Artykuł metodologiczny

Kwantyfikacja dynamiki sieci interakcji białek za pomocą multipleksowanej koimmunoprecypitacji

DOI:

10.3791/60029

⸱

21 sierpnia 2019

 ,  ,  ,  , 
1Center for Integrative Brain Research, Seattle Children's Research Institute, 2Graduate Program in Neuroscience, University of Washington, 3Department of Cancer Immunology and Virology, Dana-Farber Cancer Institute, Department of Medicine, Harvard Medical School, 4Broad Institute of Harvard and MIT, 5Department of Mathematics, University of Houston, 6Department of Molecular Microbiology and Immunology, School of Medicine, University of Missouri, 7Department of Surgery, School of Medicine, University of Missouri, 8Department Bioengineering, College of Engineering, University of Missouri, 9Department of Pediatrics, University of Washington

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ilościowe Multiplex Immunoprecipitation (QMI) wykorzystuje cytometrię przepływową do czułego wykrywania różnic w obfitości docelowych interakcji białko-białko między dwiema próbkami. QMI można wykonać przy użyciu niewielkiej ilości biomateriału, nie wymaga genetycznie modyfikowanych znaczników i może być dostosowany do dowolnej wcześniej zdefiniowanej sieci interakcji białek.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dynamiczne interakcje białko-białko kontrolują zachowanie komórek, od ruchliwości, przez replikację DNA, aż po transdukcję sygnału. Jednak monitorowanie dynamicznych oddziaływań między wieloma białkami w sieci interakcji białkowych jest technicznie trudne. W tym miejscu przedstawiamy protokół ilościowej immunoprecypitacji multipleksowej (QMI), który umożliwia ilościową ocenę zmian fałdowania w oddziaływaniach białkowych na podstawie względnych pomiarów fluorescencji białek we wspólnych kompleksach wykrywanych przez epitopy odsłoniętej powierzchni (PiSCES). W QMI kompleksy białkowe z lizatów komórkowych są immunoprecypitowane na mikrosfery, a następnie badane za pomocą znakowanego przeciwciała dla innego białka w celu ilościowego określenia obfitości PiSCES. Przeciwciała immunoprecypitacyjne są sprzężone z różnymi obszarami spektralnymi MagBead, co pozwala cytometrowi przepływowemu różnicować wiele równoległych immunoprecypitacji i jednocześnie określać ilościowo ilość przeciwciał sondujących związanych z każdym z nich. QMI nie wymaga znakowania genetycznego i może być wykonywany przy użyciu minimalnej ilości biomateriału w porównaniu z innymi metodami immunoprecypitacji. QMI może być dostosowany do dowolnej zdefiniowanej grupy oddziałujących białek i do tej pory był używany do charakteryzowania sieci sygnałowych w komórkach T i neuronalnych synapsach glutaminianu. Wyniki pozwoliły na sformułowanie nowych hipotez o potencjalnych zastosowaniach diagnostycznych i terapeutycznych. Protokół ten zawiera instrukcje dotyczące wykonywania QMI, od wstępnego wyboru panelu przeciwciał po przeprowadzanie testów i analizowanie danych. Wstępny montaż testu QMI obejmuje badanie przesiewowe przeciwciał w celu wytworzenia panelu i empiryczne określenie odpowiedniego buforu do lizy. Późniejsze przygotowanie odczynnika obejmuje kowalencyjne sprzęganie przeciwciał immunoprecypitacyjnych z MagBeads oraz przeciwciała sondy biotynylowej, dzięki czemu można je znakować fluoroforem sprzężonym ze streptawidyną. Aby uruchomić test, lizat miesza się z MagBeads przez noc, a następnie kulki są dzielone i inkubowane z różnymi przeciwciałami sondy, a następnie etykietą fluoroforową i odczytywane za pomocą cytometrii przepływowej. Przeprowadza się dwa testy statystyczne w celu zidentyfikowania PiSCE, które znacznie różnią się w zależności od warunków eksperymentalnych, a wyniki są wizualizowane za pomocą map cieplnych lub diagramów krawędzi węzłów.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dynamiczne interakcje białko-białko tworzą molekularne kaskady sygnalizacyjne i ruchome struktury, które są funkcjonalną podstawą większości fizjologii komórkowej1. Procesy te są często przedstawiane jako liniowe ścieżki sygnałowe, które przełączają się między stanami ustalonymi na podstawie pojedynczych danych wejściowych, ale dane eksperymentalne i modelowe wyraźnie pokazują, że funkcjonują one jako zintegrowane sieci2,3,4. W przypadku białek G, różne receptory często mają zdolność do aktywacji tego samego białka G, a pojedynczy receptor może również aktywować więcej niż jeden typ białka G5,6. Aby stosunkowo niewielka liczba klas białek G mogła specyficznie modulować szeroki zakres funkcji komórkowych, takich jak transmisja synaptyczna, regulacja hormonów i migracja komórek, komórki muszą zarówno integrować, jak i różnicować te sygnały4,5. Dowody wykazały, że ta specyficzność sygnału, zarówno dla białek G, jak i innych, jest przede wszystkim uzyskiwana na podstawie precyzyjnie dostrojonych interakcji białko-białko i ich dynamiki czasowej1,3,4,5,6,7. Ponieważ sieci sygnalizacyjne składają się z dynamicznych kompleksów białkowych z wieloma wejściami, wyjściami i pętlami sprzężenia zwrotnego, pojedyncze zaburzenie może zmienić ogólną równowagę homeostatyczną fizjologii komórki4,7. Obecnie panuje powszechna zgoda co do tego, że sygnalizacja powinna być badana z perspektywy sieci, aby lepiej zrozumieć, w jaki sposób integracja wielu wejść kontroluje dyskretne funkcje komórkowe w zdrowiu i chorobie7,8,9,10,11,12,13. W związku z tym opracowano ilościową immunoprecypitację multipleksową (QMI) w celu zebrania średnioprzepustowych, ilościowych danych na temat zmian fałdowania w dynamicznych sieciach interakcji białek.

QMI to test oparty na przeciwciałach, w którym lizat komórkowy jest inkubowany z panelem przeciwciał immunoprecypitacyjnych, które są kowalencyjnie sprzężone z kulkami magnetycznymi zawierającymi różne proporcje barwników fluorescencyjnych. Posiadanie specyficznych przeciwciał sprzężonych z różnymi klasami kulek magnetycznych pozwala na jednoczesną koimmunoprecypitację wielu docelowych białek z tego samego lizatu. Po immunoprecypitacji (IP) kulki magnetyczne są inkubowane z drugim, sprzężonym z fluoroforem przeciwciałem sondującym (lub przeciwciałem biotynylowanym w połączeniu ze streptawidyną sprzężoną z fluoroforem). Koasocjacje między białkami rozpoznawanymi przez każdą parę przeciwciało-sonda IP lub PiSCES (białka we wspólnych kompleksach wykrywane przez odsłonięte epitopy powierzchniowe) są następnie wykrywane za pomocą cytometrii przepływowej i mogą być ilościowo porównywane między różnymi warunkami próbki14. Ilustracje w Rysunek 1 pokazuje etapy związane z przeprowadzaniem testu QMI, w tym schemat kulek magnetycznych z immunoprecypitowanymi kompleksami białkowymi znakowanymi fluorescencyjnie sprzężonymi przeciwciałami sondy (Rysunek 1C).

Czułość QMI zależy od stężenia białka w lizacie w stosunku do liczby kulek magnetycznych używanych do immunoprecypitacji, a osiągnięcie rozdzielczości wykrywania 10% zmian krotności wymaga tylko niewielkiej ilości materiału wyjściowego w porównaniu z innymi metodami co-IP14,15. Na przykład ilość materiału wyjściowego użytego w QMI jest podobna do wymaganej w teście immunosorbentowym sprzężonym z enzymem kanapkowym (ELISA), ale w jednym teście QMI wykrywa się wiele interakcji. Testy QMI przy użyciu 20 IP i 20 celów sondy przeprowadzono przy użyciu 1-5 x 105 pierwotnych limfocytów T wyizolowanych z biopsji skóry 4 mm, preparatów synaptosomalnych P2 z 3 mm koronalnego odcinka kory przedczołowej myszy lub 3 x 106 hodowanych pierwotnych neuronów korowych myszy14,16,17. Ta czułość sprawia, że QMI jest przydatny do analizy komórek lub tkanek o ograniczonej dostępności, takich jak próbki kliniczne.

QMI może być dostosowany do dowolnej wcześniej zdefiniowanej sieci interakcji białek (pod warunkiem, że dostępne są przeciwciała) i do tej pory został opracowany do analizy sygnału receptora antygenu limfocytów T (TCR) i podzbioru białek w synapsach glutaminergicznym w neuronach17,18. W badaniach nad sygnalizacją receptora limfocytów T, QMI został najpierw wykorzystany do identyfikacji zmian wywołanych stymulacją w PiSCES, a następnie do odróżnienia pacjentów autoimmunologicznych od grupy kontrolnej, wykrycia endogennej sygnalizacji autoimmunologicznej, a na końcu do wygenerowania hipotezy obejmującej niezrównoważoną podsieć interakcji związanych z chorobą14. Niedawno ten sam panel QMI został użyty do określenia, że wybór tymocytów jest determinowany przez ilościowe, a nie jakościowe różnice w sygnalizacji białkowej związanej z TCR19. W neuronach QMI wykorzystano do opisania specyficznego dla danych wejściowych przegrupowania sieci interakcji białek dla różnych typów sygnałów wejściowych w sposób, który wspiera nowo pojawiające się modele plastyczności synaptycznej17. Dodatkowo, ten synaptyczny panel QMI został wykorzystany do zidentyfikowania różnic w siedmiu mysich modelach autyzmu, grupowania modeli w podgrupy na podstawie ich biosygnatur PiSCES i dokładnego postawienia hipotezy o wspólnym deficycie molekularnym, który wcześniej nie został rozpoznany w jednym z modeli16. Podobne podejście można zastosować do badań przesiewowych innych podgrup, które mogą reagować na różne terapie farmakologiczne, lub do przypisywania leków do określonych podgrup, które reagują. QMI ma potencjalne zastosowania w diagnostyce, podtypowaniu pacjentów i opracowywaniu leków, a także w naukach podstawowych.

Aby skompletować panel przeciwciał QMI, wstępne badania przesiewowe i protokoły selekcji przeciwciał są opisane w sekcji 1 poniżej. Po zidentyfikowaniu paneli przeciwciał w rozdziale 2 opisano protokoły koniugacji wybranych przeciwciał z kulkami magnetycznymi dla IP oraz biotynylacji wybranych przeciwciał sondowych. Protokół przeprowadzania testu QMI na lizatach komórkowych lub tkankowych opisano w sekcji 3. Wreszcie, ponieważ pojedynczy eksperyment może wygenerować ~5 x 105 indywidualnych punktów danych, instrukcje i kody komputerowe pomagające w przetwarzaniu, analizie i wizualizacji danych znajdują się w sekcji 4. Przegląd przepływu pracy opisany w sekcjach 2-4 jest pokazany w Rysunek 1.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Projekt testu

  1. Preparat przeciwciał kandydujących
    1. Dla każdego białka będącego przedmiotem zainteresowania wybierz od 3 do 5 przeciwciał do badań przesiewowych. Jeśli to możliwe, używaj przeciwciał monoklonalnych, które rozpoznają różne epitopy. Uwzględnij również jedno nieswoiste przeciwciało kontrolne.
    2. Aby usunąć Tris, należy przeprowadzić wymianę buforu, dodając przeciwciało do filtra wirowego o mocy 30 kDa, zmniejszając do minimalnej objętości, dodając 500 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i powtarzając 3 razy. W celu usunięcia białek nośnikowych należy przeprowadzić oczyszczanie przeciwciał zgodnie z protokołem producenta (szczegółowe zalecenia dotyczące oczyszczania znajdują się w Tabeli materiałów).
      UWAGA: Dzieje się tak, ponieważ białka nośnikowe i z wolnymi grupami aminowymi (takimi jak Tris) będą reagować z grupami COOH i wygaszać następujące po sobie reakcje sprzęgania kulek i biotynylacji. Upewnij się, że wszystkie przeciwciała są oczyszczone (bez białek nośnikowych) i w buforze wolnym od amin pierwszorzędowych (tj. bez Tris).
    3. Połącz każde przeciwciało z kulkami lateksu modyfikowanego karboksylanem (CML) zgodnie z opisem Davisa i Schruma20. Aby zachować przeciwciało, zmniejsz reakcje sprzęgania kulek nawet o 1/5 (tj. 3,6 x 106 kulek z 10 μl przeciwciała 0,2-1 mg / ml).
    4. Oszacuj liczbę kulek za pomocą hemocytometru (zwykle ~108/ml) i przechowuj w temperaturze 4 °C. Koraliki były przechowywane przez ponad rok i z powodzeniem stosowane w testach QMI, ale okres trwałości lub daty ważności nie zostały formalnie ustalone. NaN3 w buforze B/S zapobiega rozwojowi bakterii.
    5. Biotynylować część każdego przeciwciała (patrz punkt 2.2 poniżej). Przechowywać w temperaturze 4 °C.
    6. Potwierdzić skuteczne sprzężenie kulek CML i dokładne liczenie, barwiąc 1 x 105 kulek przeciwciałem sprzężonym z PE, reagującym na gatunek, u którego przeciwciało zostało podniesione, i odczytując na cytometrze przepływowym.
    7. Potwierdź biotynylację przeciwciał za pomocą dot blot za pomocą streptawidyny-HRP.
    8. Gdy laboratorium wygeneruje odczynniki, o których wiadomo, że są skuteczne, użyj tych odczynników jako kontroli pozytywnej w reakcjach potwierdzających w krokach 1.1.5 i 1.1.6.
  2. Badania przesiewowe przeciwciał metodą IP-FCM (immunoprecypitacja wykrywana za pomocą cytometrii przepływowej)
    1. Zdecyduj się na odpowiedni lizat przesiewowy. W przypadku tego i wszystkich innych etapów badań przesiewowych przed QMI (wszystko, co jest zawarte w tej sekcji 1: Projekt testu), nie należy używać próbek biologicznych o ograniczonej dostępności. Zamiast tego wybierz porównywalny materiał kontrolny, taki jak tkanka myszy typu dzikiego, linie komórkowe lub normalna ludzka tkanka dawcy, która nie jest zasobem ograniczającym.
      UWAGA: Wybór buforu do lizy do tego testu nie jest trywialny i jest omówiony w sekcji 1.5: Wybór detergentu, a także w przedostatnim akapicie sekcji Dyskusja. Standardowe do lizy mają bazę 150 mM NaCl, 50 mM Tris (pH 7,4), 10 mM fluorku sodu, 2 mM orthovanadan sodu oraz koktajle inhibitorów proteazy i fosfatazy. Detergenty kompatybilne z QMI obejmują 1% NP-40, 1% digitoninę, 0,1-1% Triton X-100 i 0,5-1% deoksycholan14,16,17,18,19,21.
    2. Obliczyć całkowitą objętość lizatu, która ma być użyta dla każdego IP, używając 10 μl dla każdej kombinacji IP-sonda, która ma być poddana badaniom przesiewowym. W przypadku badań przesiewowych przeciwciał sondy X i użycia jednej kontroli IgG, każdy IP użyje (X + 1) * (10 μL) * (1,1 dla błędu pipetowania); X+1 ma uwzględniać wymaganą kontrolę sondy IgG. Na przykład w badaniu przesiewowym przeciwciał 3x3 każdy adres IP powinien używać 44 ul. Pamiętaj, aby dołączyć kontrolę IgG IP (patrz przykładowa konfiguracja przesiewowa w Rysunek 2).
    3. Oblicz liczbę kulek CML, która ma być użyta. Jeśli przeprowadzasz badania przesiewowe przeciwciał sondy X, użyj [(X+1) * 5 x 104 kulki]. Idealnie, 5 000 kulek na studzienkę spowoduje, że > 2 000 kulek na studnię zostanie odczytane przez cytometr przepływowy. Na przykład w badaniu przesiewowym przeciwciał 3 x 3 każdy IP powinien użyć 20 000 kulek, co stanowi około 0,66 μl przygotowanego materiału z kulek CML z kroku 1.1.3 (kulki należy najpierw określić ilościowo za pomocą hemocytometru, aby zapewnić dokładność).
    4. Inkubować objętość lizatu z kroku 1.2.2 z objętością każdej kulki CML, która ma być przesiewana od kroku 1.2.3, przez noc w temperaturze 4 °C z rotacją w celu zapobieżenia osadzaniu się kulek. Zazwyczaj inkubacje należy wykonać w pierwszej kolumnie 96-dołkowej płytki do PCR i zakryć nakrętkami z probówkami do PCR.
    5. Odkręć kulki CML o gramaturze 3 200 x g przez 1 minutę i usuń lizat pojedynczym, szybkim ruchem talerza nad zlewem. Na dnie każdej studzienki powinna być widoczna maleńka biała granulka zarówno przed, jak i po strzepnięciu.
    6. Ponownie zawiesić kulki CML w objętości buforu FlyP równej 20 μl dla każdej pary kulka-sonda; dla przeciwciał sondy X należy użyć (X+1) * (20 μL) * (1.1 dla błędu pipetowania), podobnie jak w kroku 1.2.2. W przypadku ekranu 3 x 3 należy ponownie zawiesić w 88 μl bufora FlyP. Bufor FlyP to 100 mM NaCl, 50 mM Tris pH 7,4, 1% BSA, 0,01% NaN3.
    7. Rozprowadź każdy IP w dołkach (X + 1) 96-dołkowej płytki PCR, gdzie X to liczba przeciwciał sondy, które są poddawane badaniu, przy użyciu 20 μl / basenik. Rysunek 2A pokazuje przykładową konfigurację przesiewową.
    8. Przemyć jeszcze 2 razy przy użyciu 200 μl buforu FlyP na studzienkę. Zakręć płytką jak w kroku 1.2.5 i przesuń płytkę, aby usunąć bufor myjący po każdym praniu. Granulki będą bardzo małe, ale powinny być widoczne po każdym praniu.
    9. Dla każdego biotynylowanego przeciwciała, które ma zostać poddane badaniom przesiewowym, należy obliczyć całkowitą objętość jako (Y+1) * 1,1 * 50 μL, gdzie Y oznacza liczbę przeciwciał IP poddawanych badaniom przesiewowym. Rozcieńczyć przeciwciało do stężenia roboczego w tej objętości buforu FlyP, zwykle zaczynając od rozcieńczenia 1:100 zapasu 0,5 mg/ml.
    10. Rozprowadzić każde rozcieńczone przeciwciało w każdej kolumnie płytki 96-dołkowej i upewnić się, że kulki CML są ponownie zawieszone.
    11. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę, obracając się lub pipetując w odstępach 15 minut, aby zapewnić, że kulki CML pozostaną w zawiesinie.
    12. Przemyć 3x w 200 μl buforu FlyP dla każdej wirówki płuczącej i usunąć lizat jak w kroku 1.2.5.
    13. Ponownie zawiesić wszystkie kulki CML w 50 μl 1:200 Streptawidyny-PE w buforze FlyP.
    14. Inkubować w temperaturze 4 °C w ciemności przez 30 minut.
    15. Przemyć 3x w 200 μl buforu FlyP dla każdej wirówki płuczącej i usunąć lizat jak w kroku 1.2.5.
    16. Zawiesić ponownie w 200 μl buforu FlyP, a następnie uruchomić na cytometrze przepływowym.
  3. Wybór przeciwciał do włączenia do testu
    1. Bramka według rozmiaru za pomocą FSC-H vs SSC-H i wyeliminuj dublety za pomocą FSC-H vs FSC-A.
    2. Wygeneruj histogramy intensywności fluorescencji PE i nałóż obie kontrole IgG (sonda testowa IgG z kulkami, sonda testowa z koralikami-IgG) na badane pary (Rysunek 2).
    3. Poszukaj pary koralików-sond, która daje wyraźny sygnał ponad szumem (Rysunek 2B). Ponadto nie jest idealnym rozwiązaniem stosowanie tego samego przeciwciała zarówno dla kulki, jak i sondy. Różnicowe rozpoznawanie epitopów maksymalizuje szanse na zaobserwowanie interakcji, ponieważ niektóre epitopy mogą być zamknięte w pewnych kompleksach białkowych. Jeśli nie ma akceptowalnych opcji, powtórz badanie przesiewowe z dodatkowymi przeciwciałami.
  4. Potwierdzenie swoistości przeciwciał
    1. Aby zapewnić swoistość przeciwciał dla zamierzonych celów, należy użyć próbki lizatu, w której cel został znokautowany; na przykład myszy z nokautem lub linii komórkowej RNAi. Alternatywnie można użyć lizatu z docelowej linii komórkowej, w której białko docelowe uległo sztucznej ekspresji.
    2. Wykonaj IP-FCM zgodnie z opisem w kroku 1.2, modyfikując w celu dopasowania do eksperymentu.
  5. Wybór detergentu
    1. Ponieważ detergenty mają kluczowe znaczenie w eksperymentach co-IP, należy empirycznie przetestować różne warianty, aby upewnić się, że test ma maksymalne prawdopodobieństwo wykrycia zmian. Na początek wybierz stosunkowo mały panel interakcji (4-8), o których wiadomo, że zmieniają się w danym stanie i/lub są szczególnie interesujące dla Twojego badania.
    2. Używając niefluorescencyjnych, sprzężonych z przeciwciałami kulek CML wykonanych do wstępnych badań przesiewowych, wykonaj IP-FCM zgodnie z opisem w 1.2 przy użyciu różnych warunków detergentu buforowego do lizy. Sita detergentu mogą być wykonywane z detergentem jako jedyną zmienną lub z różnymi warunkami komórek dla każdego detergentu. Zawsze używaj kontroli IgG zarówno dla kulek, jak i sond, ponieważ detergenty czasami wytwarzają nieoczekiwane tło w niektórych kombinacjach IP-Probe.
    3. Na podstawie MIF z ekranu wybierz detergent, który optymalizuje sygnał dla interesujących Cię PiSCES. Jest prawdopodobne, że trzeba będzie pójść na pewne kompromisy22.

2. Przygotowanie odczynnika Multiplex

  1. Magnetyczne sprzężenie kulkowe
    1. Korzystając z mapy regionów ściegów magnetycznych, wybierz obszary ściegów, które mają być używane we wzorze, który minimalizuje ryzyko wykrycia krzyżowego. Koralik magnetyczny zazwyczaj rozmazuje się w górę i w prawo, więc unikaj obszarów koralików, które przylegają po przekątnej. Zalecane są koraliki z co drugiej kolumny schematu ściegów pokazanego na stronie internetowej Luminex (https://www.luminexcorp.com/magplex-microspheres/).
    2. Przygotować przeciwciało wolne od nośnika w dawce 0,1 mg/ml w PBS (jak w 1.1.2) w 250 μl. Przechowywać na lodzie do późniejszego użycia.
    3. Mocno wymieszaj kulki magnetyczne, a następnie przelej 250 μl do bursztynowej probówki mikrowirówkowej (w celu ochrony koralików przed fotobieleniem).
    4. Magnetycznie oddziel kulki magnetyczne na 60 s i usuń supernatant.
    5. Dodać 250 μl buforu MES (50 mM MES pH 6,0, 1 mM EDTA), wirować, rozdzielać magnetycznie przez 60 s i usunąć supernatant. Powtórz i ponownie zawieś kulki magnetyczne w 200 μl bufora MES.
    6. Dodać 40 μl MES do 2 mg jednorazowej probówki Sulfo-NHS, aby uzyskać zapas 50 mg/ml.
    7. Dodaj 25 μl świeżo przygotowanego Sulfo-NHS do kulek magnetycznych. Wir.
    8. Dodać 25 μl 50 mg/ml świeżo rozpuszczonego chlorowodorku EDAC [chlorowodorku 1-etylo-3-(-3-dimetyloaminopropylo)karbodimidu, zwanego również EDC] do buforu MES. Wir.
    9. Przykryj i wstrząśnij na wirówce z nasadką przytrzymującą rurkę przez 20 minut w temperaturze pokojowej, 1000 obr./min.
    10. Rozdzielać magnetycznie przez 60 s i usunąć supernatant.
    11. Zawiesić ponownie w 500 μl PBS, wirować, magnetycznie rozdzielać przez 60 s i usunąć supernatant. Powtórzyć.
    12. Zawiesić w 250 μl roztworu przeciwciał z kroku 2.1.2. Wir.
    13. Inkubować 2 godziny w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem na wirowniku przy 1000 obr./min.
    14. Dodać 500 μl PBS do kulek magnetycznych, wirować, magnetycznie rozdzielać przez 60 s i usuwać supernatant.
    15. Dodać 750 μl buforu blokującego/magazynującego (B/S) (1% BSA w PBS pH 7,4, 0,01% NaN3). Przykryć i inkubować 30 minut w temperaturze pokojowej, 1000 obr./min.
    16. Rozdzielać magnetycznie przez 60 s i usunąć supernatant. Zawiesić w 100 μl buforu B/S.
    17. Przechowywać w temperaturze 4 °C. Koraliki były przechowywane przez ponad rok i z powodzeniem stosowane w testach QMI, ale okres trwałości lub daty ważności nie zostały formalnie ustalone. NaN3 w buforze B/S powinien zapobiegać rozwojowi bakterii.
    18. Zatwierdzić sprzężenie kulek magnetycznych poprzez barwienie ~0,25 μl sprzężonych kulek magnetycznych fluorescencyjnym wtórnym gatunkiem anty-gospodarza i odczyt na cytometrze przepływowym, jak w kroku 1.1.5.
  2. Biotynylacja
    1. Upewnij się, że przeciwciała znajdują się w PBS bez białka nośnikowego.
    2. Obliczyć całkowitą μg przeciwciała, które ma być poddane biotynylacji (100-200 μg zalecane do stosowania w multipleksie, 25-50 μg zalecane do badań przesiewowych).
    3. Przygotuj świeżą 10 mM sulfo-NHS-biotyny (można to zrobić, dodając 224 μl ddH2O do probówki bez ważenia 1 mg).
    4. Dodaj 1 μl 10 mM sulfo-NHS-biotyny na 25 μg przeciwciała, wir lub pipetę w górę iw dół, aby wymieszać.
    5. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
    6. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę.
    7. Użyj filtra wirowego o mocy 30 kDa, aby usunąć niezwiązaną biotynę i zatrzymać reakcję. Dodać 500 μl PBS i obracać kolumnę, aż do osiągnięcia minimalnej objętości. Dodaj 500 μl dodatkowego PBS i powtórz dla 3 całkowitych wymian.
    8. Oszacuj stężenie, mierząc absorbancję 1-2 μl na spektrofotometrze, a następnie doprowadź stężenie przeciwciał do 0,5 mg/ml.
    9. Przechowywać w temperaturze 4 °C.

3. Ilościowe multipleksowe immunoprecypitacje

  1. Układ płyt
    UWAGA: Ten test działa najlepiej, gdy jest wykonywany przy użyciu 96-dołkowych płytek i warunków 2-4 próbek.
    1. Zawsze przeprowadzaj odpowiednie kontrole (tj. komórki stymulowane vs. niestymulowane) na tej samej płytce, aby wykryć zmiany między warunkami. Rozprowadź każdą próbkę poziomo na płytce i użyj każdej kolumny dla innego przeciwciała sondy. Zestaw powtórzeń technicznych dla każdej sondy powinien być uruchomiony natychmiast po pierwszym zestawie. Zobacz Rysunek 3 dla przykładu.
    2. Starannie udokumentuj układ płyt, aby ułatwić dokładne ładowanie i analizę płyt.
  2. Przygotowanie próbki i immunoprecypitacja (dzień 1)
    1. Poddać lizie tkanki lub komórki w odpowiednim detergencie z inhibitorami proteazy i fosfatazy i inkubować na lodzie przez 15 minut. Uważaj, aby lizat był zawsze zimny.
      UWAGA: Dokładna ilość podawanego biomateriału i stężenie białka lizatu muszą być określone empirycznie, a niektóre przykłady wcześniej użytych próbek są wymienione w trzecim akapicie wprowadzenia. Ogólnie rzecz biorąc, w zakresie 200 μl białka 2 mg/ml na próbkę udało się w przeszłości dla 20 IP i 20 celów sondy, ale idealne dane wejściowe dla każdego panelu przeciwciał i typu komórki lub tkanki muszą zostać określone empirycznie.
    2. Wirować w temperaturze 4 °C przez 15 minut przy 16 000 x g w celu usunięcia membran i zanieczyszczeń; utrzymać supernatant w postaci lizatu.
    3. Wykonaj test BCA lub podobny, aby określić stężenia białka, a następnie znormalizuj stężenie białka między próbkami. Jeśli używasz komórek, zacznij od równej liczby komórek na warunek, a normalizacja jest opcjonalna.
    4. Przygotuj główną mieszankę kulek magnetycznych, która zawiera ~ 250 kulek magnetycznych każdej klasy na studzienkę w teście. Dostosuj liczbę ściegów po analizie danych, tak aby w przyszłych testach odczytywano średnio 110 koralików z każdej klasy na studzienkę.
      UWAGA: Przykładowe obliczenie: (Objętość nowego ściegu) = [(Średnia przebiegu) / 110] * (poprzednia objętość ściegu). Objętości ściegów należy regulować w ten sposób mniej więcej co 8 cykli lub w razie potrzeby. Zazwyczaj 3-4 μl każdego koralika magnetycznego (przygotowanego jak wyżej) są używane do eksperymentu z 2 płytkami.
    5. Przemyj mieszankę kulek magnetycznych 2x w buforze FlyP z separacją magnetyczną, a następnie ponownie zawieś w buforze FlyP. Do ponownego zaparcia należy użyć 10 μl na próbkę na płytkę. Bufor FlyP to 100 mM NaCl, 50 mM Tris pH 7,4, 1% BSA, 0,01% NaN3.
    6. Po dokładnym zwirowaniu mieszanki kulek magnetycznych, podwielokrotność 10 μl przelać do lodowatych probówek do mikrowirówek (jedna probówka na próbkę). Dodaj równe objętości lizatu (o znormalizowanych stężeniach) do każdej probówki w celu immunoprecypitacji.
    7. Mieszaninę lizatu i kulki magnetycznej podzielić na dwie probówki do jednej probówki dla każdej uruchamianej płytki; np. w przypadku doświadczenia z 2 płytkami, rozdzielić lizat na dwie probówki. Umieścić probówki na rotatorze w temperaturze 4 °C na noc w celu immunoprecypitacji, przykryte, aby nie dopuścić do światła.
  3. Przeprowadzanie testu (dzień 2)
    1. Zacznij od probówek z kulkami magnetycznymi z lizatu na płytkę #1. Użyj stojaka na kulki magnetyczne, aby usunąć lizat z kulek magnetycznych i zarezerwuj lizat do przyszłej analizy. Umyj koraliki 2x w 500 μl lodowatego buforu FlyP. Utrzymuj probówki zawsze na lodzie lub w temperaturze 4 °C.
    2. Obliczyć objętość zawiesiny jako (liczba sond) * (2 kontrpróby techniczne) * (25 μl na studzienkę) * (1,1 dla błędu pipetowania). Ponownie zawieś adresy IP w obliczonej objętości lodowatego bufora FlyP.
    3. Po dokładnym ponownym zaparciu kulek magnetycznych przez delikatne pipetowanie, rozprowadzić 25 μl na dołku na płaskodennej płytce 96-dołkowej na lodzie.
    4. Na innej 96-dołkowej płytce rozcieńczyć biotynylowane przeciwciała sondy do 2x stężenia roboczego (stężenie robocze wynosi zwykle 1:100 lub 1:200, określone empirycznie) w buforze FlyP, tak aby ich kolejność odpowiadała kolumnom w układzie płytki (patrz Rysunek 3). Ostateczna objętość przeciwciał sondy w stężeniu roboczym będzie wynosić 50 μl na studzienkę, więc objętość każdego 2x przygotowanego przeciwciała powinna wynosić (25 μL) * (liczba próbek biologicznych) * (2 kontrpróby techniczne) * (1,1 dla błędu pipetowania).
    5. Za pomocą pipety wielokanałowej rozprowadzić 25 μl rozcieńczenia przeciwciał z każdej sondy na płytce testowej zawierającej kulki magnetyczne.
    6. Wstrząsnąć na poziomej wytrząsarce płytkowej w celu wymieszania i ponownego zawieszenia kulek magnetycznych, a następnie inkubować w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę, wytrząsając z prędkością 450 obr./min w ciemności.
    7. Umyć 3x buforem FlyP na magnetycznej podkładce do płyt w temperaturze 4 °C.
    8. Zawiesić kulki magnetyczne w 50 μl 1:200 Streptawidyny-PE.
    9. Wstrząsnąć w celu wymieszania i ponownego zaparcia kulek, a następnie inkubować w temperaturze 4 °C przez 30 minut, wstrząsając z prędkością 450 obr./min w ciemności.
    10. Umyć 3x buforem FlyP na magnetycznej podkładce do płyt w temperaturze 4 °C.
    11. Zawiesić w 125 μl buforu FlyP.
    12. Wstrząsaj przez 1 minutę przy 900 obr./min, aby dokładnie zawiesić kulki.
    13. Uruchomić na cytometrze przepływowym z chłodzeniem (patrz schemat na rysunku S1). Użyj ustawienia "wysoki cel RP1" w oprogramowaniu cytometru przepływowego i warunku zatrzymania 1,000 kulek na obszar (znacznie przekraczając liczbę, która powinna znajdować się w każdym pojedynczym dołku, aby zapobiec przedwczesnemu zatrzymaniu maszyny) i objętość próbki 80 μl.
    14. Wstrzymaj bieg w połowie i ponownie zawieś koraliki, aby zapobiec osiadaniu.
    15. Eksportuj pliki danych w formacie .xml.
    16. Powtórz ten proces dla pozostałych płytek, zaczynając od kroku 3.3.1.

4. Analiza danych

UWAGA: Kod ANC został zaprojektowany do porównania dwóch warunków z N = 4 eksperymentów, każdy z 2 technicznymi powtórzeniami dla każdego warunku. Na przykład, komórki są stymulowane cztery niezależne razy, QMI jest uruchamiany przez cztery różne dni na komórkach kontrolnych (niestymulowanych) i stymulowanych, z technicznymi powtórzeniami jak powyżej, a analiza danych przebiega zgodnie z opisem poniżej.

  1. Adaptacyjny nieparametryczny z regulowanym odcięciem alfa (ANC)
    1. Otwórz MATLAB i ustaw Active Directory na folder zawierający składniki programu ANC oraz .xml pliki wyeksportowane z cytometru przepływowego.
    2. Wypełnij plik "Wejście ANC", aby odzwierciedlić szczegóły projektu eksperymentalnego. Przykładowy plik zawarty w pliku uzupełniającym został wstępnie wypełniony w celu uruchomienia przykładowych danych, które również zostały dostarczone.
    3. Uruchom program, który zapisze plik .csv w usłudze Active Directory. Plik zgłasza PiSCES, które znacząco różnią się, na poziomie fałszywie dodatnim (alfa) 0,05, między warunkami kontrolnymi i eksperymentalnymi, we wszystkich 4 powtórzeniach eksperymentalnych lub co najmniej 3/4 powtórzeniach.
    4. Zwróć uwagę na "trafienia ANC", które definiuje się jako PiSCES ze znaczącymi różnicami w co najmniej 3 powtórzeniach eksperymentalnych, reprezentowanych w pliku jako 3/4∩4/4, do użycia w kroku 4.3.1.
  2. Analiza sieci korelacji ważonych23 (CNA)
    1. Wklej i transponuj tytuły kolumn pliku wyjściowego danych przez Matlaba kończące się na "_MFI. CSV" w pierwszym wierszu nowego arkusza programu Excel. Dodaj kolumny "eksperyment" dla numeru eksperymentu i "leczenie" dla leczenia eksperymentalnego lub innych zmiennych, które mają być analizowane. Zapisz ten plik jako "traits.csv".
    2. Otwórz R studio i ustaw katalog roboczy na folder zawierający "_MFI. CSV" i "CECHY. CSV".
    3. Uruchom polecenia języka R zgodnie z opisem w pliku polecenia z komentarzem i szczegółowo opisanymi w instrukcjach dołączonych do plików. Moduły WCNA istotnie skorelowane z każdą cechą eksperymentalną są wyprowadzane jako plik graficzny, a korelacja każdej interakcjiIP i_ProbeJ z każdym modułem jest wyprowadzana jako plik .csv.
    4. Zwrócić uwagę na "trafienia CNA", które definiuje się jako interakcje z członkostwem w module (MM) > 0,7 i p < 0,05 dla członkostwa w module, który został zidentyfikowany jako istotnie skorelowany ze zmienną eksperymentalną będącą przedmiotem zainteresowania, do wykorzystania w kroku 4.3.1.
  3. Pozytywne "trafienia" i wizualizacja
    1. Dla każdej interakcji z listy "3/4∩4/4 trafień" w pliku wyjściowym ANC (z kroku 4.1.4) określ, czy ta interakcja jest również "trafieniem CNA", sprawdzając plik wyjściowy CNA (patrz krok 4.2.6). Utwórz nową kolumnę, która wskazuje, czy każde trafienie ANC jest również trafieniem CNA.
    2. Oblicz średnią wartość logarytmu2-krotnej zmiany dla każdego trafienia ANC∩CNA, uśredniając wartości podane w arkuszu kalkulacyjnym wyjściowym ANC "_Hits.csv" z kroku 4.1.3. Konwertuj wartości na logarytm2-krotnej zmiany przed uśrednieniem. W przypadku interakcji, które były istotne tylko w 3/4 powtórzeniach, usuń wartość odstającą.
    3. Utwórz arkusz kalkulacyjny z każdym działaniem ANC∩CNA wymienionym jako adres IP w jednej kolumnie, sondą w drugiej kolumnie i wartością zmiany w fałdzie w trzeciej kolumnie. Użyj tego arkusza kalkulacyjnego, aby utworzyć diagram krawędzi węzła w Cytoscape, importując plik jako sieć.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie przesiewowe przeciwciał<br /> Rysunek 2B pokazuje wyniki badania przesiewowego dla białka Connexin36. Większość kombinacji IP_probe nie wytwarza sygnału przez kontrole IgG. IP z przeciwciałem monoklonalnym 1E5 i sondą z 1E5 lub przeciwciałem poliklonalnym 6200 powoduje przesunięcie w prawo w dystrybucji kulek w porównaniu z kontrolami IgG. W tym przypadku IP 1E5 i sonda 6200poly zostały wybrane tak, aby uniknąć stosowania tego samego przeciwcia...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Test QMI wymaga znacznych inwestycji w opracowanie panelu przeciwciał, sprzętu i odczynników, ale po ustaleniu testu można zebrać wielowymiarowe dane obserwujące sieci interakcji białek, gdy reagują one na bodźce kontrolowane eksperymentalnie. Z technicznego punktu widzenia QMI wymaga starannego pipetowania i śledzenia lokalizacji próbek i dołków przeciwciał. Przydatne jest staranne oznakowanie płytek testowych, a także wykonanie szczegółowego szablonu lokalizacji odwiertów na papierze, który jest następnie zapisywany do...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy pragną podziękować Tessie Davis za ważny wkład w rozwój testów QMI, a obecnym i byłym członkom laboratoriów Smith and Schrum za wskazówki techniczne i wkład intelektualny. Praca ta została sfinansowana z grantów NIMH R01 MH113545 i R00 MH 102244.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
96-dołkowe płytki płaskodenneBio Rad171025001
96-dołkowe płytki do PCRVWR82006-704
Bioplex 200 z HTFBio Rad171000205zmodyfikowany w celu częściowego chłodzenia, szczegółowe informacje znajdują się na rysunku S1
Stacja mycia Bio-Plex ProBio Rad30034376
BSASigma
Koraliki CMLInvitrogenC37481
EDTASigmaE6758
EZ-Link Sulfo-NHS-BiotinThermo ScientificA39256
MagPlex MicrospheresLuminexMC12xxx-01xxx to 3-cyfrowy obszar koralików
Melon Gel IgG Spin Purification KitThermo Scientific45206używany do oczyszczania przeciwciał
MESSigmaM3671
Folia do mikropłytek, niesterylnaUSA Scientific2920-0000
Koktajl inhibitorów fosfotazy #2SigmaP5726
Koktajl inhibitorów proteazySigmaP8340
Lodówka do przygotowywania kanapekNorlakeSMP 36 15do niestandardowego chłodzenia Bioplex 200
Sodium fluorekSigma201154
Ortowanadan soduSigma450243
Streptawidyna-PEBioLegend405204
Sulfo NHSThermo ScientificA39269
TrisFisher ScientificBP152
System

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pawson, T., Nash, P. Protein-protein interactions define specificity in signal transduction. Genes and Development. 14 (9), 1027-1047 (2000).
  2. Rodríguez-Jorge, O., et al. Cooperation between T cell receptor and Toll-like receptor 5 signaling for CD4. Science Signaling. 12 (577), (2019).
  3. Bugaj, L. J., et al. Cancer mutations and targeted drugs can disrupt dynamic signal encoding by the Ras-Erk pathway. Science. 361 (6405), (2018).
  4. Pawson, T. Dynamic control of signaling by modular adaptor proteins. Current Opinion in Cell Biology. 19 (2), 112-116 (2007).
  5. Hamm, H. E. The many faces of G protein signaling. Journal of Biological Chemistry. 273 (2), 669-672 (1998).
  6. Lohse, M. J., Hofmann, K. P. Spatial and Temporal Aspects of Signaling by G-Protein-Coupled Receptors. Molecular Pharmacology. 88 (3), 572-578 (2015).
  7. Eltschinger, S., Loewith, R. TOR Complexes and the Maintenance of Cellular Homeostasis. Trends in Cell Biology. 26 (2), 148-159 (2016).
  8. Papin, J. A., Hunter, T., Palsson, B. O., Subramaniam, S. Reconstruction of cellular signalling networks and analysis of their properties. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (2), 99-111 (2005).
  9. Komarova, N. L., Zou, X., Nie, Q., Bardwell, L. A theoretical framework for specificity in cell signaling. Molecular Systems Biology. 1, 23(2005).
  10. Schrum, A. G., Gil, D. Robustness and Specificity in Signal Transduction via Physiologic Protein Interaction Networks. Clinical and Experimental Pharmacology. 2 (3), (2012).
  11. De Las Rivas, J., Fontanillo, C. Protein-protein interactions essentials: key concepts to building and analyzing interactome networks. PLoS Computational Biology. 6 (6), 1000807(2010).
  12. Ron, D., Walter, P. Signal integration in the endoplasmic reticulum unfolded protein response. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (7), 519-529 (2007).
  13. Bogdan, A. R., Miyazawa, M., Hashimoto, K., Tsuji, Y. Regulators of Iron Homeostasis: New Players in Metabolism, Cell Death, and Disease. Trends in Biochemical Sciences. 41 (3), 274-286 (2016).
  14. Smith, S. E., et al. Multiplex matrix network analysis of protein complexes in the human TCR signalosome. Science Signaling. 9 (439), 7(2016).
  15. Schrum, A. G., et al. High-sensitivity detection and quantitative analysis of native protein-protein interactions and multiprotein complexes by flow cytometry. Science's STKE. 2007 (389), (2007).
  16. Brown, E. A., et al. Clustering the autisms using glutamate synapse protein interaction networks from cortical and hippocampal tissue of seven mouse models. Molecular Autism. 9 (1), 48(2018).
  17. Lautz, J. D., Brown, E. A., Williams VanSchoiack, A. A., Smith, S. E. P. Synaptic activity induces input-specific rearrangements in a targeted synaptic protein interaction network. Journal of Neurochemistry. 146 (5), 540-559 (2018).
  18. Smith, S. E., et al. Signalling protein complexes isolated from primary human skin-resident T cells can be analysed by Multiplex IP-FCM. Experimental Dermatology. 23 (4), 272-273 (2014).
  19. Neier, S. C., et al. The early proximal αβ TCR signalosome specifies thymic selection outcome through a quantitative protein interaction network. Science Immunology. 4 (32), (2019).
  20. Davis, T. R., Schrum, A. G. IP-FCM: immunoprecipitation detected by flow cytometry. Journal of Visualized Expiriments. (46), (2010).
  21. Smith, S. E., et al. IP-FCM measures physiologic protein-protein interactions modulated by signal transduction and small-molecule drug inhibition. PLoS One. 7 (9), 45722(2012).
  22. Lautz, J., et al. Activity-dependent changes in synaptic protein complex composition are consistent in different detergents despite differential solubility. BioRXiv. , (2019).
  23. Langfelder, P., Horvath, S. WGCNA: an R package for weighted correlation network analysis. BMC Bioinformatics. 9, 559(2008).
  24. Schrum, A. G., Gil, D., Turka, L. A., Palmer, E. Physical and functional bivalency observed among TCR/CD3 complexes isolated from primary T cells. Journal of Immunology. 187 (2), 870-878 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ilo ciowa multipleksowa immunoprecypitacjaanaliza cytometrycznaimmunoprecypitacja z u yciem kulek magnetycznychkoasocjacje bia eksystemy transdukcji sygna udob r panelu przeciwciaznakowanie streptawidyn PEwizualizacja sieci w programie Cytoscape

Powiązane artykuły