuteczność dla generacji limfocytów T1. W związku z tym system kohodowli OP9/DLL1 stał się szeroko stosowaną metodą wytwarzania limfocytów T in vitro. Ponadto metoda ta ma zastosowanie do stosowania z kilkoma typami i źródłami komórek ludzkich, w tym z krwią pępowinową, HSPC szpiku kostnego i ESC. Jednak wytwarzanie limfocytów T z tych źródeł jest ograniczone albo przez niewystarczające pobieranie komórek źródłowych, albo przez nieefektywne różnicowanie do limfocytów T1. Ponadto produkt limfocytów T z pojedynczą rekombinacją TCR nie może być wygenerowany z tych otwartych źródeł repertuarowych. Dzięki zastosowaniu technik medycyny regeneracyjnej, a mianowicie technologii indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC), możliwe jest wyprodukowanie ogromnej liczby limfocytów T specyficznych dla antygenu do wykorzystania w terapiach opartych na komórkach15.

hiPSC są podobne do pluripotencjalnych ESC pod względem zdolności do samoodnawiania, nieograniczonej ekspansji i potencjału do różnicowania się do dowolnego typu komórki somatycznej w organizmie; Brakuje w nich jednak obaw etycznych związanych z wykorzystywaniem produktów pochodzenia embrionalnego do zastosowań klinicznych. Co więcej, hiPSC mogą być wytwarzane z dowolnej komórki somatycznej, co pozwala na rozwój produktów komórkowych dla medycyny spersonalizowanej. W poprzednich doniesieniach hiPSC były wytwarzane z ludzkich limfocytów T przy użyciu całych obwodowych komórek jednojądrzastych, komórek CD3 + lub izolowanych cytotoksycznych limfocytów T (CTL) jako źródła 18,19,22,26. Kiedy hiPSC są generowane ze źródła limfocytów T (T-iPSC), dziedziczona jest pierwotna rearanżacja genu TCR. W związku z tym limfocyty T pochodzące z T-iPSC pacjenta mogą stanowić model spersonalizowanego leczenia ACT poprzez celowanie w odrębne antygeny nowotworowe pacjenta.

Różnicowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w komórki linii T dzieli się na dwa etapy: wytwarzanie hematopoetycznych komórek progenitorowych (HPC)27 i ich dalsze różnicowanie w komórki linii T21. Oba etapy można wykonać za pomocą systemu kohodowli OP9/DLL1. Co ważne, jakość komórek zasilających OP9/DLL1 ma kluczowe znaczenie dla powodzenia różnicowania limfocytów T. Ponieważ komórki OP9 / DLL1 nie są nieunieśmiertelnioną jednorodną linią komórkową, jakość FBS i warunki hodowli mają kluczowe znaczenie dla utrzymania ich ekspansji bez utraty zdolności do wspierania różnicowania hiPSC. Dlatego zaleca się wstępną ocenę partii FBS i konsekwentne przechodzenie, gdy zaczyna dochodzić do kontaktu cytoplazmatycznego między komórkami, aby zapobiec różnicowaniu się i starzeniu komórek. Jedną z kwestii, którą należy wziąć pod uwagę, jest to, że kontakt między komórkami może wydawać się nie do odróżnienia od tła w zależności od kontrastu fazowego i powiększenia mikroskopu. Z naszego doświadczenia wynika, że większość potraw OP9/DLL1 wydaje się być w 80% zlewna, gdy jest gotowa do przejścia.

Wykazano, że zróżnicowane komórki linii T wygenerowane z T-iPSC przez kokulturę OP9 / DLL1 mogą wytwarzać limfocyty T CD8 + SP po stymulacji18,19. Jednak zregenerowane limfocyty T CD8 + SP uzyskują wrodzony homodimer CD8αα22,28, który jest nieskutecznym koreceptorem dla sygnalizacji TCR29. Dodatkowo, te zregenerowane limfocyty T CD8 + SP wykazały silną cytotoksyczność niezależną od TCR, co czyni te komórki niekorzystnymi do użytku klinicznego30. Protokół ten opisuje najnowszą metodę polegającą na stymulacji oczyszczonych komórek DP CD4 + CD8 + w celu wytworzenia limfocytów T CD8αβ + SP o bardziej konwencjonalnym fenotypie i ulepszonej cytotoksyczności specyficznej dla antygenu22. Chociaż utrata swoistości antygenu spowodowana wtórnym przegrupowaniem alleli TCRα występuje w stadium DP po długotrwałej hodowli, można to przezwyciężyć poprzez edycję genomu w T-iPSC31. Z naszego doświadczenia wynika, że komórki DP pochodzące z hiPSC zaczynają pojawiać się w 30-35 dniu hodowli, a te nowo wygenerowane komórki DP nie przeszły jeszcze wtórnej rearanżacji TCRα. Dlatego większość komórek DP w 35 dniu zachowuje swoistość antygenową i może być wykorzystana do generowania specyficznych dla antygenu limfocytów T CD8αβ + SP.  

Przed ludzką stymulacją anty-CD3 i anty-CD28 w 35 dniu, komórki CD4-CD8-DN muszą zostać usunięte z hodowli, ponieważ wykazano, że powodują one bezpośrednie zabijanie komórek CD4 + CD8 + DP po stymulacji22. Zastosowanie wzbogacenia kulek magnetycznych CD4 (krok 3.10) wzbogaci zarówno DP, jak i CD4 + CD8 - pośrednie pojedyncze dodatnie komórki (ISP)1, które, jak wykazano, nie mają negatywnych skutków22. Alternatywnie można przeprowadzić sortowanie komórek aktywowane fluorescencją za pomocą cytometrii przepływowej w celu wyizolowania komórek DP. Jednak preferowana jest separacja kulek magnetycznych, ponieważ pozwala uniknąć naprężeń mechanicznych wywołanych cytometrią przepływową.

Wytwarzanie limfocytów T CD8αβ + SP z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych bez selekcji agonistycznej za pośrednictwem aktywacji zostało następnie wykazane przy użyciu hodowli mysich komórek zrębowych3D 32. Jednak fizjologiczna selekcja pozytywna zależy od interakcji TCR z kompleksami samopeptyd-MHC, które są unikalnie przetwarzane i prezentowaneprzez komórki nabłonka kory grasicy33. Ponadto wykazano, że powinowactwo TCR do peptydów selekcyjnych określa późniejsze zdolności funkcjonalne dojrzałych limfocytów T CD8αβ + SP34. Obecnie nie ma dowodów sugerujących, że system kohodowli oparty na komórkach zrębu Notch może zapewnić zdefiniowany peptyd selekcyjny i kompleks MHC wymagany do fizjologicznej selekcji pozytywnej.

Wcześniej donoszono w modelu mysim, że komórki linii T wygenerowane z hiPSC pochodzących z limfocytów T specyficznych dla antygenu nowotworowego przy użyciu samego OP9 / DLL1 nie doświadczają konwencjonalnego dojrzewania. Jednak niedojrzałe limfocyty T pochodzące z iPSC generowane przez system OP9 / DLL1 mogą dojrzewać do naiwnych limfocytów T poprzez dalszą fizjologiczną edukację grasicy w systemie hodowli 3D 28,35. Dlatego przedstawiony tutaj protokół wytwarzania niedojrzałych limfocytów T pochodzących z iPSC generowanych przez system OP9 / DLL1 jest niezbędny dla dalszych prób wygenerowania prawdziwych ludzkich komórek T post-grasiczych specyficznych dla antygenu nowotworowego, zdolnych do długotrwałego utrzymywania się in vivo ze skutecznością w leczeniu ustalonych unaczynionych guzów.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie ujawnili żadnych informacji.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Alanowi B. Hoofringowi i Erinie H. On za pomoc graficzną. Badania te były wspierane przez Intramural Research Program Narodowego Instytutu Raka (ZIA BC010763) oraz Intramural NCI Cancer Moonshot Initiative for Cell-based Cancer Immunotherapy.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Naczynie 10 cmCorning, Inc. 
Anti-CD3, człowiekBD BiosciencesCat# 561812, RRID:AB_1089628
Anti-CD34, człowiekBD BiosciencesCat# 348791, RRID:AB_400381
Anti-CD4, ludzkaBiolegendCat# 344612, RRID:AB_2028479
Anti-CD43, człowiekBD BiosciencesCat# 560198, RRID:AB_1645460
Anti-CD7, człowiekBD BiosciencesCat# 555361, RRID:AB_395764
Anti-CD8a, ludzkiBD BiosciencesCat# 555369, RRID:AB_398595
Anti-CD8b, ludzkiBD BiosciencesCat# 641057, RRID:AB_1645747
Anti-TCRb, ludzkiBD BiosciencesCat# 555548, RRID:AB_395932
Ludzkie przeciwciało monoklonalne CD28 (15E8), czysto funkcyjneMiltenyl Biotec130-093-375
Ludzkie przeciwciało monoklonalne CD3 (OKT3), czysto funkcjonalneMiltenyl Biotec130-093-387
CD4 Mikrogranulki, ludzkieMiltenyl Biotec130-045-101
Sitko do komórek 100 umFisher Scientific22-363-549
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Gemini100-500
Ligand Flt-3R& D Systems427-FL
Roztwór żelatyny 2% SIGMA-AldritchG1393-100ML
GlutaMAX (100X)Thermo Fisher Scientific35050-061Suplement L-Glutaminy
HBSS Mg+Ca+ Bez czerwieni fenolowejGibco14025-092
Interleukina-2R& D Systems202-IL
Interleukina-7R& D Systems407-ML
iTAG MHC Tetramer HLA-A*0201 Mart1 Tetramer -ELAGIGILTVMBLCat#TB-0009-2
Mart1-hiPSCVizcardo et al., Komórka macierzysta 2013RIKEN-IMS
Melan-A, MART 1 (26-35)InnoPep3146-0100
MEM Roztwór aminokwasów endogennychGibco11140050
α MEM w proszkuGibco61100061
Mysie fibroblasty embrionalne (MEF)Thermo Fisher ScientificC57BL/6 MEF MITC-TREATED 4M KAŻDY; A34962
OP9/N-DLL1Centrum zasobów biologicznych RikenCat# RCB2927; RRID:CVCL_B220OP9 / DLL1
Penicylina / streptomycynaThermo Fisher Scientific15140-122
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami pH 7,4 (1x)Thermo Fisher Scientific10010-023
PożywkareprokomórkowaRCHEMD001Ludzkie podłoże hodowlane ESC
Inhibitor Rhok (dichlorowodorek Y-27632)Tocris1254
RPMI 1640Gibco11875093
Czynnik komórek macierzystych (SCF)R& D Systems455-MC
StemProEZPassage23181-010
T2-guzATCCT2 (174 x CEM. T2) (ATCC® CRL-1992&handel ;) 
Trypsyna-EDTA (0,05%), czerwień fenolowa Thermo Fisher Scientific25300-062
Trypsyna-EDTA (0,25%), czerwień fenolowa Thermo Fisher Scientific25200-072
U Dolna 96-dołkowa płytkaCorning, Inc. Numer katalogowy: 3799
353003 ES naczelnych

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brauer, P. M., Singh, J., Xhiku, S., Zuniga-Pflucker, J. C. T Cell Genesis: In Vitro Veritas Est. Trends in Immunology. 37 (12), 889-901 (2016).
  2. Rosenberg, S. A., Restifo, N. P. Adoptive cell transfer as personalized immunotherapy for human cancer. Science. 348 (6230), 62-68 (2015).
  3. Gattinoni, L., et al. Acquisition of full effector function in vitro paradoxically impairs the in vivo antitumor efficacy of adoptively transferred CD8+ T cells. Journal of Clinical Investigation. 115 (6), 1616-1626 (2005).
  4. Rosenberg, S. A., et al. Durable complete responses in heavily pretreated patients with metastatic melanoma using T-cell transfer immunotherapy. Clinical Cancer Research. 17 (13), 4550-4557 (2011).
  5. Crompton, J. G., et al. Lineage relationship of CD8(+) T cell subsets is revealed by progressive changes in the epigenetic landscape. Cellular and Molecular Immunology. 13 (4), 502-513 (2016).
  6. Henning, A. N., Klebanoff, C. A., Restifo, N. P. Silencing stemness in T cell differentiation. Science. 359 (6372), 163-164 (2018).
  7. Henning, A. N., Roychoudhuri, R., Restifo, N. P. Epigenetic control of CD8(+) T cell differentiation. Nature Reviews Immunology. 18 (5), 340-356 (2018).
  8. Vodnala, S. K., et al. T cell stemness and dysfunction in tumors are triggered by a common mechanism. Science. 363 (6434), (2019).
  9. Restifo, N. P., Gattinoni, L. Lineage relationship of effector and memory T cells. Current Opinion in Immunology. 25 (5), 556-563 (2013).
  10. Tran, E., et al. Cancer immunotherapy based on mutation-specific CD4+ T cells in a patient with epithelial cancer. Science. 344 (6184), 641-645 (2014).
  11. Gattinoni, L., et al. Wnt signaling arrests effector T cell differentiation and generates CD8+ memory stem cells. Nature Medicine. 15 (7), 808-813 (2009).
  12. Gautam, S., et al. The transcription factor c-Myb regulates CD8(+) T cell stemness and antitumor immunity. Nature Immunology. 20 (3), 337-349 (2019).
  13. Klebanoff, C. A., et al. Determinants of successful CD8+ T-cell adoptive immunotherapy for large established tumors in mice. Clinical Cancer Research. 17 (16), 5343-5352 (2011).
  14. Klebanoff, C. A., Gattinoni, L., Restifo, N. P. Sorting through subsets: which T-cell populations mediate highly effective adoptive immunotherapy. Journal of Immunotherapy. 35 (9), 651-660 (2012).
  15. Crompton, J. G., Clever, D., Vizcardo, R., Rao, M., Restifo, N. P. Reprogramming antitumor immunity. Trends in Immunology. 35 (4), 178-185 (2014).
  16. Crompton, J. G., Rao, M., Restifo, N. P. Memoirs of a reincarnated T cell. Cell Stem Cell. 12 (1), 6-8 (2013).
  17. Kennedy, M., et al. T lymphocyte potential marks the emergence of definitive hematopoietic progenitors in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Reports. 2 (6), 1722-1735 (2012).
  18. Vizcardo, R., et al. Regeneration of human tumor antigen-specific T cells from iPSCs derived from mature CD8(+) T cells. Cell Stem Cell. 12 (1), 31-36 (2013).
  19. Nishimura, T., et al. Generation of rejuvenated antigen-specific T cells by reprogramming to pluripotency and redifferentiation. Cell Stem Cell. 12 (1), 114-126 (2013).
  20. Lo, W., et al. Immunologic recognition of a shared p53 mutated neoantigen in a patient with metastatic colorectal cancer. Cancer Immunology Research. , (2019).
  21. Timmermans, F., et al. Generation of T cells from human embryonic stem cell-derived hematopoietic zones. Journal of Immunology. 182 (11), 6879-6888 (2009).
  22. Maeda, T., et al. Regeneration of CD8alphabeta T Cells from T-cell-Derived iPSC Imparts Potent Tumor Antigen-Specific Cytotoxicity. Cancer Research. 76 (23), 6839-6850 (2016).
  23. Salter, R. D., Howell, D. N., Cresswell, P. Genes regulating HLA class I antigen expression in T-B lymphoblast hybrids. Immunogenetics. 21 (3), 235-246 (1985).
  24. Snauwaert, S., et al. In vitro generation of mature, naive antigen-specific CD8(+) T cells with a single T-cell receptor by agonist selection. Leukemia. 28 (4), 830-841 (2014).
  25. Takahama, Y., Suzuki, H., Katz, K. S., Grusby, M. J., Singer, A. Positive selection of CD4+ T cells by TCR ligation without aggregation even in the absence of MHC. Nature. 371 (6492), 67-70 (1994).
  26. Seki, T., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells. Cell Stem Cell. 7 (1), 11-14 (2010).
  27. Vodyanik, M. A., Slukvin, I. I. Hematoendothelial differentiation of human embryonic stem cells. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 23, Unit 23, 26 (2007).
  28. Vizcardo, R., et al. Generation of Tumor Antigen-Specific iPSC-Derived Thymic Emigrants Using a 3D Thymic Culture System. Cell Reports. 22 (12), 3175-3190 (2018).
  29. McNicol, A. M., et al. CD8alpha/alpha homodimers fail to function as co-receptor for a CD8-dependent TCR. European Journal of Immunology. 37 (6), 1634-1641 (2007).
  30. Themeli, M., Riviere, I., Sadelain, M. New cell sources for T cell engineering and adoptive immunotherapy. Cell Stem Cell. 16 (4), 357-366 (2015).
  31. Minagawa, A., et al. Enhancing T Cell Receptor Stability in Rejuvenated iPSC-Derived T Cells Improves Their Use in Cancer Immunotherapy. Cell Stem Cell. 23 (6), 850-858 (2018).
  32. Montel-Hagen, A., et al. Organoid-Induced Differentiation of Conventional T Cells from Human Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 24 (3), 376-389 (2019).
  33. Takada, K., Kondo, K., Takahama, Y. Generation of Peptides That Promote Positive Selection in the Thymus. Journal of Immunology. 198 (6), 2215-2222 (2017).
  34. Takada, K., et al. TCR affinity for thymoproteasome-dependent positively selecting peptides conditions antigen responsiveness in CD8(+) T cells. Nature Immunology. 16 (10), 1069-1076 (2015).
  35. Vizcardo, R., et al. A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants. JoVE. , https://www.jove.com/video/58672/a-three-dimensional-thymic-culture-system-to-generate-murine-induced e58672(2019).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

System kokultury OP9 Delta 1limfocyty T jednokrotny dodatnie dla CD8 alfa betakom rki progenitorowe krwiotw rczewzbogacanie za pomoc kulek magnetycznych CD4swoisto epitopu MART1sekrecja interferonu gammatest ELISpotzastosowania w medycynie regeneracyjnej

Powiązane artykuły