Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Oczyszczanie S100A12 człowieka i jego indukowanych jonami oligomerów do stymulacji komórek odpornościowych

5.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60065

⸱

29 września 2019

 ,  , 
1Department of Pediatric Rheumatology and Immunology, University Children's Hospital

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje metodę oczyszczania dla rekombinowanego, bezznacznikowego białka wiążącego wapń S100A12 i jego indukowanych jonami oligomerów do testów stymulacji ludzkich monocytów.

Streszczenie

W tym protokole opisujemy metodę oczyszczania ludzkiego białka wiążącego wapń S100A12 i jego indukowanych jonami oligomerów z hodowli Escherichia coli w celu stymulacji komórek odpornościowych. Protokół ten opiera się na dwuetapowej strategii chromatografii, która obejmuje wstępne oczyszczanie białek na kolumnie chromatografii anionowowymiennej, a następnie etap polerowania na kolumnie do interakcji hydrofobowej. Strategia ta pozwala uzyskać białko S100A12 wysokiej czystości i wydajności przy rozsądnych kosztach. W przypadku testów funkcjonalnych na komórkach odpornościowych, ostateczne zanieczyszczenie pozostałościami endotoksyn wymaga starannego monitorowania i dalszych kroków czyszczenia w celu uzyskania białka wolnego od endotoksyn. Większość zanieczyszczeń endotoksynami można wykluczyć za pomocą chromatografii anionowej. Aby usunąć resztki zanieczyszczeń, protokół ten opisuje etap usuwania za pomocą filtrów odśrodkowych. W zależności od dostępnej siły jonowej S100A12 mogą układać się w różne homomultimery. Aby zbadać związek między strukturą a funkcją, protokół ten opisuje dalej traktowanie jonowe białka S100A12, a następnie chemiczne sieciowanie w celu ustabilizowania S100A12 oligomerów, a następnie ich separację za pomocą chromatografii wykluczającej rozmiar. Na koniec opisujemy test komórkowy, który potwierdza aktywność biologiczną oczyszczonego białka i potwierdza preparat wolny od LPS.

Wprowadzenie

S100A12 jest białkiem wiążącym wapń, które jest wytwarzane głównie przez ludzkie granulocyty. Białko ulega nadekspresji podczas (ogólnoustrojowego) stanu zapalnego, a jego stężenie w surowicy, szczególnie w chorobach (auto)zapalnych, takich jak układowe młodzieńcze idiopatyczne zapalenie stawów (sMIZS), rodzinna gorączka śródziemnomorska (FMF) lub choroba Kawasaki (KD) może informować o aktywności choroby i odpowiedzi na terapię. W zależności od receptorów rozpoznawania wzorców (PRR), takich jak receptory toll-podobne (TLR), wrodzony układ odpornościowy może być aktywowany przez wzorce molekularne związane z patogenami (PAMP), takie jak lipopolisacharydy (LPS) lub wzorce molekularne związane z uszkodzeniem (DAMP; zwane również "alarminami"). DAMP to cząsteczki endogenne, takie jak białka komórkowe, lipidy lub kwasy nukleinowe1. Funkcje DAMP są dobrze opisane dla członków rodziny białek kalgranuliny, S100A8/A9 i S100A122, które są również zgłaszane jako dwuwartościowe peptydy przeciwbakteryjne chelatujące jony metali3,4,5,6. W zależności od dostępnej siły jonów S100A12 mogą, podobnie jak inni członkowie rodziny S100, układać się w różne homomultimery i do niedawna wpływ S100A12-oligomeryzacji na oddziaływanie PRR, zwłaszcza TLR4, był nieznany.

Monomeryczna forma białka (92 aminokwasy, 10,2 kDa) składa się z dwóch struktur EF-hand helix-loop-helix połączonych elastycznym łącznikiem. C-końcowa ręka EF zawiera klasyczny motyw wiążący Ca2+, podczas gdy N-końcowa ręka EF wykazuje specyficzną dla białka S100 strukturę rozszerzonej pętli ("pseudo-EF-ręka") i ujawnia zmniejszone powinowactwo do Ca2+. Wiązanie Ca2+ przez S100A12 może wywołać poważną zmianę konformacyjną na C-końcu białek, co powoduje odsłonięcie hydrofobowej łaty na każdym monomerze i tworzy granicę dimeryzacji. Tak więc w warunkach fizjologicznych najmniejsza czwartorzędowa struktura utworzona przez S100A12 jest niekowalencyjnym dimerem (około 21 kDa), w którym poszczególne monomery znajdują się w orientacji antyrównoległej. Po ułożeniu jako dimer S100A12 jest zgłaszany do sekwestracji Zn2+, a także innych jonów metali dwuwartościowych, np. Cu2+ o wysokim powinowactwie7. Jony te są koordynowane na granicy dimerów S100A12 przez aminokwasy H15 i D25 z jednej podjednostki oraz H85 i H89 z przeciwrównoległej drugiej podjednostki8,9,10. Podczas gdy wcześniejsze badania sugerują, że S100A12 obciążony Zn2+ może indukować organizację białka w homo-tetramery (44 kDa) i powodować zwiększone powinowactwo do Ca2+11,12, ostatnie badania miareczkowania metali6 sugerują wiązanie Ca2+ przez S100A12, aby zwiększyć powinowactwo białka do Zn2+. Gdy S100A12 ręce EF są w pełni zajęte przez Ca2+, uważa się, że dodatkowe Ca2 + wiążą się między dimerami, wywołując tworzenie heksameru (około 63 kDa). Architektura heksamzerocznej struktury ćwiartkowej wyraźnie różni się od architektury tetrameru. Proponuje się, aby interfejs tetrameru został zakłócony, aby dać początek nowym interfejsom dimer-dimer, co korzystnie wpływa na tworzenie heksamerów10. S100A12 ulega ekspresji prawie wyłącznie w ludzkich granulocytach, gdzie stanowi około 5% wszystkich białek cytozolowych13. W swojej funkcji DAMP S100A12 był historycznie opisywany jako agonista receptora wieloligandowego dla zaawansowanych produktów końcowych glikacji (RAGE), a następnie określany jako zewnątrzkomórkowe nowo zidentyfikowane białko wiążące RAGE (EN-RAGE)14. Chociaż wcześniej informowaliśmy o biochemicznym wiązaniu S100A12 zarówno z RAGE, jak i TLR415, ostatnio wykazaliśmy, że ludzkie monocyty reagują na stymulację S100A12 w sposób zależny od TLR416. Wymaga to ułożenia S100A12 w indukowaną przez Ca2+/Zn2+ heksamseryczną strukturę ćwiartkową16.

Tutaj opisujemy procedurę oczyszczania rekombinowanych S100A12 ludzkich i ich indukowanych jonami oligomerów do stymulacji komórek odpornościowych16,17. Opiera się to na dwuetapowej strategii chromatografii, która początkowo obejmuje kolumnę anionowymienną do izolowania i zagęszczania białka oraz usuwania zanieczyszczeń masowych (np. endotoksyn/lipopolisacharydów)18. Żywice do chromatografii jonowymiennej rozdzielają białka na podstawie różnych ładunków powierzchniowych netto. W przypadku białek kwaśnych, takich jak S100A12 (punkt izoelektryczny 5,81), system buforowy o pH 8,5 i silnej żywicy anionowymiennej prowadzi do dobrej separacji. Związane białka eluowano za pomocą gradientu buforu o wysokiej zawartości soli. Wraz ze wzrostem siły jonowej jony ujemne w buforze elucyjnym konkurują z białkami o ładunki na powierzchni żywicy. Białka eluują się pojedynczo w zależności od ich ładunku netto, w wyniku czego opisane tutaj pozwalają na wyizolowanie i zagęszczenie nadekspresji białka S100A12. Ze względu na ujemnie naładowane grupy w lipopolisacharydach, cząsteczki te wiążą się również z żywicami anionowymiennymi. Jednak ich wyższy ładunek netto powoduje późniejszą elucję w zastosowanym gradiencie o wysokiej zawartości soli. Drugi etap procedury oczyszczania został wprowadzony w celu polerowania. W ten sposób wykorzystuje się zdolność wiązania wapnia przez S100A12 i usuwa pozostałe zanieczyszczenia na kolumnie do interakcji hydrofobowej. Wiązanie S100A12 wapnia prowadzi do zmiany konformacyjnej i odsłonięcia hydrofobowych plam na powierzchni białka. Pod tym warunkiem S100A12 oddziałuje z hydrofobową powierzchnią żywicy. Po chelatowaniu wapnia przez EDTA, interakcja ta jest odwrócona. W obecności jonów, zwłaszcza wapnia i, S100A12 układa się w homomeryczne oligomery. Aby zbadać zależności struktura-funkcja różnych oligomerów, ustabilizowaliśmy rekombinowane S100A12 dimeryczne, tetrameryczne i heksameryczne za pomocą chemicznego środka sieciującego i rozdzieliliśmy kompleksy na kolumnie chromatografii wykluczającej rozmiar. Wreszcie, aby przeanalizować funkcjonalność i aktywność biologiczną oczyszczonego białka i jego oligomerów indukowanych jonami, można porównać uwalnianie cytokin przez monocyty stymulowane S100A12 i LPS.

Do tej pory opisano różne metody oczyszczania S100A12. Na przykład Jackson et al.19 opublikowali protokół z oczyszczaniem za pomocą kolumny wymiany anionów i późniejszą chromatografią wykluczania wielkości. Polerowanie oczyszczające na kolumnie z wykluczeniem rozmiaru prowadzi do dobrych wyników, ale – na przykład ze względu na ograniczoną objętość ładowania – jest mniej elastyczne pod względem skalowalności. Inne podejście, opublikowane przez Kiss et al.20, opisuje oczyszczanie znakowanego białka za pomocą kolumny powinowactwa Ni2+ jako pierwszy etap oczyszczania, po którym następuje rozszczepienie enzymatyczne w celu usunięcia znacznika i dalsze etapy oczyszczania. W przeciwieństwie do wyżej wymienionych badań19,20, wytworzone białko opisane w niniejszym protokole jest określane do eksperymentów na komórkach odpornościowych. Dlatego zanieczyszczenie pozostałościami endotoksyn z kultur bakteryjnych jest wyzwaniem. Chociaż do tej pory opisano różne podejścia do usuwania endotoksyn, nie ma jednolitej metody, która działałaby równie dobrze dla każdego danego roztworu białkowego21,22.

Podsumowując, nasz protokół łączy zalety bezznacznikowej ekspresji w systemie bakteryjnym z efektywnym usuwaniem endotoksyn i wysoką wydajnością czystego białka.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Proszę zapoznać się z Tabelą Uzupełniającą 1 w celu przygotowania i roztworów podstawowych.

1. Ekspresja białka w E. coli

  1. klonowanie
    1. Klonuj S100A12 ludzkie wolne od znaczników (sekwencja referencyjna NCBI: NP_005612.1) do bakteryjnego wektora ekspresji pET11b. Aby wyrazić białko, przekształć konstrukt w E. coli BL21(DE3).
  2. kultura
    1. Przygotuj kulturę starterową, zaszczepiając pojedynczą kolonię w 5 ml pożywki wzrostowej (bulion LB ze 100 μg/ml ampicyliny) w probówce okrągłodennej o pojemności 14 ml. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 220 obr./min. Przenieść 2-4 ml kultury przez noc do 400 ml pożywki wzrostowej w 2-litrowej kolbie Erlenmayera i inkubować kulturę w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 220 obr./min.
      nuta: Gęstość początkowa głównej kultury powinna wynosić gęstość optyczną przy 600 nm (OD600) = 0,1.
    2. Monitoruj OD600 podczas wzrostu. Indukować ekspresję białka przez dodanie 1 M izopropylo-ß-D-tiogalaktopiranozydu (IPTG) do końcowego stężenia 1 mM przy OD600 = 0,5−0,6. Inkubować w temperaturze 37 °C i 220 obr./min przez dodatkowe 4 godziny
      nuta: Ogólnie rzecz biorąc, OD600 0,6 zostanie osiągnięty po 1,5−2,5 h w temperaturze 37 °C.
    3. Przygotować 50 ml buforu sonikacyjnego, rozpuszczając 50 mM Tris, 50 mM NaCl i 1 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) w 40 ml wody dejonizowanej. Dostosuj pH za pomocą HCl do 8,0 i uzupełnij do 50 ml. Dodać inhibitor proteazy (1 tabletka na 50 ml roztworu) i wyrównać temperaturę buforu do 4 °C.
    4. Przenieść kulturę bakteryjną do odpowiednich butelek wirówkowych i zbierać komórki w temperaturze 3 200 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 25 ml lodowatego buforu do sonikacji. Odtąd utrzymuj komórki na lodzie.
      UWAGA: Zawieszone komórki mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C przez krótki czas i w temperaturze -80 °C przez długi czas.
  3. Sonikacja/liza
    1. Sonikuj komórki przez 6 cykli po 30 s na lodzie. Po każdym cyklu odpoczywaj przez 30-60 s, aby chronić komórki przed przegrzaniem.
    2. Przenieść zawiesinę komórek do wstępnie schłodzonej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i odwirować w wirniku o stałym kącie nachylenia przy 15 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Zdekantować oczyszczony lizat, który zawiera rozpuszczalne białka cytozolowe, do świeżej probówki o pojemności 50 ml i wyrzucić osad.

2. Oczyszczanie białek

  1. Chromatografia anionowymienna
    1. dializa
      1. Przygotować bufor A do chromatografii anionowymiennej (AIEX) przez rozpuszczenie 20 mM Tris, 1 mM EDTA i 1 mM kwasu bis(2-aminoetyloetero)-glikolu etylenowego (EGTA) w wodzie dejonizowanej i dostosować pH do 8,5 za pomocą HCl. Do dializy przygotować 2 x 5 L, a do chromatografii 2 x 1 L buforu AIEX A.
        nuta: Objętość dializatu powinna być około 100 razy większa od objętości próbki. Wszystkie używane do chromatografii powinny być przefiltrowane (0,45 μm lub mniej) i odgazowane (np. przez kąpiel ultradźwiękową lub odgazowanie próżniowe).
      2. Przyciąć rurkę do dializy (odcięcie masy cząsteczkowej [MWCO]: 3,5 kDa) na odpowiednią długość z dodatkową przestrzenią na powietrze, aby zapewnić wyporność próbki powyżej obracającego się mieszadła.
        nuta: Glicerol konserwuje membranę i należy go usunąć przed użyciem.
      3. W celu zmniejszenia lepkości oczyszczonego roztworu białkowego z etapu 1.3.2, należy rozcieńczyć roztwór 25 ml buforu A AIEX w celu ułatwienia późniejszego nałożenia na kolumnę chromatograficzną. Przymocuj pierwsze zamknięcie do rurki, załaduj próbkę do membrany i zamocuj drugie zamknięcie co najmniej 1 cm od górnego końca rurki.
      4. Umieścić 5-litrowy pojemnik z buforem AIEX A na talerzu mieszającym, dodać mieszadło i membranę wypełnić roztworem białka. Dostosuj prędkość, aby obrócić próbkę, unikając zakłóceń z obracającym się mieszadłem. Dializa przez 12−24 h w temperaturze 4 °C, następnie zastąpić bufor dializatu (bufor AIEX A) świeżym, wstępnie schłodzonym preparatem i kontynuować przez co najmniej dodatkowe 4 godziny. Przenieść dializowany roztwór białka do probówki o pojemności 50 ml i przefiltrować przez jednostkę filtrującą 0,45 μm.
        nuta: Możliwe przechowywanie.
    2. chromatografia
    3. Uruchomić system chromatografii cieczowej (FPLC) z ogólną konserwacją, podłączyć kolumnowe AIEX A i AIEX B (bufor AIEX A z 1 M NaCl) i kolumnę zawierającą żywicę anionowymienną. Ogólne parametry chromatograficzne znajdują się w Tabeli 1.
      UWAGA:, kolumny i urządzenia FPLC powinny być zrównoważone do tej samej temperatury przed rozpoczęciem serii (patrz parametry chromatograficzne w Tabeli 1, Tabeli 2, Tabeli 3, Tabeli 4 i Tabeli 5).
    4. Zrównoważyć kolumnę buforem A AIEX, a następnie załadować próbkę do kolumny i wymyć białka z gradientem liniowym od 0% do 100% buforu o wysokiej zawartości soli (AIEX B). Patrz Tabela 2, aby zapoznać się ze szczegółowym protokołem metody.
    5. Zebrać 2 ml frakcji podczas elucji i przeanalizować 10 μl każdej frakcji na elektroforezie w żelu poliakrylamidowym z 15% dodecylosiarczanem sodu barwionym Coomassie (SDS-PAGE). Zebrać frakcje zawierające białko S100A12 do dializy.
      nuta: Masa cząsteczkowa S100A12 wynosi 10 575 Da.
  2. Chromatografia oddziaływań hydrofobowych zależnych od wapnia (HIC)
    1. dializa
      1. Dializować roztwór białka w stosunku do 20 mM Tris, 140 mM NaCl, pH 7,5 zgodnie z procedurą opisaną w sekcji 2.1.1.
    2. chromatografia
      1. Przygotować 1 l buforu chromatograficznego HIC A, rozpuszczając 20 mM Tris, 140 mM NaCl i 25 mM CaCl2 w wodzie dejonizowanej i dostosować pH do 7,5. W przypadku buforu HIC B rozpuść 20 mM Tris, 140 mM NaCl i 50 mM EDTA. Dostosuj pH do 7,0, a następnie przefiltruj i odgazuj. Dodać CaCl2 do próbki do końcowego stężenia 25 mM i przefiltrować przez 0,45 μm. Zrównoważyć HIC i próbkę do temperatury 4 °C (temperatura kolumny).
      2. Uruchomić system chromatografii cieczowej z ogólną konserwacją, podłączyć kolumn HIC A i B oraz kolumnę. Patrz Tabela 3 w celu zapoznania się z dalszymi parametrami chromatograficznymi.
      3. Wyrównać kolumnę, załadować próbkę i rozciągnąć blok "przemywania próbki niezwiązanej" do momentu, gdy sygnał UV ponownie osiągnie poziom linii podstawowej. Następnie rozpocznij elucję za pomocą chelatora wapnia zawierającego bufor (EDTA). Szczegółowy protokół metody znajduje się w Tabeli 4.
        nuta: Wcześniejsze eksperymenty wykazały, że nadmiar wapnia wydaje się być korzystny dla wiązania S100A12 z żywicą chromatograficzną.
      4. Zbierz frakcje szczytowe o wielkości 2 ml i przeanalizuj 10 μl każdej frakcji na 15% SDS-PAGE wybarwionej Coomassie. Zebrać czyste frakcje S100A12 i poddać dializie w roztworze soli fizjologicznej buforowanej przez Hepes (HBS; 20 mM Hepes, 140 mM NaCl, pH 7,0), jak opisano w sekcji 2.1.1.
        UWAGA: Współczynnik ekstynkcji S100A12 monomerycznej wynosi 2980 M-1 cm-1.

3. Wykrywanie i usuwanie endotoksyn

  1. Wykrywanie endotoksyny
    1. W celu określenia zanieczyszczenia endotoksynami należy zmierzyć stężenia rozcieńczonego białka z kroku 2.2.2.4. (np. 1:10 i 1:100 w HBS) przy użyciu testu immunoenzymatycznego (ELISA) opartego na fluorescencyjnym wykrywaniu endotoksyn (tabela materiałów). Wykonaj ten test, postępując zgodnie z protokołem producenta.
      nuta: Używaj świeżo przygotowanych roztworów HBS rozpuszczonych w ultraczystej wodzie dejonizowanej, aby uniknąć (nowego) zanieczyszczenia endotoksynami przez bufor.
  2. Usuwanie endotoksyny i koncentracji białka
    1. Załadować 15 ml próbki do filtra odśrodkowego o sile 50 kDa i wirować przy ciśnieniu 3 200 x g i temperaturze 10 °C przez około 10 minut. Przenieść przepływ do świeżego naczynia (na lodzie), a następnie ponownie napełnić i odwirować rurkę filtracyjną o mocy 50 kDa tak często, jak to konieczne. Umyj membranę filtra dwukrotnie HBS, aby odzyskać jak najwięcej białka po każdym etapie.
    2. Zagęścić przepływ zawierający S100A12 za pomocą filtra odśrodkowego o sile 3 kDa, aż objętość zmniejszy się do jednej piątej do jednej dziesiątej początkowej objętości ładunku (odwirowanie przy 3 200 x g, 10 °C przez około 30 min). Filtr należy napełniać tak często, jak to konieczne, płukać membranę i po każdym napełnianiu przenosić stężony roztwór do nowej probówki. Odrzuć przepływ. Przefiltruj ponownie przez 50 kDa, jak opisano powyżej.
      nuta: Podczas tej procedury utrata białka jest znaczna (do 50%), ale pozostały preparat białkowy jest całkowicie pozbawiony LPS. Ta metoda daje około 10-15 mg białka z 400 ml kultury.
    3. Dostosować roztwór białkowy do 1 mg/ml z HBS wolnym od endotoksyn i zmierzyć zawartość LPS zgodnie z opisem w kroku 3.1.1. W przypadku, gdy roztwór białkowy nadal nie jest badany jako wolny od LPS (<0,1 EU/ml), należy wyeliminować pozostałości zanieczyszczeń za pomocą żywicy do usuwania endotoksyn.
      nuta: Przy stężeniu białka 1 mg/ml zanieczyszczenie 0,1 EU/ml LPS odpowiada około 0,01 pg LPS/μg białka.

4. Chemiczne sieciowanie i separacja oligomerów

  1. Sieciowanie chemiczne
    1. Przygotować wysoce czyste (wolne od endotoksyn) roztwory podstawowe 1 M CaCl2 i 100 mM ZnCl2 w ultraczystej wodzie dejonizowanej (tabela materiałów). Użyj tego bufora, świeżo przygotowanego, do następnego kroku.
    2. Inkubować 10 ml oczyszczonego S100A12 wolnego od endotoksyn (stężenie 1 mg/ml w HBS) przez 30 minut w temperaturze pokojowej (RT) z 25 mM CaCl2 dla dimerycznych/tetramerycznych lub 25 mM CaCl2 i 1 mM ZnCl2 dla heksamerycznych/tetramerycznych S100A12 oligomerów.
    3. Przygotować środek sieciujący, rozpuszczając 8 mg BS3 w 500 μl wody wolnej od endotoksyn bezpośrednio przed użyciem (8 mg środka sieciującego na 10 ml roztworu białka wzbogaconego jonami równa się końcowemu stężeniu 1,4 mM). Wymieszać środek sieciujący i próbkę przez pipetowanie i inkubować przez dodatkowe 30 minut w temperaturze pokojowej. Ugasić reakcję, dodając 1 M Tris-HCl, pH 7,5 do końcowego stężenia 50 mM i przefiltrować przez 0,45 μm.
  2. Chromatografia wykluczania wielkości
    1. Zrównoważyć usieciowaną próbkę do 12−15 °C (temperatura kolumny) i uruchomić system chromatografii cieczowej z ogólną konserwacją. Połącz bufor kolumn (HBS) i kolumnę wykluczania rozmiaru. Szczegółowe informacje znajdują się w Tabeli 5.
    2. Zrównoważyć kolumnę w HBS, załadować próbkę i zebrać frakcje pikowe (1-2 ml) podczas przebiegu. Analizuj te frakcje na 4−20% gradiencie SDS-PAGE i puluj frakcje z głównymi pasmami pożądanego kompleksu białkowego.
      nuta: Hydroliza odczynników estrowych NHS, takich jak BS3 w roztworach wodnych, powoduje silną absorbancję przy 280 nm. Niezwiązany środek sieciujący (masa cząsteczkowa: 572 g/mol) eluuje się pod koniec cyklu i powoduje silny pik.
    3. Zagęścić roztwory za pomocą odśrodkowych jednostek filtrujących z MWCO o sile 10 kDa (dimer), 30 kDa (tetramer) lub 50 kDa (heksamer). Oznaczyć stopień zanieczyszczenia endotoksynami w sposób opisany w sekcji 3.1. W razie potrzeby usuń pozostały LPS za pomocą żywicy do usuwania endotoksyn zgodnie z zaleceniami producenta (Tabela materiałów).

5. Testy funkcjonalne monocytów

  1. Przygotowanie monocytów
    1. Wyizolować monocyty z ludzkiej kożuchy przez wirowanie w gradiencie gęstości, a następnie wzbogacanie monocytów za pomocą zestawu do separacji kulek magnetycznych (tabela materiałów).
      nuta: W wyniku tego protokołu powstanie około 5−7 x 107 monocytów (jeden kożuchowy płaszcz) o czystości 83−95%. Ponieważ liczba, ale także reaktywność komórek zależy w dużym stopniu od dawcy, może być konieczne zwiększenie skali protokołu (w zależności od wymaganej liczby komórek).
    2. W przypadku wirowania gęstościowego należy zrównoważyć roztwór do separacji (gęstość = 1,077 g/ml) z roztworem do RT i przenieść 20 ml do probówek wirówkowych o pojemności 50 ml (2 probówki na warstwę buffy). Rozcieńczyć krew z ludzkiej sierści buffy buforowanym roztworem soli Hanka (HBSS) do całkowitej objętości 60 ml i ostrożnie ułożyć 30 ml tej mieszaniny na pożywce separacyjnej. Wirować przy 550 x g przez 35 minut przy wilgotności względnej. Wyłączyć hamulec wirówki.
    3. Po odwirowaniu jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC) znajdują się bezpośrednio na pożywce separacyjnej. Przenieść te komórki do świeżej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml, uzupełnić do 50 ml HBSS i odwirować przy 170 x g przez 10 minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w małej objętości HBSS przez pipetowanie.
    4. Napełnić probówkę do 50 ml i odwirować przy 290 x g przez 10 min. Ponownie odessać supernatant, ponownie zawiesić komórki w HBSS (50 ml) i odwirować przy 170 x g przez 10 min. Zliczyć komórki i ponownie zawiesić je w buforze do separacji komórek (tabela materiałów) do stężenia 5 x 107 komórek/ml.
      nuta: Zamiast HBSS do mycia komórek można użyć soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
    5. Do izolacji monocytów z PBMC należy użyć zestawu do izolacji komórek z ujemnym magnetycznie ujemnym i postępować zgodnie z protokołem producenta. Policz monocyty i ponownie zamieszaj w pożywce monocytowej (RPMI 1640, 15% inaktywowana termicznie płodowa surowica cielęca [FCS], 4 mM L-glutamina, 100 U/ml penicyliny/streptomycyna) do stężenia 2 x 106 komórek/ml.
    6. Aby wyhodować monocyty, należy pokryć szalki hodowlane (np. 100 mm) hydrofobową, przepuszczalną dla gazów folią, odpowiednią dla komórek zawiesinowych (tabela materiałów). Sterylizuj płytki za pomocą światła UV przez około 30 minut. Przenieść komórki na te płytki hodowlane i pozostawić je na noc w temperaturze 37 °C i 5% CO2,
      nuta: Użyj 15-25 ml zawiesiny komórek na powlekane naczynie.
  2. Stymulacja monocytów
    1. Stymulacja za pomocą S100A12 (typ dziki)
      nuta: W celu odróżnienia S100A12 niepoddanych działaniu substancji (produkt końcowy z sekcji 2.2.2) od białka usieciowanego, S100A12 w dalszej części określa się mianem "typu dzikiego".
      1. Przenieść wypoczęte komórki do probówki odśrodkowej o pojemności 50 ml i odwirować przy 350 x g przez 10 minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w podłożu stymulacyjnym (RPMI 1640, 5% inaktywowany termicznie FCS, 4 mM L-glutamina, 100 U/ml penicylina/streptomycyna) w stężeniu 2 x 106 komórek/ml.
      2. Do stymulacji użyj 24-dołkowych płytek zawiesinowych i dodaj 250 μl zawiesiny komórek na dołek (0,5 x 106 komórek/dołek). Dodać 50 μg/ml polimyksyny B do zamierzonych studzienek, a następnie LPS w różnych stężeniach (25, 50, 100 i 200 pg/ml) lub S100A12 typu dzikiego (10, 20, 40, 60 μg/ml). Następnie nałóż białko niepoddane obróbce lub denaturowane termicznie (99 °C, 10 min) w różnych stężeniach do komórek.
        nuta: Krótka obróbka cieplna denaturuje białko S100A12, ale ma mniejszy lub żaden wpływ na LPS.
      3. Inkubować płytki przez 4 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Zebrać komórki, przenosząc zawiesinę komórkową z każdej studzienki do probówek reakcyjnych o pojemności 1,5 ml. Wirować przy 500 x g przez 10 min. Przenieść supernatanty do świeżych probówek i zmierzyć uwalnianie TNFα w różnych rozcieńczeniach (np. 1:2, 1:5, 1:10) za pomocą ludzkiego zestawu TNFα ELISA zgodnie z zaleceniami producenta.
    2. Stymulacja za pomocą oligomerów S100A12
      1. Przygotować i wysiać monocyty w 24-dołkowych płytkach zawiesinowych, jak opisano powyżej. Stymuluj komórki, dodając S100A12 oligomerów z kroku 4.2.3. w różnych stężeniach molowych (125 nM, 250 nM, 500 nM, 1000 nM).
        nuta: Aby porównać zdolności różnych oligomerów do stymulacji monocytów, oligomery zastosowano do komórek w porównywalnych stężeniach molowych.
      2. Inkubować przez 4 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 , zebrać komórki i zmierzyć uwalnianie TNFα w supernatantach, jak opisano powyżej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Po wstępnym oczyszczaniu na kolumnie AIEX (Rysunek 1A-C) i następującej po nim zależnej od wapnia chromatografii HIC (Rysunek 2A,B) otrzymano białko o wysokiej czystości (Rysunek 2C). Ponadto pomiary poziomu endotoksyn wykazały skuteczne usunięcie LPS. Zawartość LPS po AIEX mierzono w rozcieńczeniu 1:10 powyżej granicy wykrywalności testu, tj. powyżej 50 EU/mL. Po pierwszej filtracji przez jednostkę...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym protokole opisujemy bezznacznikową ekspresję bakteryjną ludzkiego S100A12 i jej oczyszczanie, a także rozdzielanie na różne oligomery indukowane jonami w celu stymulacji komórek odpornościowych. W porównaniu z opublikowanym piśmiennictwem na temat oczyszczania białek S100A12 8,23,24, zastosowanie wysokiego CaCl2 (25 mM) w chromatografii oddziaływań hydrofobowych jest według naszej wiedzy unikalne. Kilka protokoł...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez granty z wewnętrznego programu innowacyjnych badań medycznych wydziału medycznego Uniwersytetu w Muenster (KE121201 do C.K.) i Niemieckiej Fundacji Badawczej (DFG, Fo354/3-1 do D.F.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Grafika wektorowa: pET11bNovagen   
BL21(DE3) kompetentny E. coliNew England BiolabsC2527 
       
100x Aminokwasy endogenneMerckK 0293
25% HClCarl RothX897.1
4− 20% Mini-PROTEAN TGX Żele białkoweBioRad4561093
Sól sodowa ampicylinyCarl RothHP62.1
BS3 (suberat bis(sulfosuccinimidylu)) - 50 mgThermoFisher Scientific21580
Dihydrat chlorku wapniaCarl Roth5239.1
Coomassie Briliant Blue R250 Roztwór odbarwiającyBioRad1610438
Roztwór barwiący Coomassie Briliant Blue R250 BioRad1610436
Zestaw do wzbogacania ludzkich monocytów EasySepStemcell19059Zestaw do izolacji komórek z ujemnym magnetycznie ujemnym
dwuwodnym sól disodowa EDTACarl Roth8043.1
EGTACarl Roth3054.3
EndoLISAHyglos609033Wykrywanie endotoksyn test
Endotoxin-Free Ultra Pure WaterSigma-AldrichTMS-011-AUltraczysta woda do przygotowania wolnych od endotoksyn
EndoTrap czerwonyHyglos321063Żywica do usuwania endotoksyn
FBS (inaktywowana termicznie)Gibco10270
HBSS, bez wapnia, bez magnezuThermoFisher Scientific14175053
HepesCarl Roth9105
Hepes (wysokiej jakości, test endotoksyn)Sigma-AldrichH4034
hTNF-alpha - OptEia ELISA SetBD555212
IPTG (izopropylo-ß-D-tiogalaktopiranozyd)Carl RothCN08.1
L-glutamina (200 mM)MerckK 0282
LB-MediumCarl RothX968.1
Lipopolisacharydy z E. coli O55:B5MerckL6529
Pancoll, ludzkiPAN BiotechP04-60500Roztwór do separacji (wirowanie w gradieniu gęstości)
Penicylina/Streptomycyna (10.000 U/ml)MerckA 2212
Phenyl Sepharose High PerformanceGE Healthcare17-1082-01Żywica do chromatografia oddziaływań hydrofobowych
Polimyksyna BInvivogentlrl-pmb
Tabletki inhibitora proteazyRoche11873580001
Q Sepharose Fast FlowGE Healthcare17-0510-01Żywica do chromatografii anionowymiennej
Bufor RoboSepStemcell20104Bufor do separacji komórek (sekcja 5.1.4)
RPMI 1640 MediumMerckF 1215
Chlorek sodu (NaCl)Carl Roth3957.2
Wodorotlenek soduCarl RothP031.1
Tris BaseCarl Roth4855.3
ChlorekCarl RothT887
Labware
0,45 &mikro; m filtr strzykawkowyMerckSLHA033SS
14 ml probówki okrągłodenneBD352059
2 L Kolba ErlenmyerCarl RothLY98.1
24-dołkowe płytki zawiesinoweGreiner662102
5 L miarkaCarl RothCKN3.1
50 ml stożkowe probówki wirówkoweCorning430829
Szybkie probówki wirówkowe 50 mlEppendorf3,01,22,178
Filtr odśrodkowy Amicon Ultra-15 MWCO 3 kDaMerckUFC900324
Amicon Ultra-15 MWCO 50 kDahodowlane MerckUFC905024
100 mm)Sarstedt83.3902
Zamknięcia rurek do dializySpectrum132738
Magnes EasySep 'The Big Easy'Stemcell18001
Probówki do zbierania frakcji 5 mlGreiner115101
Folia Lumox, 25 &mikro; m, 305 mm x 40 mSarstedt94,60,77,316Folia do hodowli monocytów
Membrana dializowa Spectra/Por (3,5 kDa)Spectrum132724
Jednostka filtrująca SteritopMerckSCGPT01RE
Equipment
37 ° C Inkubator (z wytrząsaniem)New Brunswick ScientificInnova 42
Ä Oczyszczacz KTA UPC 10GE HealthcareFPLC System
Kolektor frakcjiGE HealthcareFrac-920
Wirówka (z wirnikiem A-4-81)Eppendorf5810R
Rotor o stałym kącie nachyleniaEppendorfF-34-6-38
Mini Protean Tetra CellBioRad1658000EDU
NanoPhotometerImplenP330
SonicatorBrandelinUW2070
Czytnik fluorescencjiTecannieskończony M200PRO
pH-metrKnick765
roztworem Filtr odśrodkowy Naczynie (

Bibliografia

  1. Liston, A., Masters, S. L. Homeostasis-altering molecular processes as mechanisms of inflammasome activation. Nature Reviews Immunology. 17 (3), 208-214 (2017).
  2. Kessel, C., Holzinger, D., Foell, D. Phagocyte-derived S100 proteins in autoinflammation: putative role in pathogenesis and usefulness as biomarkers. Clinical Immunology. 147 (3), 229-241 (2013).
  3. Baker, T. M., Nakashige, T. G., Nolan, E. M., Neidig, M. L. Magnetic circular dichroism studies of iron(ii) binding to human calprotectin. Chemical Science. 8 (2), 1369-1377 (2017).
  4. Nakashige, T. G., Zhang, B., Krebs, C., Nolan, E. M. Human calprotectin is an iron-sequestering host-defense protein. Nature Chemical Biology. 11 (10), 765-771 (2015).
  5. Nakashige, T. G., Zygiel, E. M., Drennan, C. L., Nolan, E. M. Nickel Sequestration by the Host-Defense Protein Human Calprotectin. Journal of the American Chemical Society. 139 (26), 8828-8836 (2017).
  6. Cunden, L. S., Gaillard, A., Nolan, E. M. Calcium Ions Tune the Zinc-Sequestering Properties and Antimicrobial Activity of Human S100A12. Chemical Science. 7 (2), 1338-1348 (2016).
  7. Moroz, O. V., et al. Structure of the human S100A12-copper complex: implications for host-parasite defence. Acta Crystallographica Section D, Biological Crystallography. 59 (Pt 5), 859-867 (2003).
  8. Moroz, O. V., Blagova, E. V., Wilkinson, A. J., Wilson, K. S., Bronstein, I. B. The crystal structures of human S100A12 in apo form and in complex with zinc: new insights into S100A12 oligomerisation. Journal of Molecular Biology. 391 (3), 536-551 (2009).
  9. Korndorfer, I. P., Brueckner, F., Skerra, A. The crystal structure of the human (S100A8/S100A9)2 heterotetramer, calprotectin, illustrates how conformational changes of interacting alpha-helices can determine specific association of two EF-hand proteins. Journal of Molecular Biology. 370 (5), 887-898 (2007).
  10. Moroz, O. V., et al. Both Ca2+ and Zn2+ are essential for S100A12 protein oligomerization and function. BMC Biochemistry. 10, 11(2009).
  11. Baudier, J., Glasser, N., Gerard, D. Ions binding to S100 proteins. I. Calcium- and zinc-binding properties of bovine brain S100 alpha alpha, S100a (alpha beta), and S100b (beta beta) protein: Zn2+ regulates Ca2+ binding on S100b protein. Journal of Biological Chemistry. 261 (18), 8192-8203 (1986).
  12. Dell’Angelica, E. C., Schleicher, C. H., Santome, J. A. Primary structure and binding properties of calgranulin C, a novel S100-like calcium-binding protein from pig granulocytes. Journal of Biological Chemistry. 269 (46), 28929-28936 (1994).
  13. Vogl, T., et al. S100A12 is expressed exclusively by granulocytes and acts independently from MRP8 and MRP14. Journal of Biological Chemistry. 274 (36), 25291-25296 (1999).
  14. Hofmann, M. A., et al. RAGE mediates a novel proinflammatory axis: a central cell surface receptor for S100/calgranulin polypeptides. Cell. 97 (7), 889-901 (1999).
  15. Foell, D., et al. Proinflammatory S100A12 Can Activate Human Monocytes via Toll-like Receptor 4. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 187 (12), 1324-1334 (2013).
  16. Kessel, C., et al. Calcium and zinc tune autoinflammatory Toll-like receptor 4 signaling by S100A12. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 142 (4), 1370-1373 (2018).
  17. Armaroli, G., et al. Monocyte-Derived Interleukin-1beta As the Driver of S100A12-Induced Sterile Inflammatory Activation of Human Coronary Artery Endothelial Cells: Implications for the Pathogenesis of Kawasaki Disease. Arthritis & Rheumatology. 71 (5), 792-804 (2019).
  18. GE Healthcare. Strategies for Protein Purification. Handbook. , Freiburg, Germany. (2010).
  19. Jackson, E., Little, S., Franklin, D. S., Gaddy, J. A., Damo, S. M. Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12. Journal of Visualized Experiments. (123), (2017).
  20. Kiss, B., Ecsedi, P., Simon, M., Nyitray, L. Isolation and Characterization of S100 Protein-Protein Complexes. Methods in Molecular Biology. 1929, 325-338 (2019).
  21. Magalhaes, P. O., et al. Methods of endotoxin removal from biological preparations: a review. Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences. 10 (3), 388-404 (2007).
  22. Petsch, D., Anspach, F. B. Endotoxin removal from protein solutions. Journal of Biotechnology. 76 (2-3), 97-119 (2000).
  23. Heilmann, R. M., Suchodolski, J. S., Steiner, J. M. Purification and partial characterization of canine S100A12. Biochimie. 92 (12), 1914-1922 (2010).
  24. Hung, K. W., Hsu, C. C., Yu, C. Solution structure of human Ca2+-bound S100A12. Journal of Biomolecular NMR. 57 (3), 313-318 (2013).
  25. Endotoxin Removal. Application Note - Sartorius Stedim Biotech. , (2010).
  26. Hogasen, A. K. M., Abrahamsen, T. G. Polymyxin-B Stimulates Production of Complement Components and Cytokines in Human Monocytes. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 39 (2), 529-532 (1995).
  27. Valentinis, B., et al. Direct effects of polymyxin B on human dendritic cells maturation - The role of I kappa B-alpha/NF-kappa B and ERK1/2 pathways and adhesion. Journal of Biological Chemistry. 280 (14), 14264-14271 (2005).
  28. Teuber, M., Miller, I. R. Selective Binding of Polymyxin-B to Negatively Charged Lipid Monolayers. Biochimica Et Biophysica Acta. 467 (3), 280-289 (1977).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Oczyszczanie S100A12chromatografia wymiany anionowejchromatografia oddziaływań hydrofobowychchromatografia wykluczania cząsteczkowegosieciowanie chemiczneusuwanie endotoksynizolacja monocytówuwalnianie TNF alfa
Oczyszczanie S100A12 człowieka i jego indukowanych jonami oligomerów do stymulacji komórek odpornościowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.