Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wywoływanie meningokokowego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych serogrupy C u myszy poprzez dostawę domostkową

7.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60047

⸱

5 listopada 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Medicine and Medical Biotechnology, University of Naples Federico II, 2Department of Science and Technology, Sannio University, 3CEINGE – Advanced Biotechnology

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy metodę wywoływania meningokokowego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych poprzez intraciskulacyjną drogę infekcji u dorosłych myszy. Przedstawiamy krok po kroku protokół zakażenia meningokokami od przygotowania inokulum do zakażenia śródpiersiowego; Następnie rejestruj przeżywalność zwierzęcia i oceń obciążenie bakteryjne w tkankach myszy.

Streszczenie

Neisseria meningitidis (meningokoki) to mikroorganizm o wąskim zasięgu żywicielskim, uznawany na całym świecie za główną przyczynę bakteryjnego zapalenia opon mózgowych. Meningokok jest przejściowym kolonizatorem ludzkiej nosogardzieli u około 10% zdrowych osób. W szczególnych okolicznościach nabywa inwazyjną zdolność przenikania przez barierę śluzówkową i wdziera się do krwiobiegu, powodując posocznicę. W ostatnim przypadku piorunująca sepsa może wystąpić nawet bez konsekwentnego rozwoju zapalenia opon mózgowych. I odwrotnie, bakterie mogą słabo namnażać się w krwiobiegu, przekraczać barierę krew-mózg, docierać do ośrodkowego układu nerwowego, prowadząc do piorunującego zapalenia opon mózgowych. Mysie modele bakteryjnego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych stanowią użyteczne narzędzie do badania interakcji gospodarz-patogen i analizowania mechanizmów patogenetycznych odpowiedzialnych za tę śmiertelną chorobę. Chociaż w ciągu ostatnich dziesięcioleci oceniono kilka eksperymentalnych systemów modelowych, żaden z nich nie był w stanie odtworzyć charakterystycznych zdarzeń patologicznych choroby meningokokowej. W tym protokole eksperymentalnym opisujemy szczegółową procedurę indukcji meningokokowego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych w modelu mysim opartym na intrukulacji wewnątrzmostkowej bakterii. Szczególne objawy zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych u ludzi zarejestrowano u mysiego gospodarza poprzez ocenę parametrów klinicznych (np. temperatura, masa ciała), ocenę przeżywalności, analizę mikrobiologiczną i badanie histologiczne uszkodzenia mózgu. W przypadku stosowania inokulum intracisternalnego (i.cist.), meningokoki są dostarczane bezpośrednio do cisterna magna, co prowadzi do bardzo efektywnej replikacji meningokoków w tkance mózgowej. 1000-krotny wzrost liczby bakterii żyjących obserwuje się po około 18 godzinach. Co więcej, meningokoki znajdują się również w śledzionie i wątrobie zakażonych myszy, co sugeruje, że wątroba może stanowić narząd docelowy dla replikacji meningokoków.

Wprowadzenie

Neisseria meningitidis to Gram-ujemna β-proteobacterium ograniczona do ludzkiego gospodarza, dobrze znana z tego, że jest jedną z najczęstszych przyczyn zapalenia opon mózgowych i sepsy w populacji ludzkiej na całym świecie. Kolonizuje górne drogi oddechowe (nos i gardło) zdrowych i bezobjawowych nosicieli (2-30% populacji), ale bakteria czasami unika różnych mechanizmów obrony immunologicznej gospodarza i rozprzestrzenia się z krwiobiegu do mózgu, powodując niekontrolowany miejscowy stan zapalny, znany jako meningokokowe zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych. Kombinacja czynników gospodarza i bakterii wydaje się przyczyniać do przejścia od zachowania komensalnego do inwazyjnego1.

N. meningitidis specjalizuje się wyłącznie w kolonizacji i infekcjach ludzi. Ma wąski zakres żywicieli i dlatego ma ograniczone badania patogenezy in vivo ze względu na brak odpowiednich modeli zwierzęcych, które odtwarzają ludzką chorobę meningokokową. W rezultacie doprowadziło to do fundamentalnych luk w wiedzy na temat patogenezy posocznicy i zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych wywołanych przez meningokoki. W ostatnich dziesięcioleciach rozwój wielu systemów in vitro pozwolił na zidentyfikowanie kilku czynników wirulencji meningokokowej2,3,4. Chociaż te cenne badania dostarczyły ważnych informacji pozwalających zrozumieć rolę tych czynników w skutecznym zakażeniu meningokokowym, modele te nie pozwoliły na ocenę konsekwencji interakcji bakteryjnych z humoralnym i komórkowym układem odpornościowym, a tym bardziej z całą tkanką. Zwierzęce modele zakażeń in vivo mają również ogromne znaczenie dla oceny stopnia ochrony zapewnianego przez preparaty szczepionkowe. Jako ludzki patogen tropikalny, meningokoki posiadają odpowiednie determinanty niezbędne do pomyślnego zakażenia, takie jak struktury powierzchniowe (tj. pilusy typu IV i białka zmętniające) oraz systemy wychwytu żelaza dla ludzkich receptorów i białek transportowych (tj. transferyny i laktoferyny)5,6,7 aby prawidłowo przylegać, przetrwać i zaatakować ludzkiego gospodarza. Wreszcie, zdolność patogenu do unikania i/lub blokowania ludzkiej odpowiedzi immunologicznej dodatkowo przyczynia się do wysokiego tropizmu gatunkowego8,9. W związku z tym brak specyficznych czynników gospodarza, zaangażowanych w interakcję, może blokować etapy cyklu życiowego patogenu, powodując znaczne trudności w rozwoju małych modeli zwierzęcych podsumowujących cykl życiowy meningokoków.

W ciągu ostatnich dziesięcioleci opracowano kilka podejść, które mają na celu poprawę naszego zrozumienia cyklu zakaźnego meningokoków. Zakażenia dwóch modeli zwierzęcych, myszy i szczura, zarówno dootrzewnowe (i.p.), jak i donosowe (i.n.), zostały opracowane w celu rozmnażania choroby meningokokowej10,11,12,13,14,15,16,17. Mysz laboratoryjna jest prawdopodobnie jednym z bardziej wszechstronnych zwierząt do wywoływania eksperymentalnego zakażenia meningokokami.

Jednakże, sposób infekcji i.p. prowadzi do rozwoju ciężkiej sepsy, chociaż nie naśladuje naturalnej drogi infekcji, podczas gdy droga infekcji i.n. była przydatna do oceny patogenezy meningokoków, mimo że może wywołać infekcję płuc przed sepsą10,11,12,13,14,15,16,17.

Model myszy i.p. odegrał kluczową rolę w ocenie ochrony przed wyzwaniem meningokokowym10,11,12. Mysi model kolonizacji meningokoków oparty na drodze zakażenia in n został opracowany z udziałem młodych myszy, ponieważ są one bardziej podatne na meningokoki, w celu odtworzenia inwazyjnej infekcji naśladującej przebieg choroby meningokokowej u ludzi13,14,15,16,17. Ponadto, aby promować replikację meningokoków u mysiego gospodarza, zastosowano również rosnącą liczbę strategii technicznych, w tym podawanie zwierzętom żelaza w celu poprawy infekcji, stosowanie inokulum o wysokiej zawartości bakterii, szczepu bakteryjnego pasażowanego przez myszy, a także stosowanie żywicieli niemowląt lub zwierząt z obniżoną odpornością10,13,15,18, 19. Ekspresja określonych czynników ludzkich, takich jak CD4620 lub transferrin21 zwiększyła podatność myszy na tę ludzko-tropikalną bakterię; Zastosowanie modelu zakażenia ksenoprzeszczepem ludzkiej skóry było również przydatne do oceny zdolności adhezyjnej meningokoków do ludzkiego śródbłonka22,23. Reasumując, niedawny rozwój humanizowanych myszy transgenicznych poprawił zrozumienie patogenezy meningokoków i jej interakcji z gospodarzem.

Poprzednio opracowaliśmy mysi model meningokokowego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych, w którym inokulacja bakterii była przeprowadzana do cisterna magna dorosłych myszy za pomocą bakterii pasażowanych przez myszy24. Parametry kliniczne i przeżywalność zakażonych myszy wykazały powstanie zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych o cechach porównywalnych z tymi obserwowanymi u ludzkiego gospodarza, a także analizy mikrobiologiczne i histologiczne mózgu. Od tych zakażonych myszy bakterie zostały również odzyskane z krwi, wątroby i śledziony, a obciążenia bakteryjne z narządów obwodowych skorelowane z dawką zakaźną. W szczególności model ten został wykorzystany do oceny zjadliwości izogenicznego zmutowanego szczepu wadliwego w transporterze L-glutaminianu GltT24. Niedawno, korzystając z naszego mysiego modelu meningokokowego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych opartego na i.cist. z szczepem serogrupy C 93/42862,24 i izogenicznym mutantem wadliwym w genie cssA kodującym 2-epimerazę UDP-N-acetyloglukozaminy25, przeanalizowaliśmy rolę eksponowanego kwasu sjalowego w powstawaniu choroby u myszy.

W tym protokole opisujemy prostą metodę wywoływania eksperymentalnego meningokokowego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych w oparciu o i.cist. drogę infekcji u dorosłych myszy Balb/c. Metoda ta jest szczególnie przydatna do charakterystyki zakażenia meningokokami u mysiego gospodarza, a także do oceny zjadliwości między szczepami referencyjnymi typu dzikiego a mutantami izogenicznymi. Wewnątrzcysternalna droga zakażenia zapewnia całkowite dostarczenie meningokoków bezpośrednio do cisterna magna, co z kolei ułatwia replikację bakterii w płynie mózgowo-rdzeniowym (CSF) i indukuje zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych z cechami naśladującymi te obecne u ludzi2,24,25,26.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Ten protokół został przeprowadzony w celu zminimalizowania cierpienia zwierząt i zmniejszenia liczby myszy zgodnie z Dyrektywą Rady Wspólnot Europejskich z 24 listopada 1986 roku (86/609/EWG). Eksperymenty in vivo przedstawione w tym badaniu zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Etycznej Opieki i Użytkowania Zwierząt (Prot. nr 2, 14 grudnia 2012 r.) oraz włoskie Ministerstwo Zdrowia (nr prot. 0000094-A-03/01/2013). Wszystkie procedury powinny być wykonywane wewnątrz Komory Bezpieczeństwa Biologicznego 2 (BSC2) w pomieszczeniu BSL2, a ewentualne zainfekowane odpady powinny być utylizowane w dedykowanych pojemnikach.

1. Zakażenie myszy szczepem N. meningitidis Serogrupa C

UWAGA: N. meningitidis jest potencjalnie szkodliwym patogenem i należy podjąć wszelkie niezbędne środki ostrożności podczas obchodzenia się z tym mikroorganizmem. Cały eksperyment wymaga zabezpieczenia na poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL2). Badacz biorący udział w badaniach na zwierzętach powinien nosić jednorazowe środki ochrony osobistej (PPE) na czas trwania eksperymentu.

  1. Przygotowanie bakterii do badań zakażeń in vivo
    1. Wybierz pojedynczą kolonię ze świeżej kultury Neisseria meningitidis na płytce agarowej GC (gonokoki) uzupełnionej 1% (vol/vol) suplementem Polyvitox i zaszczepić w 10 ml bulionu GC.
    2. Hodować bakterie w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wytrząsarką orbitalną z prędkością 220 obr./min. Sprawdzaj średnicę zewnętrzną kultury za pomocą spektrofotometru. Hoduj kulturę do wczesnej fazy wykładniczej przy gęstości optycznej OD600 nm wynoszącej 0,7, co odpowiada ≈ 7 x 108 CFU/ml.
    3. Po uzyskaniu wymaganej średnicy zewnętrznej przygotuj zamrożone wywary, dodając 10% glicerolu. Dozuj 1 ml kultury do kriowialików. Przechowywać fiolki w temperaturze -80 °C do momentu użycia.
      nuta: Chociaż lepiej jest używać świeżej kultury bakteryjnej, zamrożone wywary zostały użyte w celu uproszczenia i standaryzacji eksperymentu in vivo. Zazwyczaj zamrożone zapasy zostały zużyte w ciągu około 6 miesięcy od przygotowania.
    4. Przed infekcją rozmrozić zamrożone bakterie w temperaturze pokojowej.
    5. Zebrać komórki bakteryjne przez odwirowanie przez 15 minut przy 1 500 x g i ponownie zawiesić w 1 ml świeżego bulionu GC zawierającego dekstran żelaza (5 mg/kg).
      nuta: Rosół GC przygotowuje się z dodatkiem dekstranu żelaza (5 mg/kg) w celu ułatwienia replikacji meningokoków w tkance gospodarza14,18,27.
    6. Przed użyciem należy przeprowadzić żywotne liczenie bakterii, aby określić dokładną liczbę CFU do infekcji. W tym celu należy pobrać 10 μl zawiesiny bakteryjnej i przystąpić do seryjnych rozcieńczeń, a następnie rozprowadzić każde rozcieńczenie na płytkach agarowych GC i inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 18-24 godziny.
  2. Wstrzyknięcie docysternowe myszy
    nuta: Cała procedura wykonywana jest w komorze z przepływem laminarnym w celu utrzymania warunków aseptycznych.
    1. Domowe myszy laboratoryjne (8 tygodni, samica Balb/c) w określonych warunkach wolnych od patogenów. Zapewnij granulki pokarmowe i wodę ad libitum.
    2. Umieść zwierzęta w nowym środowisku na 1 tydzień przed rozpoczęciem eksperymentu.
    3. Przed rozpoczęciem eksperymentu zważ i oceń temperaturę ciała.
      nuta: Wsobne samice myszy Balb/c w wieku ośmiu tygodni ważą średnio około 19 g. Średnia temperatura myszy laboratoryjnych fizjologicznie waha się od 36 do 38 °C24.
    4. Odczepić zwierzę od szyi, oczyścić okolice brzucha 70% etanolem i wstrzyknąć i.p. dekstran żelaza (rozpuszczony w 1% buforze soli fizjologicznej, 250 mg/kg) w prawy dolny kwadrant mysiego brzucha za pomocą igły 25 G 0,5 mm x 16 mm, około 2-3 godziny przed zakażeniem.
      nuta: Wstrzyknięcie dootrzewnowe wykonano w prawy dolny kwadrant mysiego brzucha, aby uniknąć uszkodzenia narządów jamy brzusznej, takich jak pęcherz moczowy, jelito ślepe itp. Podawanie zwierzętom egzogennego źródła żelaza, w postaci dekstranu żelaza, przed zakażeniem sprzyja namnażaniu się bakterii w gospodarzu14,18,27.
    5. Po 2-3 godzinach należy wykonać znieczulenie zwierzęce ketaminą (50 mg/kg) i ksylazyną (3 mg/kg) oraz lubrykantem okulistycznym.
    6. Sprawdź głębokość znieczulenia, upewniając się, że nie ma reakcji bólowej po uszczypnięciu palca u nogi.
    7. Ustaw mysz w odleżynie mostka i ostrożnie rozciągnij kończyny i kręgosłup szyjny, aby utrzymać kręgosłup w prostej pozycji.
    8. Delikatnie wymieszać zawiesinę bakteryjną, aby utrzymać stałą zawiesinę, przed załadowaniem strzykawki z igłą 30 G x 8 mm.
      nuta: Przygotować zawiesinę bakteryjną jak najbliżej czasu wstrzyknięcia; W międzyczasie przechowuj go w temperaturze pokojowej.
    9. Na podstawie miana bakterii po rozmrożeniu (jtk/ml) należy przystąpić do obliczania całkowitej jtk, która ma być użyta, w odniesieniu do całkowitej liczby zwierząt, które mają być zakażone (dawka bakterii jtk na liczbę zwierząt). Przystąpić do obliczenia dokładnej objętości, która ma być pobrana z fiolki w celu uzyskania całkowitej jtk, stosując proporcję między mianem bakterii po rozmrożeniu (jtk/ml) a całkowitym mianem bakterii przydatnym do zakażenia n myszy (miano bakterii po rozmrożeniu jtk: ml = całkowita jtk : x). Ustalić ostateczną objętość w odniesieniu do całkowitej liczby zwierząt, które mają być zakażone.
      nuta: W doświadczeniach tych zastosowano szeroki zakres miana od 104 do 109 na zwierzę.
    10. Oczyść obszar operacyjny 70% etanolem.
    11. Zidentyfikuj punkt wstrzyknięcia za pomocą igły i wstrzyknij ustalony CFU meningokoków (szczep typu dzikiego i izogeniczny zmutowany szczep) lub bulion GC uzupełniony dekstranem żelaza (5 mg/kg) jako kontrolę, w całkowitej objętości 10 μl do cisterna magna myszy przez otwór w zadziorze potylicznym za pomocą igły 30 G x 8 mm.
      1. Wykonaj inokulum cysternalne, umieszczając igłę na skrzyżowaniu czaszkowo-szyjkowym, a konkretnie w grzbietowej przestrzeni podpajęczynówkowej. Ventroflex głowy, aby ta przestrzeń była dostępna28.
      2. Krótko mówiąc, ułóż zwierzę w pozycji bocznej, trzymaj uszy z dala od drogi i umiarkowanie zegnij szyję (90 do 100°). Upewnij się, że linia środkowa szyi i głowy (od nosa do potylicy) znajduje się w idealnie równoległej pozycji do blatu.
      3. Dotknij skrzydeł atlasu i upewnij się, że zachodzą na siebie, eliminując obrót osiowy. Naturalne wgłębienie można zwykle dotknąć na linii środkowej, gdzie igła najprawdopodobniej wejdzie w otwór potyliczny.
      4. Po wstrzyknięciu myszom leku Neisseria należy bezpiecznie wyrzucić strzykawkę i igłę.
    12. Umieść zwierzę w klatce i poczekaj na przebudzenie i pełne odzyskanie ruchu.
    13. Trzymaj klatki z zakażonymi myszami w komorze z przepływem laminarnym.
    14. Monitoruj myszy, 24 godziny po zakażeniu, pod kątem klinicznych objawów śpiączki zgodnie ze skalą śpiączki29. Skala śpiączki: 1 = śpiączka, 2 = nie stoi pionowo po odwróceniu na plecy, 3 = stoi w pozycji pionowej w ciągu 30 s, 4 = stoi w pozycji pionowej w ciągu 5 s, minimalna aktywność ambulatoryjna, 5 = normalna.
      UWAGA: Gdy u zwierząt stwierdzono ból, podawano zniebóle meloksykamem (5 mg/kg i.p. przez czas trwania badania).
    15. Należy przeprowadzić test przeżywalności zwierzęcia lub test liczby CFU na zakażonych zwierzętach, jak opisano w kroku 2.
    16. Przeprowadzić eutanazję myszy z wynikiem 2 przez zwichnięcie szyjki macicy i zapisać jako martwe do analizy statystycznej.

2. Przeżywalność zwierząt i liczba CFU

  1. Przetrwanie zwierząt
    1. Przygotować inokulację bakteryjną w różnych dawkach (od 104 do 109 jtk na mysz) w celu zakażenia zwierząt drogą i.cist. (patrz krok 1.2).
    2. W ten sam sposób zaszczepić myszy kontrolne bulionem GC, uzupełnionym dekstranem żelaza (5 mg/kg).
    3. Monitoruj zwierzęta pod kątem objawów klinicznych: potargana sierść, zgarbiony wygląd, hipotermia, utrata masy ciała, letarg lub konający24,25,26,30, codziennie przez cały eksperyment przez 168 godzin (7 dni) co najmniej dwa razy dziennie przez czas trwania eksperymentu.
    4. Codziennie mierz masę ciała i temperaturę za pomocą wagi cyfrowej i termometru doodbytniczego.
    5. Rejestruj przeżywalność myszy przez tydzień.
      nuta: Rejestruj naturalną śmierć zwierzęcia po zakażeniu, podczas gdy zwierzęta, które osiągną wartość śpiączki 2 lub przeżyją ponad 168 godzin obserwacji, zostaną poddane eutanazji.
    6. Myszy ze śpiączką o wartości 2 lub które przeżyły w czasie obserwacji, znieczulić ketaminą (50 mg/kg) i ksylazyną (3 mg/kg) i nałożyć maść okulistyczną.
    7. Sprawdź, czy reakcja na ból jest nieobecna przez uszczypnięcie palca
      8. .
    8. Przeprowadzić eutanazję myszy przez zwichnięcie szyjki macicy i zapisać je jako martwe do analizy statystycznej.
  2. Ocena liczby jednostek tworzących kolonie (CFU) w narządach obwodowych
    1. Zastosować subletalną dawkę bakteryjną (5 x 10,5jtk/myszy) na podstawie wyników przeżywalności zwierząt w celu zaszczepienia zwierząt drogą i.cist. (patrz podsekcja 1.2).
    2. Codziennie monitoruj temperaturę w odbycie podczas infekcji i przeprowadzaj znieczulenie zwierząt po 48 godzinach od zakażenia, jak wspomniano w kroku 2.
    3. Kontynuuj dezynfekcję klatki piersiowej 70% etanolem i pobierz 600-700 μl krwi przez nakłucie serca jamy klatki piersiowej za pomocą igły 25 G 0,5 mm x 16 mm.
    4. Zebrać krew do probówki zawierającej 3,8% cytrynianu sodu i przechowywać w temperaturze -80 °C do późniejszej liczby żywotnych komórek bakteryjnych.
    5. Wykonaj zwichnięcie szyjki macicy, aby złożyć zwierzęta w ofierze. Potwierdź zgon, rejestrując brak bicia serca, po złożeniu myszy w ofierze zgodnie ze wszystkimi odpowiednimi wytycznymi instytucjonalnymi i etycznymi.
    6. Połóż mysz w pozycji leżącej na plecach i użyj nożyczek i kleszczy, aby przystąpić do cięcia futra wzdłuż strzałkowej płaszczyzny ciała. Przymocuj skórę z futrem po bokach ciała za pomocą szpilek.
    7. Odetnij błonę otrzewnej ostrymi nożyczkami. Użyj nożyczek i jednorazowych kleszczy, aby wyciąć narządy (np. śledzionę i wątrobę) i umieść każdy z nich na sterylnej szalce Petriego z 1 ml bulionu GC uzupełnionego 10% (obj. / obj.) glicerolu.
    8. Bezpiecznie zutylizuj korpus myszy zgodnie z wytycznymi IACUC.
    9. Homogenizować narządy mechanicznie w temperaturze pokojowej za pomocą tłoka strzykawki o pojemności 5 ml przez około 2-3 minuty, aż utworzy się zawiesina jednokomórkowa i przenieść ją do probówki.
    10. Umieść probówkę z homogenizowaną próbką tkanki natychmiast na suchym lodzie.
      nuta: Próbki można przechowywać w temperaturze -80 °C w sterylnej probówce o pojemności 2 ml w celu przeprowadzenia oceny liczby żywotnych komórek bakteryjnych w późniejszych momentach.
    11. W razie potrzeby przygotuj płytki agarowe GC z antybiotykami. Wysuszyć płytki przed użyciem wstępnie inkubować w temperaturze 37 °C przez 2-3 godziny.
    12. Przygotować 10-krotne seryjne rozcieńczenia próbek w bulionie GC z każdej homogenizowanej tkanki i płytki na płytkach agarowych GC. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .

3. Przygotowanie tkanek mózgu do liczenia CFU

  1. Zastosować subletalną dawkę bakteryjną (5 x 10,5 jtk/myszy) na podstawie wyników przeżywalności zwierząt w celu zaszczepienia zwierząt drogą i.cist. (patrz podsekcja 1.2).
  2. Przeprowadzić znieczulenie zwierząt w ustalonym czasie infekcji, jak wspomniano w kroku 2.
  3. Przeprowadzaj eutanazję zwierząt przez zwichnięcie szyjki macicy.
  4. Oczyść obszar operacyjny 70% etanolem.
  5. Odetnij głowę myszy za pomocą dużych nożyczek.
  6. Wytnij futro i skórę za pomocą małych nożyczek chirurgicznych i stalowych kleszczy z cienką końcówką, kierując się w stronę górnej części czaszki, aby móc wyraźnie zobaczyć szwy i poprowadzić otwór czaszki.
  7. Włóż końcówkę maleńkich nożyczek przez otwór wielki, aby otworzyć czaszkę.
  8. Wytnij w kierunku środka czaszki i w poprzek linii środkowej kości ciemieniowej po przeciwnej stronie czaszki. Delikatnie przeciąć wzdłuż bocznej krawędzi szwu lambdoidalnego.
  9. Podnieś czaszkę, zaczynając od tylnego kącika ciemieniowego i pociągnij ją po przekątnej w górę, aby odkryć mózg, używając kleszczyków z cienką końcówką.
  10. Upewnij się, że tkanka mózgowa nie jest przyczepiona do żadnej kości głowy, gdy czaszka jest podniesiona.
  11. Użyj jednorazowych kleszczy, aby usunąć tkankę łączną między czaszką a mózgiem, aby upewnić się, że tkanka mózgowa zostanie usunięta wraz z czaszką.
  12. Nie pozwól, aby tkanka mózgowa zbytnio wyschła. Umieść mózg, używając jednorazowych kleszczy, na szalce Petriego z 1 ml bulionu GC uzupełnionego 10% (vol/vol) glicerolem.
  13. Mechanicznie homogenizować mózg za pomocą tłoka strzykawki o pojemności 5 ml (patrz krok 2.2.9). Przenieść próbki do sterylnej probówki o pojemności 2 ml i przechowywać w temperaturze -80 °C w celu późniejszej oceny liczby żywotnych komórek bakteryjnych, jak omówiono w kroku 2.2.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przeżywalność myszy zakażonych szczepami typu dzikiego i izogenicznymi mutantami N. meningitidis.
Szczepy Neisseria meningitidis wykorzystane w tych reprezentatywnych wynikach to referencyjny szczep serogrupy C 93/4286 (ET-37) oraz jego mutant izogeniczny 93/4286ΩcssA, uzyskany poprzez inaktywację insercyjną genu cssA, kodującego UDP-N-acetylglukozaminową 2-epimerazę, który mapuje się w locus syntezy kapsuły25. Aby ocenić stopień wirulencji ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym badaniu opisujemy eksperymentalny protokół indukcji meningokokowego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych u dorosłych myszy za pomocą i.cist. inokulacja bakterii meningokokowych. Według naszej wiedzy żaden inny model meningokokowego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych nie został opracowany u myszy laboratoryjnych zakażonych i.cist. trasa; W przeszłości ten sposób był badany w celu dostarczenia modeli meningokokowego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych zarówno u szczura31, jak i królika

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Badania były częściowo wspierane przez PRIN 2012 [numer grantu 2012WJSX8K]: "Modele interakcji gospodarz-mikrob w infekcjach błony śluzowej: opracowanie nowych strategii terapeutycznych" oraz przez PRIN 2017 [2017SFBFER]: "Zintegrowane podejście do rozwiązywania problemów związanych z wzajemnym oddziaływaniem między adaptacją, warunkami stresowymi i opornością na środki przeciwdrobnoustrojowe trudnych patogenów".

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1,8 Cryovial z listwą z gwintem zewnętrznymStarlabE3090-6222
50 mL Polipropylenowa rurka stożkowaFalcon35207030 mm x 115 mm
Adson Kleszcze FST11006-12Termometr
alarmowyTESTO9000530
BactoTM Proteose PeptoneBD211693
BD Strzykawka Micro FineBD320837U-100 Insulina
BD Plastipak 1 ml 25 G 5/8 calaBD30001405 mm x 16 mm
BD Strzykawka Plastipak 5 mlBD30806207 mm x 30 mm
BIOHAZARD AURA B PIONOWA KOMORA LAMINARNABio Air s.c.r.l.Aura B3
EppendorfModel #6131
Butelka DTecniplastDPodziałka do: 400 mL, Całkowita objętość 450 mL, 72 mm x 72 mm x 122 mm
C150 CO2 InkubatorBinder9040-0078
Korpus klatki Eurostandard Typ IITecniplast1264C267 x 207 x 140 mm3, Powierzchnia podłogi 370 cm2
Cell Culture Szalka Petriego z pokrywkąThermo Scientific150288Objętość robocza: 5 ml
WirówkaEppendorfMikrowirówka 5415R
Cuvetta semi-micro L. FormKartell S.p.A.01938-00
Wodorofosforan potasu trójwodnyCarlo erba471767
Wodorofosforan di-sodu bezwodny ACS-do analizyCarloErba 480141g1000
Diete Standard CertyfikatMucedola s.r.l.4RF21Granulat spożywczy dla zwierząt
Pęseta Dumont Hp 5 Stal nierdzewnaFST firmy DUMONTAGT50340,10 x 0,06 mm2 końcówka
Waga elektronicznaGibertiniEU-C1200Max 1200 g, d = 0,01 g, T = -1200 g
Eppendorf Probówka do mikrowirówki z bezpiecznym zamkiemEppendorfT3545-1000EA
ErytromycynaSigma-AldrichE-637625 g
Bardzo cienkie nożyczki BonnF.S.T.14084-08Górna
część filtra ze stali nierdzewnej (miniizolator), H-Temp z zaciskami blokującymiTecniplast1264C400SUC
GC baza agarowaOXOIDCM0367
Gillies Kleszcze 1 x2 zębyFST11028-15
Gliceryna ze stali nierdzewnej RPECarlo Erba4537521 L
Kleszcze GraefeFST11052-10Ząbkowana szerokość końcówki: 0,8 mm
Pokrywa wewnętrznaTecniplast1264C116
Roztwór dekstranu żelazaSigma-AldrichD8517-25ML
Szafa bezpieczeństwa mikrobiologicznego
MARKAPP780751nakrętka PP, grad
Kleszcze do obsługi myszyF.S.T.11035-20Guma ząbkowana; Powierzchnia chwytna: 15 mm x 20 mm
Mucotit-F2000MERZ618462000 mL
Rękawice z naturalnego lateksuMedicaM101
New Brunswick Classic C24 Wytrząsarka do inkubatoraPBI internationalC-24 Klasyczna wytrząsarka
Petri PS SzalkiVWR391-045390 x 14,2 mm2
Pipetman Classic P20GilsonF1236002-20 μ L
Pipetman Classic P200GilsonF12360120-200 μ LL
Pipetman Classim P1000GilsonF123602200-1,000 μ L
PolyvitoxOXOIDSR0090A
Chlorek potasuJ.T. Baker Chemicals B.V.0208250 g
Diwodorofosforan potasuJ.T. Baker Chemicals B.V.02401 kg
PS Jednorazowe kleszczeVWR232-0191
Wyjmowana przegrodaTecniplast1264C812
Okrągłe rurki polipropylenoweFalcon3520635 mL
Chlorek soduMOLEKULA41272436
Ustalacz SS i poliestrowy arkusz filtracyjnyTecniplast1264C
Kleszcze o standardowym wzorzeFST11000-12
Nożyczki do tenotomii StevensFST14066-11
Nożyczki chirurgiczne ze stali nierdzewnej - ToughCutFST14130-17Jednorazowe
rękawice nitrylowe Stainless Touch N TuffAnsell92-500
Zamrażarka ultra niskotemperaturowa (ULT)HaierDW-86L288Objętość = 288 L
Nożyczki WagnerFST14070-12Wkład
ksylazynowyze
ze stali nierdzewnej Biofotometr Ketamina Intervet BH-EN i BHG Klasa II Szybsza BH-EN 2004 Probówki do mikrowirówek 1,5 mL stołowa do inkubatora ze stali nierdzewnej stali nierdzewnej

Bibliografia

  1. van Deuren, M., Brandtzaeg, P., van der Meer, J. W. Update on meningococcal disease with emphasis on pathogenesis and clinical management. Clinical Microbiology Reviews. 13, 144-166 (2000).
  2. Colicchio, R., et al. Fitness Cost of Rifampin Resistance in Neisseria meningitidis: In vitro Study of Mechanisms Associated with rpoB H553Y Mutation. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (12), 7637-7649 (2015).
  3. Talà, A., et al. Serogroup-specific interaction of Neisseria meningitidis capsular polysaccharide with host cell microtubules and effects on tubulin polymerization. Infection and Immunity. 82, 265-274 (2014).
  4. Pagliarulo, C., et al. Regulation and differential expression of gdhA encoding NADP-specific glutamate dehydrogenase in Neisseria meningitidis clinical isolates. Molecular Microbiology. 51, 1757-1772 (2004).
  5. Plant, L., Jonsson, A. B. Contacting the host: insights and implications of pathogenic Neisseria cell interactions. Scandinavian Journal of Infectious Diseases. 35, 608-613 (2003).
  6. Schryvers, A. B., Stojiljkovic, I. Iron acquisition systems in the pathogenic Neisseria. Molecular Microbiology. 32, 1117-1123 (1999).
  7. Virji, M., Makepeace, K., Ferguson, D. J., Watt, S. M. Carcinoembryonic antigens (CD66) on epithelial cells and neutrophils are receptors for Opa proteins of pathogenic neisseriae. Molecular Microbiology. 22, 941-950 (1996).
  8. de Vries, F. P., van Der Ende, A., van Putten, J. P., Dankert, J. Invasion of primary nasopharyngeal epithelial cells by Neisseria meningitidis is controlled by phase variation of multiple surface antigens. Infection and Immunity. 64, 2998-3006 (1996).
  9. Tinsley, C. R., Heckels, J. E. Variation in the expression of pili and outer membrane protein by Neisseria meningitidis during the course of the meningococcal infection. Journal of General Microbiology. 132, 2483-2490 (1986).
  10. Gorringe, A. R., et al. Experimental disease models for the assessment of meningococcal vaccines. Vaccine. 23, 2214-2217 (2005).
  11. Newcombe, J., et al. Infection with an avirulent phoP mutant of Neisseria meningitidis confers broad cross-reactive immunity. Infection and Immunity. 72, 338-344 (2004).
  12. Oftung, F., Lovik, M., Andersen, S. R., Froholm, L. O., Bjune, G. A mouse model utilising human transferrin to study protection against Neisseria meningitidis serogroup B induced by outer membrane vesicle vaccination. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 26, 75-82 (1999).
  13. Salit, I. E., Tomalty, L. Experimental meningococcal infection in neonatal mice: differences in virulence between strains isolated from human cases and carriers. Canadian Journal of Microbiology. 30, 1042-1045 (1984).
  14. Salit, I. E., Tomalty, L. A neonatal mouse model of meningococcal disease. Clinical and Investigative Medicine. 9, 119-123 (1986).
  15. Mackinnon, F. G., Gorringe, A. R., Funnell, S. G., Robinson, A. Intranasal infection of infant mice with Neisseria meningitidis. Microbial Pathogenesis. 12, 415-420 (1992).
  16. Mackinnon, F. G., et al. Demonstration of lipooligosaccharide immunotype and cap- sule as virulence factors for Neisseria meningitidis using an infant mouse intranasal infection model. Microbial Pathogenesis. 15, 359-366 (1993).
  17. Yi, K., Stephens, D. S., Stojiljkovic, I. Development and evaluation of an improved mouse model of meningococcal colonization. Infection and Immunity. 71 (4), 1849-1855 (2003).
  18. Holbein, B. E., Jericho, K. W. F., Likes, G. C. Neisseria meningitidis infection in mice: influence of iron, variations in virulence among strains, and pathology. Infection and Immunity. 24, 545-551 (1979).
  19. Saukkonen, K. Experimental meningococcal meningitis in the infant rat. Microbial Pathogenesis. 4, 203-211 (1988).
  20. Johansson, L., et al. CD46 in meningococcal disease. Science. 301, 373-375 (2003).
  21. Zarantonelli, M. L., et al. Transgenic mice expressing human transferrin as a model for meningococcal infection. Infection and Immunity. 75, 5609-5614 (2007).
  22. Join-Lambert, O., et al. Meningococcal interaction to microvasculature triggers the tissular lesions of purpura fulminans. Journal of Infection Disease. 208, 1590-1597 (2013).
  23. Melican, K., Michea Veloso, P., Martin, T., Bruneval, P., Duménil, G. Adhesion of Neisseria meningitidis to dermal vessels leads to local vascular damage and purpura in a humanized mouse model. PLoS Pathogen. 9, 1003139(2013).
  24. Colicchio, R., et al. The meningococcal ABC-Type L-glutamate transporter GltT is necessary for the development of experimental meningitis in mice. Infection and Immunity. 77, 3578-3587 (2009).
  25. Colicchio, R., et al. Virulence traits of serogroup C meningococcus and isogenic cssA mutant, defective in surface-exposed sialic acid, in a murine model of meningitis. Infection and Immunity. , 00688-00718 (2019).
  26. Ricci, S., et al. Inhibition of matrix metalloproteinases attenuates brain damage in experimental meningococcal meningitis. BMC Infectious Diseases. 14, 726(2014).
  27. Schryvers, A. B., Gonzalez, G. C. Comparison of the abilities of different protein sources of iron to enhance Neisseria meningitidis infection in mice. Infection and Immunity. 57, 2425-2429 (1989).
  28. Beverly, K. S. Chapter 105 - Cerebrospinal Fluid Sampling Small Animal. Critical Care Medicine. , 448-452 (2009).
  29. Liechti, F. D., Grandgirard, D., Leppert, D., Leib, S. L. Matrix metalloproteinase inhibition lowers mortality and brain injury in experimental pneumococcal meningitis. Infection and Immunity. 82, 1710-1718 (2014).
  30. Pagliuca, C., et al. Novel Approach for Evaluation of Bacteroides fragilis Protective Role against Bartonella henselae Liver Damage in Immunocompromised Murine Model. Frontiers in Microbiology. 7, 1750(2016).
  31. Trampuz, A., Steinhuber, A., Wittwer, M., Leib, S. L. Rapid diagnosis of experimental meningitis by bacterial heat production in cerebrospi- nal fluid. BMC Infectious Diseases. 7, 116(2007).
  32. Tuomanen, E. I., Saukkonen, K., Sande, S., Cioffe, C., Wright, S. D. Reduction of inflammation, tissue damage, and mortality in bacterial meningitis in rabbits treated with monoclonal antibodies against adhesion-promoting receptors of leukocytes. Journal of Experimental Medicine. 170, 959-969 (1989).
  33. Goldschneider, I., Gotschlich, E. C., Artenstein, M. S. Human immunity to the meningococcus. I. The role of humoral antibodies. Journal of Experimental Medicine. 129, 1307-1326 (1969).
  34. Goldschneider, I., Gotschlich, E. C., Artenstein, M. S. Human immunity to the meningococcus. II. Development of natural immunity. Journal of Experimental Medicine. 129, 1327-1348 (1969).
  35. World Health Organization. Laboratory methods for the diagnosis of meningitis caused by Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, and Haemophilus influenzae: WHO manual, 2nd Edition. World Health Organization. , Geneva: WHO. (2011).
  36. Chiavolini, D., et al. Method for inducing experimental pneumococcal meningitis in outbred mice. BMC Microbiolology. 4, 36(2004).
  37. Zhang, S., et al. Intracranial Subarachnoidal Route of Infection for Investigating Roles of Streptococcus suis Biofilms in Meningitis in a Mouse Infection Model. Journal of Visualized Experiments. (1), e137(2018).
  38. Pagliuca, C., et al. Evidence of Bacteroides fragilis protection from Bartonella henselae-induced damage. PLoS One. 7, 49653(2012).
  39. Larson, J. A., Howie, H. L., So, M. Neisseria meningitidis accelerates ferritin degradation in host epithelial cells to yield an essential iron source. Molecular Microbiology. 53, 807-820 (2004).
  40. Festing, M. F. W. Phenotypic variability of inbred and outbred mice. Nature. 263, 230-232 (1976).
  41. Festing, M. F. W. Warning: the use of heterogeneous mice may seriously damage your research. Neurobiology of Aging. 20, 237-244 (1999).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Model mysiinokulacja do cysternyNeisseria meningitidisbakteryjne zapalenie opon mózgowo-rdzeniowychcisterna magnaoddziaływanie gospodarz-patogeninfekcja tkanki mózgowejanaliza przeżywalnościbadanie histologiczne
Wywoływanie meningokokowego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych serogrupy C u myszy poprzez dostawę domostkową
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.