Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Szybka izolacja makrofagów zwoju korzenia grzbietowego

10.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60023

⸱

7 września 2019

 ,  , 
1Department of Anesthesia and Perioperative Care, University of California San Francisco

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół mechanicznej dysocjacji do szybkiego izolowania makrofagów z grzbietowego zwoju korzenia w celu fenotypowania i analizy funkcjonalnej.

Streszczenie

Rośnie zainteresowanie badaniem molekularnych i komórkowych interakcji między komórkami odpornościowymi i neuronami czuciowymi w zwojach korzenia grzbietowego po uszkodzeniu nerwów obwodowych. Wiadomo, że obwodowe komórki monocytowe, w tym makrofagi, reagują na uszkodzenie tkanki poprzez fagocytozę, prezentację antygenu i uwalnianie cytokin. Pojawiające się dowody wskazują na udział makrofagów zwojów korzenia grzbietowego w rozwoju bólu neuropatycznego i naprawie aksonów w kontekście uszkodzenia nerwów. Szybkie fenotypowanie (lub "szybka izolacja") odpowiedzi makrofagów zwojów korzenia grzbietowego w kontekście uszkodzenia nerwów jest pożądane w celu zidentyfikowania nieznanych czynników neuroimmunologicznych. Tutaj pokazujemy, jak nasze laboratorium szybko i skutecznie izoluje makrofagi z zwojów korzenia grzbietowego za pomocą protokołu dysocjacji mechanicznej bez enzymów. Próbki są trzymane na lodzie przez cały czas, aby ograniczyć stres komórkowy. Protokół ten jest znacznie mniej czasochłonny w porównaniu ze standardowym protokołem enzymatycznym i jest rutynowo stosowany do naszej analizy sortowania komórek aktywowanego fluorescencją.

Wprowadzenie

Obecnie istnieje wiele dowodów na to, że komórki odpornościowe przyczyniają się do bólu neuropatycznego po uszkodzeniu nerwów obwodowych1,2. Wiadomo, że obwodowe komórki monocytarne, w tym dojrzałe makrofagi, reagują na uszkodzenie tkanek i infekcję ogólnoustrojową poprzez fagocytozę, prezentację antygenu i uwalnianie cytokin. Równolegle do aktywacji mikrogleju wywołanej uszkodzeniem nerwu w rdzeniowym rogu grzbietowym, makrofagi w zwojach korzenia grzbietowego (DRG) również znacznie się rozszerzają po uszkodzeniu nerwu3,4. Warto zauważyć, że rośnie zainteresowanie ustaleniem, czy makrofagi przyczyniają się do rozwoju bólu neuropatycznego po uszkodzeniu nerwów obwodowych poprzez interakcję z neuronami czuciowymi w klasie DRG5,6,7,8,9,10,11. Co więcej, ostatnie badania sugerują również udział makrofagów DRG w naprawie aksonów po uszkodzeniu nerwów12,13. Inne badanie sugeruje ponadto, że subpopulacje makrofagów (tj. CD11b+Ly6Chi i CD11b+Ly6Clow/- komórki) mogą odgrywać inną rolę w nadwrażliwości mechanicznej14. Dlatego szybkie fenotypowanie odpowiedzi makrofagów DRG w kontekście uszkodzenia nerwów może pomóc nam zidentyfikować czynniki neuroimmunologiczne przyczyniające się do bólu neuropatycznego.

Konwencjonalnie, protokół izolacji makrofagów w DRG obejmuje wiele etapów, w tym trawienie enzymatyczne15,16. Technika ta jest często czasochłonna i może być kosztowna w przypadku eksperymentów na dużą skalę. Chociaż wcześniej zalecano łagodne trawienie kolagenazą typu II (4 mg/ml) i dyspazą typu II (4,7 mg/ml) przez 20 minut15, można sobie wyobrazić, że komórki po ekspozycji na ten enzym są podatne na uszkodzenie komórek lub śmierć komórki, co może prowadzić do niskiej wydajności. Ponadto różnica w jakości enzymów w poszczególnych partiach może dodatkowo wpłynąć na wydajność tego procesu. Co ważniejsze, makrofagi wystawione na trawienie enzymatyczne mogą być niepożądanie stymulowane, a zatem mogą bardzo różnić się od stanu in vivo. Zmiany te mogą potencjalnie skomplikować wynik badania funkcjonalnego.

Tutaj opisujemy bezenzymatyczny protokół szybkiego izolowania makrofagów DRG w temperaturze 4 °C za pomocą dysocjacji mechanicznej. Próbki są trzymane na lodzie, aby ograniczyć stres komórkowy. W rezultacie, nasze podejście zapewnia przewagę w utrzymaniu spójności izolacji, a izolowane komórki są przypuszczalnie zdrowsze i mniej stymulowane. Następnie przedstawiamy dowody w celu walidacji jakości izolowanych komórek za pomocą analizy sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Kalifornijskim w San Francisco i zostały przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem NIH dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych.

1. Zbierz DRG lędźwiowy od eksperymentalnych myszy

  1. Przed rozpoczęciem eksperymentu należy przygotować roztwór roboczy ośrodka o gradiencie gęstości (np. Percoll), mieszając 9 objętości pożywki z 1 objętością Ca++/Mg++-free 10x HBSS. Trzymaj go na lodzie.
  2. Znieczulij mysz 2,5% Avertin. Upewnij się, że zwierzę jest w pełni znieczulone z powodu braku reakcji na uszczypnięcie tylnej łapy.
    UWAGA: Wykorzystano zarówno samce, jak i samice myszy w wieku 6-8 tygodni.
  3. Przeprowadzić fuzję myszy przezsercowo z 10 ml wstępnie schłodzonego 1x PBS.
    1. Umieść mysz w pozycji leżącej na plecach z czterema łapami zabezpieczonymi taśmą wewnątrz okapu oparów chemicznych. Podnieś skórę poniżej klatki piersiowej za pomocą kleszczy i wykonaj małe nacięcie nożyczkami chirurgicznymi, aby odsłonić wątrobę i przeponę.
    2. Kontynuuj używanie nożyczek do przecinania przepony i klatki piersiowej, otwórz jamę opłucnej, aby odsłonić bijące serce.
    3. Szybko odetnij prawy uszek przedsionka nożyczkami do tęczówki. Po zauważeniu krwawienia włóż igłę 30 G do tylnego końca lewej komory i powoli wstrzyknij 10 ml wstępnie schłodzonego 1x PBS w celu perfuzji zwierzęcia.
  4. Wykonaj laminektomię grzbietową15 na myszy umieszczonej w pozycji leżącej.
    UWAGA: Jeśli planowana jest hodowla komórkowa, przed nacięciem spryskaj mysz 70% etanolem i użyj wstępnie wysterylizowanych narzędzi chirurgicznych do sekcji.
    1. Użyj skalpela w rozmiarze 11, aby wykonać jedno podłużne boczne głębokie nacięcia, zaczynając od okolicy piersiowej w dół do okolicy krzyżowej. Usuń skórę nożyczkami, aby odsłonić warstwę mięśni grzbietowych.
    2. Użyj Friedmana-Pearsona Rongeur, aby odkleić tkanki łączne i mięśnie, aż do odsłonięcia wyrostków kręgosłupa lędźwiowo-krzyżowego i obustronnych wyrostków poprzecznych.
    3. Użyj nożyczek Noyes Spring Scissor, aby ostrożnie otworzyć grzbietowy kręgosłup, a następnie przełącz się na Rongeur Friedmana-Pearsona, aby usunąć kości kręgów, aby odsłonić rdzeń kręgowy z nienaruszonymi nerwami rdzeniowymi.
  5. Ostrożnie wypreparuj ipsilateralny i przeciwległy DRG lędźwiowy (L4 / L5 DRG w naszym badaniu) i umieść go w 1 ml lodowatego lodu 1x HBSS wolnego od Ca + + / Mg ++ w homogenizatorze tkankowym Dounce. Teraz tkanki są gotowe do kroku 2.
    UWAGA: Jeśli to możliwe, przyciąć nerw rdzeniowy przymocowany do DRG.

2. Izoluj pojedyncze komórki od DRG odcinka lędźwiowego myszy

  1. Homogenizować tkankę DRG za pomocą luźnego tłuczka w homogenizatorze Dounce 20-25 razy.
  2. Umieść sterylne sitko nylonowe o pojemności 70 μm w sterylnej stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Zwilż sitko komórkowe 800 μl lodowatego środka 1x HBSS, a przepływ jest zbierany w stożkowej probówce.
  3. Pobrać homogenizowaną zawiesinę tkankową z homogenizatora za pomocą pipety i przepuścić przez mokre sitko do komórek nylonowych o pojemności 70 μm do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
  4. Przepłukać homogenizator dwukrotnie 800 μl lodowatego 1x HBSS, a następnie zdekantować do tej samej stożkowej probówki o pojemności 50 ml z sitkiem do komórek, aby zwiększyć wydajność.
  5. Dodać 1,5 ml zrównoważonej lodowatej pożywki o izotonicznym gradiencie gęstości (przygotowanej w kroku 1.1) do sterylnej probówki FACS o pojemności 5 ml z polistyrenu.
  6. Przenieść homogenat komórek z probówki stożkowej o pojemności 50 ml (w kroku 2.4) do probówki FACS, dobrze wymieszać z podłożem o gradiencie gęstości, pipetując w górę i w dół. Dodaj dodatkowe 500 μL 1x HBSS, aby uszczelnić górę.
  7. Granulować komórki przez odwirowanie przy 800 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
  8. Ostrożnie odessać supernatant zawierający mielinę w pożywce, nie naruszając osadu komórkowego na dnie probówki FACS.
  9. Zawiesić komórki w buforze PBS lub FACS zawierającym 5% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) do analizy FACS.
    UWAGA: Oczekuje się, że co najmniej 50 000 do 100 000 komórek z L4 / L5 DRG jednej myszy będzie zawierać.
    1. Ponownie zawiesić mechanicznie wyizolowane komórki DRG (L4/L5) w 100 μl PBS zawierającego 5% płodowej surowicy bydlęcej, a następnie inkubować z α-mysim przeciwciałem CX3CR1-APC (1:2 000) w ciemności w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę.
    2. Przemyć komórki jednorazowo 5 ml PBS; odwirować komórki 360 x g przez 8 minut w temperaturze 4 °C.
    3. Odessać supernatant, a następnie ponownie zawiesić osad komórkowy w 300 μl PBS do analizy FCAS. Jeśli planowane jest sortowanie komórek, zamiast tego ponownie zawieś komórki w buforze FACS.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby zwalidować wyizolowane komórki, w pierwszej kolejności wybraliśmy transgeniczne myszy Macrophage Fas-Induced Apoptosis (MAFIA)17. Linia ta wykazuje ekspresję indukowalnego lekiem genu fuzyjnego białka wiążącego FK506 (FKBP)-Fas oraz zielonego białka fluorescencyjnego (eGFP) pod kontrolą promotora receptora CSF1 (CSF1R), który jest specyficznie wyrażany zarówno w makrofagach, jak i w mikrogleju. Systemowe wstrzyknięcie dimeryzatora białka wiążącego FK, AP20187 (AP), indukuje apoptozę komórek wy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Tutaj przedstawiamy nową metodę skutecznego wzbogacania wyizolowanych makrofagów z mysiego DRG. Konwencjonalne podejście do izolacji komórek odpornościowych DRG wymaga trawieniaenzymatycznego 15,18, które w naszym protokole zostało zastąpione homogenizacją mechaniczną, aby ograniczyć niepożądane uszkodzenia komórek i zwiększyć wydajność. Dlatego nowy protokół jest znacznie mniej czasochłonny. Co ważniejsze, trawienie enzymatyczne może stymulować makrofagi i zmien...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują, że nie mają sprzecznych interesów finansowych związanych z tym manuskryptem.

Podziękowania

Badanie było wspierane przez: Fundację Edukacji i Badań Anestezjologicznych (XY); Wydział Anestezjologii i Opieki Okołooperacyjnej UCSF (XY); oraz 1R01NS100801-01(GZ). Badanie to było częściowo wspierane przez HDFCCC Laboratory for Cell Analysis Shared Resources Facility poprzez grant z NIH (P30CA082103).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AP20187Clontech635058
α-mysz CX3CR1-Przeciwciało APCBiolegend149007
AvertinSigmaT48402
Sitko do komórek (nylon 70 mm)Wirówka Falcon352350
Eppendorf5810R
Homogenizator tkankowy DounceWheaton357538 ( 1ml)
Probówki FACS (5ml)Falcon352052
Friedman-Pearson RongeurFST16121-14
HBSS (10x, bez Ca++/Mg++-free)Gibco14185-052
Noyes Nożyczki sprężynoweFST15012-12
PercollSigmaP4937-500ml
Jodek propidynySigmaP4864-10ml

Bibliografia

  1. Ji, R. R., Chamessian, A., Zhang, Y. Q. Pain regulation by non-neuronal cells and inflammation. Science. 354 (6312), 572-577 (2016).
  2. Inoue, K., Tsuda, M. Microglia in neuropathic pain: cellular and molecular mechanisms and therapeutic potential. Nature Reviews Neurosciences. 19 (3), 138-152 (2018).
  3. Hu, P., McLachlan, E. M. Distinct functional types of macrophage in dorsal root ganglia and spinal nerves proximal to sciatic and spinal nerve transections in the rat. Experimental Neurology. 184 (2), 590-605 (2003).
  4. Simeoli, R., Montague, K., Jones, H. R., et al. Exosomal cargo including microRNA regulates sensory neuron to macrophage communication after nerve trauma. Nature Communication. 8 (1), 1778(2017).
  5. Cobos, E. J., Nickerson, C. A., Gao, F., et al. Mechanistic differences in neuropathic pain modalities revealed by correlating behavior with global expression profiling. Cell Reports. 22 (5), 1301-1312 (2018).
  6. Zhang, H., Li, Y., de Carvalho-Barbosa, M., et al. Dorsal Root Ganglion Infiltration by Macrophages Contributes to Paclitaxel Chemotherapy-Induced Peripheral Neuropathy. The Journal of Pain. 17 (7), 775-786 (2016).
  7. Liu, T., van Rooijen, N., Tracey, D. J. Depletion of macrophages reduces axonal degeneration and hyperalgesia following nerve injury. Pain. 86 (1-2), 25-32 (2000).
  8. Peng, J., Gu, N., Zhou, L., et al. Microglia and monocytes synergistically promote the transition from acute to chronic pain after nerve injury. Nature Communication. 7, 12029(2016).
  9. Barclay, J., Clark, A. K., Ganju, P., et al. Role of the cysteine protease cathepsin S in neuropathic hyperalgesia. Pain. 130 (3), 225-234 (2007).
  10. Lim, H., Lee, H., Noh, K., Lee, S. J. IKK/NF-kappaB-dependent satellite glia activation induces spinal cord microglia activation and neuropathic pain after nerve injury. Pain. 158 (9), 1666-1677 (2017).
  11. Rutkowski, M. D., Pahl, J. L., Sweitzer, S., van Rooijen, N., DeLeo, J. A. Limited role of macrophages in generation of nerve injury-induced mechanical allodynia. Physiology and Behavior. (3-4), 225-235 (2000).
  12. Kwon, M. J., Shin, H. Y., Cui, Y., et al. CCL2 Mediates Neuron-Macrophage Interactions to Drive Proregenerative Macrophage Activation Following Preconditioning Injury. Journal of Neuroscience. 35 (48), 15934-15947 (2015).
  13. Zigmond, R. E., Echevarria, F. D. Macrophage biology in the peripheral nervous system after injury. Progress in Neurobiology. 173, 102-121 (2019).
  14. Ghasemlou, N., Chiu, I. M., Julien, J. P., Woolf, C. J. CD11b+Ly6G- myeloid cells mediate mechanical inflammatory pain hypersensitivity. Proceedings of the National Academy of Science USA. 112 (49), E6808-E6817 (2015).
  15. Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity. Nature Protocols. 2 (1), 152-160 (2007).
  16. Lin, Y. T., Chen, J. C. Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release. Journal of Visualized Experiment. (140), (2018).
  17. Burnett, S. H., Kershen, E. J., Zhang, J., et al. Conditional macrophage ablation in transgenic mice expressing a Fas-based suicide gene. J Leukoc Biol. 75 (4), 612-623 (2004).
  18. Lopes, D. M., Malek, N., Edye, M., et al. Sex differences in peripheral not central immune responses to pain-inducing injury. Science Reports. 7 (1), 16460(2017).
  19. Kim, Y. S., Anderson, M., Park, K., et al. Coupled Activation of Primary Sensory Neurons Contributes to Chronic Pain. Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).
  20. Vicuna, L., Strochlic, D. E., Latremoliere, A., et al. The serine protease inhibitor SerpinA3N attenuates neuropathic pain by inhibiting T cell-derived leukocyte elastase. Nature Medicine. 21 (5), 518-523 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Izolacja makrofagówdysocjacja bez użycia enzymówprotokół dysocjacji mechanicznejsortowanie komórek aktywowane fluorescencjąwirowanie w gradiencie gęstościbarwienie przeciwciałem przeciwko CX3CR1ocena żywotności komórekhomogenizacja tkanki zęb zwojów korzeniowychmodel uszkodzenia nerwu
Szybka izolacja makrofagów zwoju korzenia grzbietowego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.