Terenowy pośmiertny szybki immunochromatograficzny test diagnostyczny wścieklizny do zastosowań o ograniczonych zasobach z dalszymi zastosowaniami molekularnymi

Podsumowanie

Przedstawiamy kompletny protokół do pośmiertnej diagnozy wścieklizny zwierząt w warunkach polowych przy użyciu szybkiego immunochromatograficznego testu diagnostycznego (RIDT), od pobrania próbki z biopsji mózgu do ostatecznej interpretacji. Opisujemy również dalsze zastosowania urządzenia do analizy molekularnej i genotypowania wirusów.

Streszczenie

Funkcjonalne systemy nadzoru nad wścieklizną są niezbędne do dostarczania wiarygodnych danych i zwiększania zaangażowania politycznego niezbędnego do kontroli chorób. Do chwili obecnej zwierzęta podejrzane o pozytywny wynik testu na wściekliznę muszą zostać poddane potwierdzeniu poubojowemu przy użyciu klasycznych lub molekularnych metod laboratoryjnych. Jednak większość obszarów endemicznych znajduje się w krajach o niskich i średnich dochodach, w których diagnozowanie wścieklizny u zwierząt jest ograniczone do centralnych laboratoriów weterynaryjnych. Słaba dostępność infrastruktury nadzoru prowadzi do zaniżania liczby zgłaszanych poważnych chorób z odległych obszarów. Niedawno opracowano kilka protokołów diagnostycznych wymagających niskiej wiedzy technicznej, co daje możliwość ustalenia diagnozy wścieklizny w zdecentralizowanych laboratoriach. Przedstawiamy tutaj kompletny protokół terenowej diagnostyki pośmiertnej wścieklizny zwierząt za pomocą szybkiego immunochromatograficznego testu diagnostycznego (RIDT), od pobrania próbki z biopsji mózgu do ostatecznej interpretacji. Uzupełniamy protokół, opisując dalsze zastosowanie urządzenia do analizy molekularnej i genotypowania wirusów. RIDT z łatwością wykrywa wirusa wścieklizny i inne lizsywirusy w próbkach mózgu. Zasada takich testów jest prosta: materiał mózgowy nakłada się na pasek testowy, w którym przeciwciała sprzężone ze złotem wiążą się specyficznie z antygenami wścieklizny. Kompleksy antygen-przeciwciało wiążą się dalej z przeciwciałami utrwalonymi na linii testowej, w wyniku czego powstaje wyraźnie widoczna fioletowa linia. Wirus jest inaktywowany w pasku testowym, ale wirusowe RNA może być następnie ekstrahowane. Dzięki temu pasek testowy, a nie zakaźną próbkę mózgu, można bezpiecznie i łatwo wysłać do wyposażonego laboratorium w celu potwierdzenia i typowania molekularnego. Na podstawie modyfikacji protokołu producenta stwierdziliśmy zwiększoną czułość testu, sięgającą 98% w porównaniu ze złotym standardem metody referencyjnej, bezpośrednim testem przeciwciał immunofluorescencyjnych. Zalet testu jest wiele: szybki, łatwy w użyciu, niski koszt i brak konieczności korzystania z infrastruktury laboratoryjnej, takiej jak mikroskopia czy zgodność z łańcuchem chłodniczym. RIDT stanowią użyteczną alternatywę dla obszarów, w których referencyjne metody diagnostyczne nie są dostępne.

Wprowadzenie

Wścieklizna psów jest główną przyczyną wścieklizny u ludzi, globalnie odpowiedzialną za około 59 000 zgonów ludzi rocznie, prawie wszystkie występują w krajach o niskich i średnich dochodach (LMICs) w Azji i Afryce¹. Głównym czynnikiem etiologicznym jest neurotropowy klasyczny wirus wścieklizny związany z psami (RABV, rodzina Rhabdoviridae, rodzaj Lyssavirus, gatunek Lyssavirus wścieklizny). Jednak inne lyssawirusy związane z wścieklizną, głównie krążące wśród gatunków nietoperzy, również powodują chorobę^2,3. W regionach dotkniętych chorobą nadzór i kontrola chorób są często utrudnione przez zaangażowanie polityczne na niskim szczeblu, prawdopodobnie z powodu braku wiarygodnych danych^4,5,6. Jedną z przyczyn niedostatecznego zgłaszania chorób jest brak diagnostyki laboratoryjnej, częściowo ze względu na ograniczony dostęp do wyposażonych laboratoriów i przeszkolonego personelu, a także trudności w transporcie próbek. Diagnostyka laboratoryjna jest niezbędna do potwierdzenia przypadków wścieklizny, a dodatkowo pozwala na charakterystykę genetyczną zaangażowanych szczepów, dostarczając wglądu w przenoszenie wirusa na poziomie regionalnym^4,5,7.

Obecne złote standardy pośmiertnej diagnostyki wścieklizny, zatwierdzone zarówno przez Światową Organizację Zdrowia (WHO), jak i Światową Organizację Zdrowia Zwierząt (OIE), to bezpośredni test fluorescencyjny na przeciwciała (DFAT), bezpośredni szybki test immunohistochemiczny (DRIT) i metody molekularne (np. reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT-PCR))^4,8. Jednak prawidłowe zastosowanie w krajach o niskich i średnich dochodach pozostaje ograniczone ze względu na nieodpowiednie zaplecze laboratoryjne z niespójnym zasilaniem, niechłodzony transport próbek i brak systemu zarządzania jakością. Ponieważ diagnostyka wścieklizny u zwierząt jest zazwyczaj przeprowadzana tylko w centralnych laboratoriach weterynaryjnych w krajach o niskich i średnich dochodach, istniejące dane z nadzoru odzwierciedlają głównie sytuację w zakresie wścieklizny na obszarach miejskich.

Ostatnio opracowane alternatywy diagnostyczne o niskiej technologii oferują możliwość diagnozowania wścieklizny w odległych obszarach i zdecentralizowanych laboratoriach wścieklizny^4,8,9. Szybki immunochromatograficzny test diagnostyczny (RIDT) jest testem przepływu bocznego opartym na immunochromatografii przy użyciu przeciwciał ze sprzężonym ze złotem detektorem i jest bardzo obiecującym narzędziem diagnostycznym wścieklizny^10,11,12,13. Zasada jest prosta: po rozcieńczeniu materiał mózgowy miesza się w dostarczonym buforze, a kilka kropel nakłada się na pasek testowy, w którym sprzężone ze złotem przeciwciała monoklonalne wiążą się specyficznie z antygenami wścieklizny, głównie nukleoproteinami (ryc. 1). Kompleksy antygen-przeciwciało przechodzą następnie migrację przepływu bocznego, wiążąc się na linii testowej (linii T) z ustalonymi przeciwciałami przeciwko antygenom wścieklizny, w wyniku czego powstaje wyraźnie widoczna fioletowa linia. Pozostałe przeciwciała sprzężone ze złotem, które nie są związane z antygenami wścieklizny, kontynuują migrację i przyczepiają się do błony poprzez dodatkowe przeciwciała celujące, co skutkuje wyraźnie widoczną fioletową linią kontrolną (linia C).

Jednoetapowa, tania metoda jest szybka, niezwykle łatwa i nie wymaga drogiego sprzętu ani specjalnych warunków przechowywania. Dzięki modyfikacji protokołu producenta w celu wyeliminowania etapu rozcieńczania, prawie cały sprzęt i odczynniki wymagane do przeprowadzenia testu są zawarte w kit¹⁴. Wynik jest odczytywany po 5-10 minutach bez mikroskopu. Jest to duża zaleta w porównaniu z testem DFAT, który wymaga mikroskopu fluorescencyjnego i koniugatu immunofluorescencyjnego, a także transportu w lodówce i przechowywania próbki. Nawet test DRIT, który można wykonać przy użyciu mikroskopu świetlnego, wymaga ciągłego łańcucha chłodniczego w celu przechowywania przeciwciał przeciwko wściekliźnie, które również nie są jeszcze dostępne na rynku. W porównaniu z DRIT, RIDT nie wymaga stosowania toksycznych chemikaliów, co jest szczególną zaletą w krajach, w których utylizacja odpadów jest słabo uregulowana. Szybki test jest mniej czasochłonny i znacznie łatwiejszy w interpretacji w porównaniu ze złotymi standardami DFAT i DRIT. Pozwala to na przeprowadzanie testów na miejscu przez personel o ograniczonej wiedzy technicznej.

Na podstawie tych właściwości testowych, szybka diagnoza podejrzanych zwierząt w odległych obszarach staje się możliwa, ułatwiając wdrożenie profilaktyki poekspozycyjnej (PEP) dla narażonych osób tak szybko, jak to możliwe. Ponadto transport próbek wścieklizny na duże odległości nie jest konieczny, co skutkuje lepszą jakością próbki w czasie badania. Jednak wyniki uzyskane za pomocą testów RIDT powinny być obecnie potwierdzone za pomocą referencyjnego testu diagnostycznego, takiego jak DFAT lub DRIT.

Techniki RIDT do wykrywania RABV i innych lyssawirusów zostały ocenione. Jedno z pierwszych badań zostało przeprowadzone przez koreańskich naukowców w 2007 roku¹⁰. W porównaniu z metodą DFAT, w 51 próbkach zwierzęcych i 4 izolatach RAPV, RIDT wykazał czułość i swoistość odpowiednio 91,7% i 100%. Wyniki te zostały później potwierdzone na 110 próbkach mózgu zwierząt z Korei, z czułością i swoistością, w porównaniu do DFAT, odpowiednio 95% i 98,9%¹⁵. Niedawno w innych badaniach oceniano działanie tego RIDT przy użyciu izolatów wirusa i/lub zakażonych próbek mózgu od różnych zwierząt o różnym pochodzeniu geograficznym. Panel 21 próbek, w tym afrykański RABV i inne afrykańskie lizswirusy (wirus Duvenhage (DUVV), wirus nietoperzy Lagos (LBV) i wirus Mokola (MOKV)), zostały pomyślnie wykryte, z czułością 100% w porównaniu z klasą DFAT16. Podobne wartości wysokiej czułości (96,5%) i swoistości (100%) uzyskano z panelu 115 próbek mózgu z Etiopii¹⁷. W innym badaniu oceniano europejskie izolaty RABV, dwa inne europejskie lyssawirusy (europejski lyssawirus nietoperzy typu 1 (EBLV-1) i typ 2 (EBLV-2)) oraz australijski lyssawirus nietoperzy (ABLV)¹⁸. Na podstawie analizy 172 próbek mózgu zwierząt, zestaw RIDT miał 88,3% czułości i 100% swoistości w porównaniu z DFAT, a trzy lyssawirusy związane z wścieklizną zostały pomyślnie wykryte. W tym badaniu niektóre z fałszywie ujemnych wyników pochodziły z próbek mózgu przechowywanych w buforze glicerolu, co sugeruje, że niewłaściwe usunięcie glicerolu wpłynęło na przepływ kapilarny lub wiązanie przeciwciał. Niedawna analiza 43 próbek klinicznych pobranych od australijskich nietoperzy potwierdziła wcześniejsze wyniki testów, z pełną zgodnością z DFAT¹⁹. W Indiach przeprowadzono dwa badania z użyciem RIDT na ograniczonej liczbie próbek klinicznych (11 i 34 próbki). W porównaniu z DFAT czułość wynosiła od 85,7% do 91,7%, a swoistość wynosiła 100%^20,21. Kolejna ocena tego zestawu przy użyciu 80 próbek mózgów zwierzęcych z Afryki, Europy i Bliskiego Wschodu uzyskała pełną zgodność z DFAT pod względem swoistości (100%), ale wyższej czułości (96,9%) w porównaniu z poprzednimi badaniami²². W niedawnym międzylaboratoryjnym porównaniu tego RIDT przeprowadzonym w 22 różnych laboratoriach przy użyciu panelu 10 próbek, ogólna zgodność wyniosła 99,5%²³.

Tylko jedno ostatnie wieloośrodkowe badanie wykazało niezadowalającą ogólną wydajność RIDT²⁴. Próbki z trzech różnych zestawów danych zostały przetestowane i dostarczyły zmiennych wartości czułości i swoistości w porównaniu z DFAT. Na przykład czułość i swoistość uzyskane w pierwszym panelu (n = 51) i drugim panelu (n = 31) próbek od eksperymentalnych zakażonych zwierząt, wszystkie badane w laboratorium A, dały czułość odpowiednio 16% i 43%, podczas gdy swoistość wynosiła 100% dla obu. I odwrotnie, wyniki trzeciego panelu (n = 30) terenowych próbek klinicznych analizowanych przez laboratorium B dostarczyły pełnej zgodności z wynikami DFAT, które zostały następnie prawie całkowicie potwierdzone przez laboratorium A (85% czułości i 100% swoistości). Zmienność między partiami została zasugerowana jako możliwe wyjaśnienie wahań stosunkowo niskiej czułości za pomocą RIDT²⁴.

W tym samym czasie, inne badanie przeprowadziło podobny proces walidacji wyżej opisanego RIDT, z modyfikacją zalecanego przez producenta protokołu¹⁴. Etap wstępnego rozcieńczania (1:10) w PBS został pominięty podczas przygotowywania materiału mózgowego. Opierając się na tym prostszym, zmodyfikowanym protokole, autorzy uzyskali czułość i swoistość odpowiednio 95,3% i 93,3% w porównaniu z DFAT, testując, w warunkach laboratoryjnych, zestaw danych 73 próbek mózgu zwierząt, naturalnie lub eksperymentalnie zakażonych różnymi szczepami RAPV. W badaniu przedstawiono pierwszą ocenę tego RIDT w warunkach terenowych (Czad, Afryka). W 48 klinicznych próbkach mózgu czułość i swoistość wynosiły odpowiednio 94,4% i 100%. Rozbieżności między DFAT i RIDT wynikały z fałszywie dodatnich wyników DFAT, określonych po potwierdzeniu za pomocą RT-PCR. Kiedy te wyniki zostały usunięte, pojawiła się pełna zgodność i wykazano, że RIDT był bardziej wiarygodny niż DFAT w tych warunkach terenowych¹⁴. Nie zaobserwowano żadnych różnic między partiami przy użyciu zmodyfikowanego protokołu. Gdy zmodyfikowany protokół zastosowano do niewielkiej liczby rozbieżnych próbek DFAT/RIDT (n=8) w badaniu Eggerbauer et al.²⁴, wszystkie okazały się zgodne (czułość 100%).

Kolejną ważną zaletą RIDT jest wtórne użycie do wykrywania wirusowego RNA utrwalonego na pasku za pomocą technik molekularnych (takich jak RT-PCR) i późniejszego genotypowania^14,24. Po etapie ekstrakcji, Léchenne i wsp.¹⁴ wykazali wirusowe RNA utrwalone na błonie urządzenia Anigen za pomocą RT-PCR z czułością 86,3% w panelu 51 próbek (w tym 18 próbek testowanych i wysyłanych z Czadu w temperaturze otoczenia). Późniejsze genotypowanie było możliwe w 93% z 14 badanych próbek. Zastosowano sekwencjonowanie metodą Sangera amplikonów PCR o długości co najmniej 500 nukleotydów. Oprócz izolatów RABB, test wykrył cztery inne gatunki wirusa lyssa, DUVV, EBLV-1, EBLV-2 i lyssawirus nietoperzy Bokeloh (BBLV), podczas w pełni zgodnego międzynarodowego testu międzylaboratoryjnego¹⁴. Czułość wykrywania wirusowego RNA była jeszcze wyższa (100%) w badaniu Eggerbauera i wsp., opartym na badaniu próbek laboratoryjnych²⁴. To ostatnie badanie wykazało również, że bufor stosowany w zestawie RIDT inaktywował wirusa. W ten sposób urządzenia mogą być łatwo wysyłane w temperaturze otoczenia bez szczególnych środków ostrożności bezpieczeństwa biologicznego do laboratoriów referencyjnych w celu potwierdzenia molekularnego i genotypowania.

Na podstawie poprzednich ocen, narzędzia RIDT oferują wiele zalet do wykorzystania w terenie, zwłaszcza gdy referencyjne techniki diagnostyczne nie są dostępne. Jednak ten test ma również pewne ograniczenia, w szczególności niską czułość wykrywania antygenu^14,24. Test ma zastosowanie do próbek zawierających duże ilości antygenów wirusowych, takich jak próbki mózgu. Nie nadaje się jednak do innych próbek, takich jak ślina lub inne płyny ustrojowe. Kolejną wadą jest koszt urządzenia (około 5-10 euro w Europie), który jest tańszy w porównaniu z kosztem wykonania DFAT, RT-PCR lub DRIT, ale nadal pozostaje wysoki dla LMICs. Jednak przyszły rozwój i walidacja podobnych RIDT od innych firm może doprowadzić do spadku cen. Jedno z badań wykazało różnice między partiami. Chociaż nie zostało to zgłoszone przez innych, należy jednak przeprowadzać ścisłe kontrole jakości podczas testowania nowej partii, tak jak w przypadku każdego odczynnika stosowanego w środowisku zarządzania jakością. Użycie zmodyfikowanego protokołu nie zostało zmienione w przypadku korzystania z różnych batches¹⁴. We wszystkich badaniach, z wyjątkiem jednego, wykazano, że czułość RDIT była wysoka w porównaniu z DFAT (około 90%-95%). Ponieważ wścieklizna jest zawsze śmiertelna, nadal zdecydowanie zaleca się potwierdzanie wszelkich negatywnych wyników za pomocą RDIT za pomocą referencyjnego testu diagnostycznego, takiego jak DFAT, DRIT lub RT-PCR¹⁴.

W tym manuskrypcie prezentujemy kompletny protokół do polowej diagnostyki pośmiertnej wścieklizny zwierząt na przykładzie skomercjalizowanego RIDT, od pobrania próbki mózgu do zastosowania zmodyfikowanego protokołu w porównaniu z zaleceniami producenta (które zostały wcześniej zatwierdzone¹⁴) i późniejszą analizą molekularną. Protokół ten był wielokrotnie stosowany i zatwierdzany w warunkach terenowych w Afryce Zachodniej i Środkowej, gdzie RIDT był rutynowo stosowany do diagnozowania wścieklizny wraz z testem DFAT. Dodatkowo demonstrujemy drugie zastosowanie urządzenia, w warunkach laboratoryjnych, do ekstrakcji i wykrywania za pomocą RT-PCR wirusowego RNA utrwalonego na urządzeniu.

Protokół

1. Pobieranie próbek przez otwór wielki (droga potyliczna)²⁵

UWAGA: Ta technika może być stosowana w warunkach laboratoryjnych lub w terenie. Próbki powinny być przetwarzane jak najszybciej po śmierci zwierzęcia podejrzanego o zakażenie lub przechowywane w chłodnej temperaturze (w lodówce lub zamrożone, jeśli to możliwe), aby uniknąć rozkładu, który mógłby wpłynąć na wyniki. Podobnie jak w przypadku innych technik referencyjnych opartych na wykrywaniu antygenów wirusa lyssa, takich jak DFAT i DRIT, próbki rozłożone nie powinny być badane, ponieważ może to wpłynąć na wynik (ryzyko wyniku fałszywie ujemnego).

UWAGA: Wszystkie próbki powinny być uważane za potencjalnie zakaźne. Przepisy i procedury bezpieczeństwa powinny być ściśle przestrzegane, nawet w ustawieniach terenowych⁴. W szczególności należy nosić odpowiednie środki ochrony osobistej, w tym maskę, okulary, rękawice i fartuch laboratoryjny. Do odkażania materiału i próbki należy stosować odpowiedni środek dezynfekujący (np. podchloryn sodu z zalecanymi rozcieńczeniami producenta, 70% alkohol - etanol lub izopropanol, 1% roztwór mydła). Cały personel mający kontakt z próbkami powinien być zaszczepiony przeciwko wściekliźnie.

1. Usuń głowę zwierzęcia nożem przed pierwszym kręgiem szyjnym (kręgiem atlasowym), aby uzyskać dostęp do otworu wielkiego.
   UWAGA: Aby zminimalizować zakaźny aerozol, unikaj używania piły ręcznej lub podobnego narzędzia.
2. Pobrać próbkę pnia mózgu (rdzenia przedłużonego) za pomocą jednorazowej plastikowej pipety (Rysunek 2A), słomki do picia (Rysunek 2B), zacisku (Rysunek 2C) lub zakraplacza (dostarczony z RIDT) (Rysunek 2D).
   UWAGA: Należy zwrócić szczególną uwagę podczas pobierania próbki, ponieważ jest to niezwykle ważny krok dla wiarygodności wyników. Oprócz powiązanego filmu, który w prosty sposób pokazuje, jak pobrać interesującą Cię część pnia mózgu, zdecydowanie zaleca się wykonanie kroku treningowego, aby upewnić się, że pobrano prawidłowy wycinek anatomiczny
.
3. Opcjonalnie i dodatkowo pnia mózgu (rdzeń przedłużony) należy pobrać inne części pnia mózgu lub mózgu (móżdżek, hipokamp, wzgórze i korę) tą samą drogą potyliczną, popychając i obracając plastikową pipetę lub słomkę w kierunku oczodołu (Rysunek 3).
4. Jeśli używasz słomki lub pipety, delikatnie ją ściśnij, aby umieścić próbkę mózgu (0,5-2 g) w probówce do późniejszej analizy i/lub biobankowania.
   UWAGA: Przechowywanie próbki w glicerolu nie jest zalecane, ponieważ wydaje się, że wpływa to na przepływ kapilarny lub etap wiązania przeciwciał w klasie RIDT18.

2. Wykonanie zmodyfikowanego protokołu RIDT¹⁴

UWAGA: Ta modyfikacja pomija etap rozcieńczania (1:10) do PBS, jak określono w protokole producenta (wszystkie wersje) i może być zaimplementowana w warunkach laboratoryjnych lub terenowych.

1. Za pomocą wacika/zakraplacza zbierz równowartość połowy orzeszków ziemnych lub grochu (0,1-0,5 g) materiału mózgowego i umieść go w probówce z próbką buforową.
   UWAGA: W przypadku zmodyfikowanego protokołu wszystkie odczynniki/materiały eksploatacyjne są zawarte w zestawie (nie jest potrzebny PBS ani dodatkowa probówka) (Rysunek 4). Udokumentuj numer partii zestawu i sprawdź ważność daty ważności.
2. Ostrożnie rozdrobnić materiał mózgowy bezpośrednio w probówce za pomocą wacika lub zakraplacza przez około 30 s, aż do uzyskania jednorodnej zawiesiny.
   UWAGA: Reakcja buforowa dezaktywuje zakaźność wirusa w warunkach protokołu producenta²⁴.
3. Za pomocą zakraplacza nanieść cztery krople (około 100 μl) zawiesiny we wlocie próbki na urządzeniu testowym.
4. Poczekaj na pełną migrację próbki (1-5 minut) przed odczytaniem urządzenia testowego. Migracja powinna rozpocząć się szybko po zdeponowaniu próbki (1-5 min).
5. W przypadku opóźnienia (ze względu na zawiesinę o wysokiej lepkości) lub w celu przyspieszenia rozpoczęcia migracji, delikatnie podrapaj zakraplaczem spód miejsca osadzania urządzenia (1-5 razy) i ostatecznie dodaj jeszcze 1-2 krople. Migracja powinna rozpocząć się natychmiast po tym.
6. Odczytaj wynik testu w oknie wykrywania po 5-10 minutach i nie więcej niż 20 minutach po zakończeniu migracji.
7. Zinterpretuj wynik na podstawie obecności lub braku linii kontrolnej (linia C) i linii testowej (linia T) (fioletowe linie) w oknie wykrywania, zgodnie z Rysunek 5. Uznajmy, że próbka jest pozytywna, gdy widoczne są dwie linie (Rysunek 5A), ujemna, jeśli obecna jest tylko linia C (Rysunek 5B) i nieprawidłowa, jeśli obecna jest tylko linia T lub jeśli nie są widoczne żadne linie (Rysunek 5C).
   UWAGA: Nieprawidłowe wyniki należy powtórzyć co najmniej raz. Inne techniki należy wykonać, jeśli wyniki pozostają nieprawidłowe. Ujemne wyniki uzyskane za pomocą RIDT muszą być następnie potwierdzone przy użyciu złotego standardu metody referencyjnej, takiej jak DFAT, DRIT i metody molekularne (reakcja łańcuchowa polimerazy lub PCR). Mimo że czułość tego testu jest wysoka (patrz reprezentatywne wyniki), nie jest ona 100%.
8. Zużyte urządzenia należy przechowywać w temperaturze pokojowej lub w miarę możliwości przechowywać w lodówce/zamrażać w celu późniejszej analizy molekularnej (patrz punkt 4). Pozostałą zawiesinę próbki należy zamrozić w temperaturze -20 °C/-80 °C w probówce buforowej w celu powtórzenia badania, jeśli to konieczne, lub w celu przeprowadzenia kolejnej analizy molekularnej.

3. Ekstrakcja i detekcja RNA za pomocą RT-qPCR z urządzenia RIDT

UWAGA: Ten krok może być zrealizowany tylko w warunkach laboratoryjnych, z dostosowanym środowiskiem i odpowiednim sprzętem do diagnostyki molekularnej. Można to zrobić wkrótce po teście RIDT lub retrospektywnie na zarchiwizowanych urządzeniach RIDT, przechowywanych w temperaturze pokojowej (15-30 °C), schłodzonych lub zamrożonych.

1. Ekstrakcja RNA
   UWAGA: Aby monitorować etap ekstrakcji, zaleca się stosowanie kontroli wewnętrznej, która może być endogennym mRNA (takim jak ß-aktyna) lub egzogennym kontrolnym (takim jak syntetyczne RNA eGFP) bezpośrednio wzbogaconym do próbki podczas pierwszych etapów ekstrakcji^26,27.
   1. Ostrożnie otwórz urządzenie i wyjmij bibułę filtracyjną.
   2. Wytnij obszar osadu próbki i umieść ją w probówce zawierającej 1 ml Tri-Reagent LS. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę z delikatnym, regularnym mieszaniem ręcznym.
   3. Wykonaj ekstrakcję zgodnie z zaleceniami producenta, jak opisano wcześniej²⁷. Na tym etapie można dodać egzogeniczną kontrolę wewnętrzną.
   4. W trakcie procesu należy dodać 2 μl glikogenu w celu ułatwienia wytrącania RNA, zgodnie z zaleceniami producenta.
   5. Dostosuj końcową objętość do ponownego zawieszenia RNA w wodzie wolnej od nukleaz, przy czym zwykle stosuje się objętość 50 μl.
      UWAGA: Pod koniec etapu wirowania w celu oddzielenia fazy wodnej i organicznej (po dodaniu 200 μl chloroformu do Tri-Reagent LS), kawałek membrany z urządzenia będzie znajdował się na dnie probówki i nie będzie przeszkadzał w zbieraniu górnej fazy wodnej. Alternatywnie można zastosować inne łatwe i szybkie protokoły, na przykład przy użyciu odczynników na bazie fenolu i membran krzemionkowych²⁸.
2. Wykrywanie przez RT-qPCR²⁶
   UWAGA: Wykrywanie potencjalnego wirusowego RNA obecnego w wyekstrahowanych próbkach można przeprowadzić przy użyciu różnych technik molekularnych, takich jak PCR z odwrotną transkrypcją, konwencjonalna (punkt końcowy) lub PCR w czasie rzeczywistym (qPCR). Dostępnych jest kilka metod, takich jak konwencjonalna RT-PCR^27,29 lub RT-qPCR^26,30 ukierunkowana na nukleoproteinę wirusa lub gen polimerazy. Jeden z przykładów zostanie przedstawiony poniżej w oparciu o podwójnie złożony pan-lyssavirus RT-qPCR ukierunkowany na konserwatywny region wśród polimerazy wirusa. Ta technika RT-qPCR łączy dwa różne RT-qPCR: jeden oparty na technologii sondy TaqMan (pan-RABV RT-qPCR), a drugi wykorzystujący detekcję SyBR Green (pan-lyssa RT-qPCR). Ponadto wykrywanie egzogennej kontroli wewnętrznej (eGFP RNA) bezpośrednio wzbogaconej podczas procesu ekstrakcji odbywa się za pomocą specyficznego RT-qPCR opartego na sondzie TaqMan (eGFP RT-qPCR). Dokładna walidacja na miejscu technik molekularnych wybranych do wykrywania wirusowego RNA jest ważna, w szczególności w celu sprawdzenia, czy startery i sondy do RT-PCR w czasie rzeczywistym są przystosowane do wykrywania szczepów krążących w regionie zainteresowania⁴.
   1. Rozcieńczyć próbkę RNA w stosunku 1:10 w wodzie wolnej od nukleaz. Przetestuj każdą próbkę RNA w dwóch egzemplarzach, używając 96-dołkowej płytki reakcyjnej lub innych formatów. Stosować kontrole dodatnie i ujemne dla każdego testu i badać co najmniej dwukrotnie.
   2. Przygotować roztwór reakcyjny mieszaniny głównej dla trzech różnych testów RT-qPCR zgodnie z tabelą 1 oraz ze starterami/sondami wskazanymi w tabeli 2.
   3. Dodać 5 μl rozcieńczonych próbek RNA i 15 μl mieszanki wzorcowej do każdego z trzech różnych testów. Test pan-RABV RT-qPCR i test eGFP RT-qPCR mogą być cyklicznie umieszczane na tej samej płytce.
   4. Przeprowadzić różne testy zgodnie z warunkami cykli termicznych wskazanymi w tabeli 3. Jeżeli dostępny jest tylko jeden termocykler do PCR, należy rozpocząć od testu pan-RABV RT-qPCR i przechowywać płytkę dla pan-lyssa RT-qPCR w temperaturze 4 °C do końca pan-RABV RT-qPCR.
   5. Przeanalizować wyniki uzyskane za pomocą trzech testów zgodnie z tabelą 4.

4. Genotypowanie po ekstrakcji RNA z urządzenia RIDT

1. Odwrotna transkrypcja RT^27,29
   1. Przygotować mieszankę wzorcową z 6 μl RNA, 2 μl losowych starterów pd(N)6 (200 μg/μl) i 2 μl wody wolnej od nukleaz dla końcowej objętości 10 μl.
   2. Inkubować w temperaturze 65 °C przez 10 minut w bloku grzewczym, a następnie przechowywać na lodzie.
   3. Przygotować mieszankę wzorcową z 6 μl 5x buforu pierwszej nici, 2 μl 0,1 M ditiotreitolu (DTT), 1 μl (200 U) odwrotnej transkryptazy indeksu górnego II, 2 μl (80 U) RNasin, 2 μL mieszanki dNTP (10 μM) i uzupełnić wodą wolną od nukleaz, aby uzyskać końcową objętość 20 μl dla każdej próbki.
   4. Dodać mieszankę wzorcową (20 μl) do próbki (10 μl) (końcowa objętość 30 μl) i inkubować w temperaturze 42 °C przez 90 minut w bloku grzewczym.
   5. Przejdź do następnego kroku z amplifikacją PCR lub przechowuj cDNA w temperaturze -20 °C.
2. Konwencjonalny PCR^27,29,31
   UWAGA: Do genotypowania dostępne są różne techniki konwencjonalnego PCR. Przedstawiono dwa, oba PCR zagnieżdżone w półwyspie, ukierunkowane na część nukleoproteiny lub część białka wirusowego lyssawirusa. Protokół jest taki sam dla każdego z tych testów, z wyjątkiem starterów i warunków cyklicznych. Dodatnie (dodatnie RNA) i ujemne (ujemne cDNA i/lub woda wolna od nukleaz) kontrole powinny być włączone do każdej serii i każdej rundy PCR.
   1. Przygotować dla każdej próbki w mikroprobówce o pojemności 0,2 ml roztwór reakcyjny mieszaniny głównej do pierwszego etapu PCR. Mieszanina ta zawiera 5 μl 10 x buforu reakcyjnego NH4, 2,5 μl roztworu MgCl₂ (50 mM), 1 μl mieszanki dNTP (10 μM), 1 μl każdego startera (10 μM), 0,2 μl (1 U) polimerazy DNA Biotaq i 37,3 μl wody wolnej od nukleaz (końcowa objętość 48 μL). Startery są wskazane w tabeli 5.
   2. Dodać 2 μl cDNA do każdej probówki i poddać cyklowi na oddzielnym konwencjonalnym termocyklerze PCR dla każdego testu, zgodnie z tabelą 6.
   3. Przygotować drugi roztwór reakcyjny mieszaniny wzorcowej, identyczny z poprzednim, przy użyciu odpowiednich starterów (tabela 5) dla reakcji PCR zagnieżdżonej w półwyspie.
   4. Dodać 2 μl produktu pierwszej rundy PCR i poddać cyklowi na konwencjonalnym termocyklerze PCR, stosując parametry cykliczne wskazane w tabeli 6.
   5. Wizualizuj różne produkty PCR (pierwsza i druga runda PCR) po załadowaniu ich na 1% żel agarozowy (100 ml buforu EDTA tris-acetate 1x - TAE 1x) z bromkiem etydyny (końcowe stężenie około 0,01%) i uruchom żel przez 30 minut przy 120 V. Obserwuje się dodatni wynik PCR w postaci jasnego pasma o oczekiwanej wielkości (tab. 5).
3. Sekwencjonowanie Sangera
   1. Wykonaj sekwencjonowanie Sangera amplikonów uzyskanych za pomocą półzagnieżdżonego PCR pan-lyssawirusa i zakończ analizę genotypowania.

Wyniki

Podobnie jak w przypadku każdej metody diagnostycznej, pobieranie próbek ma ogromne znaczenie dla wiarygodności wyników, zwłaszcza gdy jest wykonywane w terenie. Proces pobierania próbek musi być tak prosty, jak to tylko możliwe, aby zagwarantować pobieranie próbek wysokiej jakości. Pobranie biopsji mózgu (pień mózgu z rdzeniem przedłużonym) drogą otworu wielkiego w celu pośmiertnej diagnozy wścieklizny zwierząt spełnia ten wymóg, jak wskazano w Rysunek 2A-D²⁵.

Po pobraniu, próbka mózgu jest przesyłana do zmodyfikowanego protokołu RIDT, podsumowanego w Rysunek 6. Jak wskazano w sekcji Protokół, główną adaptacją protokołu dostarczonego przez producenta jest pominięcie etapu rozcieńczania w PBS, co upraszcza procedurę i niezbędne materiały eksploatacyjne/odczynniki, a więc wszystkie zawarte w zestawie (Rysunek 4).

Ten zmodyfikowany protokół został wdrożony i oceniony w pięciu różnych laboratoriach, w tym w jednym centrum współpracy WHO ds. wścieklizny (Lab 1, Francja), jednym centrum referencyjnym FAO dla wścieklizny (Lab 5, Włochy) i trzech laboratoriach referencyjnych zlokalizowanych w enzootycznych krajach Afryki, Czadzie (Lab 2), Wybrzeżu Kości Słoniowej (Lab 3) i Mali (Lab 4). W Czadzie ocenę RIDT przeprowadzono zarówno w warunkach laboratoryjnych, jak i terenowych.

W porównaniu z techniką referencyjną DFAT, czułość i swoistość RDIT były wysokie dla wszystkich laboratoriów, odpowiednio od 96% do 100% i od 93,7% do 100% (Tabela 7). Najniższą czułość i swoistość RDIT uzyskano dla laboratorium 1 (Francja) na etapie walidacji laboratoryjnej. Na podstawie skumulowanej liczby badanych próbek (n=162) (tabela uzupełniająca 1), ogólna czułość i swoistość w porównaniu z DFAT wyniosły odpowiednio 98,2% i 95,8% (tabela 7). Jednak te wstępne, ale obiecujące wyniki uzyskano na ograniczonym zbiorze danych próbek i muszą być dalej potwierdzone na dużej liczbie próbek pozytywnych i ujemnych, zwłaszcza w przypadku próbek testowanych na obszarach enzootycznych, aby uniknąć potencjalnego niedoszacowania lub stronniczości ze względu na obecne heterogeniczne zestawy danych.

Test RIDT jest odpowiedni do wykrywania lyssawirusa w biopsjach mózgu zakażonych zwierząt, gdzie poziom antygenów wirusa lyssa jest ważny. Jednak testowa granica wykrywalności pozostaje wysoka podczas badania miareczkowanej zawiesiny wirusa (tabela 8; Rysunek 7).

Tabela 9 (z Léchenne 2016¹⁴) pokazuje przykład wyników uzyskanych po wykryciu RNA przez podwójnie kombinowany pan-lyssavirus RT-qPCR ukierunkowany na polimerazę wirusa lyssawirusa. Przetestowano panel 51 pozytywnych testów RIDT wykonanych w warunkach laboratoryjnych (Lab 1, n = 32) lub w Czadzie (Lab 2, n = 19), a następnie wysłanych w temperaturze otoczenia do Lab 1. Dodatnie wykrycie uzyskano dla 18 (94,7%), 26 (81,2%) i 44 (86,3%) próbek z Lab 1, Lab 2 i obu łącznie. Ponadto genotypowanie przeprowadzono dla 14 z tych próbek (10 z laboratorium 1 i 4 z laboratorium 2) przy użyciu hemi-zagnieżdżonego PCR ukierunkowanego na częściowy gen nukleoproteiny i zakończyło się sukcesem dla 13 z nich (93%) (z Léchenne i wsp. 2016¹⁴).

Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie struktury RIDT do diagnostyki wścieklizny. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 2: Przykłady szybkich, prostych technik pobierania próbek mózgu (pień mózgu z rdzeniem przedłużonym) u zwierząt (pies pokazany tutaj) przez otwór potyliczny w warunkach polowych (Mali). (A) Pobieranie za pomocą jednorazowej pipety plastikowej (B) Pobieranie za pomocą plastikowej słomki do napojów (C) Zbieranie za pomocą zacisku (D) Zbieranie za pomocą zakraplacza do usuwania znajdującego się w zestawie RIDT. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 3: Podłużny przekrój anatomiczny głowy psa, przedstawiający różne części mózgu (pień mózgu, móżdżek, hipokamp, wzgórze i kora) zebrane podczas pchania, w ruchu obrotowym, jednorazowej plastikowej pipety przez otwór potyliczny. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Opis zawartości zestawu RIDT, w tym urządzenia, jednorazowego plastikowego zakraplacza, jednorazowego wacika i rozcieńczalnika do oznaczania. Probówka, w której próbka będzie pobierana i przechowywana, nie jest przewidziana. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Reprezentatywne wyniki do interpretacji Anigen RIDT. (A) Wyniki dodatnie (widoczna obecność dwóch linii, linii C i linii T) (B) Wyniki ujemne (widoczna obecność tylko linii C) (C) Nieprawidłowe wyniki (brak widocznej linii C). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Schematyczne przedstawienie protokołu RIDT, zaczerpnięte z instrukcji producenta. (A) Zmodyfikowana wersja protokołu, ze skreśleniem etapu rozcieńczania zalecanego przez producenta (B) Protokół początkowy zalecany przez producenta, z krokiem rozcieńczania przed 1:10 w PBS próbek mózgu. Kroki usunięte w zmodyfikowanej wersji protokołu (przedstawione na rysunku 6A) są oznaczone czerwoną linią. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7: Przykład wyznaczania granicy wykrywalności RIDT¹⁴. Zastosowano seryjne rozcieńczenie 10:1 miareczkowanego wirusa wścieklizny szczepu 9704ARG. Ilość wirusa zdeponowanego na każdym urządzeniu jest podawana w FFU (fluorescencyjnych jednostkach tworzących ognisko). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt.

Test Pan-RABV RT-qPCR
Odczynnik	μL/reakcja
2X Mieszanina Reakcyjna (bufor zawierający 0,4 mM każdego dNTP i 6 mM MgSO4)	10
Woda wolna od nukleaz	1,5
Taq3long (Do przodu) [10 μM]	1
Taq17revlong (Bieg wsteczny) [10 μM]	1
RABV4 [10 μM]	0,3
RABV5 [10 μM]	0,3
MgSO4 [50-mM] (w zestawie)	0,25
Barwnik referencyjny ROX (25 μM) (dostarczany w zestawie)	0,05
RNasin (40U/μL) (Promega)	0,2
SuperScript III RT/Platynowy Taq Mix	0,4
Suma na reakcję	15
test RT-qPCR eGFP
Odczynnik	μL/reakcja
2X Mieszanina Reakcyjna (bufor zawierający 0,4 mM każdego dNTP i 6 mM MgSO4)	10
Woda wolna od nukleaz	2.8
EGFP1F (do przodu) [10 μM]	0,5
EGFP2R (odwrócony) [10 μM]	0,5
Sonda eGFP [10 μM]	0,3
MgSO4 [50-mM] (w zestawie)	0,25
Barwnik referencyjny ROX (25 μM) (dostarczany w zestawie)	0,05
RNasin (40U/μL) (Promega)	0,2
SuperScript III RT/Platynowy Taq Mix	0,4
Suma na reakcję	15
Test Pan-lyssa RT-qPCR
Odczynnik	μL/reakcja
2x SYBR Zielona Mieszanka Reakcyjna	10
Woda wolna od nukleaz	2.1
Taq5long (Do przodu) [10 μM]	1
Taq16revlong (Wsteczny) [10 μM]	1
MgSO4 [50-mM] (w zestawie)	0,25
Barwnik referencyjny ROX (25 μM)	0,05
RNasin (40U/μL) (Promega)	0,2
SuperScript III RT/Platynowy Taq Mix	0,4
Suma na reakcję	15

Tabela 1: Opis roztworu reakcyjnego mieszanki głównej dla trzech różnych testów RT-qPCR (pan-RABV RT-qPCR, pan-lyssa RT-qPCR i eGFP RT-qPCR).

powiedział: powiedział:

Test RT-qPCR	nazwa	typ	długość	Sekwencja (5'-3')	zmysł	pozycja
test pan-RABV RT-qPCR	Taq3long powiedział:	podkład	22 Rozdział 22	ATG AGA AGT GGA AYA AYC ATC A	S	7273-7294A
	Taq17revlong powiedział:	podkład	25	GAT CTG TCT GAA TAA TAG AYC CAR G	gdy	7390-7414A
	RABV4	Sonda pomiarowa (FAM/TAMRA)	29	AAC ACY TGA TCB AGK AGA GAR AAY ACA TC	gdy	7314-7342A
	RABV5	Sonda pomiarowa (FAM/TAMRA)	Rozdział 32	AGR GTG TTT TCY AGR ACW CAY GAG TTT TTY CA	S	7353-7384A
Test Pan-lyssa RT-qPCR	Taq5long powiedział:	podkład	23	TAT GAG AAA TGG AAC AAY CAY CA	S	7272-7294A
	Taq16revlong	podkład	25	GAT TTT TGA AAG AAC TCA TGK GTY C	gdy	7366-7390A
test RT-qPCR eGFP	EGFP1F	podkład	20	GAC CAC TAC CAG CAG AAC AC AC	S	637-656mld
	EGFP2R	podkład	Rozdział 19	GAA CTC CAG CAG GAC CAT G	gdy	768-750mld
	Europejski Instrument Ekonomiczno-Wydmieńczy (U	Sonda pomiarowa (FAM/TAMRA)	22 Rozdział 22	AGC ACC CAG TCC GCC CTG AGC A	S	703-724mld

Tabela 2: Opis starterów/sond dla trzech różnych testów RT-qPCR (pan-RABV RT-qPCR, pan-lyssa RT-qPCR i eGFP RT-qPCR). a Zgodnie z sekwencją genomu RABV ^wirusaPasteura (PV) (numer dostępu GenBank M13215). ^bZgodnie z sekwencją wektora klonowania pEGFP-1 (numer dostępu GenBank U55761).

Testy Pan-RABV RT-qPCR i eGFP RT-qPCR
krok	cykl	Najwyższa temp	Godzina	Gromadzenie danych
Odwrotna transkrypcja	1	45 °C	Czas trwania: 15 min
Inaktywacja RT/początkowa denaturacja	1	95 °C	Czas trwania: 3 min
Wzmocnienie	40	95 °C	15 sekund
		61 °C	1 min	Punkt końcowy
Test Pan-lyssa RT-qPCR
krok	cykl	Najwyższa temp	Godzina	Gromadzenie danych
Odwrotna transkrypcja	1	45 °C	Czas trwania: 15 min
Inaktywacja RT/początkowa denaturacja	1	95 °C	Czas trwania: 3 min
Wzmocnienie	40	95 °C	15 sekund
		55 °C	1 min	Punkt końcowy
Krzywa dysocjacji	1	95 °C	15 sekund	Wzrost o 0,1 °C/s, 55–95 °C
		55 °C	1 min
		95 °C	15 sekund
		55 °C	15 sekund

Tabela 3: Opis warunków cyklu termicznego dla trzech różnych testów RT-qPCR (pan-RABV RT-qPCR, pan-lyssa RT-qPCR i eGFP RT-qPCR).

Test	analiza	Wyniki	interpretacja
eGFP RT-qPCR	Cq w przedziale akceptacji	Walidacja ekstrakcji	Można przeprowadzić analizę innych testów
	Cq poza przedziałem akceptacji	Ekstrakcja nie została zweryfikowana	Ponownie przetestuj próbkę (powtórz przebieg i/lub ekstrakcję), w razie potrzeby poproś o kolejną próbkę
pan-RABV RT-qPCR	Pytanie <38	Plus	Pozytywne wykrycie wirusowego RNA
	Pytanie ≥38	Minus	Analiza testu pan-lyssa RT-qPCR
pan-lyssa RT-qPCR	Krzywa topnienia uznana za dodatnią	Plus	Pozytywne wykrycie wirusowego RNA
	Krzywa topnienia uważana za ujemną	Minus	Brak wykrycia wirusowego RNA

Tabela 4: Ogólna interpretacja testu RT-qPCR z podwójnym skojarzonym pan-lyssawirusem.

) ) ) ) )

Konwencjonalny test PCR z gniazdem hemi	Runda PCR	nazwa	długość	Sekwencja (5'-3')	zmysł	PozycjaA	Wielkość amplikonu (bp)
Półgnieżdżony PCR ukierunkowany na gen polimerazy	1. runda	PVO5m (Wieża PVO5m	20	ATG ACA GAC AAY YTG AAC AA	S	Nr kat. 7170-7189	320
		PVO9 (wersja angielska	Rozdział 19	TGA CCA TTC SAMOCHÓD GTN G	gdy	Nr kat. 7471-7489
	2. runda	PVO5m (Wieża PVO5m	20	ATGA CAG ACA AYY TGA ACA A	S	Nr kat. 7170-7189	250
		PVO8 (wersja angielska	22 Rozdział 22	GGT CTG ATC TRT CWG ARY AAT A	gdy	Nr kat. 7398-7419
Półgnieżdżony PCR ukierunkowany na gen nukleoproteiny	1. runda	Zobacz materiał N127	20	ATG TAA CAC CTC TAC AAT GG	S	55-74 Rozdział 55-74	1532
		N8m (Sieć N8m	Rozdział 19	CAG TCT CYT CNG CCA TCT C	gdy	Lata 1568-1586
	2. runda	Zobacz materiał N127	20	ATG TAA CAC CTC TAC AAT GG	S	55-74 Rozdział 55-74	845
		Zobacz materiał N829	Rozdział 19	GCC CTG GTT CGA ACA TTC T	gdy	881-899

Tabela 5: Opis starterów używanych do konwencjonalnego półzagnieżdżonego PCR.

	Półgnieżdżony PCR ukierunkowany na gen polimerazy
	krok	cykl	temperatura	Godzina
Pierwsza i druga runda	Początkowa denaturacja	1	94 °C	Czas trwania: 3 min
	denaturacja	35	94 °C	30 sekund
	Hybrydyzacja		56 °C	45 sekund
	Wydłużenie		72 °C	40 sekund
	Wydłużenie końcowe	1	72 °C	Czas trwania: 3 min
	Zagnieżdżony w półkach PCR ukierunkowany na gen nukleoproteiny
	krok	cykl	temperatura	Godzina
Pierwsza runda	Początkowa denaturacja	1	94 °C	Czas trwania: 3 min
	denaturacja	35	94 °C	30 sekund
	Hybrydyzacja		56 °C	30 sekund
	Wydłużenie		72 °C	45 sekund
	Wydłużenie końcowe	1	72 °C	Czas trwania: 3 min
Druga runda	Początkowa denaturacja	1	94 °C	Czas trwania: 3 min
	denaturacja	35	94 °C	30 sekund
	Hybrydyzacja		58 °C	30 sekund
	Wydłużenie		72 °C	30 sekund
	Wydłużenie końcowe	1	72 °C	Czas trwania: 3 min

Tabela 6: Opis warunków cyklu termicznego dla konwencjonalnego półzagnieżdżonego PCR.

Rozdział Rozdział Rozdział Rozdział

Lab	Kraj	Okres oceny	Nb próbek	Wyniki DFAT		Wyniki RIDT		Czułość	Szczegółowość
				Poz.	Neg	Poz.	Neg
Laboratorium 1	Francja	2015	Rozdział 82	50	Rozdział 32	50	Rozdział 32	96%	93,7%
Laboratorium 2	Czad	Lata 2012-2015	Rozdział 44	33 Rozdział 33	11	33 Rozdział 33	11	W 100%	W 100%
Laboratorium 3	Wybrzeże Kości Słoniowej	2017	10	8	cyfra arabska	8	cyfra arabska	W 100%	W 100%
Laboratorium 4	Mali	2017	Rozdział 18	15	3	15	3	W 100%	W 100%
Laboratorium 6	Włochy	2016	8	8	0	8	0	W 100%	-
Wszystkie		Lata 2015-2017	Rozdział 162	114	Rozdział 48	114	Rozdział 48	98,2%	95,8%

Tabela 7: Określenie wewnętrznych parametrów (czułość, swoistość) testu RIDT w porównaniu z referencyjną metodą DFAT, na podstawie analizy łącznie 162 próbek i przy udziale 5 różnych laboratoriów.

Szczepwirusa a	Pierwotny host	lokalizacja	Stężenie początkowe (FFU/ml)b	Granica wykrywalności (FFU/ml)c
9147FRA	lis	Francja	3,1 x 107	106
CVS (Życiorys)	Izolat laboratoryjny	-	1,6 x 107	106
8743THA	ludzki	Tajlandia	8,1 x 107	> 8,1 x 106
9508CZK (SAD)	Izolat laboratoryjny	-	5,4 x 108	107
Pv	Izolat laboratoryjny	-	4,3 x 107	106
9001FRA	pies	Gujana Francuska	Wymiary: 2,4 x 106	> 2,4 x 105
9704ARG (Biblioteka OGRODOWA)	nietoperz	Argentyna	9,5 x 107	105
04030PHI	ludzki	Filipiny	Wymiary: 2,5 x 107	105

Tabela 8: Granica wykrywalności RIDT przy użyciu 8 różnych miareczkowanych zawiesin wirusa wścieklizny (z Léchenne et al. 2016¹⁴). ^aCVS: szczep wirusa prowokacyjnego, SAD: Street Alabama Dufferin, PV: Wirus Pasteura. ^bLiczba fluorescencyjnych jednostek tworzących ognisko (FFU) na ml. ^cLiczba fluorescencyjnych jednostek tworzących ognisko (FFU) osadzonych na pasku.

Rozdział

		RIDT wykonany w
		Lab 1			Lab 2			Połączone
		Plus	Minus	łączny	Plus	Minus	łączny	Plus	Minus	łączny
Wykrywanie wirusowego RNA	Plus	Rozdział 18	1	Rozdział 19	26	0	Rozdział 32	Rozdział 44	7	51 Rozdział 51
	Minus	0	0	0	0	0	3	0	3	3
	łączny	Rozdział 18	1	Rozdział 19	26	0	35	Rozdział 44	10	54 Rozdział 54

Tabela 9: Wykrywanie wirusowego RNA za pomocą RT-qPCR na pasku testowym Anigen używanym w warunkach laboratoryjnych (Lab 1), w warunkach polowych i wysyłanym w temperaturze otoczenia (Lab 2) lub połączonym (z Léchenne et al. 2016¹⁴).

Tabela uzupełniająca 1: Opis 162 próbek przebadanych testem RIDT w celu określenia jego wewnętrznych parametrów przedstawionych w Tabeli 7. Kliknij tutaj, aby wyświetlić tę tabelę (kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).

Dyskusja

RIDT to prosta, szybka i tania metoda pośmiertnej diagnostyki wścieklizny oraz obiecująca alternatywa terenowa dla badań laboratoryjnych. Zastosowanie takiego testu, zwłaszcza dla zdecentralizowanych obszarów krajów o niskich i średnich dochodach, poprawiłoby zrozumienie występowania i przenoszenia wirusa wścieklizny w skali lokalnej i potencjalnie krajowej. W połączeniu z metodą szybkiego pobierania próbek mózgu (bez pełnej sekcji zwłok) ogromną zaletą jest to, że test można w całości wykonać w terenie, z dala od obiektów laboratoryjnych. Próbki mózgu pobrane przez otwór wielki mogą być wykorzystane do badań, dzięki czemu nie jest wymagane całkowite otwarcie czaszki zwierzęcia. Test jest prosty do wykonania i interpretacji i nadaje się szczególnie do działań związanych z nadzorem w terenie¹⁴. Inne zalety RIDT w porównaniu z DFAT lub DRIT to brak konieczności stosowania kontroli dodatnich i ujemnych oraz przechowywanie zestawu w temperaturze pokojowej. Ponadto zmodyfikowany protokół, w którym pominięto etap rozcieńczania (1:10) do PBS, nie wymaga dodatkowych odczynników do przeprowadzenia testu i dodatkowo upraszcza procedurę w warunkach polowych.

Kluczową kwestią jest jakość próbek mózgu. Próbki powinny być pobierane i badane jak najszybciej po śmierci zwierzęcia podejrzanego o zakażenie lub przechowywane w chłodnej temperaturze przed badaniem, aby uniknąć degradacji. Próbki rozłożone nie powinny być badane, ponieważ może to wpłynąć na wynik (ryzyko wyniku fałszywie ujemnego). Chociaż nie ma jeszcze dostępnych danych dotyczących utraty czułości RIDT w czasie dla próbek mózgu, stawiamy hipotezę, że jest ona podobna w porównaniu z testem DFAT³². Jednak czas między śmiercią zwierzęcia a wykonaniem testu może zostać skrócony, ponieważ test można wykonać szybko i bezpośrednio w terenie. W związku z tym istnieje na ogół mniejsze ryzyko rozkładu próbek.

Kolejnym krytycznym krokiem w ramach protokołu jest migracja zawiesiny próbki. Migrację należy rozpocząć bezpośrednio po osadzeniu próbki (1-5 min). Wysoka lepkość zawiesiny może zatem negatywnie wpłynąć na migrację. Delikatne zadrapanie zakraplaczem spodu miejsca depozytu urządzenia i dodanie 1-2 kolejnych kropli często rozwiązuje ten problem, a migracja rozpoczyna się zaraz po tym.

Większość testów RIDT wykonywanych w laboratoriach afrykańskich (Czad, Wybrzeże Kości Słoniowej i Mali) została wykonana w temperaturze otoczenia, która może przekraczać 30 °C, podczas gdy zalecany przez producenta zakres temperatur przechowywania i stosowania wynosi 15 °C - 30 °C. Chociaż nie zidentyfikowaliśmy żadnego wpływu wysokiej temperatury na wydajność testu RIDT, konieczna jest jego dokładniejsza ocena. Podobnie, wpływ wysokiej temperatury podczas przechowywania i transportu urządzenia po użyciu do wykrywania wirusowego RNA i genotypowania wymaga dodatkowej oceny. Na czułość wykrywania wirusowego RNA za pomocą RT-qPCR z paska RIDT może mieć wpływ jakość próbki mózgu początkowo użytej w teście, ale także stan przechowywania testów RIDT po użyciu. Na przykład czułość wykrywania RNA była wyższa, gdy stosowane testy RIDT były przechowywane w kontrolowanych warunkach laboratoryjnych (94,7%) w porównaniu z warunkami terenowymi (np. w Czadzie) (81,2%)¹⁴. Warunki te mogą również wpływać na integralność (zwłaszcza długość) RNA utrwalonego na pasku, co może wyjaśniać umiarkowaną wrażliwość na genotypowanie w oparciu o dłuższe amplikony PCR (np. >500 nukleotydów)¹⁴. Czułość RT-qPCR wykonanego na pasku testowym była niższa niż uzyskana przy użyciu kart FTA Whatman (80,6%)¹⁴. Podobnie jak w przypadku innych technik molekularnych, wiremia może również wpływać na powodzenie genotypowania na podstawie pasków RDIT, z potencjalnymi negatywnymi wynikami dla próbek o niskim mianie wirusa¹⁴.

Test nie jest obecnie zalecany przez WHO i OIE do rutynowej diagnozy i nadzoru nad chorobami, a jego wynik nie może być wykorzystany samodzielnie do podejmowania decyzji dotyczących PEP. Nadal potrzebna jest dalsza walidacja testów. Dokładna i szybka diagnoza wścieklizny jest jednak kluczowym elementem dobrze funkcjonujących systemów ciągłego nadzoru nad wścieklizną i ma zasadnicze znaczenie dla zwiększenia zaangażowania politycznego, co ma ogromne znaczenie dla skutecznej i trwałej kontroli wścieklizny³³ . Testy RIDT oferują nowe możliwości diagnostyki wścieklizny w tym kontekście i są użytecznym narzędziem do rozszerzenia nadzoru nad wścieklizną zwierząt w terenie na obszarach enzootycznych o niskich lub średnich dochodach.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Koniugat nukleokapsydu przeciw wściekliźnie (liofilizowany, adsorbowany)	Bio-Rad, Francja	3572112	Przeciwciało poliklonalne sprzężone z fluoresceiną-5-izotiocyjanianem (FITC) przeciwko nukleokapsydowi wirusa wścieklizny. Służy do obsługi technicznej dokumentacji DFAT.
Applied Biosystems 7500 System PCR w czasie rzeczywistym	Applied Biosystems, Francja	4351104	Amplifikacja wirusowego RNA metodą RT-qPCR po ekstrakcji z urządzenia RIDT.
Jednorazowa plastikowa pipeta, słomka do picia, zacisk, zakraplacz	-		sprzęt używany do pobierania pnia mózgu (rdzenia przedłużonego) przez otwór wielki (droga potyliczna).
Evans Blue Solution 1%	Bio-Rad, Francja	3574911	Przeciwbarwienie stosowane w DFAT w celu ułatwienia odczytu pod mikroskopem UV.
Primer eGFPF1	Eurofins Genomics,	Germany-Forward	starter do amplifikacji eGFP kontroli wewnętrznej metodą RT-qPCR po ekstrakcji RNA z urządzenia RIDT, sekwencja: 5'-GACCACTACCAGCAGAACAC-3'.
Primer eGFPR2	Eurofins Genomics,	Niemcy-Odwrócony starter do amplifikacji eGFP kontroli wewnętrznej metodą RT-qPCR po ekstrakcji z urządzenia RIDT, sekwencja: 5'-GAACTCCAGCAGGACCATG-3'.
Primer Taq17 revlong	Eurofins Genomics,	Niemcy-Odwrócony starter do amplifikacji wirusowego RNA metodą RT-qPCR po ekstrakcji RNA z urządzenia RIDT, sekwencja: 5'-ATGAGAAGTGG AAYAAYCATCA-3'.
Primer Taq3 long	Eurofins Genomics,	Germany-Forward	starter do amplifikacji wirusowego RNA metodą RT-qPCR po ekstrakcji RNA z urządzenia RIDT, sekwencja: 5'-GATCTGTCTGAA TAATAGAYCCARG-3'.
Sonda eGFP FAM/TAMRA	Eurofins Genomics, niemiecko-Forward		starter do amplifikacji kontroli wewnętrznej metodą RT-qPCR po ekstrakcji z urządzenia RIDT, sekwencja: 5'-AGCACCCAGT CCGCCCTGAGCA-3'.
Sonda RABV4 FAM/TAMRA	Eurofins Genomics,	Niemcy-Sonda	do amplifikacji wirusowego RNA metodą RT-qPCR po ekstrakcji RNA z urządzenia RIDT, sekwencja: 5'-AACACYTGATCBA GKACAGARAAYACATC-3'.
Sonda RABV5 FAM/TAMRA	Eurofins Genomics,	Niemcy-Sonda	do amplifikacji wirusowego RNA metodą RT-qPCR po ekstrakcji RNA z urządzenia RIDT, sekwencja: 5'-AGRGTGTTTTCYAG RACWCAYGAGTTTTTYCA-3'.
Zestaw do szybkiego testu na wściekliznę	Ag BioNote Inc., Republika Korei	RG18-01DD	Szybki immunochromatograficzny test diagnostyczny (RIDT, zwany również urządzeniem z przepływem bocznym lub LFD) do pośmiertnej diagnozy wścieklizny.
Rekombinowany inhibitor rybonukleazy RNasin	Promega, USA	N2515	Enzym stosowany z zestawem do amplifikacji wirusowego RNA metodą RT-qPCR po ekstrakcji z urządzenia RIDT.
SuperScript III Platinum One-Step qRT-PCR Kit	Invitrogen, Francja	11732-020	Zestaw do amplifikacji wirusowego RNA metodą RT-qPCR po ekstrakcji z urządzenia RIDT.
Odczynnik TRIzol	Invitrogen, Francja	15596026	ekstrakcji całkowitego RNA na bazie fenolu/chloroformu przy użyciu błony celulozowej RIDT.