Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ocena migracji limfocytów w systemie transmigracji ex vivo

6.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60060

⸱

20 września 2019

 , 
1Department of Internal Medicine, University of Utah, 2Research Service, VA Nebraska Iowa Health Care System, 3Department of Internal Medicine, University of Nebraska Medical Center, 4Department of Environmental, Agricultural & Occupational Health, University of Nebraska Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

W tym protokole, limfocyty są umieszczane w górnej komorze systemu transmigracyjnego, oddzielone od dolnej komory porowatą błoną. Do dolnej komory dodaje się chemokinę, która indukuje aktywną migrację wzdłuż gradientu chemokin. Po 48 godzinach limfocyty są liczone w obu komorach w celu ilościowego określenia transmigracji.

Streszczenie

Tutaj prezentujemy skuteczną metodę, która może być wykonana przy użyciu podstawowych umiejętności laboratoryjnych i materiałów do oceny ruchu chemokinetycznego limfocytów w systemie transmigracji ex vivo. Wrodzone komórki limfoidalne grupy 2 (ILC2) i komórki pomocnicze T CD4 + wyizolowano ze śledziony i płuc myszy z albuminą jaja kurzego (OVA) pod prowizją BALB / c. Potwierdziliśmy ekspresję CCR4 zarówno na limfocytach T CD4 +, jak i ILC2, porównanie. CCL17 i CCL22 są znanymi ligandami dla CCR4; dlatego stosując tę metodę transmigracji ex vivo, zbadaliśmy indukowany przez CCL17 i CCL22 ruch limfocytów CCR4 +. Aby ustalić gradienty chemokin, CCL17 i CCL22 umieszczono w dolnej komorze systemu transmigracyjnego. Wyizolowane limfocyty dodano następnie do górnych komór i w ciągu 48 godzin limfocyty aktywnie migrowały przez pory 3 μm w kierunku chemokiny w dolnej komorze. Jest to skuteczny system do określania chemopinetyki limfocytów, ale, co zrozumiałe, nie naśladuje złożoności występującej w mikrośrodowiskach narządów in vivo. Jest to jedno z ograniczeń metody, które można przezwyciężyć poprzez dodanie obrazowania in situ badanego narządu i limfocytów. Natomiast zaletą tej metody jest to, że może być wykonana przez technika na poziomie podstawowym w znacznie bardziej opłacalnej cenie niż obrazowanie na żywo. W miarę jak związki terapeutyczne stają się dostępne w celu zwiększenia migracji, jak w przypadku infiltracji nowotworu przez cytotoksyczne komórki odpornościowe, lub w celu zahamowania migracji, być może w przypadku chorób autoimmunologicznych, w których problemem jest immunopatologia, metoda ta może być stosowana jako narzędzie przesiewowe. Ogólnie rzecz biorąc, metoda jest skuteczna, jeśli chemia będąca przedmiotem zainteresowania konsekwentnie generuje chemokinetykę na statystycznie wyższym poziomie niż kontrola pożywki. W takich przypadkach można również określić stopień zahamowania/wzmocnienia przez dany związek.

Wprowadzenie

Ta oryginalna metoda transmigracji została zaprezentowana przez Stephena Boydena w 1962 roku w Journal of Experimental Medicine1. Wiele z tego, co wiemy o chemotaksji i chemokinetyce, nie byłoby możliwe bez opracowania komory Boydena. Przed odkryciem pierwszej chemokiny w 1977 roku, systemy transmigracji ex vivo były wykorzystywane do poznania czynników surowicy, które mogą zatrzymywać ruch komórek w makrofagach, jednocześnie wzmacniając ruchliwość komórek u neutrofili1,2. Opracowano ogromne bogactwo wiedzy na temat migracji komórek odpornościowych i do tej pory odkryto 47 chemokin, którym odpowiada 19 odpowiadających im receptorów3,4. Ponadto wiele inhibitorów/wzmacniaczy tych szlaków chemokinowych zostało opracowanych w celach terapeutycznych5,6,7,8. Wiele z tych związków zostało przetestowanych w podobnych komorach transmigracyjnych, aby zrozumieć bezpośrednie interakcje między związkami i odpowiedź komórek odpornościowych na daną chemokinę9.

Transmigracja, czyli diapedeza, do tkanki objętej stanem zapalnym jest niezbędnym procesem do uzyskania zdrowej odpowiedzi zapalnej na usunięcie infekcji10,11. Komora Boydena, system transmigracji lub aparat transwell składają się zazwyczaj z dwóch komór oddzielonych porowatą membraną1,12. W dolnej komorze najczęściej znajdują się pożywki zawierające chemokinę będącą przedmiotem zainteresowania, natomiast leukocyty umieszcza się w górnej komorze. Wielkość porów w membranie można wybrać na podstawie wielkości interesującej nas komórki. Do tego projektu wybraliśmy membranę porowatą o grubości 3 μm, ponieważ komórki limfoidalne mają wielkość 7-20 μm, w zależności od etapu rozwoju komórkowego. Ta wielkość porów zapewnia, że komórki te nie opadają biernie przez pory, ale że aktywnie migrują w odpowiedzi na gradient chemokin.

Główną zaletą tego protokołu jest jego opłacalność. Transmigracja in vivo jest trudna, ponieważ wymaga intensywnego szkolenia w zakresie obchodzenia się ze zwierzętami i chirurgii, a często wiąże się z mikroskopią o dużej mocy, która nie zawsze jest dostępna dla badacza. Opłacalne badania przesiewowe związków, które uważa się za zwiększające lub hamujące transmigrację, można przeprowadzić przed obrazowaniem in vivo. Ponieważ system transmigracji jest ściśle kontrolowany, komórki mogą być początkowo traktowane, a następnie dodawane do aparatu transwell, lub odwrotnie, chemokina może być najpierw traktowana inhibitorem chemokiny, a następnie komórki dodawane do aparatu transwell. Wreszcie, komórki śródbłonka i/lub białka błony podstawnej można dodać na dno wkładki transwell 1-2 dni przed eksperymentem transmigracyjnym, aby zrozumieć udział tych komórek barierowych w chemokinetyce. Ponownie, te manipulacje systemem dostarczają potężnego środka do określania ważnych informacji o skuteczności danego związku przed bardziej skomplikowanymi badaniami in vivo.

Wykorzystanie systemu komór transmigracyjnych jest skutecznym sposobem oceny mobilności limfocytów w różnych warunkach in vivo i in vitro12,13,14. W niniejszym artykule opisano zoptymalizowaną metodę oceny odpowiedzi limfocytów ex vivo na chemokiny w komorze transmigracyjnej. W tym przykładowym eksperymencie limfocyty T CD4 + i wrodzone komórki limfoidalne grupy 2 (ILC2) wyizolowano od samców i samic myszy BALB / c po ekspozycji na alergen OVA. Sformułowano hipotezę, że CCR4 + CD45 + Lineage- (LIN-) ILC2 od myszy z alergenami migrowałaby bardziej efektywnie w kierunku CCL17 i CCL22 niż komórki pomocnicze T CCR4 + CD4 +. CCL17 i CCL22 to chemokiny powszechnie wytwarzane przez komórki dendrytyczne i makrofagi o fenotypie M2 (alergicznym), między innymi, w klasie alergy15,16. CCL17 i CCL22 mogą być traktowane jako biomarkery alergicznego stanu zapalnego, ponieważ są łatwo wykrywalne w płucach podczas zaostrzeń dróg oddechowych16,17,18. Co ważne, ekspresja CCR4 jest podwyższona w porównaniu z nieleczonymi kontrolami, jak ujawniono w danych bioinformatycznych wygenerowanych z ILC2 wyizolowanego od zwierząt leczonych roztoczami kurzu domowego, a podobnie ILC2 od naiwnych zwierząt leczonych ex vivo IL-33 (cytokina wrodzona promująca alergeny) zwiększa CCR419,20. Ponadto, zgodnie z danymi dotyczącymi ILC2 w bazie danych Immunological Genome Project (www.immgen.org), mRNA CCR4 jest wysoce eksprymowane w tych wrodzonych komórkach odpornościowych. Do tej pory niewiele wiadomo na temat transportu ILC2 do tkanek, ale jest prawdopodobne, że limfocyty T ILC2 i CD4 + wykorzystują podobne chemokiny i receptory do chemotaksji i chemokinetyki, ponieważ wyrażają podobne czynniki transkrypcyjne i receptory. W związku z tym porównaliśmy reakcję CCL17 i CCL22 limfocytów T ILC2 i CD4 +, zarówno u samców, jak i samic zwierząt z OVA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie opisane tutaj metody zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Instytucjonalne Komitety ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania w Centrum Medycznym Uniwersytetu Nebraski (UNMC) oraz Uniwersytecie Utah.

1. Konfiguracja i przygotowanie odczynników

  1. Przygotuj kompletne nośniki RPMI (Roswell Park Memorial Institute).
    1. Dodaj 10 ml inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej (FBS) do 90 ml RPMI.
    2. Dodaj 1 ml 100x penicylina-streptomycyna-glutamina do 100 ml 10% FBS RPMI.
  2. Przygotuj nośnik rozszerzeń ILC2.
    1. Dodaj IL-2 i IL-33 (20 ng/ml każdej cytokiny) do 10 ml pełnego RPMI.
    2. Jeśli cytokiny podstawowe wynoszą 10 μg/ml, należy pobrać pipetę z 20 μl IL-2 i IL-33 do probówki o pojemności 15 ml zawierającej 10 ml kompletnej pożywki RPMI.
  3. Przygotować pożywkę do dysocjacji płuc.
    1. Dodaj 50 mg kolagenazy typu 1 do 250 ml niesuplementowanego RPMI.
    2. Dodaj 2,5 ml 100x penicyliny-streptomycyny-glutaminy do 250 ml pożywki w kroku 1.3.1.
    3. Delikatnie wymieszaj podłoże, aby upewnić się, że kolagenaza typu 1 jest całkowicie rozpuszczona przed użyciem.
  4. Przygotuj RPMI bez surowicy.
    1. Rozcieńczyć 1 g liofilizowanej albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w 200 ml RPMI.
    2. Dodaj 2 ml 100x penicyliny-streptomycyny-glutaminy.
    3. Przed użyciem delikatnie wymieszaj podłoże, aby upewnić się, że BSA jest całkowicie rozpuszczone w podłożu.
  5. Przygotuj podłoże migracyjne za pomocą CCL17.
    1. Zdobądź 10 ml RPMI bez surowicy i dodaj CCL17 [50 ng/ml].
      1. Jeśli zapas CCL17 wynosi 10 μg/ml, dodaj 50 μl zapasu CCL17 do 10 ml pożywki RPMI bez surowicy.
  6. Przygotuj podłoże migracyjne za pomocą CCL22.
    1. Zdobądź 10 ml RPMI bez surowicy i dodaj CCL22 [50 ng/ml].
    2. Jeśli zapas CCL22 wynosi 10 μg/ml, dodaj 50 μl zapasu CCL22 do 10 ml pożywki RPMI bez surowicy.
  7. Przygotuj koktajl barwiący przeciwciała CCR4.
    1. W przypadku łącznie 10 testów dodaj po 5 μl każdego z następujących przeciwciał do probówki o pojemności 5 ml: anty-mysie CCR4, CD19, CD11b, CD45, ST2 i ICOS.
      nuta: Przykład przygotowania koktajlu przeciwciał na 10 próbek: 0,5 μl każdego przeciwciała x 10 próbek = 5 μl każdego z przeciwciał wymienionych w ppkt 1.7.1.
    2. Dla łącznie 10 testów dodać 2,5 μl następujących przeciwciał do koktajlu przeciwciał z kroku 1.7.1: anty-mysie CD3, CD11c i NK1.1.
      nuta: Przykład uzupełnienia koktajlu przeciwciał dla 10 próbek: 0,25 μl x 10 próbek = 2,5 μl przeciwciał CD3, CD11c i NK1.1.
    3. Koktajl barwiący przeciwciała CCR4 należy przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu, aż będzie gotowy do dodania do próbek. Wyrzuć koktajl przeciwciał po 1 tygodniu, jeśli nie jest używany.
  8. Przygotuj 1x stabilizujący utrwalacz.
    1. Dodaj 10 ml dejonizowanej wody destylowanej do 5 ml 3x stabilizującego koncentratu utrwalającego

2. Przygotowanie myszy BALB/c z alergenami

UWAGA: Samce i samice myszy BALB/c zostały zakupione w Charles River (UNMC) lub Jackson Laboratories (University of Utah) w wieku od 6 do 8 tygodni.

  1. Po aklimatyzacji (1 tydzień) uwrażliwić wszystkie zwierzęta na OVA.
    1. Połączyć 100 μg/ml OVA zaadsorbowanego z wodorotlenkiem glinu (20 mg/ml) w probówce polistyrenowej o pojemności 5 ml.
    2. Wymieszać probówkę i natychmiast pobrać 500 μl zawiesiny OVA-ałun do strzykawki o pojemności 1 ml i pojemności 28 g (strzykawki insulinowej).
    3. Umieść mysz w słoiku z izofluranem (1-2 ml pod fałszywą podłogą, tak aby zwierzę nie stało bezpośrednio w izofluranie). Pozwól myszy przejść pod narkozę na około 1-2 minuty lub do momentu, gdy częstość oddechów spadnie.
    4. Szybko podnieś mysz za futro na grzbiecie i ramionach i wstrzyknij 100 μl ałunu OVA dootrzewnowo na mysz21,22.
    5. Umieść mysz z powrotem w klatce i obserwuj, czy odzyska mobilność; powinno to nastąpić w ciągu 2–5 minut.
  2. Siedem dni po uczuleniu należy poddać wszystkie zwierzęta donosowemu (i.n.) 1,5% OVA rozcieńczonemu w sterylnej soli fizjologicznej w komorze nebulizacyjnej (Data Sciences International) przez 20 minut.
    1. Wyjmij myszy z klatek i umieść je w komorze nebulizacji dla zwierząt. Zamknij pokrywę komory.
    2. Podłącz wąż nebulizacyjny do wylewki wejściowej w komorze nebulizacji.
    3. Dodaj 30 ml 1,5% OVA rozcieńczonego w sterylnym roztworze soli fizjologicznej do kubka do nebulizacji na nebulizatorze.
    4. Włącz nebulizator i pozwól komorze wypełnić się mgłą przez 20 minut.
    5. Wyłącz nebulizator i pozwól, aby mgła opadła.
    6. Wróć zwierzęta do ich klatek.
  3. Powtórz krok 2.2 w sumie 5 razy, przez 5 kolejnych dni, aby wywołać alergiczne zapalenie.

3. Izolacja limfocytów T CD4+ ze śledziony i płuc myszy z prowizją OVA

  1. Humanitarna eutanazja wszystkich samców i samic leczonych OVA przez uduszenie CO2 zgodnie z zatwierdzonymi protokołami IACUC, przy użyciu od 2 do 3 zwierząt na grupę, na eksperyment.
  2. Wytnij płuca i śledziony od zwierząt i umieść tkanki w oddzielnych probówkach dysocjacyjnych w zależności od rodzaju tkanki i płci zwierzęcia23.
  3. Dysocjacja tkanki płucnej w 500 μl pożywki do dysocjacji płuc (25 U/ml; kolagenaza, typ 1) w automatycznym dysocjatorze tkanek przy użyciu protokołu "płuc".
    1. Powtórzyć czynności 3.2 i 3.3 w sumie dwa razy.
  4. Dysocjuj tkankę śledziony w 500 μl kompletnego podłoża RPMI za pomocą protokołu "śledziony" na automatycznym dysocjatorze tkanek.
    nuta: Pozostałe czynności należy wykonać w komorze bezpieczeństwa biologicznego przy użyciu techniki sterylnej.
  5. Przepłukać probówki dysocjacyjne zawierające homogenaty płuc i śledziony odpowiednio 5 ml dodatkowych pożywek do dysocjacji płuc lub pełnego RPMI.
  6. Przefiltruj zawiesiny komórek przez sitko o wielkości 40 μm i zbierz je do stożkowych probówek o pojemności 50 ml.
  7. Homogenaty płuc inkubować przez 15–30 minut w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 w celu dalszej dysocjacji tkanki płucnej.
  8. Dodać 5 ml Complete RPMI do homogenatów płuc i śledziony i rozdrobnić komórki na dnie probówek o pojemności 50 ml za pomocą wirowania; 378 x g w temperaturze pokojowej (RT) przez 5 min.
  9. Połącz splenocyty i komórki płuc w jednej stożkowej probówce o pojemności 50 ml i określ całkowitą liczbę komórek za pomocą automatycznego licznika komórek.
  10. Dostosuj zawiesiny komórek męskich i żeńskich do 1 x 108 komórek/ml w buforze separacyjnym i dodaj do probówki polistyrenowej o pojemności 5 ml.
    nuta: Protokół wzbogacania można dostosować do 14 ml probówek polistyrenowych, gdy więcej komórek zostanie pobranych ze śledziony i płuc. Protokół ten został opracowany dla tkanek od 2-3 myszy na grupę; dlatego powinna wystarczyć probówka o pojemności 5 ml.
  11. Do izolacji ILC2 należy użyć około dwóch trzecich wszystkich komórek zgodnie z protokołem wzbogacania ILC2.
    1. Dodać koktajl przeciwciał (50 μl/ml) do zawiesiny komórek i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    2. Wirować szybkie kulki przez 30 s i dodawać do próbki z szybkością 75 μl/ml zawiesiny komórek. Delikatnie wymieszać i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    3. Uzupełnij probówkę do 3 ml buforem separacyjnym i umieść w 8-komorowym magnesie ułatwiającym separację. Inkubować przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
    4. Przechylić magnes do przodu (z dala od kompleksów kula-przeciwciało-komórki przylegających do tylnej części probówki) i odpipetować zawiesinę komórek do czystej probówki o pojemności 5 ml.
    5. Dodać 1,5 ml pełnego RPMI do probówek i wirować przy 378 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    6. Odlej pożywkę z osadu komórkowego i ponownie zawieś ILC2 w ilości 1 x 107 komórek na ml.
    7. Umieścić 100 μl męskiego i żeńskiego ILC2 na studzienkę w 96-dołkowej płytce z dnem w kształcie litery U i dodać 100 μl pożywki rozszerzającej ILC2 do każdej studzienki.
    8. Inkubuj komórki przez 4-5 dni, aby rozwinąć ILC2.
    9. Zbierz ILC2 do probówki o pojemności 5 ml i dodaj do 4,5 ml RPMI bez surowicy. Odwirować komórki przy ciśnieniu 378 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    10. Policz komórki za pomocą hemekytometru i ponownie zawieś w stężeniu 1 x 107 ILC2 na ml w RPMI bez surowicy.
  12. Użyj pozostałych komórek do procedury izolacji limfocytów T CD4 +, która jest przeprowadzana zgodnie z protokołem izolacji mysich limfocytów T CD4 + z niewielkimi modyfikacjami.
    1. Dodać surowicę szczura (50 μl/ml) do zawiesiny wzbogacającej limfocyty T CD4.
    2. Dodać koktajl izolacyjny (50 μl/ml) do próbki i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    3. Wirować szybkie kulki przez 30 s i dodawać do próbki z szybkością 75 μL/ml.
    4. Delikatnie wymieszać zawiesinę komórkową i inkubować przez 2,5 minuty i RT
    5. Uzupełnij próbki do 3 ml i umieść probówki o pojemności 5 ml w 8-komorowym magnesie do łatwej separacji i inkubuj przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    6. Przechylić magnes do przodu i odpipetować zawiesinę komórek do czystej probówki o pojemności 5 ml.
    7. Dodaj 1,5 ml RPMI bez surowicy do probówek i odwiruj przy 378 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    8. Odlej pożywkę z osadu komórkowego i ponownie zawieś limfocyty T CD4 + w 1 x 107 komórek na ml w RPMI bez surowicy.

4. Określ ekspresję CCR4 na limfocytach T CD4+ i wrodzonych komórkach limfoidalnych grupy 2 (ILC2) od zwierząt z prowizją OVA za pomocą cytometrii przepływowej

UWAGA: Następujące kroki mogą być wykonywane na otwartym blacie, ponieważ są to techniki niesterylne.

  1. Zdobądź około 1–2,5 x 105 komórek ILC2 z kroku 3.11.10 i 1–2,5 x 106 limfocytów T CD4 + z kroku 3.12.8 w oddzielnych probówkach o pojemności 5 ml.
    1. Zachowaj dodatkową probówkę z co najmniej 5,0 x 104 limfocytami T CD4 + jako niebarwioną kontrolę.
  2. Zawiesić komórki w 100–200 μl buforu FACS i dodać 1 μl bloku Fc do każdej probówki, a następnie inkubować na lodzie (lub w lodówce o temperaturze 4 °C) przez 10 minut.
  3. Dodać 1-2 ml buforu FACS do każdej probówki i odwirować przy 378 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Odlać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 100–200 μl buforu FACS.
  5. Dodać 37,5 μl koktajlu barwiącego przeciwciała CCR4 do zawiesiny komórek w każdej probówce z wyjątkiem probówki zawierającej "niebarwione" komórki.
  6. Inkubować probówki na lodzie lub w lodówce o temperaturze 4 °C przez 20–30 minut.
  7. Dodać 1-2 ml buforu FACS do każdej probówki i odwirować przy 378 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  8. Odlej sklarowany osad.
  9. Powtórz kroki 4.7 i 4.8.
  10. Dodać 250–300 μl 1x stabilizującego utrwalacza (patrz tabela materiałów) do każdej probówki.
  11. Przygotuj jednokolorowe kontrole kulkowe dla każdego przeciwciała w koktajlu przeciwciał CCR4 zgodnie z protokołem dostarczonym z kulkami kompensacyjnymi.
    1. Wiruj koraliki kompensacyjne.
    2. Dodaj jedną kroplę koralików do każdej jednokolorowej rurki kontrolnej.
    3. Dodać 1 μl każdego przeciwciała z koktajlu przeciwciał CCR4 do jego własnej oznakowanej probówki.
    4. Delikatnie wymieszać i inkubować przez 10 minut w lodówce o temperaturze 4 °C lub na lodzie.
    5. Dodać 1-2 ml buforu FACS do wszystkich probówek i odwirować przy 378 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    6. Odlać supernatant i ponownie zawiesić kulki w 200 μl buforu FACS.
    7. Jednokolorowe kontrolki należy przechowywać w lodówce, aż wszystkie próbki zostaną zabarwione i będą gotowe do analizy na cytometrze przepływowym.
  12. Przeanalizować niebarwione komórki, jednokolorowe kontrole i próbki eksperymentalne na cytometrze przepływowym w ciągu 24 godzin od utrwalenia.

5. Procedura transmigracji ex vivo

UWAGA: Następujące kroki powinny być wykonywane w Komorze Bezpieczeństwa Biologicznego, ponieważ wymagają one sterylnej techniki.

  1. Zdobądź ILC2 z kroku 3.11.10 i limfocyty T CD4 z kroku 3.12.8 i określ liczbę wkładek transwell potrzebnych do eksperymentu.
    nuta: Przykład: Dla 1,2 ml wzbogaconych limfocytów T CD4 z kroku 3.12.8 pomnóż 1,2 x 1,000 μl = 1,200 μL; następnie podzielić 1,200 μL przez 100 μL = 12, liczba wkładek potrzebnych do transmigracji CD4 T.
  2. Delikatnie przesuń wkładki transwell 3 μm ze środkowych rzędów płytki 24-dołkowej.
  3. Dodać 500 μl pożywki migracyjnej z CCL17 do około jednej trzeciej studzienek.
  4. Dodać 500 μl pożywki migracyjnej z CCL22 do kolejnej jednej trzeciej studzienek.
  5. Dodać 500 μl bezsurowicowego RPMI niezawierającego chemokiny do ostatniej jednej trzeciej studzienek.
  6. Wyraźnie oznaczyć pokrywkę na talerzu odpowiednimi pożywkami transmigracyjnymi umieszczonymi w studzienkach dennych.
  7. Umieść wkładki transwell z powrotem w studzienkach zawierających różne zabiegi.
  8. Delikatnie dodaj 100 μl limfocytów T CD4 lub ILC2 do górnej studzienki każdej wkładki. Nie mieszać ani pipetować zawiesiny komórek w górę i w dół w transwellach, ponieważ może to zakłócić wyniki eksperymentu.
  9. Wyraźnie oznacz pokrywkę płytki typem komórek umieszczonych w każdym studzienku i napisz datę i godzinę dodania komórek.
  10. Powtarzaj kroki od 5.2 do 5.9, aż wszystkie ogniwa zostaną umieszczone we wkładkach transwell z mediami.
  11. Delikatnie umieścić płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 48 godzin. Zminimalizować kontakt z płytką w okresie inkubacji.

6. Kwantyfikacja transmigracji ex vivo

  1. Delikatnie wyjmij płytkę z inkubatora i wyjmij wszystkie wkładki transwell ze środkowych rzędów do pustych studzienek tuż powyżej lub poniżej.
  2. Zebrać komórki z dolnej i górnej studzienki wkładek transwell do probówek oznaczonych TOP lub BOTTOM, CCL17, CCL22 lub pożywką, typem komórki i numerem kontrpróby (co najmniej 3 powtórzenia na eksperyment).
  3. Przepłukać studzienki denne 500 μl 1x PBS i zebrać ten płyn do odpowiedniej probówki.
  4. Przepłukać górne studzienki 250 μl 1x PBS i zebrać ten płukany do odpowiedniej probówki.
  5. Granulować komórki przez odwirowanie przy 378 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  6. Delikatnie odpipetować cały supernatant z osadu komórkowego.
  7. Zawiesić limfocyty T i ILC2 w 50 μl 1x PBS.
  8. Weź 10 μl zawiesiny komórek i dodaj do 90 μl 0,4% błękitu trypanowego.
  9. Policz komórki w automatycznym liczniku komórek.
    1. Rekordowa %rentowność.
    2. Zapisać liczbę komórek na ml dla każdej próbki.
    3. Określ całkowitą liczbę komórek na zabieg w górnej i dolnej komorze; zapisz liczbę komórek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Ekspresja CCR4 na komórkach T CD4+ i ILC2.

Dla powodzenia eksperymentu z transmigracją ex vivo konieczne jest określenie, czy limfocyty reagują na CCL17 i CCL22 poprzez receptor CCR4; dlatego określiliśmy ekspresję CCR4 zarówno na komórkach T CD4+, jak i na komórkach ILC2 za pomocą cytometrii przepływowej. Podczas gdy wiadomo, że OVA-specyficzne pomocnicze komórki T CD4+ wykazują ekspresję CCR4, mniej wiadomo o ekspresji CCR4 na komórkach ILC2.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W niniejszym artykule przedstawiono sprawdzoną metodę oceny indukowanej chemokiną migracji limfocytów w systemie transmigracji ex vivo. W protokole jest kilka krytycznych kroków, z których pierwszym jest weryfikacja ekspresji prawidłowego receptora chemokiny na komórkach odpornościowych w eksperymencie. W naszych rękach wybraliśmy CCR4 ze względu na literaturę, która podkreśla znaczenie CCR4 na limfocyty T pomocnicze Th2 w alergicznym zapaleniu. Wcześniej wykazano, że stan zapalny wywołany albuminą jaja kurzego jest ogra...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie ujawniają żadnych informacji finansowych ani nie mają do ujawnienia konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta praca została sfinansowana przez American Lung Association (K.J.W.), fundusz Memorial Eugene Kenney przyznany T.A.W. i K.J.W., hojne wsparcie start-upu od University of Utah dla K.J.W., oraz nagrodę Departamentu Spraw Weteranów dla T.A.W. (VA I01BX0003635). T.A.W. jest laureatem nagrody Research Career Scientist Award (IK6 BX003781) przyznawanej przez Departament ds. Weteranów. Autorzy pragną podziękować za pomoc redakcyjną ze strony Pani Lisy Chudomelki. Autorzy dziękują rdzeniowi UNMC Flow Cytometry za wsparcie w zbieraniu danych cytometrii przepływowej wygenerowanych na potrzeby tego manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,4% Trypan BlueSigma-Aldrich15250061
strzykawka 1 mlBD Bioscience329424U-100 Strzykawki Micro-Fine 28 G 1/2" 1cc
100x Penicylina-Streptomycyna, L-GlutaminaGibco10378-016Rozcieńczony do 1x w pożywce RPMI
15 ml probówki stożkoweOlympus Plastics28-101rurki polipropylenowe
3 i mu; m wkładki transwellGenesee Scientific25-28824-dołkowa płytka zawierająca 12 wkładek transwell
3x stabilizujący utrwalaczBD Pharmigen338036Przygotuj 1x roztwór zgodnie z protokołem producenta
Probówki polistyrenowe 5 mlSTEM Cell Technologies38007
Probówki stożkowe 50 mlOlympus Plastics28-106tuby
polipropylenowe8-komorowy magnes do łatwej separacjiSTEM Cell Technologies18103
ACK Lysing BufferLife Technologies CorporationA1049201
Zaawansowany filtr siatkowy do komórek, 40 μ mGenesee Scientific25-375siatka nylonowa, 40 μ m sitka
Wodorotlenek glinu, odczynnik klasySigma-Aldrich239186-25G20 mg / ml
anty-mysz CCR4; Sprzężony z APCBiolegend1312110,5 i mu; g/test
anty-mysz CD11bBD Pharmigen5573960,5 μ g/test
anty-myszy CD11c; PE eFluor 610Thermo-Fischer Scientific61-0114-820,25 μ g/test
anty-mysz CD16/32, blok FcBD Pharmigen5531410,5 μ g/test
anty-myszy CD19; APC-eFluor 780 sprzężonyThermo-Fischer Scientific47-0193-820,5 μ g/test
anty-myszy CD3; PE Cy 7-sprzężonyBD Pharmigen5527740,25 μ g/test
anty-myszy CD45; PE sprzężonyBD Pharmigen560870,5 μ g/test
przeciw myszom ICOS (CD278)BD Pharmigen5640700,5 μ g/test
anty-mysz NK1.1 (CD161); BD Pharmigen5531640,25 μ g/test
anty-mysz ST2 (IL-33R); Sprzężony z PerCP Cy5.5Biolegend1453110,5 μ g/test
Automatyczny licznik komórekBIORAD1450102
Automatyczny dysocjatorMACS Miltenyi Biotec130-093-235
Albumina surowicy bydlęcej, liofilizowany proszekSigma-AldrichA2153-10G0,5% w bezsurowicy Licznik komórek RPMI
ClidesBIORAD1450015
Albumina jaja kurzego z jaja kurzego, klasa VSigma-AldrichA5503-10G500 μ g / ml
Kolagenaza, typ 1, filtrowanaWorthington Biochemical CorporationCLSS-1, kup jako 5 fiolek 50 mg (LS004216)25 U / ml w kulkach kompensacyjnych RPMI
Affymetrix01-1111-411 kropla w probówce kontrolnej
Probówki dysocjacyjneMACS Miltenyi Biotec130-096-335
Bufor FACSBD Pharmigen5546571x PBS + 2% FBS, z azydkiem sodu; przechowywany w temperaturze 4 & st.; C
Inaktywacja termiczna-FBSGenesee Scientific25-525H10% w pełnym RPMI i Mysz multimedialna ILC2
CCL17GenScriptZ02954-2050 ng/ml
CCL22GenScriptZ02856-2050 ng/mL
CD4+ Zestaw do wzbogacania limfocytów TSTEM Cell Technologies19852
Mysz IL-2GenScriptZ02764-2020 ng/ml
Zestaw do wzbogacania ILC2Technologie komórek STEM19842
Mysz rekombinowana IL-33STEM Cell Technologies7804420 ng/mL
RPMILife Technologies Corporation22400071
Bufor separacyjnySTEM Cell Technologies201441x PBS + 2% FBS; przechowywany w temperaturze 4 & st; C
Nebulizator i komora dla małych zwierzątData Sciences International
sól fizjologiczna, sterylnaBaxter2F7124; NDC 0338-0048-040,9% chlorek sodu
sprzężony z FITC Mysz Mysz Mysz : , , ,

Bibliografia

  1. Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).
  2. Moser, B. Editorial: History of Chemoattractant Research. Frontiers in Immunology. 6, 548(2015).
  3. Borroni, E. M., Savino, B., Bonecchi, R., Locati, M. Chemokines sound the alarmin: The role of atypical chemokine in inflammation and cancer. Seminars in Immunology. 38, 63-71 (2018).
  4. Charo, I. F., Ransohoff, R. M. The many roles of chemokines and chemokine receptors in inflammation. The New England Journal of Medicine. 354 (6), 610-621 (2006).
  5. Abboud, D., Hanson, J. Chemokine neutralization as an innovative therapeutic strategy for atopic dermatitis. Drug Discovery Today. 22 (4), 702-711 (2017).
  6. Aldinucci, D., Casagrande, N. Inhibition of the CCL5/CCR5 Axis against the Progression of Gastric Cancer. International Journal of Molecular Sciences. 19 (5), E1477(2018).
  7. Chonco, L., et al. Novel DNA Aptamers Against CCL21 Protein: Characterization and Biomedical Applications for Targeted Drug Delivery to T Cell-Rich Zones. Nucleic Acid Therapy. 28 (4), 242-251 (2018).
  8. Trivedi, P. J., Adams, D. H. Chemokines and Chemokine Receptors as Therapeutic Targets in Inflammatory Bowel Disease; Pitfalls and Promise. Journal of Crohn's and Colitis. 12 (12), 1508(2018).
  9. Pietrosimone, K. M., Bhandari, S., Lemieux, M. G., Knecht, D. A., Lynes, M. A. In vitro assays of chemotaxis as a window into mechanisms of toxicant-induced immunomodulation. Current Protocols in Toxicology. 58 (Unit 18.17), (2013).
  10. Davis, D. M. How studying the immune system leads us to new medicines. Lancet. 391 (10136), 2205-2206 (2018).
  11. Culley, F. J., Pennycook, A. M., Tregoning, J. S., Hussell, T., Openshaw, P. J. Differential chemokine expression following respiratory virus infection reflects Th1- or Th2-biased immunopathology. Journal of Virology. 80 (9), 4521-4527 (2006).
  12. Denney, H., Clench, M. R., Woodroofe, M. N. Cleavage of chemokines CCL2 and CXCL10 by matrix metalloproteinases-2 and -9: implications for chemotaxis. Biochemical and Biophysics Research Communications. 382 (2), 341-347 (2009).
  13. Burrell, B. E., et al. Lymph Node Stromal Fiber ER-TR7 Modulates CD4+ T Cell Lymph Node Trafficking and Transplant Tolerance. Transplantation. 99 (6), 1119-1125 (2015).
  14. Warren, K. J., Iwami, D., Harris, D. G., Bromberg, J. S., Burrell, B. E. Laminins affect T cell trafficking and allograft fate. The Journal of Clinical Investigation. 124 (5), 2204-2218 (2014).
  15. Hirata, H., et al. Th2 cell differentiation from naive CD4(+) T cells is enhanced by autocrine CC chemokines in atopic diseases. Clinical and Experimental Allergy: Journal of the British Society for Allergy and Clinical Immunology. , (2018).
  16. Lin, R., Choi, Y. H., Zidar, D. A., Walker, J. K. L. beta-Arrestin-2-Dependent Signaling Promotes CCR4-mediated Chemotaxis of Murine T-Helper Type 2 Cells. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 58 (6), 745-755 (2018).
  17. Zhang, Y., et al. A new antagonist for CCR4 attenuates allergic lung inflammation in a mouse model of asthma. Science Reports. 7 (1), 15038(2017).
  18. Lu, Y., et al. Dynamics of helper CD4 T cells during acute and stable allergic asthma. Mucosal Immunology. 11 (6), 1640-1652 (2018).
  19. Li, B. W. S., Beerens, D., Brem, M. D., Hendriks, R. W. Characterization of Group 2 Innate Lymphoid Cells in Allergic Airway Inflammation Models in the Mouse. Methods in Molecular Biology. 1559, 169-183 (2017).
  20. Li, B. W. S., et al. Group 2 Innate Lymphoid Cells Exhibit a Dynamic Phenotype in Allergic Airway Inflammation. Frontiers in Immunology. 8, 1684(2017).
  21. Warren, K. J., et al. Sex differences in activation of lung-related type-2 innate lymphoid cells in experimental asthma. Annals of Allergy, Asthma, Immunology: Official Publication of the American College of Allergy, Asthma, Immunology. , (2016).
  22. Warren, K. J., et al. Ovalbumin-sensitized mice have altered airway inflammation to agriculture organic dust. Respiratory Research. 20 (1), 51(2019).
  23. Poole, J. A., et al. alphabeta T cells and a mixed Th1/Th17 response are important in organic dust-induced airway disease. Annals of Allergy, Asthma, Immunology: Official Publication of the American College of Allergy, Asthma, Immunology. 109 (4), 266-273 (2012).
  24. Matsuo, K., et al. A CCR4 antagonist ameliorates atopic dermatitis-like skin lesions induced by dibutyl phthalate and a hydrogel patch containing ovalbumin. Biomedical Pharmacotherapy. 109, 1437-1444 (2019).
  25. Mikhak, Z., et al. Contribution of CCR4 and CCR8 to antigen-specific T(H)2 cell trafficking in allergic pulmonary inflammation. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 123 (1), 67-73 (2009).
  26. Monticelli, L. A., et al. Innate lymphoid cells promote lung-tissue homeostasis after infection with influenza virus. Nature Immunology. 12 (11), 1045-1054 (2011).
  27. Saenz, S. A., et al. IL25 elicits a multipotent progenitor cell population that promotes T(H)2 cytokine responses. Nature. 464 (7293), 1362-1366 (2010).
  28. Hoyler, T., et al. The transcription factor GATA-3 controls cell fate and maintenance of type 2 innate lymphoid cells. Immunity. 37 (4), 634-648 (2012).
  29. Nakajima, H., Shores, E. W., Noguchi, M., Leonard, W. J. The common cytokine receptor gamma chain plays an essential role in regulating lymphoid homeostasis. The Journal of Experimental Medicine. 185 (2), 189-195 (1997).
  30. Warren, K. J., et al. RSV-specific anti-viral immunity is disrupted by chronic ethanol consumption. Alcohol. , (2016).
  31. Warren, K. J., Poole, J. A., Sweeter, J. M., DeVasure, J. M., Wyatt, T. A. An association between MMP-9 and impaired T cell migration in ethanol-fed BALB/c mice infected with Respiratory Syncytial Virus-2A. Alcohol. , (2018).
  32. Molteni, R., et al. A novel device to concurrently assess leukocyte extravasation and interstitial migration within a defined 3D environment. Lab on a Chip. 15 (1), 195-207 (2015).
  33. Bersini, S., et al. Human in vitro 3D co-culture model to engineer vascularized bone-mimicking tissues combining computational tools and statistical experimental approach. Biomaterials. 76, 157-172 (2016).
  34. Jeon, J. S., et al. Human 3D vascularized organotypic microfluidic assays to study breast cancer cell extravasation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (1), 214-219 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Gradient chemokinekspresja CCR4izolacja ILC2limfocyt T CD4test Transwellcytometria przepływoważywotność komórekscreening chemokin
Ocena migracji limfocytów w systemie transmigracji ex vivo
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.