Charakterystyka transporterów błonowych przez ekspresję heterologiczną u E. coli i wytwarzanie pęcherzyków błonowych

Podsumowanie

Opisujemy metodę charakterystyki transporterów błonowych napędzanych protonami w preparatach pęcherzyków błonowych wytwarzanych przez heterologiczną ekspresję w E. coli i lizę komórek za pomocą prasy francuskiej.

Streszczenie

Opracowano kilka metod do funkcjonalnego charakteryzowania nowych transporterów membranowych. Poliaminy są wszechobecne we wszystkich organizmach, ale wymienniki poliaminowe w roślinach nie zostały zidentyfikowane. W tym miejscu przedstawiamy metodę charakteryzowania antyporterów poliaminowych za pomocą pęcherzyków błonowych powstałych w wyniku lizy komórek Escherichia coli heterologicznie eksprymujących antyporter roślinny. Po pierwsze, heterologicznie eksprymowaliśmy AtBAT1 w szczepie E. coli z niedoborem transporterów wymiany poliaminy i argininy. Pęcherzyki wyprodukowano za pomocą prasy francuskiej, oczyszczono przez ultrawirowanie i wykorzystano w teście filtracji membranowej znakowanych substratów w celu wykazania specyficzności substratu transportera. Testy te wykazały, że AtBAT1 jest transporterem argininy, kwasu γ-aminomasłowego (GABA), putrescyny i spermidyny, za pośrednictwem protonów. Zmutowany szczep, który został opracowany do testu AtBAT1, może być przydatny do analizy funkcjonalnej innych rodzin roślinnych i zwierzęcych wymienników poliaminowych. Stawiamy również hipotezę, że to podejście może być wykorzystane do scharakteryzowania wielu innych typów antyporterów, o ile białka te mogą ulegać ekspresji w błonie komórkowej bakterii. E. coli jest dobrym systemem do charakterystyki nowych transporterów, ponieważ istnieje wiele metod, które można zastosować do mutagenizacji rodzimych transporterów.

Wprowadzenie

Białka biorące udział w transporcie metabolitów stanowią niezbędny poziom regulacji fizjologicznej, ale zdecydowana większość transporterów błon roślinnych nie została jeszcze funkcjonalnie scharakteryzowana. Wdrożono kilka strategii w celu scharakteryzowania nowych białek transportowych. Heterologiczna ekspresja w organizmach modelowych, takich jak E. coli i komórkach eukariotycznych, takich jak drożdże, oocyty Xenopus, komórki ssaków, komórki owadów i komórki roślinne, została wykorzystana do określenia ich aktywności transportowej¹. Komórki eukariotyczne są preferowane do ekspresji białek eukariotycznych, ponieważ podstawowy skład komórkowy, szlaki transdukcji sygnału, mechanizmy transkrypcji i translacji są zgodne z warunkami natywnymi.

Drożdże były ważnym organizmem modelowym do charakterystyki nowych białek transportowych w roślinach. Pierwszym białkiem transportowym roślinnym, które z powodzeniem uległo ekspresji w drożdżach (Saccharomyces pombe) był transporter heksozy HUP1 z Chlorella². Od tego czasu wiele białek transportowych roślin zostało funkcjonalnie scharakteryzowanych przy użyciu systemu ekspresji drożdży. Należą do nich transportery cukru roślinnego (SUC1 i SUC2³, VfSUT1 i VfSTP1⁴) oraz transportery auksyny (AUX1 i PIN⁵). Wady wykorzystania drożdży do ekspresji białek roślinnych mogą obejmować upośledzoną aktywność białek zlokalizowanych plastydowo, ponieważ drożdże nie mają tych organelli, błędne ukierunkowanie⁶ oraz tworzenie nieprawidłowo sfałdowanych agregatów i aktywację reakcji stresowych u drożdży z powodu nadekspresji białek błonowych7^,8,9.

Heterologiczna ekspresja białek transportowych w oocytach Xenopus była szeroko stosowana do elektrofizjologicznej charakterystyki transporterów¹⁰. Pierwszymi białkami transportowymi roślin scharakteryzowanymi za pomocą ekspresji heterologicznej w oocytach Xenopus były kanał potasowy Arabidopsis KAT1¹⁰ i transporter heksozy Arabidopsis STP1¹¹. Od tego czasu oocyty Xenopus zostały wykorzystane do scharakteryzowania wielu białek transportu roślinnego, takich jak transportery błony komórkowej¹², wakuolarny transporter sacharozy SUT4¹³ i transporter jabłczanu wakuolarnego ALMT9¹⁴. Ważnym ograniczeniem oocytów Xenopus do oznaczania transportu jest to, że nie można manipulować stężeniem metabolitów wewnątrzkomórkowych¹. Ponadto do przygotowania oocytów Xenopus potrzebna jest fachowa wiedza, a zmienność partii oocytów jest trudna do kontrolowania.

Heterologiczna ekspresja w organizmie modelowym E. coli jest idealnym systemem pod względem charakterystyki nowych białek transportu roślinnego. Dzięki w pełni zsekwencjonowanemu genome¹⁵, molekularne i fizjologiczne cechy E. coli są dobrze znane. Narzędzia i techniki molekularne są dobrze znane¹⁶. Ponadto dostępne są różne wektory ekspresji, niepatogenne szczepy i mutanty^17,18,19. Ponadto E. coli ma wysokie tempo wzrostu i może być łatwo uprawiana w warunkach laboratoryjnych. Wiele białek może być łatwo eksprymowanych i oczyszczanych w dużych ilościach w E. coli⁹. W sytuacji, gdy białka nie mogą być oznaczane bezpośrednio w systemach komórkowych, rekonstytucja białek w liposomach była również udaną, choć trudną innowacją w zakresie charakterystyki oczyszczonych białek błonowych. Funkcjonalna charakterystyka mitochondrialnych białek transportowych roślin, w tym transporterów substancji rozpuszczonych, takich jak transportery fosforanów w soi, kukurydzy, ryżu i rzodkiewniku, nośnik dikarboksylanowo-trikarboksylowy u Arabidopsis, została osiągnięta przy użyciu tego systemu modelowego^20,21. Jednak w eksperymentach rekonstytucji stwierdzono, że rekombinowane białka pomidora SICAT9 nie działają, a inni członkowie rodziny transporterów CAT są niefunkcjonalni w testach oocytów Xenopus²². W związku z tym potrzebne są dodatkowe narzędzia molekularne do scharakteryzowania transporterów błonowych.

W E. coli^{23 znajduje się pięć systemów transportu poliamin}. Obejmują one dwa transportery ABC pośredniczące w wychwytywaniu spermidyny i putrescyny, wymiennik putrescyna/ornityna, wymiennik kadaweryna/lizyna, eksporter spermidyny i importer putrescyny. Wymiennik putrescyny PotE został pierwotnie scharakteryzowany za pomocą testu pęcherzykowego, w którym pęcherzyki wywrócone na lewą stronę zostały przygotowane przez lizę komórek za pomocą prasy francuskiej i pomiar wychwytu znakowanej radioaktywnie putrescyny do pęcherzyków w zamian za ornitynę²⁴. Testy pęcherzykowe wykorzystano również do scharakteryzowania transportera wapnia, który pośredniczył w transporcie wapnia w odpowiedzi na gradient protonów²⁵. Eksperymenty te skłoniły nas do opracowania strategii charakterystyki innych wymienników poliaminowych. Najpierw stworzyliśmy szczep E. coli z niedoborem wymienników PotE i CadB. W tym miejscu demonstrujemy funkcjonalną charakterystykę roślinnego antyportera poliaminowego poprzez ekspresję heterlogiczną w zmodyfikowanym szczepie E. coli, generowanie pęcherzyków błonowych za pomocą prasy francuskiej i testy znakowane radioaktywnie.

Protokół

1. Generacja podwójnie nokautującego mutanta E. coli z transdukcją P1

1. Zmutowane szczepy E. coli z pojedynczym nokautem ΔPotE i ΔCadB należy uzyskać z Centrum Zasobów Genetycznych E. coli (http://cgsc.biology.yale.edu).
   nuta: Szczep ΔPotE jest odporny na kanamycynę²⁶, a szczep ΔCadB jest odporny na tetracyklinę²⁷.
2. Zbuduj szczep PotE/CadB z podwójnym nokautem (DKO) przy użyciu protokołu transdukcji P1²⁸.
   1. Przygotowanie lizatu
      1. Rozcieńczyć nocną hodowlę ΔPotE w świeżym LB (1:100) uzupełnionym 10-25 mM MgCl₂, 5 mM CaCl₂ i 0,1-0,2% glukozy.
      2. Rosnąć w temperaturze 37 °C przez 1-2 godziny.
      3. Dodać 40 μl lizatu fagowego P1 do kultury i kontynuować wzrost w temperaturze 37 °C. Monitorować przez 1-3 godziny, aż hodowla ulegnie lizie
         UWAGA: Gdy kultura jest poddawana lizie, w probówce będą widoczne resztki komórkowe, a kultura będzie miała znaczną utratę zmętnienia.
      4. Dodaj kilka kropli chloroformu (50-100 μl) do lizatu i wiruj. Wirować przy 12 000 x g przez 2 minuty w celu usunięcia resztek komórkowych i przeniesienia supernatantu do świeżej probówki.
   2. Transdukcji
      1. Uprawiaj szczep ΔCadB przez noc na podłożu LB.
      2. Zebrać komórki przez odwirowanie przy 4 000 x g przez 2 minuty i ponownie zawiesić w 1/5-1/3 zebranej objętości kultury w świeżym LB uzupełnionym 100 mM_MgSO4 i 5 mM CaCl₂.
      3. Dodać zawiesinę komórek ΔCadB do probówki z fagiem z kroku 1.2.1.4 i szybko wymieszać.
      4. Dodać 200 μl 1 M cytrynianu na-cytrynianu (pH 5,5), a następnie dodać 1 ml LB. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę, aby umożliwić ekspresję markera oporności na antybiotyki.
      5. Wiruj komórki przy 4000 x g przez 5 min.
      6. Zawiesić ponownie w 100 μl LB uzupełnionym 100 mM cytrynianem na-cytrynianu (pH 5,5) i dobrze zmieszać, aby rozproszyć komórki.
      7. Wybierz rekombinowane szczepy na płytkach agarowych LB z 50 μg/ml kanamycyny i 10 μg/ml tetracykliny, a następnie potwierdź reakcją łańcuchową polimerazy (PCR) z odpowiednimi starterami^26,27.
      8. Zweryfikuj fragmenty PCR przez sekwencjonowanie.

2. Ekspresja genu docelowego (AtBAT1) w zmutowanym E. coli

1. Amplifikuj pełną długość sekwencji genu docelowego metodą PCR i wprowadź do wektora wejściowego bramki pENTR/D-TOPO²⁹.
   nuta: W tym przypadku ATBAT1.1 amplifikowano za pomocą startera do przodu 5'CGGCGATCAATCCTTTGTT i startera wstecznego 5'GCTAAGAATGTTGGAGATGG, początkowej denaturacji w temperaturze 98 °C przez 2 min, a następnie 30 cykli denaturacji w temperaturze 98 °C przez 0,1 min, wyżarzania w temperaturze 59 °C przez 0,3 min, przedłużania w temperaturze 72 °C przez 0,40 min i końcowego przedłużania w temperaturze 72 °C przez 10 min. Produkt PCR oczyszczono przy użyciu zestawu do czyszczenia PCR, oznaczonego ilościowo za pomocą spektrometru. Wprowadzenie produktu PCR do wektora Gateway odbyło się zgodnie ze wskazówkami producenta.
   1. Przekształć wektor wejściowy w kompetentne komórki Top10 E. coli za pomocą szoku termicznego i wybierz udane rekombinanty na pożywkach LB z 50 μg / ml kanamycyny zgodnie ze standardowymi protokołami klonowania molekularnego³⁰.
   2. Wyodrębnij plazmidowe DNA za pomocą zestawu do ekstrakcji plazmidu, postępując zgodnie ze wskazówkami producenta i sekwencją, aby potwierdzić prawidłowe wprowadzenie.
2. Przenieś gen docelowy do wektora docelowego E. coli, pBAD-DEST49 przez klonowanie Gateway LR, aby utworzyć wektor wyrażenia²⁹.
   1. Przekształć wektor ekspresyjny w kompetentne komórki Top10 E. coli przez szok termiczny przez 30 s i wybierz udane rekombinanty na pożywce LB z 100 μg / ml ampicyliny³⁰.
   2. Wyodrębnij plazmidowe DNA³⁰ i sekwencjonuj, aby potwierdzić poprawną insercję.
3. Przekształć wektor ekspresji w E. coli ΔpotE740(del)::kan, ΔcadB2231::Tn10 i wybierz na płytkach LB z ampicyliną, kanamycyną i tetracykliną³⁰.
4. W celu określenia optymalnego stężenia arabinozy do indukcji, należy spryskać gen docelowy pod kontrolą promotora araBAD w pożywkach LB z gradientowymi stężeniami arabinozy, jak opisano²⁹.
5. Zbierz osady komórkowe i oceń ekspresję białka za pomocą SDS-PAGE i wizualizacji prążków białkowych zgodnie z opisem w instrukcji produktu²⁹.
   nuta: Jako próbkę kontrolną bez ekspresji BAT1 użyto E. coli ΔpotE740(del)::kan, ΔcadB2231::Tn10. Zmutowane komórki E.coli z podwójnym nokautem z pustym wektorem pBAD-DEST49 nie były stosowane jako kontrola ze względu na obecność genu ccdB w wektorze.

3. Wytwarzanie pęcherzyków błonowych na lewą stronę

1. Hodowla zmutowanych komórek E. coli wykazujących ekspresję białka docelowego poprzez wyhodowanie pojedynczej kolonii przez noc w 5 ml pożywki wolnej od poliaminy (2% glicerolu, 6 g_K2HPO₄, 3 g KH₂PO₄, 0,5 g NaCl, NH₄Cl, 50 mg tiaminy, 0,79 g drożdży kompletne syntetyczne pożywki hemisulfian adeniny (10 mg / L), L-arginina (50 mg/L), kwas L-asparaginowy (80 mg/L), L-chlorowodorek histydyny jednowodny (20 mg/L), L-leucyna (100 mg/L), chlorowodorek L-lizyny (50 mg/L), L-metionina (20 mg/L), L-fenyloalanina (50 mg/L), L-treonina (100 mg/L), L-tryptofan (50 mg/L), L-tyrozyna (50 mg/L), L-walina (140 mg/L), Uracyl (20 mg/L)). Przenieś tę kulturę do 500 ml pożywki bez poliaminy uzupełnionej 0,0002% arabinozy i hoduj, aż kultura komórkowa osiągnie OD₆₀₀ 0,6-0,8 (zwykle ~5 godzin).
2. Zebrać osad komórkowy przez odwirowanie w stężeniu 2 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Zawiesić osad i przepłukać trzykrotnie 0,1 M buforem fosforanu potasu o pH 6,6, zawierającym 10 mM EDTA (bufor 1). Ostateczna objętość komórek w buforze 1 po trzecim wirowaniu powinna wynosić 10 ml.
3. Wygeneruj pęcherzyki błonowe od wewnątrz na zewnątrz przez obróbkę French Press (10 000 psi) nienaruszonych komórek za pomocą 35 ml francuskiej komory ciśnieniowej.
4. Przed załadowaniem próbki do standardowej francuskiej komory ciśnieniowej należy nasmarować tłok i pierścienie uszczelniające o przekroju okrągłym, aby ułatwić włożenie do ogniwa.
   nuta: Poniższe instrukcje dotyczą korzystania ze standardowej komory ciśnieniowej³¹.
   1. Ostrożnie wkręć zatyczkę zamykającą w dolny koniec ogniwa. Upewnij się, że komórka jest skierowana prawą stroną do góry zgodnie z literą z boku komórki. Włóż tłok do komórki i przenieś go do komórki, aż linia maksymalnego napełnienia tłoka dotrze do górnej części tłoka. Odwróć urządzenie i umieść je na dostarczonym stojaku między trzema słupkami.
   2. Wlać zawiesinę komórkową do korpusu komórki.
      nuta: Do tej pory zużywaliśmy tylko 10 ml, więc we francuskiej komorze ciśnieniowej o pojemności 35 ml zostanie jeszcze dużo miejsca.
   3. Zamontuj standardową komorę ciśnieniową na francuskim zespole komory ciśnieniowej.
      1. Najpierw sprawdź, czy zasilanie jest wyłączone. Po lewej stronie panelu znajduje się przełącznik wyboru proporcji. Ma trzy pozycje: Dół na końcu cyklu, Niska do korzystania z mniejszej celi ciśnieniowej i Wysoka do użytku ze standardową francuską komorą ciśnieniową. Jeśli prasa francuska była wcześniej używana z mniejszą komórką, tłok może nie być całkowicie cofnięty. Ustaw ten przełącznik w pozycji W dół.
   4. Włącz maszynę za pomocą przełącznika na RHS z tyłu urządzenia i ustaw przełącznik Pauza-Praca w pozycji Praca. Spowoduje to całkowite cofnięcie tłoka. Przesuń przełącznik z powrotem do pozycji Pauza i wyłącz urządzenie.
   5. Poluzuj radełkowane i przesuń na bok zacisk zabezpieczający, który obejmuje dwie kolumny ze stali nierdzewnej. Wychyli się w prawo. Jedną ręką trzymając podstawę korka zamykającego na miejscu, podnieś francuską komorę ciśnieniową obiema rękami i obróć ją o 180°, tak aby tłok znalazł się teraz w pozycji pionowej. Ustaw go na platformie i przesuń zacisk bezpieczeństwa z powrotem na miejsce, tak aby ten zacisk utrzymywał francuską komorę ciśnieniową na miejscu.
   6. Należy pamiętać, że zespół zaworu przepływowego na korku zamykającym musi być dostępny dla operatora i umieszczony tak, aby zawór można było swobodnie obracać. Otwórz zespół zaworu przepływowego, wykonując kilka obrotów w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara. Ustawić ramiona tłoka tak, aby były zorientowane w pozycji godziny drugiej i ósmej. Dokręć skrzydełkowe tak, aby standardowa komora ciśnieniowa została utrzymana na miejscu.
   7. Włóż rurkę wylotową próbki do zatyczki zamykającej i podłącz krótki kawałek elastycznej rurki, aby uszkodzone resztki komórek można było zebrać w probówce Falcon. Zwykle używamy zlewki wypełnionej lodem o pojemności 300 ml, aby utrzymać rurkę sokoła w pozycji pionowej i utrzymać resztki komórek w chłodzie.
   8. Upewnij się, że przełącznik Pauza-Praca jest ustawiony w pozycji Pauza, a zespół zaworu jest w pozycji otwartej. Włącz maszynę z powrotem, ustaw przełącznik wyboru proporcji w pozycji wysokiej i przekręć zawór zwiększania ciśnienia na panelu przednim w prawo o około pół obrotu.
   9. Tłok zacznie unosić się od podstawy, aby wyprzeć powietrze w komorze. Skierować powietrze wychodzące z rurki Tygon podłączonej do rurki wylotowej próbki do rurki w zlewce.
   10. Gdy wypłyną pierwsze krople płynu, zamknij zespół zaworu przepływowego, obracając go zgodnie z ruchem wskazówek zegara. W ten sposób powstaje uszczelnienie metal-metal z ogniwem ciśnieniowym, więc nie dokręcaj zbyt mocno.
   11. Z przodu French Press znajduje się wykres na przednim panelu, który wytwarza odpowiednie ciśnienie na komórkach biologicznych wewnątrz komory ciśnieniowej. W takim przypadku zwiększ ciśnienie, obracając zawór zwiększający ciśnienie zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aż manometr osiągnie 640 psi. Spowoduje to wytworzenie ciśnienia wewnętrznego o wartości 10 000 psi.
   12. Gdy ogniwo osiągnie ciśnienie docelowe, otwórz lekko zespół zaworu przepływowego, obracając go w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara. Wyreguluj otwarcie zaworu, aby umożliwić przepływ tylko około 10 kropli na minutę.
   13. Gdy linia zatrzymania na korpusie tłoka osiąga górną część komory przepływowej. Przełącz przełącznik Pauza-Uruchom w pozycji Pauza. Ma to kluczowe znaczenie, ponieważ włożenie tłoka głębiej w ogniwo spowoduje uszkodzenie urządzenia. Otwórz zespół zaworu przepływowego i zbierz pozostałe krople.
   14. Ustaw przełącznik Selektor proporcji w pozycji W dół, a następnie ustaw przełącznik Pause Run (Wstrzymaj bieg) w pozycji Run (Biegnij). Gdy dolna płyta jest całkowicie schowana, ustaw przełącznik Run w pozycji Pauza i wyłącz maszynę.
   15. Wyjmij francuską komórkę ciśnieniową z prasy francuskiej i zdemontuj w celu czyszczenia. Przechowuj wszystkie części w suchym miejscu, lekko przykrywając glicerolem. Usuń i wymień wszelkie uszczelki lub uszczelki noszące ślady zużycia.
5. Usunąć nieuszkodzone komórki i resztki komórek eluentu z prasy francuskiej przez odwirowanie w temperaturze 10 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Wyrzucić osad i przenieść supernatant do probówek ultrawirówek.
6. Pęcherzyki membranowe osadu z otrzymanego supernatantu przez ultrawirowanie w temperaturze 150 000 g przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.
7. Przemyć pęcherzyki membranowe raz, bez ponownego zawieszania, w 1 mM tris-maleinianu o pH 5,2 zawierającym 0,14 M KCl, 2 mM 2-merkaptoetanolu i 10% glicerolu i ponownie zawiesić w tym samym buforze (Buffer 2)²³ za pomocą młynka do tkanek Dounce. Zazwyczaj frakcja błonowa z 500 ml kultury byłaby zawieszona w 5 ml buforu o stężeniu 5-10 mg białka błonowego / ml przy użyciu testu kwasu biochińskiego < klasa sup = "xref">32.
8. Przechowywać 100 μl porcji preparatów membranowych w temperaturze -80 °C w probówkach do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.

4. Western Blot i orientacja testu transportera

1. Umyj i ponownie zawieś pęcherzyki z kroku 3,7 w 30 mM Tris pH 7,8 + 0,1 mM CoCl₂.
2. Do 100 μl próbek dodać 1 μl karboksypeptydazy A o stężeniu 2 mg/ml w 0,1 M NaCl, 30 mM Tris, 0,2 mM CoCl₂ pH 7,8.
3. Inkubować przez 20 minut w temperaturze 20 °C. Zatrzymać trawienie, dodając 5 μl 0,5 M NaEDTA, 0,5 M 2-merkaptoetanolu o pH 7,5.
4. Aby całkowicie dezaktywować enzym, inkubować roztwór przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
   nuta: Jako kontrolę stosowano pęcherzyki bez leczenia katboksypeptydazą A.
5. Analizować próbki metodą elektroforezy w obecności dodecylosiarczanu litu. Dodać 5-10 μl 150 mg/ml dodecylowego siarczanu litu, 450 mg/ml glicerolu, 0,1 mg/ml błękitu bromofenolowego, 0,4 M Tris pH 7,5 do 100 μl próbki.
6. Przeprowadzić immunoblotting, kładąc filtr nitrocelulozowy zwilżony 25 mM wodorofosforanem sodu o pH 7,5 na żelu poliakrylamidowym. Umieść je między dwoma zwilżonymi filtrami celulozowymi, a na końcu między dwoma zwilżonymi plastikowymi gąbkami do szorowania. Umieścić ten zestaw między elektrodami komory zawierającej 25 mM wodorofosforanu sodu o pH 7,5 w temperaturze 2-4 °C.
7. Pozostawić elektrotransfer białek przez 3 godziny przy napięciu 20 V i natężeniu 2-3 A.
8. Zablokuj membranę nitrocelulozową na noc w temperaturze 2 °C w buforze blokującym 0,15 M NaCl, 10 mM Tris, pH 7,5 i 0,5 mg/ml Tween 20³³.
9. Inkubować filtr nitrocelulozowy przez 2 godziny w rozcieńczeniu 1:5000 przeciwciała Anti-His (C-terminal)-HRP w buforze blokującym (20 ml) i przemywać dwukrotnie 50 ml buforu przez łącznie 60 minut.
10. Aby uwidocznić immunoblot, rozpuść 6 mg 4-chloro-1-naftolu w 20 ml denaturatu alkoholu i dodaj 80 ml 15 mM Tris pH 7,5 i 50 μL 30% H₂O₂ . Kąpać bibułę filtracyjną w roztworze podłoża przez 20 minut. Odczynnik zareaguje z przeciwciałem, tworząc niebieski osad na membranie nitrocelulozowej. Gdy rozwinie się wystarczający kolor, spłucz membranę wodą i pozostaw do wyschnięcia.

5. Test transportu

1. Inkubować 100 μl porcji pęcherzyków błonowych w temperaturze 12 °C przez 5 minut.
2. Rozpocząć transport, dodając do pęcherzyków błonowych znakowane radioizotopowo poliaminy o końcowym stężeniu 50 μM (o ile nie zaznaczono inaczej). Przygotuj ³roztwory substratu H (spermidyna lub putrescyna) w buforze testowym składającym się z 10 mM Tris-HCl, 10 mM fosforanu potasu, pH 8,0 i 0,14 M KCl²³ (Bufor 3) z modyfikacjami w zależności od testu.
3. Przeprowadzać testy transportowe przez 1 minutę w temperaturze 12 °C w probówkach do mikrofuge o pojemności 1,5 ml.
4. Po upływie 1 minuty przenieść mieszaniny reakcyjne do kolektora filtracyjnego i przefiltrować przez filtr membranowy nitrocelulozowy o wielkości 0,45 μm.
   1. Dodać 3 ml lodowatego buforu testowego zawierającego 10-krotnie wyższe stężenie nieznakowanych poliamin, a następnie 3 ml buforu testowego bez poliamin w celu zmniejszenia niespecyficznego wiązania.
   2. Przenieść umyte filtry do jednorazowych fiolek scyntylacyjnych o pojemności 20 ml zawierających 10 ml cieczy scyntylacyjnej i określić radioaktywność za pomocą licznika scyntylacyjnego cieczy. Licznik scyntylacyjny mierzy radioaktywność w próbce i podaje ją jako rozpady na minutę (dpm).
5. Obliczyć wychwyt netto poliaminy jako różnicę między wychwytem po 1 minucie przez pęcherzyki inkubowane w temperaturze 12 °C a wychwytem po 0 minutach przez pęcherzyki inkubowane na lodzie.
   nuta: Masę substratu importowanego do pęcherzyków oblicza się w następujący sposób. Jeśli objętość próbki w probówce do mikrofuge wynosi 0,2 μL, a początkowe stężenie substratu wynosi 100 μM, to całkowita masa substratu w probówce do mikrofuge wynosi 20 x ^10-12 M. Ze względu na bardzo wysoką aktywność właściwą komercyjnie znakowanych substratów (często 2,22 x 10⁹ dpm/mM) masa dodanego izotopu może być pominięta w obliczeniach. Tak więc, jeśli całkowita ilość izotopu, która została dodana do probówki mikrofuge, wynosiła 100 x 10⁶ dpm, a pęcherzyki miały pobór netto 1,000 dpm, to całkowita masa substratu pobranego przez pęcherzyki wynosiła 1% całkowitej liczby moli substratu lub 2 x ^10-13 M.
   1. Oznaczyć K_m dla substratu, mierząc wychwyt 10, 25, 50, 250 i 500 μM znakowanego radioaktywnie substratu do pęcherzyków wykazujących ekspresję białka docelowego. Oblicz kinetykę Michaelisa-Mentena przy użyciu metody regresji nieliniowej przy użyciu modelu Michaelisa Mentona pakietu oprogramowania statystycznego³⁴.
6. W przypadku doświadczeń konkursowych dodać 100 μM, 500 μM, 1 mM, 1,5 mM lub 2 mM nieznakowanego konkurencyjnego substratu wytworzonego w buforze testowym do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml zawierającej 100 μl pęcherzyków w temperaturze 12 °C.
   1. Dodać jednocześnie znakowany radioizotopowo poliaminę (50 μM) do probówki mikrowirówkowej.
   2. Zmierzyć radioaktywność uwięzioną wewnątrz pęcherzyków, jak wspomniano powyżej, powtarzając kroki od 5 do 5.4.2.
   3. Określić pozorne K_m (K_{m, app}) dla konkurencyjnych substratów, mierząc wychwyt 10, 25, 50, 250 i 500 μM znakowanych radioizotopem poliamin w obecności 100 μM lub więcej nieznakowanego substratu i stosując metodę regresji nieliniowej do wykreślenia krzywej.

Wyniki

Główne kroki w tym protokole są podsumowane obrazowo w Rysunek 1. Krótko mówiąc, komórki E. coli z niedoborem wszystkich wymienników poliaminowych i wykazującymi ekspresję AtBAT1 są hodowane, odwirowywane, przemywane buforem i poddawane lizie komórek za pomocą prasy francuskiej. Liza ma tendencję do wytwarzania pęcherzyków, które są w większości wywrócone na lewą stronę i zatrzymują bufor na zewnątrz komórek. Resztki komórek są usuwane przez...

Dyskusja

W niniejszym badaniu przedstawiamy metodę charakterystyki antyportera poprzez najpierw ekspresję białka w E. coli , a następnie generowanie pęcherzyków błonowych, tak aby heterologicznie wyrażane białko można było oznaczyć w systemie bezkomórkowym. Oprócz sprzętu znajdującego się w większości laboratoriów biologii molekularnej, strategia ta wymaga użycia prasy francuskiej, ultrawirówki i dostępu do obiektu do przeprowadzania testów radioizotopowych.

Podstawowym wymogiem tej techniki j...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
2-merkaptoetanol	Sigma-Aldrich	M6250
3H-putrescyna	PerkinElmer	NET185001MC
3H-spermidyna	PerkinElmer	NET522001MC
4-chloro-1-naftol	Sigma-Aldrich	C8890
14C arginina	Moravek Inc.	MC137
Arginina	Sigma-Aldrich	A-5006
Przeciwciało anty-His (C-term)-HRP	ThermoFisher	R931-25	Wykrywa C-końcowy znacznik polihistydyny (6xHis), wymaga wolnej grupy karboksylowej do wykrycia
Arabinoza	BCA Sigma-Aldrich A3256
	ThermoFisher	23227	Pierce BCA zestaw.
Błękit bromofenolowy	Bio-Rad	161-0404
Karboksypeptydaza B	Sigma-Aldrich	C9584-1mg
Wirówka	Sorvall		SS-34 o stałym kącie nachylenia i GA-6 o stałym kącie
rozdrabniania Młynek do tkanek	LabGenome	7777-7	Corning 7777-7 homogenizator pyrexowy z dziobkiem.
Ecoscint-H	National Diagnostics	LS275	scyntylacyjny
EDTA	Sigma-Aldrich
Kolektor filtracyjny	Hoefer	FH225V
Francuska komórka ciśnieniowa	Glen Mills	FA-080A120
Glutaminian	Sigma-Aldrich	G6904
Oprogramowanie
Nadtlenek wodoru	KROGER
Chlorek potasu	J.T. Baker	3040-01
Licznik scyntylacyjny cieczy	Beckman	LS-6500
Maleate	Sigma-Aldrich	M0375
Nanodrop	ThermoFisher
Filtry membranowe nitrocelulozowe	Merck Millipore	hawp02500	0,45 i mikro;
Zestaw do czyszczenia M PCR	Genscript		QuickClean II
Fosforan potasu dwuzasadowy	ThermoFisher	P290-500
putrescyna	fluka	32810
Fosforan potasu jednozasadowy	J.T.Baker	4008
Spermidyna	Sigma-aldrich	S2501
Szczepy: E. coli i Delta; potE740(del)::kan, Δ cadB2231::Tn10	Ten manuskrypt	dostępny na żądanie.	Niedobór szczepu występuje w wymiennikach poliaminowych PotE i CadB.
Tris-base	Research Products	T60040-1000
Ultrawirówka	Sorvall MTX 150	46960	Thermo Fisher S150-AT z wirnikiem o stałym kącie
Probówki do ultrawirówek	ThermoFisher	45237	Probówki wirówkowe do wirnika S150-AT
Wektor: pBAD-DEST49	Wektor wyrażenia ThermoFisher Gateway dla E. coli