Tutaj prezentujemy protokół mechanicznej dysocjacji do szybkiego izolowania makrofagów z grzbietowego zwoju korzenia w celu fenotypowania i analizy funkcjonalnej.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Szybka izolacja makrofagów zwoju korzenia grzbietowego
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Rośnie zainteresowanie badaniem molekularnych i komórkowych interakcji między komórkami odpornościowymi i neuronami czuciowymi w zwojach korzenia grzbietowego po uszkodzeniu nerwów obwodowych. Wiadomo, że obwodowe komórki monocytowe, w tym makrofagi, reagują na uszkodzenie tkanki poprzez fagocytozę, prezentację antygenu i uwalnianie cytokin. Pojawiające się dowody wskazują na udział makrofagów zwojów korzenia grzbietowego w rozwoju bólu neuropatycznego i naprawie aksonów w kontekście uszkodzenia nerwów. Szybkie fenotypowanie (lub "szybka izolacja") odpowiedzi makrofagów zwojów korzenia grzbietowego w kontekście uszkodzenia nerwów jest pożądane w celu zidentyfikowania nieznanych czynników neuroimmunologicznych. Tutaj pokazujemy, jak nasze laboratorium szybko i skutecznie izoluje makrofagi z zwojów korzenia grzbietowego za pomocą protokołu dysocjacji mechanicznej bez enzymów. Próbki są trzymane na lodzie przez cały czas, aby ograniczyć stres komórkowy. Protokół ten jest znacznie mniej czasochłonny w porównaniu ze standardowym protokołem enzymatycznym i jest rutynowo stosowany do naszej analizy sortowania komórek aktywowanego fluorescencją.
Wprowadzenie
Obecnie istnieje wiele dowodów na to, że komórki odpornościowe przyczyniają się do bólu neuropatycznego po uszkodzeniu nerwów obwodowych1,2. Wiadomo, że obwodowe komórki monocytarne, w tym dojrzałe makrofagi, reagują na uszkodzenie tkanek i infekcję ogólnoustrojową poprzez fagocytozę, prezentację antygenu i uwalnianie cytokin. Równolegle do aktywacji mikrogleju wywołanej uszkodzeniem nerwu w rdzeniowym rogu grzbietowym, makrofagi w zwojach korzenia grzbietowego (DRG) również znacznie się rozszerzają po uszkodzeniu nerwu3,4. Warto zauważyć, że rośnie za....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Kalifornijskim w San Francisco i zostały przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem NIH dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych.
1. Zbierz DRG lędźwiowy od eksperymentalnych myszy
- Przed rozpoczęciem eksperymentu należy przygotować roztwór roboczy ośrodka o gradiencie gęstości (np. Percoll), mieszając 9 objętości pożywki z 1 objętością Ca++/Mg++-free 10x HBSS. Trzymaj go na lodzie.
- Znieczulij mysz 2,5% Avertin. Upewnij się, że zwierzę jest w pełni ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Aby zwalidować wyizolowane komórki, w pierwszej kolejności wybraliśmy transgeniczne myszy Macrophage Fas-Induced Apoptosis (MAFIA)17. Linia ta wykazuje ekspresję indukowalnego lekiem genu fuzyjnego białka wiążącego FK506 (FKBP)-Fas oraz zielonego białka fluorescencyjnego (eGFP) pod kontrolą promotora receptora CSF1 (CSF1R), który jest specyficznie wyrażany zarówno w makrofagach, jak i w mikrogleju. Systemowe wstrzyknięcie dimeryzatora białka wiążącego FK, AP20187 (AP), indukuje apoptozę komórek wy.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Tutaj przedstawiamy nową metodę skutecznego wzbogacania wyizolowanych makrofagów z mysiego DRG. Konwencjonalne podejście do izolacji komórek odpornościowych DRG wymaga trawieniaenzymatycznego 15,18, które w naszym protokole zostało zastąpione homogenizacją mechaniczną, aby ograniczyć niepożądane uszkodzenia komórek i zwiększyć wydajność. Dlatego nowy protokół jest znacznie mniej czasochłonny. Co ważniejsze, trawienie enzymatyczne może stymulować makrofagi i zmien.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują, że nie mają sprzecznych interesów finansowych związanych z tym manuskryptem.
Podziękowania
Badanie było wspierane przez: Fundację Edukacji i Badań Anestezjologicznych (XY); Wydział Anestezjologii i Opieki Okołooperacyjnej UCSF (XY); oraz 1R01NS100801-01(GZ). Badanie to było częściowo wspierane przez HDFCCC Laboratory for Cell Analysis Shared Resources Facility poprzez grant z NIH (P30CA082103).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| AP20187 | Clontech | 635058 | |
| α-mysz CX3CR1-Przeciwciało APC | Biolegend | 149007 | |
| Avertin | Sigma | T48402 | |
| Sitko do komórek (nylon 70 mm) | Wirówka Falcon | 352350 | |
| Eppendorf | 5810R | ||
| Homogenizator tkankowy Dounce | Wheaton | 357538 ( 1ml) | |
| Probówki FACS (5ml) | Falcon | 352052 | |
| Friedman-Pearson Rongeur | FST | 16121-14 | |
| HBSS (10x, bez Ca++/Mg++-free) | Gibco | 14185-052 | |
| Noyes Nożyczki sprężynowe | FST | 15012-12 | |
| Percoll | Sigma | P4937-500ml | |
| Jodek propidyny | Sigma | P4864-10ml |
Bibliografia
- Ji, R. R., Chamessian, A., Zhang, Y. Q. Pain regulation by non-neuronal cells and inflammation. Science. 354 (6312), 572-577 (2016).
- Inoue, K., Tsuda, M. Microglia in neuropathic pain: cellular and molecular mechanisms and therapeutic potential. Nature....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
Przeglądaj więcej artykułów
