Artykuł metodologiczny

Ulepszony test oparty na białku zielonej fluorescencji do badania wzrostu neurytów w neuronach pierwotnych

6.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60031

⸱

19 października 2019

 ,  ,  , 
1School of Life Sciences, The Chinese University of Hong Kong, Hong Kong Special Administrative Region, 2Shenzhen Institutes of Advanced Technology, Chinese Academy of Sciences, Shenzhen

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

W tym raporcie opisujemy prosty protokół badania wzrostu neurytów w embrionalnych neuronach korowych szczurów poprzez jednoczesną transfekcję z EGFP i interesującym nas białkiem.

Streszczenie

Wzrost neurytu jest fundamentalnym wydarzeniem w tworzeniu obwodów nerwowych podczas rozwoju układu nerwowego. Poważne uszkodzenia neurytów i dysfunkcja synaps występują w różnych chorobach neurodegeneracyjnych i zwyrodnieniach związanych z wiekiem. Badanie mechanizmów regulujących rozrost neurytów nie tylko rzuciłoby cenne światło na procesy rozwojowe mózgu, ale także na takie zaburzenia neurologiczne. Ze względu na niską wydajność transfekcji, obecnie trudno jest zbadać wpływ określonego białka na wzrost neurytów w pierwotnych neuronach ssaków. W tym miejscu opisujemy prostą metodę badania wzrostu neurytów poprzez kotransfekcję pierwotnych neuronów korowych szczura za pomocą EGFP i białka będącego przedmiotem zainteresowania (POI). Metoda ta pozwala na identyfikację neuronów transfekowanych POI poprzez sygnał EGFP, a tym samym można precyzyjnie określić wpływ POI na przerost neurytów. Ten test oparty na EGFP zapewnia wygodne podejście do badania szlaków regulujących wzrost neurytów.

Wprowadzenie

Neuryty, w tym zarówno aksony, jak i dendryty, są projekcjami neuronów biorących udział w tworzeniu sieci neuronowych. Dynamiczny rozrost neurytów jest niezbędny do rozwoju neurologicznego. Mechanizmy regulacyjne leżące u podstaw tego zjawiska pozostają jednak niejasne. W szczególności uszkodzenia neurytów są często obserwowane w różnych chorobach neurodegeneracyjnych i po urazach mózgu1. W związku z tym badanie roli domniemanych cząsteczek w różnych szlakach regulacyjnych wzrostu neurytów poprawiłoby nasze zrozumienie tego procesu. Co więcej, może ujawnić nowe cele terapeutyczne dla różnych zaburzeń neurologicznych. Linie komórkowe neuronów są cennymi modelami do badania procesów neuronalnych, w tym wzrostu neurytów, ponieważ są łatwe do manipulowania i transfekcji2,3. Jednak donoszono, że dryf genetyczny występuje w niektórych powszechnie używanych liniach komórkowych, co może prowadzić do zmian w ich reakcjach fizjologicznych4. Ponadto wykazano zróżnicowaną ekspresję białek między liniami komórek neuronalnych a neuronami pierwotnymi. Na przykład PC12, neuronalna linia komórkowa pochodząca z nadnerczy szczura, która jest szeroko stosowana do badania wzrostu neurytów2,3, nie wyraża receptorów NMDA5. Ponadto zaproponowano, że zmniejszona reakcja mysiej linii neuroblastoma neuro-2a na neurotoksyny w porównaniu z neuronami pierwotnymi wynika z braku ekspresji niektórych receptorów błonowych i kanałów jonowych6. Dlatego neurony pierwotne są bardziej pożądanym i reprezentatywnym modelem do badania wzrostu neurytów. Jednak korzystanie z neuronów pierwotnych jest utrudnione przez ich niską wydajność transfekcji7.

Tutaj opisujemy metodę, która polega na kotransfekcji białka będącego przedmiotem zainteresowania (POI) i EGFP do pierwotnych neuronów korowych szczura. EGFP działa jako marker morfologiczny do identyfikacji pomyślnie transfekowanych neuronów i umożliwia pomiar neurytów. Zwalidowaliśmy tę metodę, używając związków/cząsteczek, które, jak doniesiono, modulują wzrost neurytów. Co więcej, do zilustrowania tego podejścia wykorzystano FE65, neuronalne białko adaptorowe, które, jak wykazano, stymuluje wzrost neurytów8,9. Protokół ten obejmuje (1) izolację pierwotnych neuronów korowych z embrionalnych zarodków szczurów w dniu 18 (E18), (2) kotransfekcję neuronów za pomocą EGFP i POI (FE65 w tym badaniu) oraz (3) obrazowanie i analizę neuronów za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazu ImageJ z wtyczką NeuronJ10,11.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury były zgodne ze standardami etycznymi komisji etyki eksperymentów na zwierzętach Chińskiego Uniwersytetu w Hongkongu.

1. Przygotowanie szkiełek nakrywkowych

  1. Umieścić sterylne okrągłe szkiełko nakrywkowe o średnicy 18 mm w każdym dołku 12-dołkowej płytki do hodowli tkankowej.
  2. Pokryć szkiełko nakrywkowe 5 μg/ml roztworem poli-D-lizyny w wilgotnym inkubatorze o temperaturze 37 °C przez co najmniej 1 godzinę.
  3. Odessać roztwór poli-D-lizyny z płytki do hodowli tkankowej i raz spłukać powlekane szkiełka nakrywkowe sterylną wodą.

2. Analiza neuronów embrionalnych szczurów

  1. Uśmierc szczura Sprague'a-Dawleya w ciąży w wieku ciążowym 18 dni (E18) przez zwichnięcie szyjki macicy lub uduszenieCO2.
    nuta: Prosimy o zapoznanie się z lokalnymi przepisami dotyczącymi uśmiercania ciężarnych szczurów.
  2. Otwórz jamę brzuszną ciężarnej szczurki nożyczkami preparacyjnymi i przenieś macicę na 10-centymetrową szalkę Petriego.
  3. Ostrożnie otwórz macicę i worek owodniowy małymi nożyczkami preparacyjnymi i usuń łożysko z zarodka szczura za pomocą małych nożyczek preparacyjnych. Przenieść cały zarodek na 10-centymetrową szalkę Petriego ze wstępnie schłodzonym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami uzupełnionym glukozą (PBS-glukoza, 10 mM fosforany sodu, 2,68 mM chlorek potasu, 140 mM chlorek sodu i 3 g/l glukozy) za pomocą pary małych kleszczyków.
  4. Przeciąć wzdłuż szwu strzałkowego czaszki i ostrożnie go otworzyć małymi nożyczkami do preparowania. Przenieś embrionalny mózg za pomocą małej płaskiej szpatułki na 10-centymetrową szalkę Petriego z lodowatą glukozą PBS.
  5. Oddziel dwie półkule mózgowe od móżdżku i pnia mózgu za pomocą dwóch pęset #5 pod mikroskopem preparacyjnym.
    nuta: Zobacz reference12, aby zapoznać się ze strukturą mózgu szczura.
  6. Usuń opony mózgowe za pomocą pęsety #5.
  7. Odizoluj korę mózgową od półkul mózgowych za pomocą dwóch prostych pęset #5.
  8. Przenieś izolowaną korę do lodowatego PBS-glukozy w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml.

3. Pierwotna hodowla neuronów korowych

UWAGA: Wszystkie procedury w krokach 3 i 4 są wykonywane w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II.

  1. Ustabilizować wyizolowaną korę grawitacyjnie w temperaturze 4 °C przez 5 minut i odessać PBS-glukozę.
  2. Dodaj 1 ml 0,05% trypsyny-EDTA do wyizolowanej kory i delikatnie wymieszaj, stukając i inkubując tkankę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 10 minut, aby umożliwić trawienie enzymatyczne. Delikatnie postukaj w probówkę do mieszania co 2 minuty.
  3. Dodać 4 ml pożywki podtrzymującej (np. pożywki neurobazalnej) do mieszaniny tkanka/trypsyna.
    nuta: Wszystkie pożywki podtrzymujące stosowane w tym protokole są uzupełnione o penicylinę-streptomycynę i B-27 supplement13.
  4. Delikatnie odciąć tkankę przez rozcieranie za pomocą pipety o pojemności 1 ml.
  5. Zdeocjowane komórki osadzać przez odwirowanie przy 200 x g przez 5 minut. Odessać supernatant.
  6. Powtórz kroki od 3.5 do 3.7 dwukrotnie.
  7. Zawiesić osad komórkowy w 1 ml pożywki konserwującej.
  8. Dodać 10 μl 0,4% roztworu błękitu trypanowego do 10 μl zawiesiny komórek w celu zliczenia żywych komórek za pomocą hemocytometru.
  9. Umieść neurony o gęstości 65 000/cm2 (żywe komórki) w 1 ml pożywki podtrzymującej na dołek na 12-dołkowej płytce.

4. Transfekcja i utrwalanie komórek

  1. Po 2 dniach in vitro (DIV2) transfekować 0,5 μg konstruktu EGFP (pEGFP-C1) do neuronów razem z 0,5 μg POI lub bez 0,5 μg POI za pomocą 1 μl odczynnika do transfekcji (np. Lipofectamine 2000). Skorzystaj z instrukcji producenta.
    nuta: Konstrukty ekspresji ssaków przygotowano przy użyciu zestawu do przygotowania plazmidu wolnego od endotoksyn. Leczenie substancjami chemicznymi/cząsteczkami (w tym manuskrypcie zastosowano cytochalazynę D (Cyto D) i czynnik wzrostu nerwów (NGF)) można wykonać po 6 godzinach od transfekcji.
  2. Odessać pożywkę hodowlaną 24 godziny po transfekcji i przemyć transfekowane komórki jednorazowo PBS o temperaturze 37 °C (10 mM fosforanów sodu, 2,68 mM chlorku potasu, 140 mM chlorku sodu).
  3. Utrwal komórki 4% paraformaldehydem w PBS przez 10 minut w ciemności w temperaturze pokojowej.
  4. Umyj utrwalone komórki trzykrotnie PBS.
  5. Dodaj minimalną ilość fluorescencyjnego medium mocującego na szkiełko mikroskopowe. Ostrożnie przenieść szkiełko nakrywkowe z płytki 12-dołkowej na podłoże montażowe, tak aby próbka była skierowana w stronę szkiełka podstawowego.
    nuta: Uszczelnij krawędź szkiełka nakrywkowego lakierem do paznokci, jeśli używane jest wodne medium mocujące.

5. Pomiar rozrostu neurytu

  1. Użyj obiektywu 40x do robienia zdjęć za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego.
  2. Przechwytuj obrazy z co najmniej 40 nienaruszonych neuronów z sygnałem EGFP na transfekcję.
  3. Otwórz przechwycony obraz w oprogramowaniu ImageJ za pomocą wtyczki NeuronJ11, aby zmierzyć długość najdłuższego neurytu, od ciała komórki do czubka stożka wzrostu, każdego obrazowanego neuronu.
  4. Przeanalizuj dane uzyskane za pomocą oprogramowania, aby określić wpływ docelowych białek na wzrost neurytów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby przetestować tę metodologię, zastosowano Cyto D oraz czynnik wzrostu nerwów NGF, o których wykazano odpowiednio, że hamują i stymulują wypustki neurytów14,15,16. Długość neurytów w neuronach przetransfekowanych EGFP mierzono po zastosowaniu Cyto D lub NGF. Wydajność transfekcji EGFP do neuronów wyniosła 2,7% (policzono 1 068 neuronów). Jak pokazano na Rysunku 1

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Jak wspomniano wcześniej, PC12 i jego subklony są szeroko stosowane do badania ekspansji neurytów, ponieważ mają doskonałą wydajność transfekcji 2,3. W przeciwieństwie do tego, neurony pierwotne mają niski współczynnik transfekcji, co jest główną przeszkodą w badaniu regulatorów wzrostu neurytów przez transfekcję7. W tym miejscu opisujemy wygodny protokół ilościowego określania wzrostu neurytów w neuronach pierwotnych. Pomimo niskiej ogóln...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów z treścią niniejszego artykułu.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez fundusze z Research Grants Council Hong Kong, Health and Medical Research Fund (Hong Kong), programu bezpośrednich grantów CUHK, funduszu wieczystego United College oraz TUYF Charitable Trust.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
#5 pęsetaRegine5-COB
18 mm Szkiełka nakrywkoweThermo ScientificCB00180RASterylizuj przed użyciem
Suplement B27Gibco17504044
Cytochalasin DInvitrogenPHZ1063rozpuszczony w DMSO
D-(+)-GlukozaSigma-AldrichG8270
DimetylosulfotlenekSigma-AldrichD2650
, 10 cmWorld Precision Instruments14393
Nożyczki preparacyjne, 12.5 cmWorld Precision Instruments15922
EndoFree Plasmid Maxi KitQIAGEN12362
Fluorescencyjne medium montażoweDakoS302380
Lipofectamine 2000 Transfekcja OdczynnikInvitrogen11668019
Neurobasal MediumGibco21103049
NGF 2.5S Natywne białko myszyGibco13257019
Nugent Utility Szczypce, 10 mm, Straight TipWorld Precision Instruments504489
ParaformaldehydSigma-AldrichP6148
pEGFP-C1Clontech#6084-1
pCI FE65Zobacz referencje 8 i 15
Tabletki PBSGibco18912014
Penicylina-StreptomycynaGibco15140122
Bromowodorek poli-D-lizynySigma-AldrichP7280
SzpatułkaSigma-AldrichS4147
Trypsyna-EDTA (0,05%), fenol czerwonyGibco25300062
Roztwór błękitu trypanowego, 0,4%15250061Gibco
Nożyczki preparacyjne

Bibliografia

  1. Kaplan, A., Bueno, M., Hua, L., Fournier, A. E. Maximizing functional axon repair in the injured central nervous system: Lessons from neuronal development. Developmental Dynamics. 247 (1), 18-23 (2018).
  2. Harrill, J. A., Mundy, W. R. Quantitative assessment of neurite outgrowth in PC12 cells. Methods in Molecular Biology. 758, 331-348 (2011).
  3. Yeyeodu, S. T., Witherspoon, S. M., Gilyazova, N., Ibeanu, G. C. A rapid, inexpensive high throughput screen method for neurite outgrowth. Current Chemical Genomics. 4, 74-83 (2010).
  4. Ben-David, U., et al. Genetic and transcriptional evolution alters cancer cell line drug response. Nature. 560 (7718), 325-330 (2018).
  5. Edwards, M. A., Loxley, R. A., Williams, A. J., Connor, M., Phillips, J. K. Lack of functional expression of NMDA receptors in PC12 cells. Neurotoxicology. 28 (4), 876-885 (2007).
  6. LePage, K. T., Dickey, R. W., Gerwick, W. H., Jester, E. L., Murray, T. F. On the use of neuro-2a neuroblastoma cells versus intact neurons in primary culture for neurotoxicity studies. Critical Reviews in Neurobiology. 17 (1), 27-50 (2005).
  7. Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. Journal of Neuroscience. 30 (18), 6171-6177 (2010).
  8. Cheung, H. N., et al. FE65 interacts with ADP-ribosylation factor 6 to promote neurite outgrowth. The FASEB Journal. 28 (1), 337-349 (2014).
  9. Li, W., et al. Neuronal adaptor FE65 stimulates Rac1-mediated neurite outgrowth by recruiting and activating ELMO1. Journal of Biological Chemistry. 293 (20), 7674-7688 (2018).
  10. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  11. Meijering, E., et al. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry. Part A: the Journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (2), 167-176 (2004).
  12. Swanson, L. W. Brain maps 4.0-Structure of the rat brain: An open access atlas with global nervous system nomenclature ontology and flatmaps. The Journal of Comparative Neurology. 526 (6), 935-943 (2018).
  13. Brewer, G. J. Serum-free B27/neurobasal medium supports differentiated growth of neurons from the striatum, substantia nigra, septum, cerebral cortex, cerebellum, and dentate gyrus. Journal of Neuroscience Research. 42 (5), 674-683 (1995).
  14. Yamada, K. M., Spooner, B. S., Wessells, N. K. Axon growth: roles of microfilaments and microtubules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 66 (4), 1206-1212 (1970).
  15. Casella, J. F., Flanagan, M. D., Lin, S. Cytochalasin D inhibits actin polymerization and induces depolymerization of actin filaments formed during platelet shape change. Nature. 293 (5830), 302-305 (1981).
  16. Calabrese, E. J. Enhancing and regulating neurite outgrowth. Critical Reviews in Toxicology. 38 (4), 391-418 (2008).
  17. Lau, K. F., et al. Dexras1 Interacts with FE65 to Regulate FE65-Amyloid Precursor Protein-dependent Transcription. Journal of Biological Chemistry. 283 (50), 34728-34737 (2008).
  18. Cui, X., et al. Niacin treatment of stroke increases synaptic plasticity and axon growth in rats. Stroke. 41 (9), 2044-2049 (2010).
  19. Khodosevich, K., Monyer, H. Signaling involved in neurite outgrowth of postnatally born subventricular zone neurons in vitro. BMC Neuroscience. 11, 18(2010).
  20. Tang, F., et al. Resveratrol Enhances Neurite Outgrowth and Synaptogenesis Via Sonic Hedgehog Signaling Following Oxygen-Glucose Deprivation/Reoxygenation Injury. Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 43 (2), 852-869 (2017).
  21. He, W., Liu, Y., Tian, X. Rosuvastatin Improves Neurite Outgrowth of Cortical Neurons against Oxygen-Glucose Deprivation via Notch1-mediated Mitochondrial Biogenesis and Functional Improvement. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 6(2018).
  22. Tesarova, P., et al. Receptor for advanced glycation end products (RAGE)--soluble form (sRAGE) and gene polymorphisms in patients with breast cancer. Cancer Investigation. 25 (8), 720-725 (2007).
  23. Park, S. Y., et al. Hippocalcin Promotes Neuronal Differentiation and Inhibits Astrocytic Differentiation in Neural Stem Cells. Stem Cell Reports. 8 (1), 95-111 (2017).
  24. Radbruch, A. Immunofluorescence: Basic Considerations. Flow Cytometry and Cell Sorting. , Springer Lab Manual Book Series. 38-52 (2000).
  25. Wang, T., Larcher, L. M., Ma, L., Veedu, R. N. Systematic Screening of Commonly Used Commercial Transfection Reagents towards Efficient Transfection of Single-Stranded Oligonucleotides. Molecules. 23 (10), (2018).
  26. Sariyer, I. K. Transfection of neuronal cultures. Methods in Molecular Biology. 1078, 133-139 (2013).
  27. Banker, G. A., Cowan, W. M. Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture. Brain Research. 126 (3), 397-425 (1977).
  28. Banker, G. A., Cowan, W. M. Further observations on hippocampal neurons in dispersed cell culture. The Journal of Comparative Neurology. 187 (3), 469-493 (1979).
  29. Biffi, E., Regalia, G., Menegon, A., Ferrigno, G., Pedrocchi, A. The influence of neuronal density and maturation on network activity of hippocampal cell cultures: a methodological study. PLoS One. 8 (12), e83899(2013).
  30. Hiragi, T., et al. Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cell (hiPSC)-Derived Neurons in Mouse Hippocampal Slice Cultures. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 143(2017).
  31. Zeng, H., Sanes, J. R. Neuronal cell-type classification: challenges, opportunities and the path forward. Nature Reviews. Neuroscience. 18 (9), 530-546 (2017).
  32. Jones, M. R., Villalon, E., Northcutt, A. J., Calcutt, N. A., Garcia, M. L. Differential effects of myostatin deficiency on motor and sensory axons. Muscle & Nerve. 56 (6), E100-E107 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Analiza EGFPkotransfekcjahodowla neuron w korowychbarwienie immunofluorescencyjneanaliza w programie ImageJpomiar d ugo ci neuryt wbia ko FE65czynnik wzrostu nerw w

Powiązane artykuły