Artykuł metodologiczny

Sekcja, hodowla i analiza pierwotnych komórek grzebienia nerwowego czaszki od myszy w celu zbadania delaminacji i migracji komórek grzebienia nerwowego

12.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60051

⸱

3 października 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Craniofacial and Regenerative Biology, King's College London, 2Institute of Molecular Biology and Biotechnology, FORTH, Department of Biomedical Research, University of Ioannina, 3Randall Centre of Cell & Molecular Biophysics, King's College London, 4Department of Biological Applications and Technology, University of Ioannina

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje sekcję i hodowlę komórek grzebienia nerwowego czaszki z modeli mysich, głównie do badania migracji komórek. Opisujemy stosowane techniki obrazowania na żywo oraz analizę zmian prędkości i kształtu komórek.

Streszczenie

W ciągu ostatnich kilku dekad nastąpił wzrost dostępności genetycznie modyfikowanych modeli myszy, używanych do naśladowania ludzkich patologii. Jednak możliwość badania ruchów i różnicowania komórek in vivo jest nadal bardzo trudna. Neurokrystopatie, czyli zaburzenia linii grzebienia nerwowego, są szczególnie trudne do zbadania ze względu na brak dostępności kluczowych etapów embrionalnych i trudności w oddzieleniu mezenchymy grzebienia nerwowego od sąsiedniej mezenchymy mezenchymalnej. W tym miejscu postanowiliśmy ustalić dobrze zdefiniowany, rutynowy protokół hodowli pierwotnych komórek grzebienia nerwowego czaszki. W naszym podejściu wycinamy granicę płytki nerwowej myszy podczas początkowego etapu indukcji grzebienia nerwowego. Obszar graniczny płytki nerwowej jest eksplantowany i hodowany. Komórki grzebienia nerwowego tworzą się w arkuszu nabłonka otaczającym granicę płytki nerwowej, a po 24 godzinach od eksplantacji zaczynają się rozwarstwiać, przechodząc przejście nabłonkowo-mezenchymalne (EMT), aby stać się w pełni ruchliwymi komórkami grzebienia nerwowego. Dzięki naszemu dwuwymiarowemu podejściu do hodowli, można łatwo rozróżnić odrębne populacje tkanek (płytka nerwowa kontra przedmigracyjny i migrujący grzebień nerwowy). Korzystając z metod obrazowania na żywo, możemy zidentyfikować zmiany w indukcji grzebienia nerwowego, EMT i zachowaniach migracyjnych. Połączenie tej techniki z mutantami genetycznymi będzie bardzo skutecznym podejściem do zrozumienia normalnej i patologicznej biologii komórek grzebienia nerwowego.

Wprowadzenie

Linia grzebienia nerwowego (NC) to przejściowa, multipotencjalna i migrująca populacja komórek, która pojawia się wyłącznie u kręgowców we wczesnym okresie rozwoju embrionalnego1,2. Pochodne grzebienia nerwowego są niezwykle zróżnicowane i obejmują glej, mięśnie gładkie, melanocyty, neurony oraz kości i chrząstki twarzoczaszki3,4. Ponieważ grzebień nerwowy przyczynia się do funkcjonowania wielu układów narządów, ta linia jest niezbędna dla embriogenezy człowieka. Nieprawidłowy rozwój NC jest związany z szerokim zakresem najczęstszych wad wrodzonych u ludzi (tj. rozszczep wargi i podniebienia)5, a także zaburzeń, takich jak choroba Hirschsprunga (HSCR), zespół Wardensburga (WS), zespół CHARGE i zespół Williamsa6,7,8,9.

Rozwój NC był badany w wielu systemach modelowych niezwiązanych z ssakami, w tym w modelach Xenopus, piskląt i danio pręgowanego. U ssaków prace na modelach mysich zidentyfikowały niektóre z kluczowych zdarzeń genetycznych leżących u podstaw rozwoju grzebienia nerwowego; Jednak śledzenie biologii komórki migracji grzebienia nerwowego było trudniejsze ze względu na niedostępność zarodka myszy (omówione gdzie indziej10,11). Co więcej, podczas gdy badania na pisklętach, ksenopusach i danio pręgowanym ustanowiły sieć regulacji genów dla NC, badania utraty funkcji w tych modelach zwierzęcych czasami nie wykazują porównywalnego fenotypu u myszy. Na przykład w przypadku Xenopus, danio pręgowanego i piskląt, niekanoniczna sygnalizacja Wnt jest jednym z mechanizmów komórkowych, które pozwalają NC uzyskać zdolność migracyjną12,13,14,15. Jednak w przypadku myszy utrata niekanonicznej sygnalizacji Wnt nie wydaje się wpływać na migrację16. Ponieważ migracja NC in vivo była trudna do śledzenia przez długi czas u myszy, nie jest jasne, czy te różnice gatunkowe odzwierciedlają różne sposoby migracji, czy różnice w regulacji molekularnej.

Jak zauważyłem, badania NC na myszach były bardzo trudne, ponieważ hodowla embrionów ex utero jest pracochłonna. Co więcej, NC jest w stałym bliskim kontakcie z sąsiednimi tkankami, takimi jak mezoderma i neurektoderma. Niedawne zastosowanie specyficznych dla grzebienia neuronalnego sterowników Cre lub barwników egzogennych pozwoliło nam fluorescencyjnie oznaczyć migrujący NC; Podejścia te są jednak nadal ograniczone. Pomimo wielu raportów opisujących różne techniki wizualizacji migracji NC17,18, trudno było przekształcić te techniki w prostą i rutynową procedurę.

Oczywiste jest, że istnieje zapotrzebowanie na techniki, które pozwolą na obsługę i charakterystykę NC ssaków. Skoncentrowaliśmy nasze wysiłki na NC czaszki myszy, ponieważ jest to podstawowy model do badania rozwoju ludzkiej twarzoczaszki i neurokrystopatii. Udoskonaliliśmy nasze podejście w oparciu o kilka interesujących raportów opisujących pierwotną hodowlę komórek NC19,20,21. W tym miejscu dokładnie opisujemy optymalne techniki hodowli do eksplantacji pierwotnych komórek NC. Demonstrujemy metodę obrazowania żywych komórek i optymalne wykorzystanie różnych matryc do powlekania płytek hodowlanych. Nasz protokół opisuje, w jaki sposób uchwycić migrację żywych komórek NC za pomocą odwróconego mikroskopu, który ma służyć jako wskazówka do użytku z innymi mikroskopami, a także jako szczegółowe podsumowanie naszych analiz komórkowych.

Oczekiwanym wynikiem z eksplantatu powinien być pięknie rozplanowany rozkład komórek, które są wyraźnie rozróżniane pod mikroskopem, gdzie można zobaczyć trzy różne populacje komórek, które reprezentują (i) płytkę nerwową, (ii) wstępne i (iii) migrujące komórki grzebienia nerwowego. Pokazujemy, jak analizować zachowania komórek na granicy przedmigracyjnej populacji komórek podczas przejścia nabłonkowo-mezenchymalnego. Skoncentrowaliśmy również nasze wysiłki na badaniu w pełni migrujących komórek pod kątem szybkości komórki, odległości i morfologii komórki.

Protokół

Wszystkie prace na zwierzętach przeszły etyczne zatwierdzenie przez King's College London Ethical Review Process i zostały wykonane zgodnie z licencją brytyjskiego Ministerstwa Spraw Wewnętrznych na projekt P8D5E2773 (KJL).

1. Przygotowanie odczynników

  1. Przygotuj ogólne roztwory i narzędzia, w tym sterylny bufor fosforanowy z solą fizjologiczną (PBS), 70% etanol, narzędzia do preparowania (kleszcze i ostrza do preparowania lub sterylne igły), plastikowe płytki lub szkiełka pokryte dostępnym w handlu hydrożelem lub fibronektyną na bazie macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) (patrz tabela materiałów) oraz pożywką grzebienia nerwowego (patrz poniżej).
  2. Przygotuj podłoże podstawowe grzebienia nerwowego za pomocą zmodyfikowanego podłoża Eagle's Medium firmy Dulbecco (DMEM, 4500 mg/L glukozy), 15% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), minimum 0,1 mM niezbędnej pożywki aminokwasów endogennych (MEM NEAA 100X), 1 mM pirogronianu sodu, 55 μM β-merkaptoetanolu, 100 jednostek/ml penicyliny, 100 jednostek/ml streptomycyny i 2 mM L-glutaminy.
    1. Kondycjonuj podłoże przez noc za pomocą komórek zasilających STO z zahamowaniem wzrostu21.
      1. Przygotować pożywkę z komórek STO (patrz tabela materiałów) zawierającą DMEM uzupełnioną o 10% FBS i 100 U/ml penicyliny, 100 U/ml streptomycyny. Hoduj i rozkwijaj komórki STO do zbiegu w 25 cm2 kolbach pokrytych 0,1% żelatyną. Zastosuj 5000 radów promieniowania gamma.
      2. Wysiewać około 3 x 106 komórek z zahamowaniem wzrostu na szalce o długości10 cm2 lub kolbie o powierzchni 25cm2 (od kroku 1.2.1.1). Dodać około 10–12 ml podłoża podstawowego grzebienia nerwowego i inkubować przez noc.
        UWAGA: Komórki nasienne mogą być używane do produkcji pożywki warunkowej przez okres do 10 dni. Regularnie sprawdzaj wygląd komórek
    2. Przefiltrować pożywkę (wielkość porów 0,22 μm) i uzupełnić 25 ng / ml zasadowego czynnika wzrostu fibroblastów (bFGF) i 1000 U czynnika hamującego białaczkę (LIF).
      UWAGA: Przechowywać w temperaturze 4 °C i zużyć w ciągu miesiąca lub przechowywać w temperaturze -20 °C i zużyć w ciągu 3 miesięcy.
  3. Pokryj powierzchnie kultur tkankowych macierzą zewnątrzkomórkową.
    UWAGA: W zależności od zadawanego pytania biologicznego, matryca może być pokryta na szalkach hodowlanych ze szklanym dnem, plastikowych naczyniach do hodowli tkankowych lub szklanych szkiełkach nakrywkowych. Poniżej znajdują się różne rozcieńczenia hydrożelu na bazie ECM w zależności od podłoża matrycy. Fibronektyna została przetestowana na naczyniach ze szklanym dnem i szkiełkach nakrywkowych tylko w stężeniach określonych poniżej. W tym miejscu będziemy nazywać powierzchnie pokryte podłożem "płytami powlekanymi".
    1. Pokryj powierzchnie kultur tkankowych hydrożelem na bazie ECM.
      UWAGA: Utrzymuj podłoże w chłodzie do momentu powlekania, schładzając podłoże lub trzymając na lodzie.
      1. Rozmrozić hydrożel w temperaturze 4 °C przez noc. Dodaj 5 ml 10% FBS w DMEM do 5 ml hydrożelu, aby uzyskać końcową objętość 10 ml (patrz tabela materiałów).
      2. Przygotować 0,5–1 ml porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C.
      3. Rozmrozić podwielokrotności hydrożelu na lodzie.
      4. Użyj rozcieńczenia hydrożelu w stosunku 1:20 do pokrycia plastiku.
      5. Użyć rozcieńczenia hydrożelu w stosunku 1:5 do pokrycia szkiełek szklanych i płytek do hodowli tkankowych ze szklanym dnem.
        UWAGA: Rozcieńczyć hydrożel w zimnym DMEM.
      6. Nałóż wystarczającą ilość rozcieńczonego hydrożelu, aby pokryć żądany obszar na płytki/szkiełka i inkubuj przez 30–45 minut w temperaturze 37 °C.
      7. Powlekane płytki/szkiełka należy natychmiast zużyć lub przechowywać powlekane szkiełka w temperaturze 4 °C przez noc.
      8. Przed użyciem usuń nadmiar i spłucz szkiełka preparatami DMEM o wysokim poziomie glukozy (opcjonalnie).
    2. Pokryj powierzchnie kultur tkankowych fibronektyną.
      1. Przygotować podwielokrotności 1 mg/ml roztworu podstawowego fibronektyny i przechowywać w temperaturze -80 °C. Rozcieńczyć fibronektynę PBS (dPBS) firmy Dulbecco do końcowego stężenia 1 μg/ml.
      2. Nałóż wystarczającą ilość fibronektyny, aby pokryć żądany obszar i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
      3. Usuń resztki fibronektyny i pozostaw szklankę do wyschnięcia na 30-45 minut.
      4. Przed użyciem przepłukać studzienki lub szkiełka nakrywkowe DMEM o wysokim poziomie glukozy (opcjonalnie).

2. Dzień 1: Sekcja zarodków we wczesnym stadium somitu

UWAGA: Używaj sterylnych narzędzi i sterylnych roztworów. Jeśli potrzebne jest genotypowanie, należy pobrać ciało zarodka w celu ekstrakcji DNA.

  1. Rozwarstwienie płytki nerwowej czaszki jest ograniczone do zarodków po 8,5 dniu po stosunku (dpc). Selekcjonuj zarodki w stadium 5–8 somitów. Rozwiń macicę na PBS i przetnij mezometrium, aby oddzielić każdy zarodek (Ryc. 1A). Ściana mięśniowa macicy kurczy się, a tkanka dziesiętna staje się widoczna (Rysunek 1B).
    UWAGA: Utrzymuj zarodki w macicy w lodowatym PBS, podczas gdy sekcje są wykonywane pojedynczo zarodki. Przenieś zarodki za pomocą szklanej pipety Pasteura do świeżego, sterylnego PBS, aby poprawić widoczność i zmniejszyć zanieczyszczenie.
  2. Wsuń kleszcze między warstwę mięśniową a tkankę dziesiętną i usuń warstwę mięśniową za pomocą drugiej pary kleszczyków (Rysunek 1C).
  3. Za pomocą kleszczy przebij deciduum na krawędziach słupa mesometrialnego i drugą parą kleszczy rozerwij, aby otworzyć się prostopadle do słupa.
  4. Oderwij tkankę dziesiętną za pomocą kleszczy, aby uwidocznić błonę Reicherta.
  5. Ostrożnie usunąć membranę Reicherta. Woreczek żółtkowy trzewny staje się widoczny, a zarodek można zobaczyć w środku (Ryc. 1D).
  6. Usuń woreczek z żółtka trzewnego i owodnię (Ryc. 1E) i ustaw zarodek tak, aby uwidocznić fałd głowy (Ryc. 1F).
  7. Przetnij fałd głowy nad sercem i zeskrob leżącą pod nim mezodermę za pomocą kleszczy i/lub narzędzi do rzęs, aby uzyskać czystą płytkę nerwową (NP) (Rysunek 1H).
    UWAGA: NP może być utrzymywany w całości lub podzielony wzdłuż osi przednio-tylnej, tak aby każda strona mogła być posiewana indywidualnie. Granicę płytki nerwowej można dodatkowo przyciąć od płytki nerwowej, aby zminimalizować wkład neuronów w eksplantaty.
  8. Użyj szklanej pipety Pasteura, aby przenieść wypreparowaną płytkę nerwową na naczynie pokryte hydrożelem wypełnione kondycjonowanym podłożem grzebienia nerwowego.
  9. Delikatnie zakręć naczyniem, aby umieścić NP na środku studzienki. Jest to ważne dla maksymalizacji jakości fazy w obrazowaniu żywych komórek (w 2. dniu).
  10. Inkubować przez noc (lub do żądanego punktu czasowego) w temperaturze 37 °C w 5% CO2 . Komórki grzebienia nerwowego powinny widocznie migrować z płytki nerwowej.
    UWAGA: Komórki zwykle przyczepiają się w ciągu 6–8 godzin. Po przyczepieniu się eksplantatu daj więcej czasu na wizualizację migrujących komórek. Zwykle po 24 godzinach od eksplantacji możemy znaleźć trzy rozróżnialne populacje komórek. Pierwszą populacją, w centrum eksplantatu, jest płytka nerwowa (NP). Druga populacja, przedmigracyjna NC (pNC), otacza NP w nabłonkowym arkuszu komórek. Trzecia populacja, w pierścieniu zewnętrznym, składa się z migrujących NC (mNC), które są większe i wydają się w pełni mezenchymalne (Ryc. 2).

3. Dzień 2: Obrazowanie żywych komórek mysich komórek grzebienia nerwowego czaszki

UWAGA: Obrazowanie powinno być wykonane po 24 godzinach od eksplantacji, aby optymalnie zobrazować i określić ilościowo migrację komórek grzebienia nerwowego. Pożywki indukcyjne NC nie muszą być odświeżane przed obrazowaniem żywych komórek. Wymagany jest dostęp do odwróconego mikroskopu ze zmotoryzowanym stolikiem i wbudowaną komorą środowiskową. Stosować wielodołkowe szalki do hodowli tkankowych odpowiednie do obrazowania (tabela materiałów).

  1. Konfiguracja mikroskopu
    1. Ustawić komorę środowiskową na temperaturę 37 °C i 5% CO2 .
    2. Przebić otwór w pokrywie pokrywy płytki do hodowli tkankowej, aby igła CO2 podłączona do komory nawilżania CO2 mogła znaleźć się w płytce.
    3. Umieść naczynie do hodowli tkankowych w uchwycie próbki i przyklej taśmą pokrywkę płytki i igłę CO2, aby zapobiec wstrząsom podczas pobierania wielu dołków.
    4. Włącz kontroler mikroskopu, kontroler stolika i oprogramowanie do obrazowania.
    5. Skoncentruj się na komórkach NC czaszki przy 10-krotnym powiększeniu (z wybranym pasującym pierścieniem fazowym w kondensatorze).
    6. Ustaw wysokiej jakości kontrast fazowy w mikroskopie, regulując przysłonę przysłony pola widzenia, przysłonę przysłony i teleskop centrujący, zgodnie z instrukcją konfiguracji mikroskopu.
  2. Obrazowanie żywych komórek z kontrastem fazowym
    1. Ustaw katalog lub lokalizację pliku, w którym zostaną zapisane pliki poklatkowe.
    2. Ustaw czas ekspozycji, binowanie i obszar aparatu.
    3. Ustaw liczbę punktów czasowych, czas trwania obrazowania i odstęp czasu między klatkami.
      1. Aby określić ilościowo zdolność migracji komórek NC, ustaw mikroskop na 10-krotne powiększenie, wykonując 1 klatkę co 5 minut (217 punktów czasowych w ciągu 18 godzin). Aby określić ilościowo morfologię komórki, ustaw powiększenie na 40x, biorąc 1 klatkę/min (61 punktów czasowych w ciągu 1 godziny). Aby określić ilościowo dynamikę lamelipodiów, ustaw powiększenie na powiększenie 40x lub 60x, wykonując 1 klatkę co 10 s (ponad 10 min).
    4. W przypadku obrazowania wielodołkowego ustaw stolik mechaniczny tak, aby poruszał się między wybranymi pozycjami XY. Upewnij się, że komórki NC czaszki są ostre, a pozycje stolika są prawidłowe.
    5. Użyj polecenia Acquire, aby rozpocząć obrazowanie poklatkowe.
    6. Po zakończeniu obrazowania poklatkowego przejrzyj dane wielowymiarowe i wyeksportuj pliki .stk do analizy.
      UWAGA: .stk jest plikiem stosu TIFF.
    7. Wyjdź z oprogramowania, wyłącz komputer i wyłącz stolik, kamerę i kontrolery mikroskopu.

4. Analiza obrazowa: kwantyfikacja migracji komórek grzebienia nerwowego

UWAGA: Aby lepiej zdefiniować zachowania komórkowe wykazywane przez migrujące mysie komórki grzebienia nerwowego czaszki, przeanalizowaliśmy szereg mierzalnych parametrów migracji, koncentrując się w szczególności na zdolności migracyjnej i dynamice kształtu komórki. (1) Migracja (skumulowana odległość) to całkowita długość drogi przebytej przez komórkę (μm); (2) Migracja (odległość euklidesowa) to odległość w linii prostej między początkowym i końcowym położeniem komórki (μm); (3) Migracja (prędkość komórki) to odległość przebyta przez komórkę w jednostce czasu (μm/min); (4) Kształt komórki (obszar komórki) to całkowita powierzchnia pokryta przez komórkę. Ustaw piksel w skali mikronów zgodnie z mikroskopem obrazowania. (A = Apx x Npx, gdzie Apx = obszar pikseli, a Npx = liczba pikseli. Jednostki: μm2; (5) Kształt komórki (okrągłość komórki) to odchylenie kształtu komórki od idealnego koła, które jest wskazywane przez wartość kołowości 1,0 (4π (A / P2)) gdzie A = powierzchnia, a P = obwód.

  1. Śledzenie pojedynczej komórki
    UWAGA: Aby zmierzyć migrację komórek NC, generowane są współrzędne XY poszczególnych komórek we wszystkich klatkach poklatkowych. Pozwala to na późniejszą analizę miar odległości, szybkości i trwałości migracji komórek.
    1. Otwórz ImageJ i zaimportuj dane jako pliki stosu TIFF.
    2. Kliknij pozycję Analizuj | Ustaw Skala, aby skalibrować pliki .stk zgodnie z ustawieniami mikroskopu, pracując w pikselach/μm.
    3. Kliknij Wtyczki | Śledzenie | Śledzenie ręczne, aby otworzyć wtyczkę do ręcznego śledzenia komórek Image J. Aby rozpocząć śledzenie komórek, wybierz opcję Dodaj ścieżkę.
    4. Śledź komórki we wszystkich klatkach filmów poklatkowych, używając jądra jako punktu odniesienia.
      UWAGA: Należy śledzić 10–20 komórek na eksplant, przy czym łącznie śledzonych jest 60 komórek (n = 3). Komórki, które ulegają podziałowi komórkowemu w trakcie upływu czasu, powinny być wyłączone z analizy.
    5. Zapisz i wyeksportuj wyniki jako plik .csv. Wyniki reprezentują numer ścieżki pojedynczej komórki, numer wycinka i współrzędne XY we wszystkich ramkach.
  2. Kwantyfikacja zdolności migracyjnej komórek grzebienia nerwowego
    1. Otwórz dane śledzenia pojedynczej komórki (patrz wyżej). Konwertuj pliki .csv na .txt format pliku.
    2. Otwórz oprogramowanie do migracji (Tabela materiałów). Kliknij kartę Importuj dane, aby zaimportować dane śledzenia komórek jako plik .txt.
    3. W obszarze Zestawy danych | Inicjalizacja, wybierz liczbę wycinków lub klatek do analizy i ustaw kalibrację XY oraz interwał czasowy między klatkami. Wybierz pozycję Zastosuj ustawienia, aby zapisać ustawienia.
    4. Wybierz symbol Dane wykresu, aby utworzyć wykresy trajektorii. Wybierz symbol Statystyki, aby określić ilościowo miary odległości i prędkości.
    5. Wykresy trajektorii można zapisać jako pliki map bitowych (.bmp), a miary odległości i prędkości jako pliki .txt. Wybierz symbol Usuń dane. Powtórz te czynności dla innych plików poklatkowych.
      UWAGA: Wykresy trajektorii mogą być używane do wizualizacji bezpośredniości ścieżek poszczególnych komórek dla danego stanu lub stanu komórki w trakcie filmów poklatkowych (Rysunek 4A). Dane dotyczące odległości i prędkości zapisane w plikach .txt mogą być następnie wykorzystane do dalszej analizy.
  3. Kwantyfikacja obszaru komórek grzebienia nerwowego i kolistości
    1. Otwórz pliki poklatkowe .stk w ImageJ i skalibruj je zgodnie z ustawieniami mikroskopu, pracując w pikselach/μm.
    2. W obszarze Analizuj | Ustaw Pomiary, kliknij, aby wybrać parametry kształtu komórki: obszar komórki, obwód i deskryptor kształtu.
    3. Użyj narzędzia Zaznaczanie odręczne, aby ręcznie obrysować każdą komórkę, używając granic błony komórkowej jako przewodnika.
    4. Naciśnij Ctrl + B na klawiaturze, aby kontur komórki był nałożony na obraz. Powtórz te czynności dla komórek w każdej klatce poklatkowej.
    5. Korzystanie z punktu menu Obraz | Nakładka | Do Menedżera zwrotu z inwestycji w celu zapisania wartości.
    6. Po obrysowaniu wszystkich interesujących komórek w każdej klatce kliknij przycisk Zmierz. Zapisz wyniki jako plik .csv.
      UWAGA: Należy obrysować 10–20 komórek na film, przy czym w sumie analizowanych jest 30–60 komórek na warunek (n = 3). Dane dotyczące kształtu komórki (pliki .csv) mogą być wykorzystane do ilościowego określenia, jak dynamika kształtu komórki zmienia się w czasie (Rysunek 4C) lub jak morfologia może zostać zmieniona pod wpływem różnych terapii komórkowych.

Wyniki

Stosując zaprezentowaną tutaj procedurę, zarodki myszy wypreparowano z macicy, a następnie usunięto tkanki pozazarodkowe (Rycina 1A–D). Określono stadium somytów zarodków (wykorzystując wyłącznie zarodki w stadium 5–8 somytów (ss), Rycina 1E,F). Następnie wypreparowano przednią płytkę neuralną i wyizolowano neuroepithelium. Komórki mezo-dermalne, zidentyfikowane jako luźne, okrągłe komórki mezenchymalne, zostały delikatnie usunięte pędzelkiem (Rycina 1G-L). Przednią płytkę neuralną można wypreparować w całości, w takim przypadku tkanka grzebienia neuralnego pojawi się bocznie i będzie rozprzestrzeniać się radialnie wokół eksplantatu, lub można osobno wypreparować każdą z krawędzi płytki neuralnej (prawą i lewą). Jest to szczególnie przydatne podczas preparowania tkanek z mutantów genetycznych.

W ciągu 24 h wokół eksplantu płytki neuronalnej można wyraźnie zaobserwować obszar przedmigracyjnej (nabłonkowej) grzebieni neuronalnej czaszki (Rysunek 2B). Co więcej, subpopulacja komórek grzebienia neuronalnego przeszła przejście nabłonkowo-mezenchymalne i wykazuje pełny charakter mezenchymalny (Rysunek 2). W ten sposób otrzymujemy kilka koncentrycznych pierścieni różnych komórek, z płytką neuronalną (NP) w centrum, przedmigracyjnym grzebieniem neuronalnym (pNC) w kręgu pośrednim oraz populacją migrującego grzebienia neuronalnego (mNC) w zewnętrznym pierścieniu (Rysunek 2B). Aby śledzić komórki NC, można wykorzystać genetycznie zmodyfikowane modele mysie, co pokazano na Rysunku 2C. W tym przypadku zastosowano specyficzny dla grzebienia neuronalnego model Wnt1::Cre;RosamTmG, w którym komórki NC są znakowane na zielono. U tych myszy komórki wykazują ekspresję białka membrane tomato (mT, na czerwono), chyba że ekspresyjne jest u nich rekombinaza Cre. Rekombinacja prowadzi do ekspresji błonowego zielonego białka fluorescencyjnego (GFP, na zielono). Czerwone komórki widoczne w centrum eksplantu to komórki płytki neuronalnej. Niektóre grzbietowe komórki płytki neuronalnej również wykazują ekspresję GFP; w przypadku długotrwałej hodowli wycięlibyśmy wszystkie komórki z centrum. Dla naszych celów czystość eksplantu jest wystarczająca, aby śledzić poszczególne populacje komórek grzebienia neuronalnego. Tam, gdzie wymagana jest wyższa czystość grzebienia neuronalnego, tę strategię znakowania genetycznego można połączyć z sortowaniem komórek aktywowanym fluorescencją (FACS), aby zapewnić jednorodność populacji. Alternatywnie można utrwalić eksplanty i zidentyfikować populację NC za pomocą znakowania przeciwciałami.

Po 24 h stało się również oczywiste, że charakterystyczne koncentryczne pierścienie komórek NC w fazie przedmigracyjnej i pełnej migracji w kulturach eksplantów nie były zależne od wyboru macierzy ani nie były przez nią sterowane (Rycina 3). Kultury eksplantów wysiane zarówno na hydrożelu opartym na ECM, jak i na fibronektynie, tworzyły porównywalne struktury eksplantów, składające się z trzech populacji komórek: NP, pNC i mNC (Rycina 3A,C). Morfologia komórek grzebienia nerwowego była również porównywalna pomiędzy komórkami wysianymi na hydrożelu opartym na ECM a tymi na fibronektynie (Rycina 3B,D). Jednak eksplanty wysiane na fibronektynie wytworzyły komórki z bardziej wyraźnymi lamelipodiami na czołowej krawędzi komórki, które wydawały się być bardziej spolaryzowane w kierunku migracji (Rycina 3B,D).

Po pojawieniu się populacji migrujących komórek grzebienia neuralnego można przystąpić do obrazowania żywych komórek. Mikroskopię poklatkową ustawia się na powiększeniu 10x (18 h, 1 klatka/5 min) w celu późniejszej analizy migracji komórek grzebienia neuralnego (Rycina 4A). Wtyczka Manual Tracking programu ImageJ generuje współrzędne XY poszczególnych komórek we wszystkich klatkach filmów poklatkowych (Rycina 4B). Współrzędne te mogą być przetwarzane za pomocą oprogramowania do analizy migracji. Oprogramowanie to umożliwia wizualizację torów poszczególnych komórek w czasie (Rycina 4B) i może być wykorzystane do ilościowego określenia dystansu skumulowanego i euklidesowego, a także prędkości komórek.

Dane z obrazowania time-lapse dostarczają również bogatej wiedzy na temat morfologii komórek podczas migracji komórek grzebienia neuronalnego czaszki (Rycina 4C). Poprzez obrysowanie poszczególnych błon komórkowych, z wszystkich klatek filmów można obliczyć pomiary powierzchni i obwodu komórek (Rycina 4C). Pomiary te umożliwiają późniejszą kwantyfikację powierzchni i kolistości komórek (Rycina 4D). Rycina 4C przedstawia analizę zmian kształtu komórek w ciągu 18 h. Należy zauważyć, że w miarę jak komórki migrują z dala od eksplantatu, powierzchnia komórek znacząco wzrasta, podczas gdy ich kolistość pozostaje stosunkowo stała (jednoczynnikowa ANOVA, test wielokrotnych porównań Tukeya) (Rycina 4E,F). Sugeruje to, że w momencie opuszczania brzegu nabłonkowego i utraty kontaktów międzykomórkowych, komórki wykazują zwiększoną powierzchnię rozprzestrzeniania. Pomiary kolistości komórek nie uległy istotnym zmianom w czasie; jednakże krótkotrwałe zmiany kolistości mogą być widoczne przy kwantyfikacji większej liczby punktów czasowych. Pomiary kolistości komórek mogą również dostarczać interesujących danych na temat dynamiki kształtu komórek w obecności sygnału chemotaktycznego lub w warunkach ograniczenia przestrzennego.

Proces dysekcji tkanek w mikroskopii; sekwencja obrazów pokazująca technikę mikrodysekcji.
Rycina 1: Izolacja eksplantów grzebienia neuronalnego czaszki z zarodka w stadium e8.5.
Obrazy są klatkami z filmu dokumentującego technikę mikrodysekcji. (A–C) Dysekcja zarodka z macicy. (B–C) Przy użyciu dwóch ostrych pęset delikatnie rozdzielić warstwę mięśniową. Panel (D) pokazuje zarodek wewnątrz trzewnego pęcherzyka żółtkowego (żółta linia). Wyjąć zarodek z trzewnego pęcherzyka żółtkowego. (E) Widoki boczne zarodka w stadium 8.5. (F) Widok grzbietowy zarodka w stadium 8.5. Policzyć somity (ss), aby określić wiek zarodków; zazwyczaj 5–8 ss (żółte okręgi w F). (G) Zbliżenie na region czaszkowy zarodka. Usunąć błony pozazarodkowe z regionu czaszkowego; somity są zaznaczone żółtą linią. (H) Dysekcje przedniej płytki neuronalnej są wykonywane pod pierwszym łukiem skrzelowym (żółta linia). (I) Widok boczny dysekcji przedniej płytki neuronalnej. Fałdy neuronalne, z których wywodzą się komórki grzebienia neuronalnego, są zaznaczone żółtą linią. (J–L) Przed wysianiem NP na przygotowane szalki hodowlane, w możliwie największym stopniu usunąć tkankę mezo-dermalną (puszyste komórki mezenchymalne) znajdującą się pod przednimi fałdami neuronalnymi. Film został nagrany przy użyciu stereomikroskopu z szerokopolowym obiektywem apochromatycznym przy powiększeniu 3.0X (patrz Tabela materiałów). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Schemat brzegu płytki neuralnej; fazy embrionalnego rozwoju czaszki; obraz mikroskopii fluorescencyjnej.
Rysunek 2: Eksplant grzbietowej grzebieni neuralnej czaszki myszy.
(A) Schematyczny widok grzbietowy zarodka myszy w stadium e8.5. Region czaszki zarodka jest przecięty wzdłuż przerywanej linii. Brzeg płytki neuralnej (zaznaczony na czerwono) zostaje wyizolowany z otaczającej tkanki mezo-dermalnej i hodowany przez 24 h, aby umożliwić emigrację grzebieni neuralnej czaszki. Schemat zaadaptowano z22,23. (B) Po lewej: Reprezentatywny obraz w świetle przechodzącym eksplantu grzebieni neuralnej czaszki 24 godziny po wysianiu. Obserwuje się trzy populacje komórek, które przedstawiono również schematycznie po prawej stronie. NP = płytka neuralna, pNC = przedmigracyjna grzebień neuralna i mNC = migrująca grzebień neuralna. Pasek skali = 250 μm. (C) Obrazy w większym powiększeniu eksplantu od myszy znakowanej genetycznie (Wnt1::cre; RosamTmG). Komórki bez sterownika Cre wykazują ekspresję błonowego tomato (mT) w kolorze czerwonym. Ekspresja Cre pod kontrolą specyficznego dla grzebieni neuralnej promotora Wnt1 prowadzi do wycięcia kasety mT i ekspresji błonowego GFP (mG) w kolorze zielonym. Jądra komórkowe są barwione Hoescht (na niebiesko). Pasek skali = 200 µm. (D–D’’) Obrazy w większym powiększeniu komórek migrujących wykazujących ekspresję błonowego GFP (D). (D’) DNA jest znakowane Hoescht (niebieski). (D’’) Nałożenie obrazów D i D’. Pasek skali = 20 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Porównanie morfologii komórek, hydrożel ECM vs. fibronektyna, obrazy mikroskopowe, oznaczenia mNC, pNC, NP.
Rysunek 3: Eksplanty hodowane na różnych podłożach.
(A–B) Obrazy w kontraście fazowym eksplantów hodowanych na komercyjnym hydrożelu ECM. (C–D) Eksplanty hodowane na 1 µg/mL fibronektyny. Komórki płytki neuronalnej (NP), przedmigracyjne (pNC) i migrujące (mNC) grzebienia neuronalnego można odróżnić na podstawie ich różnej morfologii. Pasek skali = 100 μm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Analiza migracji komórek: dołączono mikroskopię time-lapse, śledzenie komórek oraz wykresy pola powierzchni i kolistości.
Rycina 4: Ilościowe określenie migracji komórek grzebienia neuronalnego czaszki oraz dynamiki kształtu komórek.
(A) Klatki z obrazowania w kontraście fazowym w trybie time-lapse kultur eksplantów z nałożonymi trajektoriami pojedynczych komórek grzebienia neuronalnego, opracowane przy użyciu wtyczki ImageJ/Fiji Manual Cell Tracking. Dziesięć reprezentatywnych komórek mNC śledzono ręcznie przez 18 h (217 klatek) i wyeksportowano współrzędne XY. Dane przedstawiono w formie nałożonych wykresów punktowych i liniowych. Komórki wysiano na 1 μg/mL fibronektyny. Pasek skali = 200 μm. (B) Reprezentatywny wykres trajektorii 10 komórek mNC, wygenerowany za pomocą oprogramowania do analizy migracji. (C) Klatki w kontraście fazowym pobrane z analizy time-lapse kultur eksplantów. Linie przerywane obrysowują 8 reprezentatywnych migrujących komórek grzebienia neuronalnego, w których analizowano dynamikę kształtu komórek po wysianiu na 1 μg/mL fibronektyny. Pasek skali = 200 μm. (D) Schematyczne przedstawienie obliczeń wykorzystanych do ilościowego określenia pola powierzchni i kolistości komórek. Morfologia komórki na schemacie odpowiada komórce zaznaczonej na niebiesko w części (C). Apx = pole powierzchni piksela, Npx = liczba pikseli, A = pole powierzchni, P = obwód (1 pixel = 1.60772 µm2). (E–F) Ilościowe określenie miar pola powierzchni i kolistości komórek w czasie. Dane przedstawiono jako średnia ± SEM. Każda kropka reprezentuje jedną komórkę (n = 60), pobraną z 3 niezależnych eksperymentów i analizowaną w 0 h, 6 h, 12 h oraz 18 h (ns – brak istotności, * p<0.05, **** p < 0.0001 jednoczynnikowa ANOVA, test wielokrotnych porównań Tukeya). Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Badanie komórek grzebienia nerwowego ssaków było wyzwaniem dla naukowców ze względu na charakter rozwoju ssaków in utero. Badania in vivo są trudne do przeprowadzenia, ponieważ zarodek musi być manipulowany w warunkach naśladujących życie w macicy. W praktyce prawie niemożliwe jest powtarzalne hodowanie tych zarodków (E8+) przez okres dłuższy niż 24 godziny, zwłaszcza w przypadku obrazowania na żywo. Co więcej, indukcja i migracja grzebienia nerwowego zachodzą jednocześnie z zamykaniem cewy nerwowej i obracaniem się embrionalnym u myszy; Jest to kluczowe i stresujące zdarzenie morfogenetyczne, które często kończy się niepowodzeniem, gdy zarodki są hodowane ex utero. W związku z tym wskaźnik powodzenia podejść ex utero jest na ogół niski. Zastosowanie unieśmiertelnionych komórek NC21 jest użytecznym narzędziem do ograniczenia wykorzystywania zwierząt i może stanowić lepsze źródło komórek grzebienia nerwowego do długoterminowej analizy, transfekcji i badań wzbogacających. Istnieje jednak wyraźna potrzeba niezawodnej hodowli pierwotnych komórek grzebienia nerwowego. Nasza metoda ma zastosowanie do mysich modeli genetycznych z nokautem lub warunkowych modeli genetycznych. Metoda porównywalna do naszej została opisana dla innych populacji grzebieni nerwowych20; jednak nasza metoda dokładnie opisuje krok po kroku izolację mysich komórek NC czaszki. Opisujemy również szczegółowo zastosowanie różnych matryc, a także procedurę analizy migracji.

Aby osiągnąć spójne wyniki, stwierdziliśmy, że szczególną uwagę zwrócono na ocenę stopnia zaawansowania podczas selekcji zarodków. Nic dziwnego, że liczba somitów koreluje z różnymi etapami rozwoju NC czaszki. Dlatego znajomość anatomii zarodka jest bardzo ważna przed uzyskaniem jakichkolwiek danych eksperymentalnych. Podejście to można następnie dostosować do izolowania dyskretnych populacji komórek grzebienia nerwowego, w zależności od pytania biologicznego i komórek docelowych.

Po wybraniu i wypreparowaniu zarodków komórki mezodermalne można łatwo odróżnić i należy je usunąć, aby umożliwić lepszą wizualizację i zmniejszyć zanieczyszczenie. W przypadku hodowli długotrwałych tkankę płytki nerwowej można usunąć po 24 godzinach od posiewu, aby zapobiec zanieczyszczeniu przez tkanki nerwowe. Dalszym udoskonaleniem może być zastosowanie fluorescencyjnego znakowania linii (na przykład przy użyciu sterowników Wnt1::cre lub Sox10::creERT w połączeniu z reporterami fluorescencyjnymi24,25) w celu odróżnienia komórek grzebienia nerwowego od innych tkanek, jak pokazano na rysunku 2C.

Poprzednie doniesienia podkreślały potencjał posiewu mysich kultur eksplantatów NC na różnych matrycach, najczęściej na komercyjnych hydrożelach ECM, fibronektynie i kolagenie I20,21,26. W naszych rękach mysie czaszkowe kultury eksplantatów NC są z powodzeniem hodowane na wszystkich trzech matrycach, w stężeniach określonych w oryginalnych raportach (dane nie pokazane). Początkowe, wyrafinowane podejście, które dostosowaliśmy do naszych kultur eksplantatów NC, wykorzystywało komercyjny hydrożel jako matrycę z wyboru, która składała się głównie z lamininy i kolagenów21 (Figura 3A-B). Jednak skład tego hydrożelu nie jest jasno określony, o nieznanym czynniku wzrostu i zawartości białka. W związku z tym od tego czasu zmieniliśmy nasze podejście do posiewu mysich kultur eksplantatów NC na fibronektynie (ryc. 3C-D). Fibronektyna jest dobrze zdefiniowana i silnie eksprymowana w ECM i błonach podstawnych, wzdłuż których migrują komórki NC in vivo 28,29,30. Aby zoptymalizować matrycę fibronektyny, która najlepiej replikuje migrację i morfologię komórek grzebienia nerwowego, jak widać przy użyciu hydrożelu, porównaliśmy zachowania komórek NC wykazywane na hydrożelu w porównaniu z miareczkowaniem 0,25-30 μg / ml fibronektyny i zdefiniowaliśmy fibronektynę 1 μg / ml jako zapewniającą idealne właściwości (dane nie pokazane). Uważamy, że te wstępne prace mogą pomóc w ustanowieniu ram dla systematycznego porównywania matryc, takich jak fibronektyna, z poprzednio opisanymi, a mianowicie kolagenem i lamininą 32,33,34. Szczególnie interesujące byłoby porównanie zdolności migracyjnej mysich komórek NC na fibronektynie w porównaniu z kolagenem I, biorąc pod uwagę, że kolagen-IA1 jest endogennie wydzielany przez mysie, ptasie i ludzkie komórki NC 28,30,31,32. Kolagen I jest zatem tak samo istotny jak fibronektyna przy rozważaniach nad wyborem matrycy. Warto również zauważyć, że biodostępność czynników wzrostu w pożywkach może być zmieniona przez różne składniki matrycy, zwłaszcza biorąc pod uwagę wysoką zawartość surowicy w naszych pożywkach. Aby temu zaradzić, pracujemy obecnie nad stworzeniem zdefiniowanych warunków hodowli bez surowicy. Te zdefiniowane pożywki są z powodzeniem stosowane w protokołach indukcji grzebienia nerwowego w polu pluripotencjalnych komórek macierzystych, ale wymagają dalszej optymalizacji dla naszego systemu hodowli eksplantatów NC33,34. Nasza praca może również posłużyć jako punkt wyjścia do udoskonalenia warunków dla innych typów komórek NC, takich jak NC serca i tułowia, oraz do późniejszych badań różnicowania NC. Co najważniejsze, protokół ten pozwala na izolację komórek NC czaszki do różnych zastosowań. Przewidujemy badania nad migracją kierowaną, migracją 3D i inwazją. Wyizolowane w ten sposób komórki mogą być poddawane obróbce in vitro w celu przeprowadzenia szeregu analiz. Na przykład, komórki mogą być łatwo leczone przy użyciu różnych małych cząsteczek do celowania w określone białka, mogą być leczone w określonych punktach czasowych, a eksperymenty z wymłukiwaniem mogą być zaprojektowane w celu określenia odzyskiwania zachowań komórek (Figura 4). Możliwa jest długoterminowa hodowla do testów transfekcji i różnicowania, a także pasaż komórek (dane nie pokazane). Jednak żywotność, zdolność do odnawiania komórek i multipotencja powinny być potwierdzone po pasażowaniu. Komórki platerowane na szklanych szkiełkach nakrywkowych mogą być również stosowane w protokołach barwienia immunofluorescencyjnego, po obrazowaniu na żywo. Wreszcie, podejście to reprezentuje niezwykle potężny system do badania migracji NC z genetycznych modeli myszy 22,23,24,25.

Oświadczenia

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Podziękowania

Jesteśmy wdzięczni Jednostce Usług Biologicznych King's College London, szczególnie Tiffany Jarvis i Lynsey Cashnella za ich nieustające wsparcie. Dziękujemy Derekowi Stemple, Mamoru Ishii i Robertowi Maxsonowi za rady i pomoc z odczynnikami podczas początkowego ustanawiania tego protokołu. Dziękujemy Dheraj Taheem za pomoc w napromienianiu promieniami gamma komórek STO. Dziękujemy laboratoriom Liu i Krause, a w szczególności Tommy'emu Pallettowi, za ogromne wsparcie. Praca ta została sfinansowana z grantów BBSRC (BB/R015953/1 dla KJL/MK), stypendium z MRC Doctoral Training Programme (LD), Newland Pedley Fund (ALM) i KRIPIS II, Sekretariatu Generalnego ds. Badań i Technologii (GSRT), Ministerstwa Edukacji i Spraw Religijnych, Grecji oraz Fondation Santé (dla SGGM).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
bFGFR& Systemy D233-FB
b-merkaptoetanolGibco31350-010
Kolby do hodowli tkankowychCorning430639Kolby hodowlane 25 cm2
DMEM (4500 mg/L glukozy)SigmaD5671
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (dPBS)SigmaD8537
EtanolFisher ChemicalsE/0650DF/C17
Płodowa surowica bydlęcaSigmaTFS AA 10-155
Płodowa surowica bydlęca (ES Cell FBS)Gibco26140079/16141-079
Fibronektyna osocze bydlęceSigmaF1141
Żelatyna ze skóry bydlęcejSigmaG9382
L-glutaminaSigmaG7513
Szklane, wielodołkowe 24- studzienkowa płytka do hodowlitkankowej Ibidi82406Szklane dno, nr 1,5, 24-dołkowe naczynie do hodowli tkankowej z czarnymi bokami
Narzędzie do analizy migracji komórekIbidiv2.0Instrukcje obsługi tego oprogramowania można znaleźć pod adresem: https://ibidi.com/manual-image-analysis/171-chemotaxis-and-migration-tool.html.
Wtyczka Circularity ImageJw wersji 1.29 lub nowszejWtyczka Circularity jest rozszerzoną wersją ImageJ/Fiji' s Polecenie Mierz, zaprojektowane przez Rasbanda, W., (2000) (wsr@nih.gov).
LIFESGRO firmy MilliporeESG1106
Ręczna wtyczka do śledzenia komórekImageJv1.34k lub nowszaref Cordelieres F. Institut Curie, Orsay (Francja) 2005
Oprogramowanie do analizy obrazu mikroskopuUniversal Imaging Corporation6.3r7MetaMorph Software Series 6.3r7
MEM endogenne aminokwasy 100XGibco11140-050
Matrigel ( Hydrożel na bazie ECM)Mikroskop Corning356234
Olympus1X81Olympus 1X81 mikroskop odwrócony
Kamera mikroskopowaFotometria512BKamera fotometryczna Cascadell 512B (4x UPlanFL N, 10x UPlanFL N, 20x UPlanFL N, 40x UPlanFL N)
Sterownik mikroskopuOlympus1X2-UCBSterownik
mikroskopu Olympus 1X2-UCBRegulator temperatury mikroskopuSolent ScientificRS232Utrzymywany na poziomie 37° C
Penicylina / streptomycynaSigmaA5955
Pirogronian soduSigmaS8636
Oprogramowanie statystyczneGraphpad Prismv7.0
Ogniwa zasilające STOATCCCRL-1503
Mikroskop stereoskopowyNikonSMZ
XY Kontroler stopniaApplied Scientific Oprzyrządowanie (ASI)MS-4400

Bibliografia

  1. Duband, J. L. Diversity in the molecular and cellular strategies of epithelium-to-mesenchyme transitions: Insights from the neural crest. Cell Adhesion & Migration. 4, 458-482 (2010).
  2. Mayor, R., Carmona-Fontaine, C. Keeping in touch with contact inhibition of locomotion. Trends in Cell Biology. 20, 319-328 (2010).
  3. Le Douarin, N., Kalcheim, C. The neural crest. 2nd edn. , Cambridge University Press. (1999).
  4. Trainor, P. A. Neural Crest Cells : Evolution, Development, and Disease. , Academic Press. (2014).
  5. Jiang, R., Bush, J. O., Lidral, A. C. Development of the upper lip: morphogenetic and molecular mechanisms. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 235, 1152-1166 (2006).
  6. Ahola, J. A., et al. Increased incidence of Hirschsprung's disease in patients with hypoplastic left heart syndrome--a common neural crest-derived etiology? Journal of Pediatric Surgery. 44, 1396-1400 (2009).
  7. Bajpai, R., et al. CHD7 cooperates with PBAF to control multipotent neural crest formation. Nature. 463, 958-962 (2010).
  8. Inoue, K., et al. Congenital hypomyelinating neuropathy, central dysmyelination, and Waardenburg-Hirschsprung disease: phenotypes linked by SOX10 mutation. Annals of Neurology. 52, 836-842 (2002).
  9. Kim, H., Kang, K., Ekram, M. B., Roh, T. Y., Kim, J. Aebp2 as an epigenetic regulator for neural crest cells. PloS one. 6, e25174(2011).
  10. Barriga, E. H., Trainor, P. A., Bronner, M., Mayor, R. Animal models for studying neural crest development: is the mouse different? Development. 142, 1555-1560 (2015).
  11. Bronner, M. E., LeDouarin, N. M. Development and evolution of the neural crest: an overview. Developmental Biology. 366, 2-9 (2012).
  12. De Calisto, J., Araya, C., Marchant, L., Riaz, C. F., Mayor, R. Essential role of non-canonical Wnt signalling in neural crest migration. Development. 132, 2587-2597 (2005).
  13. Carmona-Fontaine, C., et al. Contact inhibition of locomotion in vivo controls neural crest directional migration. Nature. 456, 957-961 (2008).
  14. Matthews, H. K., et al. Directional migration of neural crest cells in vivo is regulated by Syndecan-4/Rac1 and non-canonical Wnt signaling/RhoA. Development. 135, 1771-1780 (2008).
  15. Banerjee, S., et al. A novel role for MuSK and non-canonical Wnt signaling during segmental neural crest cell migration. Development. 138, 3287-3296 (2011).
  16. Pryor, S. E., et al. Vangl-dependent planar cell polarity signalling is not required for neural crest migration in mammals. Development. 141, 3153-3158 (2014).
  17. Serbedzija, G. N., Bronner-Fraser, M., Fraser, S. E. Vital dye analysis of cranial neural crest cell migration in the mouse embryo. Development. 116, 297-307 (1992).
  18. Kawakami, M., Umeda, M., Nakagata, N., Takeo, T., Yamamura, K. Novel migrating mouse neural crest cell assay system utilizing P0-Cre/EGFP fluorescent time-lapse imaging. BMC Developmental Biology. 11, 68(2011).
  19. Stemple, D. L., Anderson, D. J. Isolation of a stem cell for neurons and glia from the mammalian neural crest. Cell. 71, 973-985 (1992).
  20. Etchevers, H. Primary culture of chick, mouse or human neural crest cells. Nature protocols. 6, 1568-1577 (2011).
  21. Ishii, M., et al. A stable cranial neural crest cell line from mouse. Stem Cells and Development. 21, 3069-3080 (2012).
  22. Gonzalez Malagon, S. G., Liu, K. J. ALK and GSK3: Shared Features of Neuroblastoma and Neural Crest Cells. Journal of Experimental Neuroscience. 12, 1179069518792499(2018).
  23. Gonzalez Malagon, S. G., et al. Glycogen synthase kinase 3 controls migration of the neural crest lineage in mouse and Xenopus. Nature Communications. 9, 1126(2018).
  24. Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase. Current Biology : CB. 8, 1323-1326 (1998).
  25. Laranjeira, C., et al. Glial cells in the mouse enteric nervous system can undergo neurogenesis in response to injury. Journal of Clinical Investigation. 121, 3412-3424 (2011).
  26. Pfaltzgraff, E. R., Mundell, N. A., Labosky, P. A. Isolation and culture of neural crest cells from embryonic murine neural tube. Journal Of Visualized Experiments : JoVE. , e4134(2012).
  27. Sternberg, J., Kimber, S. J. The relationship between emerging neural crest cells and basement membranes in the trunk of the mouse embryo: a TEM and immunocytochemical study. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 98, 251-268 (1986).
  28. Sternberg, J., Kimber, S. J. Distribution of fibronectin, laminin and entactin in the environment of migrating neural crest cells in early mouse embryos. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 91, 267-282 (1986).
  29. George, E. L., Georges-Labouesse, E. N., Patel-King, R. S., Rayburn, H., Hynes, R. O. Defects in mesoderm, neural tube and vascular development in mouse embryos lacking fibronectin. Development. 119, 1079-1091 (1993).
  30. Henderson, D. J., Copp, A. J. Role of the extracellular matrix in neural crest cell migration. Journal of Anatomy. 191 (Pt 4), 507-515 (1997).
  31. Thomas, S., et al. Human neural crest cells display molecular and phenotypic hallmarks of stem cells. Human Molecular Genetics. 17 (21), 3411-3425 (2008).
  32. Greenberg, J. H., Seppa, S., Seppa, H., Hewitt, T. Role of collagen and fibronectin in neural crest cell adhesion and migration. Developmental Biology. 87 (2), 259-266 (1981).
  33. Leung, A. W., et al. WNT/β-catenin signaling mediates human neural crest induction via a pre-neural border intermediate. Development. 143 (3), 398-410 (2016).
  34. Zhu, Q., Lu, Q., Gao, R., Cao, T. Prospect of Human Pluripotent Stem Cell-Derived Neural Crest Stem Cells in Clinical Application. Stem Cells International. 2016, 7695836(2016).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Podstawowa hodowla kom rekprzej cie epitelialno mezenchymalneobrazowanie ywych kom rekmikroskopia time lapseanaliza migracji kom rekkwantyfikacja morfologii kom reksekcja zarodkaszalka pokryta hydrogelem
Sekcja, hodowla i analiza pierwotnych komórek grzebienia nerwowego czaszki od myszy w celu zbadania delaminacji i migracji komórek grzebienia nerwowego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.