Artykuł metodologiczny

Przetwarzanie zarodków, skorupek jaj i kultur grzybów do skaningowej mikroskopii elektronowej

DOI:

10.3791/60018

⸱

16 sierpnia 2019

 , 
1Department of Biological Sciences, SUNY Oswego

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy szczegółowe protokoły przetwarzania dla obrazowania delikatnych próbek tkanek za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM). Opisano trzy różne metody przetwarzania, a mianowicie suszenie chemiczne heksametylu disilazana (HMDS), proste suszenie powietrzem i suszenie w punkcie krytycznym dla przygotowania sztywnych skorupek jaj, zarodków we wczesnych stadiach rozwojowych i kultur grzybów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chociaż skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM) jest powszechnie stosowana do ultrastrukturalnej analizy różnych próbek biologicznych i niebiologicznych, metody związane z przetwarzaniem różnych próbek biologicznych wymagają unikalnych praktyk. Wszystkie konwencjonalne praktyki opisane w literaturze dotyczące przetwarzania próbek nadal znajdują użyteczne zastosowania, ale subtelne zmiany w przygotowaniu próbki mogą zmienić jakość obrazu, a także wprowadzić artefakty. W związku z tym do uzyskania dobrej jakości obrazu o rozdzielczości ultrastrukturalnej wymagane jest zastosowanie unikalnej techniki przygotowania próbki specyficznej dla rodzaju analizowanej tkanki. Celem tego badania jest zapewnienie optymalnych protokołów przygotowania próbek do obrazowania zarodków, sztywnych skorupek jaj i kultur grzybów za pomocą SEM. Zalecono następujące optymalizacje, aby uzyskać dobre wyniki dla trzech różnych delikatnych próbek biologicznych badanych. Obowiązkowe jest stosowanie łagodniejszych utrwalaczy, takich jak 4% paraformaldehydu lub 3% aldehydu glutarowego, a następnie odwodnienie serią etanolową. Grzybnia grzybów na blokach agarowych uzyskana przez hodowle szkiełkowe daje lepszą integralność ultrastrukturalną w porównaniu z kulturami pobranymi bezpośrednio z płytek agarowych. Suszenie chemiczne zarodków za pomocą HMDS zapewnia suszenie bez wprowadzania artefaktów napięcia powierzchniowego w porównaniu z suszeniem w punkcie krytycznym. HMDS zapobiega pękaniu spowodowanemu skurczem, ponieważ próbki są mniej kruche podczas suszenia. Jednak w przypadku hodowli grzybów suszenie w punkcie krytycznym zapewnia akceptowalną jakość obrazu w porównaniu z suszeniem chemicznym. Skorupki jaj można obrazować bez specjalnych czynności przygotowawczych, z wyjątkiem dokładnego umycia i wysuszenia na powietrzu przed montażem. Metodologie przygotowania zostały ustandaryzowane w oparciu o akceptowalną jakość obrazu uzyskaną w każdym badaniu.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analiza ultrastrukturalna skaningowego mikroskopu elektronowego (SEM) i obrazowanie wewnątrzkomórkowe uzupełniają mikroskopię świetlną do trójwymiarowego profilowania prokariontów, roślin i zwierząt. Wysoka rozdzielczość przestrzenna SEM sprawia, że jest to jedna z najbardziej wszechstronnych i wydajnych dostępnych technik badania cech mikrostrukturalnych próbek w skali od nanometra do mikrometra. Wysuszone próbki są przekształcane w struktury kompozycyjne i topograficzne z dużą szczegółowością, co stanowi podstawę do wyciągania prawidłowych wniosków na temat relacji funkcjonalnych1,2,3,4,5,6,7,8,9. Podczas interpretacji obrazów SEM próbek biologicznych dużym wyzwaniem jest rozróżnienie między strukturami natywnymi a artefaktami, które powstają podczas przetwarzania. SEM jest zazwyczaj eksploatowany w bardzo wysokich próżniach, aby uniknąć jakichkolwiek zakłóceń ze strony cząsteczek gazu wpływających na pierwotne, wtórne lub wstecznie rozproszone wiązki elektronów emitowane z próbki10,11. Ponadto materiały biologiczne są podatne na uszkodzenia spowodowane promieniowaniem ze względu na ich słabe lub nieprzewodzące właściwości. Istotne jest, aby próbki załadowane do SEM były całkowicie suche i wolne od wszelkich zanieczyszczeń organicznych, aby wyeliminować ewentualne odgazowanie w środowisku wysokiej próżni10,11. Ponieważ okazy biologiczne składają się w większości z wody, wymagane są dodatkowe techniki przygotowawcze, aby zapewnić zachowanie rodzimych struktur.

Uzyskana rozdzielczość opiera się na optymalizacji metod przygotowania specyficznych dla typów próbek i wykorzystywanych parametrów instrumentalnych. W związku z tym konieczne jest unikanie stosowania uogólnionych etapów przetwarzania dla wszystkich typów tkanek. Niektóre próbki biologiczne będą wymagały mniej rygorystycznego przetwarzania, aby zachować ich strukturę, podczas gdy w przypadku delikatnych rodzajów próbek może być potrzebne więcej czasu i ostrożności, aby uniknąć wprowadzania artefaktów wysuszających, takich jak kurczenie się i zapadanie. Przygotowanie próbki jest krytycznym etapem obrazowania SEM; Na wyniki badań morfometrycznych znaczący wpływ mają procedury przygotowania próbek12,13. Typowymi etapami przygotowania wielu próbek biologicznych są utrwalanie, odwadnianie i powlekanie metalem, takim jak złoto, platyna lub pallad, w celu przekształcenia ich powierzchni w przewodzenie do analizy SEM. Charakter i kombinacja zastosowanych kroków będą się różnić w zależności od rodzaju tkanki i konkretnych celów badania. Nagromadzenie ładunku, wrażliwość na próżnię i uszkodzenie wiązką elektronów stwarzają problemy podczas przetwarzania miękkich, delikatnych próbek biologicznych, co wymaga dodatkowych etapów przetwarzania w celu zachowania natywnej struktury obiektu. Stosowanie konwencjonalnych metod, takich jak wiązanie tetratlenku osmu i odwodnienie, powoduje kurczenie się i zapadanie delikatnych tkanek14,15,16,17. Celem pracy jest opracowanie eleganckich metodologii powstałych poprzez połączenie pomysłów z wcześniejszych badań z modyfikacjami w celu przygotowania i zobrazowania miękkich, delikatnych tkanek (np. zarodków, skorupek jaj malowanych żółwi i kultur grzybów).

Wybór odpowiedniej metody mocowania jest pierwszym najważniejszym krokiem do mikroskopowej analizy próbek biologicznych. Utrwalenie tkanek natychmiast po wyizolowaniu z organizmu jest niezbędne, aby zapobiec zmianom w ich morfologii spowodowanym rozkładem. Skuteczny utrwalacz powinien kończyć procesy komórkowe poprzez szybkie przenikanie komórek i nieodwracalne utrzymywanie efektu, aby ustabilizować strukturę próbki, aby wytrzymać zarówno kolejne etapy przetwarzania, jak i badanie w ramach SEM17,18. Chociaż znanych jest kilka chemicznych i fizycznych metod utrwalania, utrwalanie chemiczne jest częściej stosowane w przypadku próbek biologicznych, aby uniknąć zmian komórkowych spowodowanych autolizą, gniciem i efektami suszenia. W literaturze omówiono wiele utrwalających preparatów chemicznych17,19,20,21,22,23, utrwalacze, które działają poprzez denaturację i koagulację makrocząsteczek biologicznych oraz te, które utrwalają się poprzez kowalencyjne sieciowanie makrocząsteczek. Alkohole są stosowane jako utrwalacze denaturujące, które bardzo słabo zachowują ultrastrukturę i są używane głównie do mikroskopii świetlnej i nie są zalecane do analizy mikroskopem elektronowym. Utrwalacze sieciujące, takie jak formaldehyd, aldehyd glutarowy i tetratlenek osmu, tworzą międzycząsteczkowe i wewnątrzcząsteczkowe sieciowanie między makrocząsteczkami w tkankach, zapewniając doskonałe zachowanie ultrastruktur11,24,25,26. Próbki biologiczne są wrażliwe na temperaturę. Zaleca się, aby temperatura na początku wiązania wynosiła 4 °C, aby zmniejszyć boczną ruchliwość białek błonowych, spowolnić dyfuzję cząsteczek międzykomórkowych i spowolnić tempo fiksacji11. Czas potrzebny do utrwalenia tkanek w dużej mierze zależy od wielkości próbki i szybkości, z jaką utrwalacz dyfunduje i reaguje ze składnikami próbki. Utrwalanie przez noc w 4% paraformaldehydzie lub 3% aldehydzie glutarowym w PBS w temperaturze 4 °C jest preferowaną metodą analizy SEM próbek użytych w tym badaniu ze względu na ich sekwencyjne właściwości penetracyjne, które pozwalają na przetwarzanie mniejszych, delikatnych próbek17,18,19,20,27. Etap po utrwaleniu tetratlenkiem osmu został wyeliminowany nie tylko ze względu na jego toksyczny charakter, ale także stwierdzono, że nie zapewnia on żadnych dodatkowych korzyści w zakresie poprawy jakości obrazu próbek analizowanych w tym badaniu.

Próbki biologiczne zawierają płyny, które zakłócają działanie SEM; dlatego próbki muszą być wysuszone przed włożeniem ich do komory na próbki SEM. Po zapewnieniu odwodnienia rozpuszczalnik musi zostać usunięty z tkanki bez tworzenia artefaktów w próbkach z powodu napięcia powierzchniowego/wysuszenia. Trzy różne metody suszenia były powszechnie stosowane podczas przetwarzania tkanek do obrazowania SEM: suszenie powietrzem, suszenie w punkcie krytycznym i liofilizacja próbek28,29,30,31. Niewiele badań podaje, że wszystkie trzy metody suszenia dają identyczne wyniki z próbkami tkanek zwierzęcych28,29,30,31. Ogólną praktyką stosowaną w przypadku mniejszych próbek jest chemiczne odwadnianie za pomocą rosnących serii stężeń alkoholu i heksametyldisilazanu (HMDS), ale większe próbki są suszone przy użyciu przyrządu do suszenia w punkcie krytycznym (CPD)32. Podczas procesu suszenia w małych wnękach powstają znaczne siły, które są przepuszczane przez próbkę przez granicę faz ciecz/gaz; Może to nawet doprowadzić do całkowitego zawalenia się pustych struktur33. Wszelkie deformacje powstałe w wyniku obróbki mogą być wówczas mylone z natywną cechą strukturalną próbki. W związku z tym należy wyeliminować uogólnione zjawisko przetwarzania i ustandaryzować unikalny proces suszenia dla każdego rodzaju tkanki, zwłaszcza gdy analizowane są delikatne próbki tkanek.

W kilku próbach przeprowadzonych przy użyciu różnych kombinacji wszystkich wyżej wymienionych procesów, ustandaryzowaliśmy metody, które mogą być używane do analizy SEM trzech delikatnych tkanek: embrionów, skorupek jaj malowanych żółwi i kultur grzybów. Biolodzy i morfolodzy rozwojowi opisują normalną i nieprawidłową morfogenezę podczas rozwoju zarodka u reprezentatywnych kręgowców. Badania nad szlakami sygnalizacji genów zależą od morfologicznego opisu nowych struktur. Aby uniknąć nagłych zmian w strukturze zarodka kręgowców podczas analizy SEM, zalecamy suszenie chemiczne po odwodnieniu. Suszenie chemiczne przy użyciu HMDS jest stosunkowo nową metodą suszenia, a zalety obejmują względną szybkość, łatwość użycia, utracone koszty oraz ograniczoną wiedzę specjalistyczną i potrzebny sprzęt9. CPD jest powszechnie stosowaną techniką suszenia polegającą na przepuszczaniu CO2 przez próbki w określonej temperaturze i ciśnieniu. Stwierdziliśmy, że HMDS nadaje się do suszenia miękkich, delikatnych tkanek i umożliwia przetwarzanie większych próbek w porównaniu z suszeniem w punkcie krytycznym, które powodowało rozległe deformacje tkanek embrionalnych. Do przygotowania próbek do obrazowania SEM wykorzystano kilka metod w celu zbadania cech morfologicznych grzybów34. Próbki grzybów są zwykle utrwalane w tetratlenku osmu, a następnie odwadniane etanolem i suszenie w punkcie krytycznym, co może zapewnić zadowalające wyniki, chociaż toksyczne działanie tetratlenku osmu 6,7,35 i utrata materiałów grzybowych podczas zmiany roztworów podczas przetwarzania są wyraźnymi wadami. Technika przygotowania próbek przy użyciu suszenia na powietrzu bez utrwalania była również praktykowana36, ale skutkuje skurczonymi i zapadniętymi strukturami, a obserwacja takich okazów może być łatwo błędnie zinterpretowana podczas charakteryzowania gatunku. Strzępka grzybów traci swoją integralność w kontakcie z cieczami, a równomierne wysuszenie może nie być osiągnięte w celu przywrócenia struktury. Ze względu na ten efekt, liofilizacja jest powszechnie stosowana do suszenia tkanek miękkich, takich jak grzybnia. Liofilizacja sprawdza się dobrze w przypadku czystych materiałów, ale obecność jakichkolwiek soli lub wydzieliny zasłania szczegóły powierzchni, które zostaną zidentyfikowane dopiero na etapie oglądania SEM. Połączyliśmy metodę hodowli szkiełkowej z wiązaniem aldehydu glutarowego i suszeniem w punkcie krytycznym, aby uzyskać szczegóły strukturalne nienaruszonych strzępek i zarodników grzybów. Chociaż suszenie CPD powodowało kurczenie się zarodków, skutkowało to dobrze zachowanymi strukturami grzybni w połączeniu z wiązaniem aldehydu glutarowego. Skorupka jaja ma podstawowe znaczenie dla zarodka jajorodnych, ponieważ nie tylko działa jako osłona ochronna, ale także zapewnia stabilność mechaniczną, przepuszczalność gazów i wody oraz rezerwę wapnia dla rozwijającego się zarodka. Skorupki jaj żółwi słodkowodnych są klasyfikowane jako "sztywne" na podstawie ich struktury, a ze względu na ich dostępność spotkały się z dużym zainteresowaniem biologów1,2,3,4,5,6,7,37, 38.

Szczegółowo opisujemy proste metody łatwego badania skorupek jaj i błon skorupek malowanych żółwi, które można zastosować do każdego gatunku skorupy jaja o sztywnej skorupie. Metodologie przygotowania zostały ocenione na podstawie uzyskanej jakości obrazu i zredukowanych potencjalnych artefaktów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Jaja żółwia malowanego (Chrysemys picta) użyte w tym badaniu zostały zebrane podczas sezonu lęgowego od maja do czerwca 2015-16 z Rice Creek Field Station, Oswego New York, za zgodą uzyskaną od Departamentu Ochrony Środowiska Stanu Nowy Jork (DEC).

1. Chemiczna metoda suszenia do przetwarzania zarodków do SEM

  1. Zbieraj jaja żółwi z terenów w okresie lęgowym. Przygotuj wcześniej komory inkubacyjne, wykonane z plastikowych pudełek z pokrywkami (dł. x szer. x wys.) o wymiarach 6,7 cm x 25,4 cm x 10,2 cm wypełnionych podłożem ściółkowym przygotowanym z wilgotnej mieszanki wermikulitu i mchu torfowego (stosunek 1:1). Wykonaj 4-6 otworów o długości około 0,25 cm wzdłuż boków pudełek i na pokrywie, aby umożliwić napowietrzenie.
  2. Delikatnie usuń ziemię z gniazda, aby odsłonić jaja. Przetrzyj powierzchnię jaj żółwi rozcieńczoną nalewką jodową (1:25 000), aby kontrolować zanieczyszczenie mikrobiologiczne podczas inkubacji. Umieść lęgi oddzielnie od siebie, wielkość lęgu pomalowanego żółwia może wahać się od 5-9 jaj i umieść maksymalnie 8-9 jaj w pudełku.
    UWAGA: Ostrożnie obchodź się z jajkami podczas zbierania, wycierania, etykietowania i umieszczania w pudełkach. Pozycja i wyrównanie jaj muszą być takie same, jak zostały złożone, każdy ruch zahamuje rozwój zarodka.
  3. Ręcznie zakopać jaja do połowy w ściółce, przykryć i umieścić pudełko w inkubatorze ustawionym na 30 °C. Inkubuj jaja przez 10-17 dni, aby uzyskać stadia embrionalne odpowiednio 12, 13 i 18 użyte w tym badaniu. Dodawać wodę destylowaną, aby częściowo zwilżyć podłoże ściółkowe co drugi dzień, aby uniknąć odwodnienia i utrzymać poziom wilgoci dla prawidłowego rozwoju zarodków.
    UWAGA: Inkubacja i klasyfikacja zarodków są zgodne z pełną tabelą rozwoju opublikowaną wcześniej39.
  4. Utrwal zarodki, wykonując pierwsze nacięcie po jednej stronie grzbietowej skorupki jaja i błony żółtka razem, pionowo do długiej osi za pomocą spiczastych nożyczek. Ostrożnie włóż nożyczki do żółtka, aby uniknąć przecięcia krążka zarodkowego. Teraz przetnij boczną stronę jajka wzdłuż długiej osi, a następnie odetnij drugą stronę jajka wzdłuż krótkiej osi.
  5. Oderwij wycięty kawałek zarodkiem do góry za pomocą kleszczy. Odciąć drugą boczną stronę skorupki jajka i umieścić wycięty kawałek w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS o pH 7,4).
    UWAGA: Jajo żółwia jest wypełnione żółtkiem o dużej lepkości, a grzbietowa strona zarodka przylega do błony skorupki jaja. Błona skorupki jaja w pobliżu zarodka zmienia się wraz z inkubacją z półprzezroczystej bieli na nieprzezroczystą, kredowo-białą. Pozwala to na zlokalizowanie zarodka w środku długiej osi i bycie widzianym jako ciemna, zwapniała plama z zewnątrz40,41.
  6. Użyj mikroskopu stereoskopowego, aby wyizolować zarodki wraz z błoną żółtka, obierając je ze skorupki jajka za pomocą kleszczy. Usuń błony pozazarodkowe za pomocą kleszczy i mikronożyczek. Przenieś zarodek za pomocą łyżki do zarodków do świeżego PBS na szalce Petriego, aby zmyć krew lub żółtko.
  7. Użyj przezroczystych 12-dołkowych płytek, aby utrwalić zarodki przez noc w 4% paraformaldehydzie w PBS w temperaturze 4 °C lub w 2-3% aldehydzie glutarowym w PBS. Umieść od jednego do trzech zarodków w każdym dołku, w zależności od wielkości zarodków. Zapewnić pełną infiltrację (próbki będą wydawały się białe) w przypadku starszych zarodków, wydłużając czas utrwalenia o 2-3 dni. Opłucz zarodki 3x świeżym PBS przez 5 minut przy każdym płukaniu.
    UWAGA: Unikaj uszkadzania powierzchni zarodka poprzez stosowanie wkładek polistyrenowych z dnem z siatki poliestrowej do płytek 12-dołkowych do przenoszenia próbek z jednego rozpuszczalnika do drugiego.
  8. Odwodnić próbki, stosując serię stężeń etanolu w wodzie destylowanej: 30%, 50%, 70%, 80%, 95% i 100% i traktować próbki przez 1 godzinę w każdym roztworze odwadniającym. Powtórz ten krok ze 100% etanolem dwa razy, aby zapewnić całkowite odwodnienie. W przypadku natychmiastowego użycia próbki należy przechowywać przez dłuższy czas w 70% etanolu w temperaturze -20 °C.
  9. Suszenie zarodków za pomocą serii heksametyldisilazana (HMDS) do 100% stężenia etanolu: 1:2, 2:1 i 100%. Pozostawić próbki w każdym roztworze na 20 minut i utrzymywać szalkę Petriego częściowo przykrytą podczas procesu.
    UWAGA: Wszystkie czynności związane z HMDS należy wykonywać w dygestoriach z niezbędnym sprzętem ochrony osobistej, ponieważ HMDS jest wysoce toksyczny.
  10. Pozostaw zarodki w końcowym 100% roztworze HMDS całkowicie lub częściowo przykryte pod wyciągiem na noc, pomagając w odparowaniu HMDS, pozostawiając próbki gotowe do montażu i napylenia. Przykryj naczynie, aby zapobiec osadzaniu się kurzu na próbkach.
    UWAGA: Tkanka będzie wyglądać na białą po całkowitym wysuszeniu, a częściowo wysuszone próbki będą miały żółty kolor, pozostaw te chusteczki w dygestoriach na dłuższy czas.
  11. Wybierz rozmiar aluminiowych króćców i węglowej taśmy klejącej dla każdej wielkości analizowanej próbki. Ostrożnie zamontuj wysuszone próbki na standardowym aluminiowym króćcu (12,7 mm x 8 mm) za pomocą podwójnej taśmy przewodzącej z włókna węglowego (12 mm).
  12. Wprowadzić zamontowane próbki do komory powlekarki napylającej, aby pokryć próbkę bardzo cienką warstwą złota, aby wyeliminować efekt ładunku. Pozłacane próbki przez 60-120 s przy napylaniu 35 mA.
  13. Zamontuj króćce do odpowiednich płytek porowych, bezpiecznie dokręcając dociskowe. Przenieść uchwyt próbki do lub z komory na próbkę SEM za pomocą narzędzia do wymiany próbek. Obrazowanie próbek w trybie wysokiej próżni z napięciem wiązki przyspieszającej 10 kV i prądem emisji 10 μA.
    UWAGA: Zawsze noś rękawice podczas pracy z próbkami, uchwytami na próbki, króćcami montażowymi i narzędziami do przenoszenia, aby uniknąć zanieczyszczenia smarem rąk do systemu SEM.
  14. Przetestuj alternatywne techniki wymienione poniżej, aby porównać rozdzielczość próbek uzyskanych z powyższej procedury.
    1. Dołącz utrwalanie po utrwaleniu 1% tetratlenku osmu przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej po kroku 1.7.
    2. Częściowo lub całkowicie wyjmij gogle HMDS w kroku 1.10, aby szybko odparować gogle
      3. .
    3. Przetwarzaj zarodki po kroku 1.8 przy użyciu suszenia w punkcie krytycznym (CPD), wykonując kroki 3.3-3.4.

2. Przygotowanie skorupki jajka do SEM metodą suszenia na powietrzu

  1. Zebrać i wysiadywać jaja pomalowanego żółwia (Chrysemys picta) w celu utrwalenia zarodków, jak określono w krokach 1.1-1.7.
  2. Zachowaj skorupki jaj w wodzie destylowanej po utrwaleniu zarodka w kroku 2.1. Dokładnie oczyść skorupki jaj, mocząc je w wodzie destylowanej przez co najmniej 1 godzinę, aby wyeliminować zanieczyszczenie żółtkiem i albuminą.
  3. Wysuszyć skorupki jaj na powietrzu po umyciu na delikatnych chusteczkach antystatycznych w dygestoriach przez noc. Przechowuj wysuszone skorupki jaj w czystych butelkach z próbkami oznaczonych numerem i etapem.
  4. Zamontuj, napyl i zobrazuj próbki, wykonując czynności określone w krokach 1.11-1.13.

3. Metoda suszenia punktu krytycznego do przygotowania kultur grzybów do SEM

  1. Ustalanie kultur szkiełkowych
    1. Przygotować pożywkę z agadem ziemniaczanym z dekstrozą (PDA) do hodowli grzybów: Dodać 39 g mocy PDA do 1 l wody destylowanej w kolbie Erlenmeyera. Dobrze wymieszać, obracając kolbę i sterylizować pożywkę w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 30 minut. Pozostawić roztwór pożywki do ostygnięcia, a następnie dodać antybiotyk chloramfenikol (25 μg/ml) za pomocą sterylnej mikropipety.
      UWAGA: Po sterylizacji roztwór agaru powinien być gorący i nie zastygnie szybko. Ostudzić go na tyle, aby nie dezaktywował antybiotyków.
    2. Wymieszaj go, mieszając i wlewając talerze (około 10-12 ml pożywki na każde 10 cm szalki Petriego), ostrożnie ułóż w stos i pozwól mu zastygnąć.
    3. Użyj sterylnego ostrza skalpela, aby wyciąć małe bloki agaru o wielkości około 1/2 do 3/4 cala. Wyjmij i umieść blok agaru na czystym szklanym szkiełku mikroskopowym.
    4. Umieść szkiełko na czystej szalce Petriego, aby zapobiec zanieczyszczeniu i zachować wilgoć podczas inkubacji.
    5. Podnieś szkiełko z dna szalki Petriego za pomocą sterylnej wykałaczki, aby wytworzyć napięcie powierzchniowe między płytką a szkiełkiem, aby usunąć szklane szkiełko bez przerywania delikatnego wzrostu po inkubacji.
    6. Użyj sterylnej pętli lub igły, aby przenieść część grzybów z inokulum próbki na każdą z czterech stron bloku agarowego na szkiełku.
    7. Po zaszczepieniu umieścić czyste szkiełko nakrywkowe na powierzchni bloku agaru. Dodaj kilka kropli sterylnej wody destylowanej do szalki Petriego wokół szkiełka, aby zapewnić wilgoć rosnącym grzybom.
    8. Częściowo uszczelnić płytkę folią parafinową i inkubować płytkę w temperaturze 30 °C przez odpowiedni okres czasu (w przypadku gatunków Fusarium inkubować przez 36–48 godzin).
    9. Zdjąć szkiełko z płytki Petriego i oddzielić ściśle przylegające szkiełko nakrywkowe od bloku agarowego za pomocą sterylnych kleszczyków. Utrwalić bloki agaru w 3% aldehydzie glutarowym w PBS przez noc w temperaturze 4 °C.
  2. Odwodnić próbki, przechodząc przez serie etanolu: 10%, 25%, 50%, 75% i 90% z 15 minutami na zmianę. Przetwarzaj próbki do końcowego odwodnienia z dwiema przemianami w 100% etanolu, z których każda trwa 30 minut, aby zapewnić całkowite nasycenie.
  3. Suszenie w punkcie krytycznym: Umieścić odwodnione próbki w komorze aparatu CPD. Uszczelnij i schłodzić komorę, otwierając zawory, aby umożliwić dopływ ciekłego CO2 i wypuścić etanol, aż ciekły CO2 całkowicie wypełni komorę.
    1. Uszczelnij i podgrzej komorę powoli, aby osiągnąć punkt krytyczny, gdy ciśnienie w komorze przekracza 1000 psi, a temperatura przekracza 31 °C, faza ciekła i gazowa CO2 jest w równowadze. Powoli spuścić CO2 z komory i próbki w postaci gazu, aby uniknąć skutków napięcia powierzchniowego.
  4. Wykonaj montaż, złocenie i obrazowanie próbek, wykonując czynności określone w krokach 1.11-1.13.
  5. Przeprowadzić analizę porównawczą, susząc chemicznie próbki z kroku 3.2 za pomocą HMDS, wykonując kroki 1.9-1.13.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 1 przedstawia skaningową analizę mikroskopową zarodków żółwia malowanego (Chrysemys picta). Pomalowane jaja żółwi zebrane i wysiadywane na podłożu ściółkowym, zamontowane na aluminiowych kikutach po wysuszeniu chemicznym, zostały użyte do obrazowania SEM (Rysunek 1A-E). Widok boczny zarodka w stadium 12 pokazuje struktury twarzoczaszki; wypukłość szczęki wykracza poza żuchwę i ogranicza dobrze zaznaczony dół nosowy przyśrodkowo; zaobserw...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W naszym badaniu przetestowano różne środki utrwalające, metody odwadniania i suszenia, aby przygotować trzy różne delikatne próbki biologiczne do obrazowania SEM: zarodki, skorupki jaj i kultury grzybów. SEM jest powszechnie stosowany do analizy powierzchni, więc penetracja utrwalająca jest mniej niepokojąca, ale należy zrozumieć, że źle zamocowane struktury wewnętrzne spowodują kurczenie się do wewnątrz i/lub zapadnięcie struktur powierzchniowych. W przypadku większych próbek tkanek należy również rozważyć wydłużenie c...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować Dr. Danielowi Baldassarre, SUNY Oswego za pomocne dyskusje i komentarze na temat manuskryptu. Badanie to było wspierane przez Rice Creek Associate Grants, Oswego; Challenge Granty SUNY Oswego i National Science Foundation (NSF) Małe granty dla PGL i JG.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AgarFischer ScientificS25127Ado hodowli szkiełek
Aluminiowy króciecTedpella1611112,7 mm x 8 mm
BD Difco Dehydrated Culture Podłoża: Agar z dekstrozą ziemniaczanąBD 213400DF0013-17-6Pożywki do izolacji i hodowli grzybów, drożdży i pleśni
ChloramfenikolFischer BioReagentsBP904-100Antybiotyk do pożywek
Gruboziarnista szklarnia wermikulitowaMegastoreSO-VER-12podłoże
ściółkowe Przezroczysta 12-dołkowa płytkaCorning07-201-589do utrwalania zarodków
Szkiełka nakrywkoweFischer ScientificS17525Bdo hodowli szkiełek
Suszarka do punktów krytycznychQuorum CPDEMS850suszenie w punkcie krytycznym
Naczynia hodowlaneFischer Scientific08 747BSZALKA PETRI 100X10MM 12/PK
EtanolFischer ScientificA406P 4środek odwadniający
Kleszcze - Pęseta AquariusTedpella5804styl 4, długość 108mm, szer. x grubość 0,017 x 0,17 mm
Aldehyd glutarowyFischer ScientificG151-1utrwalacz
Złoty cel do powlekarki napylającejDENTONTAR001-0158Złoty Cel, 2.375″ D x .002″
HexamethyldisilazanaFischer ScientificC19479-5000chemiczny środek osuszający
Kim chusteczkiKimtechS-8115czyszczenie
Szkiełka mikroskopoweThermo Scientific67-762-16do hodowli
preparatów NożyczkiTedpella1327Podwójnie spiczaste, stal nierdzewna, 100 mm L (3-5/8").
MikronożyczkiTedpella1346Vannas-type, proste, 80mm L
Moria Perforated Embryo SpoonFine Science Tools10370-17Długość 14,5 cm, średnica końcówki 20 mm, głębokość łyżki 5 mm
Wkładki NetwellCorning0330B0915 mm Wkładki z 74 &mikro; m Rozmiar oczek Membrana poliestrowa działa jako poręczne nośniki podczas przetwarzania próbek na różne rozpuszczalniki
ParaformaldehydFischer ScientificT353 500utrwalacz
Mech torfowyWalmart- Miracle Gro551705263pościel medium
PELCO zakładki podwójna taśma przewodząca węglowaTedpella500012 mm OD
NapylarkaDENTONVACUUM DESK Vcienka powłoka metalowa
SEMJEOL USAJEOL JSM 6610LV skaningowy mikroskop elektronowy
mikroskopowe

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Packard, M. J. Ultrastructural Morphology of the Shell and Shell Membrane of Eggs of Common Snapping Turtles (Chelydra serpentina). Journal of Morphology. 165 (2), 187-204 (1980).
  2. Solomon, S. E., Watt, J. M. The structure of the eggshell of the leatherback turtle (Dermochelys coriacea). Animal Technology. 36 (1), 19-27 (1985).
  3. Sahoo, G., Mohapatra, B. K., Sahoo, R. K., Mohanty-Hejmadi, P. Ultrastructure and Characteristics of Eggshells of the Olive Ridley Turtle (Lepidochelys olivacea) from Gahirmatha, India. Acta Anatomica. 156, 261-267 (1996).
  4. Mitrus, S. The calcareous layer eggshell of the turtle Emys Orbicularis: Ultrastructure and composition. Italian Journal of Zoology. 70 (1), 13-16 (2003).
  5. Chang, Y., Chen, P. Y. Hierarchical structure and mechanical properties of snake (Naja atra) and turtle (Ocadia sinensis) eggshells. Acta Biomaterialia. 31, 33-49 (2016).
  6. Samson, R. A., Stalpers, J. A., Verkerke, W. A simplified technique to prepare fungal specimens for scanning electron microscopy. Cytobios. 24, 7-11 (1979).
  7. Kaminskyj, S. G. W., Dahms, T. E. S. High spatial resolution surface imaging and analysis of fungal cells using SEM and AFM. Micron. 39, 349-361 (2008).
  8. Wisse, E., et al. Fixation methods for electron microscopy of human and other liver. World Journal of Gastroenterology. 16 (23), 2851-2866 (2010).
  9. Braet, F., De Zanger, R., Wisse, E. Drying cells for SEM, AFM and TEM by hexamethyldisilazane: a study on hepatic endothelial cells. Journal of Microscopy. 186 (1), 84-87 (1997).
  10. Echlin, P. Handbook of Sample Preparation for Scanning Electron Microscopy and X-Ray Microanalysis. , UK: Springer. (2009).
  11. Bell, P. B., Safiejko-Mroczka, B. Preparing whole mounts of biological specimens for imaging macromolecular structures by light and electron microscopy. International Journal of Imaging System Technology. 8 (3), 225-239 (1997).
  12. Bahr, G. F., Bloom, G., Friberg, U. Volume changes of tissues in physiological fluids during fixation in osmium tetroxide or formaldehyde and during subsequent treatment. Experimental Cell Research. 12 (2), 342-355 (1957).
  13. Baker, J. R. Principles of biological microtechnique; a study of fixation and dyeing. , Wiley. London Methuen; New York. (1958).
  14. Glauert, A. M. Practical methods in electron microscopy. Journal of Microscopy. 3, 5-65 (1974).
  15. Hayst, M. A. Biological Applications. Principles and techniques of electron microscopy, 4th ed. , Cambridge University Press. 13-105 (1970).
  16. Pathan, A. K., Bond, J., Gaskin, R. E. Sample preparation for SEM of plant surfaces. Materials Today. 12 (1), 32-43 (2010).
  17. Hayat, M. A. Electron microscopy: Biological applications. 4th ed. , Cambridge University Press. New York. (2000).
  18. Hayat, M. A. Fixation for electron microscopy. , Academic Press. New York. (1981).
  19. Karnovsky, M. J. A formaldehyde-glutaraldehyde fixative of high osmolarity for use in electron microscopy. Journal of Cell Biology. 27, 137-138 (1965).
  20. McDowell, E. M., Trump, B. F. Histologic fixatives suitable for diagnostic light and electron microscopy. Archives Pathology and Laboratory Medicine. 100, 405(1976).
  21. Wisse, E., et al. Fixation methods for electron microscopy of human and other liver. World Journal of Gastroenterology. 16 (23), 2851-2866 (2010).
  22. Fischer, E. R., Hnasen, B. T., Nair, V., Hoyt, F. H., Dorward, D. W. Scanning Electron Microscopy. Current Protocols in Microbiology. , Unit2B.2 (2012).
  23. Magalhaes, M., et al. Embryonic development of the Giant South American River Turtle, Podocnemis expansa (Testudines: Podocnemididae). Zoomorphology. 136 (4), 523-537 (2017).
  24. Hopwood, D. Fixatives and fixation: a review. The Histochemistry Journal. 1 (4), 323-360 (1969).
  25. Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P. Formaldehyde fixation. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 33 (8), 845-853 (1985).
  26. Bell, P. B., Rundquist, I., Svensson, I., Collins, V. P. Formaldehyde sensitivity of a GFAP epitope, removed by extraction of the cytoskeleton with high salt. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 35 (12), 1375-1380 (1987).
  27. Hayat, M. A. Glutaraldehyde: Role in electron microscopy. Micron and Microscopica Acta. 17 (2), 115-135 (1986).
  28. Nation, J. L. A new method using hexamethyldisilazane for preparation of soft insect tissues for scanning electron microscope. Stain Technology. 58 (6), 347-351 (1983).
  29. Bray, D. F., Bagu, J., Koegler, P. Comparison of hexamethyldisilazane (HMDS), Peldri II, and critical point drying methods for scanning electron microscopy of biological specimens. Microscopy Research Technique. 26 (6), 489-495 (1993).
  30. Barre, C., O'Neil, D., Bricelj, V. M. Preparation of large bivalve specimens for scanning electron microscopy using Hexamethyldisilazane (HMDS). Journal of Shellfish Research. 25 (2), 639-641 (2006).
  31. Lee, J. T. Y., Chow, K. L. SEM sample preparation for cells on 3D scaffolds by freeze-drying and HMDS. SCANNING. 33, 1-14 (2011).
  32. Araujo, J. C., et al. Comparison of hexamethyldisilazane and critical point drying treatments for SEM analysis of anaerobic biofilms and granular sludge. Journal of Electron Microscopy. 52, 429-433 (2003).
  33. Boyde, A., Bailey, E., Jones, S. J., Tamarin, A. Dimensional changes during specimen preparation for scanning electron microscopy. SEM/IITRI. 10, 507-518 (1977).
  34. Read, N. D., Porter, R., Beckett, A. A comparison of preparative techniques for the examination of the external morphology of fungal material with the scanning electron microscope. Canadian Journal of Botany. 61 (8), 2059-2078 (1983).
  35. Melo, I. S., Faull, J. L. Scanning electron microscopy of conidia of Thichoderma stromaticum, a biocontrol agent of witches broom disease of cocoa. Brazilian Journal of Microbiology. 35, 330-332 (2004).
  36. Pathan, A. K., Bond, J., Gaskin, R. E. Sample preparation for scanning electron microscope of plant surfaces- Horses for courses. Micron. 39, 1049-1061 (2008).
  37. Packard, G. C., Taigen, T. L., Packard, M. J., Boardman, T. J. Water relations of pliable-shelled eggs of common snapping turtle (Chelydra serpentine). Canadian Journal of Zoology. 58, 1404-1411 (1979).
  38. Packard, M. J., Packard, G. C., Boardman, T. J. Structure of eggshells and water relations of reptilian eggs. Herpetologica. 38, 136-155 (1982).
  39. Cordero, G. A., Janzen, F. J. An Enhanced Developmental Staging Table for the Pianted Turtle, Chrysemys picta (Testudines: Emydidae). Journal of Morphology. 275, 442-455 (2014).
  40. Yntema, C. L. Procurement and use of turtle embryos for experimental procedures. The Anatomical Record. 149, 577-586 (1964).
  41. Matsubara, Y., Kuroiwa, A., Suzuki, T. Efficient harvesting methods for early-stage snake and turtle embryos. Development Growth Differentiation. 58, 241-249 (2016).
  42. Moran, P., Coats, B. Biological Sample Preparation for SEM Imaging of Porcine Retina. Microscopy Today. , 10-12 (2012).
  43. Bray, D. F., Bagu, J., Koegler, P. Comparison of hexamethyldisilazane (HMDS), Peldri II, and critical point drying methods for scanning electron microscopy of biological specimens. Microscopy Research Technique. 26, 489-495 (1993).
  44. Botes, L., Price, B., Waldron, M., Pitcher, G. C. A simple and rapid Scanning Electron Microscope preparative technique for delicate "Gymnodinioid" Dinoflagellates. Microscopy Research Technique. 59, 128-130 (2002).
  45. Dekker, N. P., Lammel, C. J., Brooks, G. F. Scanning Electron Microscopy of piliated Neisseria gonorrhoeae processed with hexamethyldisilazane. Journal of Electron Microscopy. 19, 461-467 (1991).
  46. Fratesi, S., Lynch, F. L., Kirkland, B. L., Brown, L. R. Effects of SEM preparation techniques on the appearance of bacteria and biofilms in the Carter Sandstone. Journal of Sedimentary Research. 74, 858-867 (2004).
  47. Jung, S. W., Joo, H. M., Park, J. S., Lee, J. H. Development of a rapid and effective method for preparing delicate dinoflagellates for scanning electron microscopy. Journal of Applied Phycology. 22, 313-317 (2010).
  48. Bernd, S., Bentley, D. Use of HMDS (hexamethyldisilazane) to dry organic microstructures in etched bivalve mollusk and barnacle shells. Nautilus -Greenville then Sanibel. 116, 25-31 (2002).
  49. Bowen, W. R., Hemann, C. C., Johnson, A. A., Good, B. H. Mermithid Nematodes: SEM Observations Comparing Hexamethyldisilazane and Critical Point Drying Methods. Journal of the Arkansas Academy of Science. 44, Article 6 (1990).
  50. Jusman, J., Ng, S. C., Osman, N. A. A. Investigation of CPD and HMDS Sample Preparation Techniques for Cervical Cells in Devloping Computer-Aided Screening System Based on FE-SEM/EDX. The Scientific World Journal. 289817, 1-11 (2014).
  51. Hazrin-Chong, N. H., Manefield, M. An alternative SEM drying method using hexamethyldisilazane (HMDS) for microbial cell attachment studies on sub-bituminous coal. Journal of Microbiological Methods. 90, 96-99 (2012).
  52. Laforsch, C., Tollrian, R. A new preparation technique of daphnids for Scanning Electron Microscopy using hexamethyldisilazane. Arch Hydrobiology. 149 (4), 587-596 (2000).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Przygotowanie zarodk wobr bka skorup jajodwadnianie pr beksuszenie HMDSsuszenie w punkcie krytycznymseria etanolowahodowla na szkie kumontowanie preparat w

Powiązane artykuły