Izolacja podzbiorów makrofagów i komórek zrębu z próbek mięśnia sercowego u ludzi i myszy

Podsumowanie

Prezentowany tutaj jest protokół izolowania różnych podzbiorów makrofagów i innych komórek nieimmunologicznych z mięśnia sercowego ludzkiego i mysiego poprzez przygotowanie zawiesiny pojedynczej komórki poprzez trawienie enzymatyczne. Przedstawiono również schematy bramkowania do identyfikacji i charakterystyki izolowanych makrofagów w oparciu o cytometrię przepływową.

Streszczenie

Makrofagi reprezentują najbardziej heterogeniczne i obfite populacje komórek odpornościowych w sercu i odgrywają kluczową rolę w wywoływaniu stanów zapalnych i reakcjach naprawczych po urazie serca. Sposób, w jaki różne podzbiory makrofagów koordynują odpowiedzi immunologiczne po urazie serca, jest aktywnym obszarem badań. Przedstawiono tutaj prosty protokół, który nasze laboratorium wykonuje rutynowo, w celu ekstrakcji makrofagów z próbek mięśnia sercowego myszy i ludzi uzyskanych od osób zdrowych i chorych. Krótko mówiąc, protokół ten obejmuje enzymatyczne trawienie tkanki serca w celu wytworzenia zawiesiny pojedynczej komórki, a następnie barwienie przeciwciał i cytometrię przepływową. Technika ta nadaje się do testów funkcjonalnych wykonywanych na posortowanych komórkach, a także do sekwencjonowania RNA masowych i jednokomórkowych. Główną zaletą tego protokołu jest jego prostota, minimalna codzienna zmienność i szerokie zastosowanie, umożliwiające badanie heterogeniczności makrofagów w różnych modelach mysich i ludzkich jednostkach chorobowych.

Wprowadzenie

Makrofagi reprezentują najliczniejszy typ komórek odpornościowych w sercu i odgrywają znaczącą rolę w generowaniu silnych reakcji zapalnych i naprawczych po urazie serca^1,2,3,4. Wcześniej nasza grupa zidentyfikowała dwa główne podzbiory makrofagów w mysim sercu, pochodzące z różnych źródeł rozwojowych^5,6. Ogólnie rzecz biorąc, można zidentyfikować odrębne populacje podzbiorów makrofagów sercowych rezydujących w tkankach na podstawie ekspresji CCR2 (receptor chemokiny z motywem C-C 2). Makrofagi CCR2 (ekspresja powierzchni komórki: CCR2-MHCII^niska i^{CCR2-MHCII wysoka}) są pochodzenia embrionalnego (linie pierwotne i erytromieloidalne), zdolne do samoodnawiania się i reprezentują populację dominującą w warunkach homeostazy. Makrofagi rezydentne CCR2 ⁺ są ostatecznego pochodzenia hematopoetycznego, są utrzymywane poprzez rekrutację z krążących monocytów i reprezentują niewielką populację w warunkach homeostatycznych. Funkcjonalnie, makrofagi CCR2^- generują minimalny stan zapalny i mają kluczowe znaczenie dla rozwoju naczyń wieńcowych regeneracja serca noworodków^5,7. W przeciwieństwie do tego, makrofagi CCR2⁺ inicjują silne reakcje zapalne po urazach serca i przyczyniają się do pobocznego uszkodzenia kardiomiocytów, niekorzystnej przebudowy lewej komory i progresji niewydolności serca^8,9.

Ostatnio wykazaliśmy, że ludzki mięsień sercowy zawiera również dwa odrębne podzbiory makrofagów zidentyfikowane podobnie jak CCR2^- lub CCR2⁺⁸. Ekspresja genów i analizy funkcjonalne wykazały, że ludzkie makrofagi ^{CCR2 i} CCR2⁺ reprezentują funkcjonalnie rozbieżne podzbiory i są funkcjonalnie analogiczne do makrofagów ^{CCR2 i} CCR2⁺ znajdujących się w sercu myszy. Ludzkie makrofagi CCR2^- wyrażają silne poziomy czynników wzrostu, w tym IGF1, PDGF, Cyr61 i HB-EGF. Makrofagi CCR2⁺ są wzbogacone w chemokiny i cytokiny sprzyjające zapaleniu, takie jak IL-1b, IL-6, CCL-2, CCL-7 i TNF-a. Stymulowane makrofagi CCR2⁺ wydzielają znacznie wyższe poziomy cytokiny zapalnej interleukiny-1β (IL-1β) w hodowli. To, w jaki sposób te podzbiory w różny sposób przyczyniają się do naprawy tkanek i przebudowy lewej komory (LV) w kontekście uszkodzenia serca, pozostaje obszarem aktywnych badań.

Analiza heterogeniczności makrofagów w sercu myszy i człowieka oparta na cytometrii przepływowej wymaga trawienia tkanki serca i wytworzenia zawiesiny pojedynczej komórki, a następnie analizy cytometrycznej przepływowej lub sortowania komórek do dalszych procesów, takich jak sekwencjonowanie masowego RNA/sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki lub hodowla komórek do testów funkcjonalnych. Oryginalny protokół wytwarzania zawiesiny pojedynczej komórki z mysich serc został po raz pierwszy opisany przez grupę Nahrendorfa w Nahrendorf et al. 2007¹⁰. Nasze laboratorium dostosowało i zmodyfikowało protokół ekstrakcji makrofagów z ludzkiego mięśnia sercowego. Korzystając z tego samego protokołu, ale z niewielkimi modyfikacjami w schemacie barwienia i bramkowania, można również pobrać ^{komórki zrębu} CD45 z ludzkiego mięśnia sercowego. Przedstawiony tutaj, w tekście i filmie, jest protokołem, który jest wykonywany rutynowo w celu ekstrakcji makrofagów lub zrębu z ludzkiego mięśnia sercowego.

Próbki tkanek serca są pobierane od dorosłych pacjentów z kardiomiopatią rozstrzeniową (DCM: idiopatyczną lub rodzinną) lub kardiomiopatią niedokrwienną (ICM) poddawanych implantacji urządzenia wspomagającego lewą komorę (LVAD) lub przeszczepowi serca. Eksplantowane serca lub rdzenie LVAD są donaczyniowo perfundowane zimną solą fizjologiczną przed rozpoczęciem procedury trawienia. Należy zauważyć, że "jakość" próbki tkanki określona pod kątem stopnia bliznowacenia lub naciekania tkanki tłuszczowej może mieć duży wpływ na wydajność makrofagów. Próbki serca z dużymi obszarami bliznowacenia będą miały znacznie niższą wydajność komórek i mogą stanowić poważne ograniczenie techniczne, gdy pożądane metody dalszej analizy wymagają hodowli komórek in vitro.

Protokół

Przedstawiony protokół został zatwierdzony przez Washington University in St. Louis Institutional Review Board (#201305086). Wszyscy uczestnicy wyrażają świadomą zgodę przed pobraniem próbki, a eksperymenty są przeprowadzane zgodnie z zatwierdzonym protokołem badania. Prezentowany protokół jest wykonywany za zgodą Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Washington University School of Medicine i jest zgodny z wytycznymi opisanymi w Przewodniku NIH dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych.

1. Przygotowanie próbek tkanek ludzkiego serca

1. Przepłukać wyczyszczone serca przez kaniulację ujścia lewej i prawej tętnicy wieńcowej i perfuzję 200 ml zimnego soli fizjologicznej.
2. Przepłukać wierzchołkowe tkanki rdzeniowe LVAD przez kaniulację naczynia nasierdziowego i perfuzję 50 ml zimnej soli fizjologicznej.
3. Wypreparuj próbkę tkanki z wierzchołkowej lub bocznej ściany lewej komory w zimnym roztworze soli fizjologicznej lub HBSS za pomocą sterylnych nożyczek.
4. Ostrożnie wypreparuj tłuszcz nasierdziowy i struny ścięgniste z próbki za pomocą cienkich nożyczek.
5. Rozciąć fragmenty tkanek na kawałki o wadze około 200 mg za pomocą sterylnego ostrza lub nożyczek.

2. Przygotowanie Serca Myszy

1. Poddaj mysz eutanazji przez uduszenie CO₂ lub zwichnięcie szyjki macicy.
2. Otwórz klatkę piersiową za pomocą ostrych nożyczek. Użyj hemostatów, aby podnieść serce do góry. Wykonać perfuzję serca zimnym PBS za pomocą igły 25 G dołączonej do strzykawki o pojemności 5 ml. Perfuzuj, aż serce stanie się blanowane.
3. Wyjmij serce i umieść na sterylnej szalce Petriego na lodzie.

3. Przygotowanie zawiesiny pojedynczej komórki

1. Umieść kawałki ludzkiej tkanki serca (~200 mg) lub mysie serce na sterylnej szalce Petriego. Drobno zmiel tkankę za pomocą sterylnego ostrza lub nożyczek.
2. Ustaw trawienie:
   1. Użyj końcowej objętości trawienia 3 ml na fragment ludzkiej tkanki serca (200 mg) lub na jedno mysie serce. Końcowe stężenia enzymów są następujące: kolagenaza1 (450 U/ml), DNaza1 (60 U/ml), hialuronidaza (60 U/ml).
   2. Do każdej reakcji trawienia dodać DMEM i wszystkie enzymy do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Za pomocą czystych kleszczy umieść drobno zmieloną tkankę w każdej probówce reakcyjnej. Dobrze wymieszaj, delikatnie wirując.
3. Trawić przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wytrząsaniem ustawionym na niską lub średnią prędkość mieszania.
4. Po 1 godzinie trawienia wyjąć probówki z inkubatora i umieścić na lodzie. Ustaw stożkowe probówki o pojemności 50 ml z sitkiem o pojemności 40 μm na górze. Zwilżyć filtry 2 ml buforu dezaktywującego enzymy (ED).
5. Dezaktywuj enzymy wytrawiające, dodając 8 ml buforu ED do każdej probówki wytrawiającej. Następnie wlej powstałą mieszaninę o objętości 13 ml przez sitko o pojemności 40 μm do stożkowych probówek o pojemności 50 ml. Przenieść próbki z powrotem do świeżej stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Umożliwia to optymalne granulowanie komórek i minimalizuje ich utratę podczas wirowania.
6. Wirować próbki w temperaturze 400 x g przez 6 minut (wirówka ustawiona na 4 °C). Odrzucić sklarowany osad, pozostawiając 0,5 ml pożywki. Zawiesić osad komórkowy przez delikatne pipetowanie i dodać 1 ml buforu do lizy ACK. Delikatnie zakręć probówką i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 5 minut, aby przeprowadzić lizę czerwonych krwinek (RBC).
7. Po 5 minutach w buforze ACK dodać 9 ml DMEM do próbki. Załóż pokrywkę z powrotem na probówki i delikatnie odwróć probówki, aby się wymieszały, a następnie przefiltruj przez sitko o wielkości 40 μm. Zebrać filtrat do stożkowych probówek o pojemności 15 ml.
8. Odwirować probówki o masie 400 x g przez 6 minut i wyrzucić supernatant.
9. Dodać 1 ml buforu FACS i ponownie zawiesić osad. Następnie przenieść do komórek w buforze FACS do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Ponownie odwirować przy 400 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 100 μl buforu FACS. Zawiesina pojedynczej komórki jest teraz gotowa do barwienia przeciwciałami.

4. Barwienie przeciwciał

1. Typowy ludzki panel przeciwciał składa się z następujących przeciwciał: CD45-PercpCy5.5, CD14-PE, CD64-FITC, HLA-DR-APC/Cy7, CCR2-APC. Proszę zapoznać się z Tabelą 1. Dodać wszystkie przeciwciała do próbek serca w rozcieńczeniu 1:50 i inkubować przez ~30-40 minut w temperaturze 4 °C w ciemności. Przejdź do kroku 4.4 poniżej.
2. W przypadku komórek zrębu (komórki śródbłonka, fibroblasty, komórki mięśni gładkich) dodać DRAQ5 (stężenie końcowe 1 μM) i CD45-percpCy5.5. Proszę zapoznać się z Tabelą 1. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C w ciemności. Przejdź do kroku 4.4 poniżej.
3. W przypadku makrofagów serca mysiego dodaj następujące przeciwciała: CD45-PercpCy5.5, CD64-APC, MHCII-APC/Cy7, CCR2-BV421 i Ly6G-FITC. Proszę zapoznać się z Tabelą 2. Dodać wszystkie przeciwciała do próbek serca w rozcieńczeniu 1:100 i inkubować przez ~30-40 minut w temperaturze 4 °C w ciemności. Przejdź do kroku 4.4 poniżej.
4. Umyć próbki dwukrotnie w buforze FACS. Do każdego przemywania dodać 1 ml buforu FACS, delikatnie odwirować i odwirować przy 400 x g przez 5 minut, ponownie zawiesić w 350 μl buforu FACS i dodać DAPI (1 μM, stężenie końcowe). Próbki są teraz gotowe do analizy/sortowania metodą FACS.

Wyniki

Opisany protokół pozwala na izolację makrofagów z mięśnia sercowego myszy i człowieka. Korzystając z tego samego protokołu, ale z inną strategią barwienia i bramkowania, komórki zrębu można również pobrać z ludzkiego mięśnia sercowego. Przedstawione wyniki FACS zostały uzyskane na platformie BD LSRII lub BD FACS ARIA III. Kontrole kompensacyjne wygenerowano z pojedynczych próbek kontrolnych koloru z barwionych splenocytów. Rysunek 1 pokazuje nieprzetworzony i...

Dyskusja

Protokół pozwala na ekstrakcję różnych podzbiorów makrofagów z ludzkiego mięśnia sercowego. Protokół jest prosty i zajmuje od 3 do 4 godzin, aby przygotować zawiesinę pojedynczej komórki gotową do analizy FACS. Chociaż protokół jest stosunkowo prosty do wykonania, istnieją pewne aspekty techniczne, które należy wziąć pod uwagę, co zminimalizuje zmienność. Po pierwsze, praca w odpowiednim czasie z tkanką ludzką jest niezbędna do optymalnej żywotności komórek. Ważne jest, aby utrzymywać tkankę w zimnym roztworze soli fizjo...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
15 ml Probówki konoczne	Thermo Fisher	14-959-53A
40 µ m Sitka komórkowe	Thermo Fisher	50-828-736
50 ml Rurki stożkowe	Thermo Fisher	352098
ACK Bufor do lizy	Gibco	A10492-01
Albumina surowicy bydlęcej	Sigma	A2058
Kolagenaza 1	Sigma	C0130-1G
DAPI	Thermo Fisher	D1306
DMEM 1x	Gibco	11965-084
DNAse 1	Sigma	D4527-20KU
DRAQ5	Thermo Fisher	62251
EDTA 0,5 M pH 8	Corning	46-034-CI
Bufor			490 ml HBSS, 10 ml FBS, 1 g
BSA FACS Bufor			976 ml PBS, 20 ml FBS, 4 ml EDTA (0,5 M)
Płód Surowica bydlęca	Gibco	A3840201
kleszcze	VWR	82027-406
HBSS 1x	Gibco	14175-079
Hemostatyki	VWR	63042-052
Hialuronidaza typ 1-s	Sigma	H3506-500MG
PBS 1x	Gibco	14190-136
Szalki Petriego	Thermo Fisher
172931 Żyletka	VWR	55411-050
Nożyczki	VWR	82027-578