Method Article

Kwantyfikacja dynamiki sieci interakcji białek za pomocą multipleksowanej koimmunoprecypitacji

DOI:

10.3791/60029

⸱

August 21st, 2019

 ,  ,  ,  , 
1Center for Integrative Brain Research, Seattle Children's Research Institute, 2Graduate Program in Neuroscience, University of Washington, 3Department of Cancer Immunology and Virology, Dana-Farber Cancer Institute, Department of Medicine, Harvard Medical School, 4Broad Institute of Harvard and MIT, 5Department of Mathematics, University of Houston, 6Department of Molecular Microbiology and Immunology, School of Medicine, University of Missouri, 7Department of Surgery, School of Medicine, University of Missouri, 8Department Bioengineering, College of Engineering, University of Missouri, 9Department of Pediatrics, University of Washington

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ilościowe Multiplex Immunoprecipitation (QMI) wykorzystuje cytometrię przepływową do czułego wykrywania różnic w obfitości docelowych interakcji białko-białko między dwiema próbkami. QMI można wykonać przy użyciu niewielkiej ilości biomateriału, nie wymaga genetycznie modyfikowanych znaczników i może być dostosowany do dowolnej wcześniej zdefiniowanej sieci interakcji białek.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dynamiczne interakcje białko-białko kontrolują zachowanie komórek, od ruchliwości, przez replikację DNA, aż po transdukcję sygnału. Jednak monitorowanie dynamicznych oddziaływań między wieloma białkami w sieci interakcji białkowych jest technicznie trudne. W tym miejscu przedstawiamy protokół ilościowej immunoprecypitacji multipleksowej (QMI), który umożliwia ilościową ocenę zmian fałdowania w oddziaływaniach białkowych na podstawie względnych pomiarów fluorescencji białek we wspólnych kompleksach wykrywanych przez epitopy odsłoniętej powierzchni (PiSCES). W QMI kompleksy białkowe z lizatów komórkowych są immunoprecypitowane na mikrosfery, a następnie badane za pomocą znakowanego przeciwciała dla innego białka w celu ilościowego określenia obfitości PiSCES. Przeciwciała immunoprecypitacyjne są sprzężone z różnymi obszarami spektralnymi MagBead, co pozwala cytometrowi przepływowemu różnicować wiele równoległych immunoprecypitacji i jednocześnie określać ilościowo ilość przeciwciał sondujących związanych z każdym z nich. QMI nie wymaga znakowania genetycznego i może być wykonywany przy użyciu minimalnej ilości biomateriału w porównaniu z innymi metodami immunoprecypitacji. QMI może być dostosowany do dowolnej zdefiniowanej grupy oddziałujących białek i do tej pory był używany do charakteryzowania sieci sygnałowych w komórkach T i neuronalnych synapsach glutaminianu. Wyniki pozwoliły na sformułowanie nowych hipotez o potencjalnych zastosowaniach diagnostycznych i terapeutycznych. Protokół ten zawiera instrukcje dotyczące wykonywania QMI, od wstępnego wyboru panelu przeciwciał po przeprowadzanie testów i analizowanie danych. Wstępny montaż testu QMI obejmuje badanie przesiewowe przeciwciał w celu wytworzenia panelu i empiryczne określenie odpowiedniego buforu do lizy. Późniejsze przygotowanie odczynnika obejmuje kowalencyjne sprzęganie przeciwciał immunoprecypitacyjnych z MagBeads oraz przeciwciała sondy biotynylowej, dzięki czemu można je znakować fluoroforem sprzężonym ze streptawidyną. Aby uruchomić test, lizat miesza się z MagBeads przez noc, a następnie kulki są dzielone i inkubowane z różnymi przeciwciałami sondy, a następnie etykietą fluoroforową i odczytywane za pomocą cytometrii przepływowej. Przeprowadza się dwa testy statystyczne w celu zidentyfikowania PiSCE, które znacznie różnią się w zależności od warunków eksperymentalnych, a wyniki są wizualizowane za pomocą map cieplnych lub diagramów krawędzi węzłów.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dynamiczne interakcje białko-białko tworzą molekularne kaskady sygnalizacyjne i ruchome struktury, które są funkcjonalną podstawą większości fizjologii komórkowej1. Procesy te są często przedstawiane jako liniowe ścieżki sygnałowe, które przełączają się między stanami ustalonymi na podstawie pojedynczych danych wejściowych, ale dane eksperymentalne i modelowe wyraźnie pokazują, że funkcjonują one jako zintegrowane sieci2,3,4. W przypadku białek G, różne receptory często mają zdolność do aktywacji tego samego białka G, a pojedynczy receptor może również....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Projekt testu

  1. Preparat przeciwciał kandydujących
    1. Dla każdego białka będącego przedmiotem zainteresowania wybierz od 3 do 5 przeciwciał do badań przesiewowych. Jeśli to możliwe, używaj przeciwciał monoklonalnych, które rozpoznają różne epitopy. Uwzględnij również jedno nieswoiste przeciwciało kontrolne.
    2. Aby usunąć Tris, należy przeprowadzić wymianę buforu, dodając przeciwciało do filtra wirowego o mocy 30 kDa, zmniejszając do minimalnej objętości, dodając 500 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i powtarzając 3 razy. W celu usunięcia białek nośnikowych należy przeprowadzić oczyszczanie przeciwciał zgodnie z protokoł....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie przesiewowe przeciwciał<br /> Rysunek 2B pokazuje wyniki badania przesiewowego dla białka Connexin36. Większość kombinacji IP_probe nie wytwarza sygnału przez kontrole IgG. IP z przeciwciałem monoklonalnym 1E5 i sondą z 1E5 lub przeciwciałem poliklonalnym 6200 powoduje przesunięcie w prawo w dystrybucji kulek w porównaniu z kontrolami IgG. W tym przypadku IP 1E5 i sonda 6200poly zostały wybrane tak, aby uniknąć stosowania tego samego przeciwcia.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Test QMI wymaga znacznych inwestycji w opracowanie panelu przeciwciał, sprzętu i odczynników, ale po ustaleniu testu można zebrać wielowymiarowe dane obserwujące sieci interakcji białek, gdy reagują one na bodźce kontrolowane eksperymentalnie. Z technicznego punktu widzenia QMI wymaga starannego pipetowania i śledzenia lokalizacji próbek i dołków przeciwciał. Przydatne jest staranne oznakowanie płytek testowych, a także wykonanie szczegółowego szablonu lokalizacji odwiertów na papierze, który jest następnie zapisywany do.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy pragną podziękować Tessie Davis za ważny wkład w rozwój testów QMI, a obecnym i byłym członkom laboratoriów Smith and Schrum za wskazówki techniczne i wkład intelektualny. Praca ta została sfinansowana z grantów NIMH R01 MH113545 i R00 MH 102244.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
96-dołkowe płytki płaskodenneBio Rad171025001
96-dołkowe płytki do PCRVWR82006-704
Bioplex 200 z HTFBio Rad171000205zmodyfikowany w celu częściowego chłodzenia, szczegółowe informacje znajdują się na rysunku S1
Stacja mycia Bio-Plex ProBio Rad30034376
BSASigma
Koraliki CMLInvitrogenC37481
EDTASigmaE6758
EZ-Link Sulfo-NHS-BiotinThermo ScientificA39256
MagPlex MicrospheresLuminexMC12xxx-01xxx to 3-cyfrowy obszar koralików
Melon Gel IgG Spin Purification KitThermo Scientific45206używany do oczyszczania przeciwciał
MESSigmaM3671
Folia do mikropłytek, niesterylnaUSA Scientific2920-0000
Koktajl inhibitorów fosfotazy #2SigmaP5726
Koktajl inhibitorów proteazySigmaP8340
Lodówka do przygotowywania kanapekNorlakeSMP 36 15do niestandardowego chłodzenia Bioplex 200
Sodium fluorekSigma201154
Ortowanadan soduSigma450243
Streptawidyna-PEBioLegend405204
Sulfo NHSThermo ScientificA39269
TrisFisher ScientificBP152
System

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pawson, T., Nash, P. Protein-protein interactions define specificity in signal transduction. Genes and Development. 14 (9), 1027-1047 (2000).
  2. Rodríguez-Jorge, O., et al. Cooperation between T cell receptor and Toll-like receptor 5 signaling for C....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Multiplexed Co ImmunoprecipitationProtein Interaction NetworkQuantitative Multiplex ImmunoprecipitationFlow Cytometry AnalysisMagnetic Bead ImmunoprecipitationProtein Co AssociationsSignal Transduction SystemsAntibody Panel SelectionStreptavidin PE LabelingCytoscape Network Visualization

Related Articles