Artykuł metodologiczny

Trójwymiarowy system oznaczania angiogenezy wykorzystujący sferoidy współhodowlane utworzone przez komórki tworzące kolonie śródbłonka i mezenchymalne komórki macierzyste

DOI:

10.3791/60032

⸱

18 września 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1College of Pharmacy, Duksung Innovative Drug Center, Duksung Women's University, 2Korea Drug Development Platform using Radio-isotope, Korea Institute of Radiological & Medical Sciences

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Trójwymiarowy system testowania angiogenezy sferoidalnej w kokulturze został zaprojektowany tak, aby naśladować fizjologiczną angiogenezę. Sferoidy kohodowlane są tworzone przez dwa prekursory ludzkich komórek naczyniowych, ECFC i MSC, i zatopione w żelu kolagenowym. Nowy system jest skuteczny w ocenie modulatorów angiogennych i dostarcza bardziej istotnych informacji do badania in vivo.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania nad angiogenezą agresywnie rozwijają się w ciągu ostatnich kilku dekad, uznając, że angiogeneza jest cechą charakterystyczną ponad 50 różnych stanów patologicznych, takich jak reumatoidalne zapalenie stawów, okulopatia, choroby sercowo-naczyniowe i przerzuty nowotworowe. Podczas opracowywania leków do angiogenezy kluczowe znaczenie ma stosowanie systemów testów in vitro z odpowiednimi typami komórek i odpowiednimi warunkami, aby odzwierciedlić fizjologiczny proces angiogenezy. Aby przezwyciężyć ograniczenia obecnych systemów oznaczania angiogenezy in vitro wykorzystujących głównie komórki śródbłonka, opracowaliśmy trójwymiarowy (3D) system do oznaczania kiełkowania sferoidów w kokulturze. Sferoidy z kohodowli zostały wytworzone przez dwa prekursory ludzkich komórek naczyniowych, komórki tworzące kolonie śródbłonka (ECFC) i mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) w stosunku 5 do 1. Sferoidy ECFCs + MSCs osadzono w macierzy kolagenu typu I, aby naśladować środowisko zewnątrzkomórkowe in vivo. Rejestrator komórek w czasie rzeczywistym został wykorzystany do ciągłej obserwacji postępu angiogennego kiełkowania ze sferoid przez 24 godziny. Zastosowano również technikę znakowania fluorescencyjnego żywych komórek w celu śledzenia lokalizacji każdego typu komórek podczas tworzenia kiełków. Potencjał angiogenny określono ilościowo, zliczając liczbę kiełków i mierząc łączną długość kiełków wygenerowanych z poszczególnych sferoid. Pięć losowo wybranych sferoid analizowano w każdej grupie eksperymentalnej. Eksperymenty porównawcze wykazały, że sferoidy ECFCs+MSCs wykazywały większą liczbę pędów i skumulowaną długość kiełków w porównaniu ze sferoidami zawierającymi wyłącznie ECFC. Bewacyzumab, zatwierdzony przez FDA inhibitor angiogenezy, został przetestowany za pomocą nowo opracowanego systemu testów sferoidalnych do współhodowli w celu zweryfikowania jego potencjału do badań przesiewowych leków antyangiogennych. Wartość IC50 dla sferoid ECFCs+MSCs w porównaniu ze sferoidami zawierającymi tylko ECFC była bliższa efektywnemu stężeniu bewacyzumabu w osoczu uzyskanemu z mysiego modelu guza ksenoprzeszczepu. Niniejsze badanie sugeruje, że system oznaczania angiogenezy sferoidalnej 3D ECFCs + MSCs jest istotny dla fizjologicznej angiogenezy i może przewidywać efektywne stężenie w osoczu przed eksperymentami na zwierzętach.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oczekuje się, że około 500 milionów ludzi na całym świecie skorzysta z terapii modulującej angiogenezę w chorobach związanych z malformacją naczyniową, takich jak reumatoidalne zapalenie stawów, okulopatia, choroby sercowo-naczyniowe i przerzuty nowotworowe1. W związku z tym opracowywanie leków kontrolujących angiogenezę stało się ważnym obszarem badawczym w przemyśle farmaceutycznym. W trakcie procesu opracowywania leku konieczne jest przeprowadzenie badań na zwierzętach in vivo w celu zbadania wpływu kandydatów na leki na funkcje fizjologiczne i interakcje ogólnoustrojowe między narządami. Jednak kwestie etyczne i kosztowe zwiększyły obawy związane z eksperymentami na zwierzętach2. W związku z tym potrzebne są ulepszone systemy testów in vitro, aby uzyskać dokładniejsze i bardziej przewidywalne dane, co pozwoli na lepsze podejmowanie decyzji przed eksperymentami na zwierzętach. Obecne testy angiogenezy in vitro zwykle mierzą proliferację, inwazję, migrację lub tworzenie struktury kanalików komórek śródbłonka (EC) wysianych na dwuwymiarowych (2D) płytkach hodowlanych3. Te testy angiogenezy 2D są szybkie, proste, ilościowe i opłacalne i znacząco przyczyniły się do odkrycia leków modulujących angiogenezę. Jednak kilka kwestii pozostaje jeszcze nierozwiązanych.

Takie systemy testów in vitro 2D nie mogą odzwierciedlać złożonych wieloetapowych zdarzeń angiogenezy, które występują w warunkach fizjologicznych in vivo, co prowadzi do niedokładnych wyników, które powodują rozbieżności między danymi z testów in vitro a wynikami badań klinicznych4. Warunki hodowli 2D również indukują zmianę fenotypów komórkowych. Na przykład, po proliferacji na płytkach hodowlanych 2D, EC mają słaby fenotyp komórkowy, co objawia się zmniejszoną ekspresją CD34 i kilkoma sygnałami, które rządzą odpowiedziami komórkowymi5,6. Aby przezwyciężyć ograniczenia systemów oznaczania angiogenezy opartych na kulturach 2D, opracowano trójwymiarowe (3D) systemy oznaczania angiogenezy sferoidalnej. Kiełkowanie, a następnie tworzenie struktury rurkowej ze sferoid utworzonych przez EC odzwierciedla procesy neowaskularyzacji in vivo7,8. W związku z tym test angiogenezy sferoidalnej 3D został uznany za skuteczny system testowy do badań przesiewowych potencjalnych leków pro- lub antyangiogenezy.

Większość testów angiogenezy sferoidalnej 3D wykorzystuje tylko ECs, głównie ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) lub ludzkie komórki śródbłonka mikronaczyniowego skóry (HDMEC), aby skupić się na odpowiedzi komórkowej EC podczas angiogenezy. Jednak naczynia włosowate krwi składają się z dwóch typów komórek: EC i perycytów. Opracowanie dwukierunkowej interakcji między EC a perycytami ma kluczowe znaczenie dla prawidłowej integralności i funkcji naczyń krwionośnych. Niektóre choroby, takie jak dziedziczny udar mózgu, retinopatia cukrzycowa i malformacja żylna, są związane ze zmienioną gęstością perycytów lub zmniejszonym przyczepieniem perycytów do śródbłonka9. Perycyty są również znane jako kluczowy element procesu angiogennego. Perycyty są rekrutowane w celu stabilizacji nowo powstałych struktur naczyń krwionośnych przez EC. W związku z tym test angiogenezy sferoidalnej w monokulturze nie obejmuje pericytów7,10. W związku z tym sferoidy z kohodowli utworzone przez EC i perycyty mogą stanowić cenne podejście do ściślejszego naśladowania fizjologicznych zdarzeń angiogennych.

Niniejsze badanie miało na celu opracowanie testu angiogenezy sferoidalnej w 3D z kombinacją ludzkich komórek tworzących kolonie śródbłonka (ECFC) i mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC), aby dokładniej odzwierciedlić angiogenezę in vivo. System sferoidalny kokulturowy jako zespół reprezentacyjny in vitro normalnego naczynia krwionośnego został po raz pierwszy ustanowiony przez Korffa i in. w 200111. Połączyli HUVEC i ludzkie komórki mięśni gładkich tętnicy pępowinowej (HUSMC) i wykazali, że jednoczesna hodowla dwóch dojrzałych komórek naczyniowych zmniejszyła potencjał kiełkowania. Wiadomo, że dojrzałe EC (HUVEC) stopniowo tracą zdolność do proliferacji i różnicowania, co negatywnie wpływa na ich reakcje angiogenezy12,13. Dojrzałe komórki okołonaczyniowe (HUSMC) mogą powodować inaktywację komórek śródbłonka poprzez zniesienie reakcji czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF)11. Główną różnicą między systemem sferoidalnym Korffa a naszym systemem sferoidalnym jest użyty typ komórek. Zastosowaliśmy dwa prekursory naczyniowe, ECFC i MSC, aby ustalić właściwy system testów angiogenezy do badań przesiewowych i badań czynników pro- lub antyangiogennych. ECFC są prekursorami ECFC. ECFC mają dużą zdolność do proliferacji w porównaniu z dojrzałymi ECs14, co pozwala przezwyciężyć ograniczenia ECs. ECFC przyczyniają się do tworzenia nowych naczyń krwionośnych w wielu stanach patofizjologicznych po urodzeniu15,16,17. MSCs to pluripotencjalne komórki macierzyste, które mają zdolność różnicowania się w perycyty, przyczyniając się w ten sposób do angiogenezy18,19.

W poprzednich raportach, ECFC i MSC wykazały synergiczny wpływ na tworzenie jajowodów in vitro20, in vivo neowaskularyzacja21,22, oraz poprawiły reperfuzję niedokrwionych tkanek23,24. W niniejszym badaniu ECFC i MSCs wykorzystano do utworzenia sferoid kokulturowych i zatopiono w żelu kolagenowym typu I, aby odzwierciedlić środowisko 3D in vivo. Kolagen jest uważany za główny składnik macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) otaczającej ECs25. ECM odgrywa kluczową rolę w regulacji zachowania komórek26. Proponowany tutaj protokół testu można łatwo i szybko przeprowadzić w ciągu dwóch dni przy użyciu powszechnie stosowanych technik laboratoryjnych. W celu skutecznego śledzenia komórek podczas procesu kiełkowania, każdy typ komórek może być znakowany fluorescencyjnie i monitorowany za pomocą rejestratora komórek w czasie rzeczywistym. Nowo opracowany system oznaczania angiogenezy sferoidalnej 3D we wspólnej hodowli został zaprojektowany w celu zwiększenia czułości oceny potencjalnych modulatorów angiogennych i dostarczania przewidywalnych informacji przed badaniem in vivo.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ludzkie ECFC zostały wyizolowane z ludzkiej krwi obwodowej, jak opisano w poprzednim raporcie27. Krótko mówiąc, warstwa komórek jednojądrzastych została oddzielona od krwi pełnej za pomocą Ficoll-Paque Plus i hodowana w odpowiednim podłożu, aż pojawiły się kolonie podobne do śródbłonka. Zebrano kolonie, a ECFC wyizolowano za pomocą kulek magnetycznych pokrytych CD31. MSCs wyizolowano z przylegającej frakcji komórek jednojądrzastych (MNC) dorosłego ludzkiego szpiku kostnego. Protokół badania został zatwierdzony przez instytucjonalną komisję rewizyjną Duksung Women's University (IRB nr 2017-002-01).

1. Hodowla komórkowa

  1. Przygotowanie płytek ECFC i MSC i pośrednich i powłokowych
    1. Przygotować pożywkę do wzrostu komórek śródbłonka MV2 (ECGM-MV2, z wyjątkiem hydrokortyzonu) uzupełnioną 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% glutaminą-penicyliną-streptomycyną (GPS).
    2. Przygotuj mezenchymalne podłoże do wzrostu komórek macierzystych-2 (MSCGM-2) zawierające 10% FBS i 1% GPS.
    3. W przypadku hodowli ECFC należy pokryć płytki hodowli komórkowych 1% roztworem żelatyny. Aby przygotować 1% roztwór żelatyny, rozpuść 1 g proszku żelującego w 500 ml PBS za pomocą mieszadła magnetycznego i wysterylizuj w autoklawie. Płytki można pokryć 3 ml/60 mm, 5 ml/100 mm lub 15 ml/150 mm 1% roztworu żelatyny. Inkubować powlekane płytki przez 15 minut w inkubatorze do hodowli komórkowych (37 °C i 5% CO2 ). Następnie usunąć pozostały 1% roztwór żelatyny przez aspirację i przemyć powlekane płytki raz PBS.
  2. Uprawa ECFC i MSC
    1. Wysiewaj 1 x 106 ECFC na 1% pokrytych żelatyną płytkach o średnicy 150 mm i hoduj przy użyciu ECGM-MV2 (10% FBS, 1% GPS) w inkubatorze do hodowli komórkowych (37°C i 5% CO2) do 80-90% konfluencji. Użyj ECFC we fragmentach o numerach 7-10, aby uzyskać spójne wyniki.
    2. Wysiewaj 1 x 106 MSC na niepowlekanych płytkach o średnicy 150 mm i hoduj przy użyciu MSCGM-2 w inkubatorze do hodowli komórkowych (37°C i 5%CO2) do 80-90% konfluencji. Użyj MSC przy przejściach o numerach 7-10, aby uzyskać spójne wyniki.

2. Przygotowanie 1,2% w/v roztworu metylocelulozy

  1. Odmierz 6 g metylocelulozy w szklanej butelce o pojemności 500 ml i sterylizuj w autoklawie.
  2. Podgrzewać ECGM-MV2 (bez FBS i GPS) w temperaturze 60 °C przez 20 minut i dodać 250 ml podgrzanego ECGM-MV2 do wysterylizowanego proszku metylocelulozy. Aby utrzymać sterylne warunki, przeprowadź proces wewnątrz okapu przepływowego.
  3. Dodać wysterylizowane mieszadło magnetyczne i mieszać roztwór przez 20 minut na mieszadle magnetycznym, aż metyloceluloza zostanie dokładnie zwilżona i równomiernie zdyspergowana bez grudek. Dodać 250 ml zimnego (4 °C) ECGM-MV2 (bez FBS i GPS) w sterylnych warunkach i mieszać przez dodatkowe 10 minut na mieszadle magnetycznym. Następnie schłodzić roztwór w lodówce (4 °C) przez noc.
    nuta: Metyloceluloza jest polimerem węglowodanowym, który dobrze rozpuszcza się w niskich temperaturach dzięki pęcznieniu i późniejszemu uwodnieniu.
  4. Następnego dnia podsycić roztwór do probówki o pojemności 50 ml i odwirować przy 5 000 x g przez 3 godziny w temperaturze 4 °C. Pobrać klarowny, lepki roztwór sklarowany nad osadem i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu użycia przez okres do 3-6 miesięcy.
    nuta: Osad może zawierać resztki włókna celulozowego, dlatego delikatnie pobrać roztwór sklarowanego osadu, pozostawiając co najmniej 5 ml objętości. Objętość tę można dostosować do warunków eksperymentalnych.

3. Generowanie i osadzanie sferoid tylko ECFC, tylko MSC i ECFCs-MSCs

Dzień 1

  1. Przygotowanie zawiesiny komórek ECFC i MSCs
    1. Przepłukać 80-90% zlewające się ECFC i MSC, dodając sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) bez wapnia i magnezu oraz aspirat.
    2. Aby odłączyć ECFC i MSCs od płytki hodowlanej, należy je inkubować z 0,05% trypsyną-EDTA przez 3 minuty i 5 minut w inkubatorze do hodowli komórkowych (odpowiednio 37°C i 5%CO2) w inkubatorze do hodowli komórkowych.
    3. Dezaktywuj trypsynę, dodając pożywkę DMEM zawierającą 10% FBS i 1% GPS. Pipetuj komórki w górę i w dół, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki.
    4. Osadzać komórki przez odwirowywanie przy 282 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    5. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w odpowiednim pożywce.
  2. Znakowanie ECFC i MSC barwnikiem fluorescencyjnym
    nuta: Wykonać znakowanie błony komórkowej ECFC za pomocą PKH67 (zielony) i MSC za pomocą barwnika fluorescencyjnego PKH26 (czerwony) zgodnie z instrukcjami producenta z niewielkimi modyfikacjami w następujący sposób.
    1. Umyj komórki dwa razy pożywką wolną od surowicy, aby usunąć FBS.
      nuta: Białka i lipidy w FBS zmniejszają efektywne stężenie barwnika do znakowania komórek poprzez wiązanie.
    2. Policz ECFC i MSC za pomocą hemocytometru pod mikroskopem i przenieś 3 x 106 ECFC i 2 x 106 MSC do mikroprobówek o pojemności 2 ml.
      nuta: Są to optymalne gęstości komórek do znakowania komórek za pomocą barwników. Użycie dużej liczby komórek powoduje słabe i niejednorodne barwienie, podczas gdy użycie zbyt małej liczby komórek powoduje słabą regenerację komórek.
    3. Odwirować probówki o sile 100 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, aby uzyskać osad komórkowy. Ostrożnie zassać supernatant, pozostawiając nie więcej niż 15-25 μl resztkowej objętości.
    4. Ponownie zawiesić ECFC i MSC w 250 μl rozcieńczalnika C z zestawu do farbowania. Delikatnie odpipetować zawiesinę komórek, aby zapewnić pełną dyspersję.
      nuta: Rozcieńczalnik C jest solą fizjologiczną i może zmniejszać skuteczność barwienia barwnika poprzez tworzenie miceli. Dlatego nie pozwól, aby komórki stały długo w rozcieńczalniku C i nie obracaj probówek.
    5. Przygotować roztwór barwiący dla ECFC, dodając 5 μl PKH67 do 250 μl rozcieńczalnika C (końcowe stężenie 20 μM), a dla MSC, dodając 3 μl PKH26 do 250 μl rozcieńczalnika C (końcowe stężenie 12 μM).
      nuta: Końcowe stężenia barwnika różnią się od zaleceń producenta. Wysokie stężenie prowadziłoby do zlepiania się komórek i toksyczności komórek. Niskie stężenie nie byłoby wystarczające do barwienia.
    6. Dodać 250 μl zawiesiny komórek ECFC do 250 μl roztworu barwnika PKH67 i 250 μl MSCs do 250 μl roztworu barwnika PKH26. Natychmiast wymieszaj komórki z barwnikami, pipetując w górę i w dół, a następnie inkubuj przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Aby uzyskać lepsze rezultaty, przykryj probówkę folią aluminiową i umieść na shakerze, aby zapewnić wystarczające wymieszanie podczas barwienia.
    7. Zatrzymaj proces barwienia, dodając 0,5 ml FBS do wybarwionej zawiesiny komórek, a następnie inkubuj przez 1 minutę, aby umożliwić FBS związanie nadmiaru niezwiązanego barwnika. Osadzane komórki należy rozsiewać przez odwirowanie przy 100 x g przez 5 min.
      nuta: Granulki ECFC i MSCs po barwieniu są odpowiednio jasnożółte i różowe.
    8. Ostrożnie usunąć supernatant i przemyć komórki dwa razy kompletnym podłożem, aby usunąć nadmiar barwnika. Odwirować probówki o stężeniu 100 x g przez 5 minut i ponownie zawiesić osad w 2 ml każdej kompletnej pożywki.
  3. Generowanie sferoid ECFC, MSC lub ECFC+MSC
    nuta: Zastosuj technikę wiszącego upuszczania, aby wygenerować sferoidy, jak opisano wcześniej28. Kroki przygotowania sferoid podano poniżej.
    1. Policz poplamione ECFC i MSC.
    2. Zawiesić barwione ECFC, MSC lub ECFCs+MSC w ECGM-MV2 zawierającym 20% roztworu metylocelulozy i 5% FBS. Przygotować w gęstości komórek 4 x 104 komórki/ml dla ECFC lub MSC (25 μl zawiesiny komórkowej zawiera 1 000 komórek). W przypadku dwukomórkowej zawiesiny ECFC i MSC należy przygotować w gęstości komórek 2 x 104 komórek/ml ECFC i 0,4 x 104 komórek/ml MSC (25 μl zawiera 500 ECFC i 100 MSCs).
      nuta: Stosunek ECFC do MSC nie powinien przekraczać 5:1. Większa liczba MSCs może prowadzić do nadmiernej migracji i nieregularnej morfologii kiełków. Mniejsza liczba MSCs może powodować słabą interakcję między komórkami, powodując słabe kiełkowanie.
    3. Przygotuj jednostkę nawadniającą, dodając 15 ml PBS na dno płytki hodowlanej o średnicy 150 mm.
    4. Przenieś zawiesinę komórek do wysterylizowanego prostokątnego zbiornika z polistyrenu w celu użycia pipety wielokanałowej. Zawiesinę komórek rozprowadzić równomiernie, pipetując.
    5. Umieść 25 μl kropli zawiesiny komórek na pokrywie płytki hodowlanej o średnicy 150 mm za pomocą pipety wielokanałowej (około 100 kropli/pokrywę płytki 150 mm). Odwrócić pokrywę na jednostce hydratacyjnej wypełnionej PBS i inkubować w inkubatorze do hodowli komórkowych przez 24 godziny
      nuta: Roztwór metylocelulozy zapewnia odpowiednią lepkość roztworu zawiesiny. Gdy metoda wiszącej kropli była wykonywana bez roztworu metylocelulozy, krople były łatwo zsuwane w dół, gdy pokrywa była odwrócona (rysunek uzupełniający 1). Co więcej, po całonocnej inkubacji sferoidy nie były idealnie uformowane bez roztworu metylocelulozy. Wynik ten wskazuje, że odpowiednia lepkość roztworu metylocelulozy jest niezbędna do uzyskania okrągłego kształtu sferoid.

Dzień 2

  1. Osadzanie sferoid w zneutralizowanym żelu kolagenowym
    1. Ciepły FBS i ECGM-MV2 (bez FBS i GPS) w łaźni wodnej (37 °C). Umieść zimny roztwór metylocelulozy na stole roboczym, aby osiągnąć temperaturę pokojową.
    2. Umieścić 24-dołkową płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych (37 °C) w celu ogrzania.
    3. Przetnij spiczaste końcówki pipet o pojemności 1 ml na 3-5 mm, aby wygodnie i dokładnie zassać sferoidy i lepkie zawiesiny, takie jak roztwór metylocelulozy i kolagen typu I.
    4. Przygotuj 3 mg/ml zneutralizowany żel kolagenowy typu I na lodzie zgodnie z instrukcją producenta żelu kolagenowego typu I.
      nuta: Neutralizację należy przeprowadzić na lodzie, aby uniknąć żelowania kolagenu w temperaturze pokojowej. Do jednego dołka z 24-dołkowej płytki potrzeba 500 μl zneutralizowanego kolagenu. Zawsze przygotuj 1 ml dodatkowej objętości kolagenu. Żel kolagenowy można stosować do 2-3 godzin po neutralizacji, jeśli jest przechowywany na lodzie.
    5. Zebrać sferoidy, przepłukując pokrywę zawierającą sferoidy 5 ml PBS. Zebrać roztwór zawieszony sferoidalnie w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Ponownie przepłukać pokrywę 5 ml PBS, aby uzyskać pozostałe sferoidy.
      nuta: Podczas zbiorów uważnie obserwuj, aby potwierdzić istnienie sferoid. W celu dokładniejszej kontroli wzrokowej przenieś około 50-100 μl roztworu zawieszonego sferoidy na szkiełku szkiełkowym i sprawdź okrągły kształt sferoid pod mikroskopem.
    6. Sferoidy należy osadzić przez odwirowanie przy 282 x g przez 5 minut. Supernatant należy wyrzucić ostrożnie, nie naruszając sferoid, pozostawiając nie więcej niż 100-200 μl pozostałej objętości.
    7. Delikatnie postukaj w ściankę probówki, aby sferoidy swobodnie zawiesiły się w pozostałych 100-200 μl pozostałego roztworu.
    8. Dodać ECGM-MV2 zawierający 5% FBS i 40% roztwór metylocelulozy do probówki zawierającej sferoidy. Dodaną objętość określa się na podstawie około 100 sferoid/ml. Zawiesinę sferoidalną należy delikatnie wymieszać, pipetując końcówką pipety o pojemności 1 ml.
      nuta: Roztwór metylocelulozy jest szeroko stosowany jako środek zawieszający, który nie pozwala na osadzanie się sferoid. Stężenie FBS powinno wynosić 5%. Wyższe stężenie FBS powoduje nieprawidłowe kiełkowanie z powodu nadmiernych czynników wzrostu. Niższe stężenie FBS nie jest w stanie utrzymać zdrowych warunków dla komórek.
    9. Wymieszać roztwór zawiesiny sferoidowej i zneutralizowany żel kolagenowy typu I (3 mg/ml) w stosunku 1:1 na lodzie. Użyj końcówki do pipety o pojemności 1 ml, aby uniknąć pękania sferoidów.
      UWAGA: 1 ml roztworu żelu kolagenowego zawieszającego sferoidy jest wymagany na jedno zagłębienie płytki 24-dołkowej. Jeśli to możliwe, należy przygotować dodatkowy roztwór mieszanej zawiesiny.
    10. Jeśli konieczne jest zbadanie właściwości angiogennych któregokolwiek ze środków lub substancji chemicznych, przenieś 1 ml roztworu żelu kolagenowego zawieszającego sferoidy do mikroprobówki o pojemności 1 ml i dodaj środek(i) lub substancję chemiczną(e), a następnie delikatnie wymieszaj końcówką do pipety o pojemności 1 ml.
      UWAGA: Objętość środka i substancji chemicznej może wynosić 200 μl, co rozcieńcza stężenie żelu kolagenowego typu I od 1,5 mg / ml do 1,25 mg / ml, ale nie wpływa na polimeryzację żelu kolagenowego typu I. Dodać tę samą objętość nośnika do sferoid kontrolnych.
    11. Dodaj roztwór żelu kolagenowego zawieszającego sferoidy do studzienek wstępnie podgrzanej 24-dołkowej płytki (0,9 ml / dołek) przez pipetowanie, a następnie inkubować przez 30 minut w inkubatorze do hodowli komórkowych w celu polimeryzacji.
      nuta: Podczas procesu zatapiania sferoidy nie należy naruszać żelu poprzez mieszanie płytki.
    12. Przykryj żel kolagenowy zawieszający sferoidy, dodając 100 μl ECGM-MV2 zawierającego 2,5% FBS z/bez VEGF. W przypadku sferoid zawierających tylko ECFC należy stymulować komórki egzogennym dodatkiem VEGF (końcowe stężenie 50 ng / ml) w celu utworzenia odpowiednich kiełków. Sferoidy ECFC+MSC nie wymagają egzogennej stymulacji żadnymi czynnikami wzrostu.
    13. Umieść płytkę w rejestratorze komórek w czasie rzeczywistym zainstalowanym w inkubatorze do hodowli komórkowych (37 °C i 5% CO2 ) i losowo ustaw ostrość na 5-10 sferoidach (soczewka obiektywu 10x). Monitoruj formowanie się kiełkowania każdej sferoidy znakowanej fluorescencyjnie co 1 godzinę przez 24 godziny bez żadnych zakłóceń.

4. Ilościowe określanie kiełkowania sferoidów

  1. Zaimportuj pliki obrazów do oprogramowania ImageJ, aby określić ilościowo liczbę kiełków i zmierzyć długość każdego kiełka. W przypadku sferoid z kohodowli należy oznaczyć ECFC zielonym barwnikiem fluorescencyjnym przed wykonaniem sferoid. Następnie zmierz liczbę i długość kiełków zabarwionych zieloną fluorescencją (rysunek uzupełniający 2). Pięć losowo wybranych sferoid określono ilościowo dla każdej grupy eksperymentalnej.
    nuta: Kiełki są wspólnie wydłużonymi strukturami utworzonymi przez kilka ECFC wystających ze sferoid. Długość kiełków mierzy się jako długość od punktu początku kiełków od powierzchni sferoid do wierzchołka kiełków.
  2. Wartości należy wyrazić jako średnie ± SEM z co najmniej trzech niezależnych eksperymentów. Określ statystycznie istotną różnicę za pomocą jednoczynnikowej ANOVA dla porównań wielokrotnych lub testu t-Studenta dla porównań sparowanych.
    UWAGA: P ≤ 0,05 jest uważane za statystycznie istotne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eksperymenty porównawcze zostały przeprowadzone przy użyciu sferoidów monokulturowych (tylko ECFC) i sferoidów kokulturowych (ECFCs+MSC), aby zbadać, czy MSCs odgrywają znaczącą rolę w angiogenezie za pośrednictwem ECFCs. Powstawanie kiełkowania z każdej sferoidy było monitorowane przez 24 godziny przez rejestrator komórek w czasie rzeczywistym, który mógł uchwycić postęp angiogennego kiełkowania ze sferoid. Potencjał angiogenny określono ilościowo, zliczając liczbę kiełków i mierząc skumulowaną długość kiełków generowan...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niniejsze badanie wprowadza ulepszony system testów angiogenezy in vitro wykorzystujący sferoidy z kokultury utworzone przez dwa ludzkie komórki progenitorowe komórek naczyniowych, ECFC i MSC. System sferoidalny kohodowli może naśladować tworzenie się kiełków naczyniowych in vivo, co odbywa się poprzez interakcję i włączenie między komórkami śródbłonka a perycytami. W porównaniu z innymi testami angiogenezy in vitro, które odzwierciedlają tylko angiogenezę za pośrednictwem ECs, ten system testów kohodowlanych jest bardzi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez grant (17172MFDS215) z Ministerstwa Bezpieczeństwa Żywności i Leków, grant Narodowej Fundacji Badawczej Korei (NRF) finansowany przez rząd Korei (MSIP) (2017R1A2B4005463) oraz Program Badań Podstawowych przez National Research Foundation of Korea(NRF) finansowany przez Ministerstwo Edukacji (2016R1A6A1A03007648).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,05% Trypsyna EDTA (1x)Gibco25300-054
BevacizumabRocheNANazwa handlowa: Avastin
Dulbecco Modified Eagle MediumGibco11885-084DMEM
Dulbeco's Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (10x)Gibco21600-010PBS (10x)
Dulbeco's Solanka buforowana fosforanem (1x)Corning21-031-CVRPBS (1x)
Pożywka wzrostowa komórek śródbłonka Zestaw MV2PromocellC-22121ECGM-MV2
Surowica bydlęca płodu (FBS)AtlasFP-0500AFBS
ŻelatynaBD Sciences214340
L-glutamina– Penicylina– StreptomycynaGibco10378-016GPS
Mezenchymalne podłoże wzrostu komórek macierzystych-2PromocellC-28009MSCGM-2
MetylocelulozaSigma-AldrichM0512
PKH26 Zestawy łączników komórek fluorescencyjnychSigma-AldrichMINI26PKH26 PKH67
Zestawy łączników komórek fluorescencyjnychSigma-AldrichMINI67PKH67
Wodorotlenek soduSigma-AldrichS5881
Żel kolagenowy typu ICorning354236
Czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego AR& D293-VE-010VEGF

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Carmeliet, P. Angiogenesis in life, disease and medicine. Nature. 438 (7070), 932-936 (2005).
  2. Goodwin, A. M. In vitro assays of angiogenesis for assessment of angiogenic and anti-angiogenic agents. Microvascular research. 74 (2-3), 172-183 (2007).
  3. Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. International journal of experimental pathology. 90 (3), 195-221 (2009).
  4. Lutolf, M. P., Gilbert, P. M., Blau, H. M. Designing materials to direct stem-cell fate. Nature. 462 (7272), 433-441 (2009).
  5. Fina, L., et al. Expression of the CD34 gene in vascular endothelial cells. Blood. 75 (12), 2417-2426 (1990).
  6. Delia, D., et al. CD34 expression is regulated reciprocally with adhesion molecules in vascular endothelial cells in vitro. Blood. 81 (4), 1001-1008 (1993).
  7. Korff, T., Augustin, H. G. Tensional forces in fibrillar extracellular matrices control directional capillary sprouting. Journal of Cell Science. 112 (19), 3249-3258 (1999).
  8. Korff, T., Augustin, H. G. Integration of endothelial cells in multicellular spheroids prevents apoptosis and induces differentiation. The Journal of cell biology. 143 (5), 1341-1352 (1998).
  9. Gaengel, K., Genové, G., Armulik, A., Betsholtz, C. Endothelial-mural cell signaling in vascular development and angiogenesis. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 29 (5), 630-638 (2009).
  10. Hutmacher, D. W. Biomaterials offer cancer research the third dimension. Nature Materials. 9 (2), 90-93 (2010).
  11. Korff, T., Kimmina, S., Martiny-Baron, G., Augustin, H. G. Blood vessel maturation in a 3-dimensional spheroidal coculture model: direct contact with smooth muscle cells regulates endothelial cell quiescence and abrogates VEGF responsiveness. FASEB Journal. 15 (2), 447-457 (2001).
  12. Gumkowski, F., Kaminska, G., Kaminski, M., Morrissey, L. W., Auerbach, R. Heterogeneity of mouse vascular endothelium. In vitro studies of lymphatic, large blood vessel and microvascular endothelial cells. Journal of Vascular Research. 24 (1-2), 11-23 (1987).
  13. Asif, A. R., Oellerich, M., Armstrong, V. W., Hecker, M., Cattaruzza, M. T-786C polymorphism of the NOS-3 gene and the endothelial cell response to fluid shear stress-a proteome analysis. Journal of Proteome Research. 8 (6), 3161-3168 (2009).
  14. Melero-Martin, J. M., et al. In vivo vasculogenic potential of human blood-derived endothelial progenitor cells. Blood. 109 (11), 4761-4768 (2007).
  15. Ingram, D. A., et al. Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood. Blood. 104 (9), 2752-2760 (2004).
  16. Murasawa, S., Asahara, T. Endothelial progenitor cells for vasculogenesis. Physiology (Bethesda). 20, 36-42 (2005).
  17. Rafii, S., Lyden, D., Benezra, R., Hattori, K., Heissig, B. Vascular and haematopoietic stem cells: novel targets for anti-angiogenesis therapy. Nature Review Cancer. 2 (11), 826-835 (2002).
  18. Shi, S., Gronthos, S. Perivascular niche of postnatal mesenchymal stem cells in human bone marrow and dental pulp. Journal of Bone and Mineral Research. 18 (4), 696-704 (2003).
  19. Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3 (3), 301-313 (2008).
  20. Lee, H., Kang, K. T. Advanced tube formation assay using human endothelial colony forming cells for in vitro evaluation of angiogenesis. Korean Journal of Physiology & Pharmacology. 22 (6), 705-712 (2018).
  21. Melero-Martin, J. M., et al. Engineering robust and functional vascular networks in vivo with human adult and cord blood-derived progenitor cells. Circulation Research. 103 (2), 194-202 (2008).
  22. Kang, K. T., Allen, P., Bischoff, J. Bioengineered human vascular networks transplanted into secondary mice reconnect with the host vasculature and re-establish perfusion. Blood. 118 (25), 6718-6721 (2011).
  23. Kang, K. T., Coggins, M., Xiao, C., Rosenzweig, A., Bischoff, J. Human vasculogenic cells form functional blood vessels and mitigate adverse remodeling after ischemia reperfusion injury in rats. Angiogenesis. 16 (4), 773-784 (2013).
  24. Kang, K. T., Lin, R. Z., Kuppermann, D., Melero-Martin, J. M., Bischoff, J. Endothelial colony forming cells and mesenchymal progenitor cells form blood vessels and increase blood flow in ischemic muscle. Scientific Reports. 7 (1), 770(2017).
  25. Paupert, J., Sounni, N. E., Noel, A. Lymphangiogenesis in post-natal tissue remodeling: lymphatic endothelial cell connection with its environment. Molecular Aspects of Medicine. 32 (2), 146-158 (2011).
  26. Lu, P., Weaver, V. M., Werb, Z. The extracellular matrix: a dynamic niche in cancer progression. Journal of Cell Biology. 196 (4), 395-406 (2012).
  27. Melero-Martin, J. M., Bischoff, J. Chapter 13. An in vivo experimental model for postnatal vasculogenesis. Methods in Enzymology. 445, 303-329 (2008).
  28. Laib, A. M., et al. Spheroid-based human endothelial cell microvessel formation in vivo. Nature Protocols. 4 (8), 1202-1215 (2009).
  29. Leuning, D. G., et al. The cytokine secretion profile of mesenchymal stromal cells is determined by surface structure of the microenvironment. Scientific Reports. 8 (1), 7716(2018).
  30. Shah, S., Kang, K. T. Two-Cell Spheroid Angiogenesis Assay System Using Both Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells. Biomolecules & Therapeutics (Seoul). 26 (5), 474-480 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

3D sferoid w kokulturzemacierz z kolagenu typu Irejestrator kom rkowy w czasie rzeczywistymtechnika znakowania fluorescencyjnegokwantyfikacja liczby wypustekskumulowana d ugo wypustekwarto IC50 bevacizumabu

Powiązane artykuły