Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Metoda elektroporacji do dostarczania in vivo plazmidowego DNA w kresomózgowiu dorosłego danio pręgowanego

9.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60066

⸱

13 września 2019

 , 
1Institute of Stem Cell Research, Helmholtz Zentrum München, 2Graduate School of Systemic Neurosciences, Ludwig Maximilian University, 3Department of Cell Biology and Anatomy, Biomedical Center, Ludwig Maximilian University, 4Munich Cluster for Systems Neurology (SyNergy)

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiona tutaj jest metoda elektroporacji do dostarczania plazmidowego DNA i znakowania komórek ependymoglialnych u dorosłego kresomózgowia danio pręgowanego. Protokół ten jest szybką i skuteczną metodą wizualizacji i śledzenia pojedynczych komórek eścidendomoglialnych i otwiera nowe możliwości zastosowania elektroporacji w szerokim zakresie manipulacji genetycznych.

Streszczenie

Elektroporacja to metoda transfekcji, w której pole elektryczne jest przykładane do komórek, aby stworzyć tymczasowe pory w błonie komórkowej i zwiększyć jej przepuszczalność, umożliwiając w ten sposób wprowadzenie różnych cząsteczek do komórki. W niniejszej pracy elektroporacja jest stosowana do wprowadzania plazmidów do komórek wyściółki, które wyściełają strefę komorową dorosłego kresomózgowia danio pręgowanego. Frakcja tych komórek wykazuje właściwości komórek macierzystych i generuje nowe neurony w mózgu danio pręgowanego; Dlatego badanie ich zachowania jest niezbędne do określenia ich roli w neurogenezie i regeneracji. Wprowadzenie plazmidów za pomocą elektroporacji umożliwia długoterminowe znakowanie i śledzenie pojedynczej komórki eścigomogliicznej. Co więcej, plazmidy, takie jak rekombinaza Cre lub Cas9, mogą być dostarczane do pojedynczych komórek wyściółkowo-moglialnych, co umożliwia rekombinację genów lub edycję genów i daje unikalną możliwość oceny autonomicznej funkcji genów komórki w kontrolowanym, naturalnym środowisku. Wreszcie, ten szczegółowy, krok po kroku protokół elektroporacji jest używany do uzyskania udanego wprowadzenia plazmidów do dużej liczby pojedynczych komórek wyściółkiowych.

Wprowadzenie

Danio pręgowany to doskonałe modele zwierzęce do badania regeneracji mózgu po zranieniu kłutym. W porównaniu ze ssakami, na drabinie ewolucyjnej, mniej rozwinięte gatunki, takie jak danio pręgowany, na ogół wykazują wyższe wskaźniki konstytutywnej neurogenezy i szersze obszary pobytu dorosłych nerwowych komórek macierzystych, co prowadzi do ciągłego generowania nowych neuronów w większości obszarów mózgu w dorosłym życiu. Ta cecha wydaje się korelować ze znacznie wyższą zdolnością regeneracyjną danio pręgowanego w porównaniu ze ssakami1, ponieważ danio pręgowany ma niezwykły potencjał do efektywnego generowania nowych neuronów w większości badanych modeli uszkodzeń mózgu2,3,4,5,6,7,8. Tutaj badana jest telecefalon danio pręgowanego, ponieważ jest to obszar mózgu z wyraźną neurogenezą w wieku dorosłym. Te strefy neurogenezy dorosłego ssaka są homologiczne do stref neurogennych w mózgu dorosłego ssaka9,10,11.

Liczne obszary neurogenne w kresomózgowiu danio pręgowanego są obecne dzięki istnieniu promienistych komórek glejowych lub komórek ependymoglii. Komórki wyściółki działają jak dorosłe nerwowe komórki macierzyste i są odpowiedzialne za generowanie nowych neuronów zarówno w nienaruszonym, jak i regenerującym się mózgu3,5. Eksperymenty ze śledzeniem linii wykazały, że wyściółka komorowa reaguje na uraz, a następnie namnaża się i generuje nowe neuroblasty, które migrują do miejsca uszkodzenia5. Ze względu na nieustanny charakter kresomózgowia danio pręgowanego, komórki wyściółki wyściełają powierzchnię komory i budują brzuszną ścianę komory. Ściana komory grzbietowej jest utworzona przez grzbietową warstwę komórek wyściółki (ryc. 1A). Co ważne, ependymoglia danio pręgowanego ucieleśniają cechy zarówno promienistego gleju jak i komórek wyściółki ssaków. Długie wyrostki promieniowe są typową cechą promieniowych komórek glejowych, podczas gdy rozszerzenia komórkowe i ścisłe połączenia (a także ich pozycje komorowe) są typowymi cechami komórek wyściółki12,13,14. Dlatego komórki te są określane jako komórki wyściółki.

Aby śledzić in vivo zachowanie pojedynczych komórek ependymoglialnych podczas regeneracji, muszą one być niezawodnie oznaczone. Wcześniej opisano różne metody znakowania komórek in vivo do mikroskopii fluorescencyjnej, takie jak endogenne reportery lub barwniki lipofilowe15. Metody te, w przeciwieństwie do elektroporacji, mogą wymagać dłuższych okresów czasu i często nie oferują możliwości znakowania pojedynczych komórek lub trwałego, długoterminowego śledzenia. Jednak elektroporacja (oprócz znakowania pojedynczych komórek) daje możliwość wprowadzenia nowego DNA do komórki gospodarza. Co więcej, w porównaniu z innymi metodami transferu DNA do komórek, wykazano, że elektroporacja jest jedną z najbardziej wydajnych metod16,17,18,19.

Prezentowany tutaj jest protokół elektroporacji, który został udoskonalony w celu oznaczania pojedynczych komórek ependymoglialnych u dorosłego kresomózgowia danio pręgowanego. Protokół ten pozwala na znakowanie pojedynczych komórek wyściółki w celu śledzenia ich przez długi czas20 lub manipulowania określonymi szlakami w sposób autonomiczny dla komórki21,22.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie zwierzęta użyte w tym protokole były trzymane w standardowych warunkach hodowlanych, a eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi i przepisami UE oraz Rządu Górnej Bawarii (AZ 55.2-1-54-2532-0916).

1. Przygotowanie mieszaniny plazmidu do elektroporacji

  1. Rozcieńczyć interesujący nas plazmid w sterylnej wodzie i dodać roztwór podstawowy z szybkim zielonym zabarwieniem [1 mg/ml]. Upewnij się, że końcowe stężenie plazmidu wynosi ∼1 μg/μL. Dodaj barwnik o stężeniu nie większym niż 3%, ponieważ jego jedynym celem jest zabarwienie roztworu i wizualizacja wstrzyknięcia komorowego.
  2. Po przygotowaniu wymieszać roztwór plazmidu, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół lub stukając palcem. Przechowywać w temperaturze pokojowej (RT) do momentu użycia.
    nuta: W przypadku koelektroporacji dwóch plazmidów w tym samym ogniwie należy upewnić się, że stężenie każdego pojedynczego plazmidu użytego w mieszaninie wynosi co najmniej 0,8 ng/μl przy stosunku molowym 1:1, aby uzyskać 80%–90% wydajności koelektroporacji.

2. Przygotowania do iniekcji i zabiegu elektroporacji

  1. Przygotować szklane kapilary (średnica zewnętrzna 1 mm, średnica wewnętrzna 0,58 mm) niezbędne do wstrzyknięcia w aparacie do wyciągania igły.
  2. W celu wstrzyknięcia odpowiedniej ilości plazmidu (patrz wyżej), pociągnij kapilarnę do temperatury 68,5 °C za pomocą dwóch lekkich i dwóch ciężkich ciężarków (patrz Tabela materiałów dla specyfikacji ściągacza).
    nuta: W przypadku, gdy używany jest inny ściągacz, skalibruj kapilarę, aby dostarczyć odpowiednią objętość mieszanki do elektroporacji.
  3. Ręcznie ustaw urządzenie wtryskowe na ciśnienie wtrysku 200 hPa (obracając pokrętło Pi) i stałe ciśnienie 0 hPa. Ręcznie ustaw czas wtrysku na tryb ręczny i kontroluj ciśnienie za pomocą pedału nożnego.
  4. Ustaw urządzenie do elektroporacji w "trybie LV" z pięcioma impulsami pod napięciem 54–57 V (25 ms każdy w odstępach 1 s). Podłącz elektrody do urządzenia.
  5. Przygotuj jedno akwarium z czystą wodą dla ryb, w którym ryby zostaną wybudzone ze znieczulenia po zabiegu elektroporacji. Napowietrzaj wodę, trzymając kamień napowietrzający przymocowany do pompy powietrza przez cały okres rekonwalescencji, aż ryba zostanie całkowicie obudzona.
  6. Weź zwykłą gąbkę kuchenną i wykonaj podłużne nacięcie w gąbce, aby przytrzymać rybę podczas procedury iniekcji i elektroporacji (patrz poprzednia publikacja3).
    nuta: Gąbkę kuchenną należy regularnie myć lub wymieniać w celu usunięcia potencjalnie toksycznych chemikaliów.
  7. Umieść niewielką ilość wysoce przewodzącego, wielofunkcyjnego żelu ultradźwiękowego obok zestawu do wstrzykiwań i elektroporacji.
    nuta: Zapewni to odpowiednią przewodność elektryczną, a co za tym idzie, rozmieszczenie elektroporowanych komórek w całym kresomózgowiu.

3. Znieczulenie danio pręgowanego

  1. Przed znieczuleniem należy przygotować podstawowy roztwór znieczulenia z 0,2% MS222 w wodzie destylowanej i dostosować pH do 7 za pomocą buforu Tris-HCl. Rozcieńczyć ten bulion w stosunku 1:10 (tj. do 0,02% MS222) za pomocą wody dla ryb.
  2. Znieczulij ryby, trzymając je w tym roztworze roboczym, aż ruch ciała i skrzeli ustąpi (zwykle na kilka minut).

4. Wstrzyknięcie roztworu plazmidu

  1. Wypełnij przygotowaną szklaną kapilę 10 μl roztworu plazmidu za pomocą końcówek mikroładowacza. Unikaj tworzenia się pęcherzyków powietrza wewnątrz kapilary.
  2. Nacisnąć Menu/Zmień kapilar na urządzeniu do wstrzykiwania. Włożyć igłę i zamocować w uchwycie igły.
  3. Pod mikroskopem stereoskopowym o powiększeniu 3,2x lub 4x odetnij tylko końcówkę kapilary za pomocą kleszczyków z cienkimi końcami. Przełącz urządzenie do wstrzykiwania z trybu zmiany kapilary na tryb wstrzykiwania, a następnie naciskaj pedałem nożnym, aby upewnić się, że roztwór plazmidu łatwo wydostaje się z igły i bez przeszkód.
  4. Przenieś rybę ze zbiornika hodowlanego do pojemnika (plastikowego pudełka) z roztworem znieczulającym. Poczekaj kilka minut, aż ruch skrzeli ustąpi.
  5. Umieść rybę w wstępnie zwilżonej gąbce grzbietem do góry. Wykonaj wszystkie poniższe etapy iniekcji pod mikroskopem stereoskopowym, aby zapewnić dokładność procedury.
  6. Za pomocą mikronoża preparacyjnego ze stali nierdzewnej o krawędzi tnącej 40 mm i grubości 0,5 mm wykonaj mały otwór w czaszce ryby po tylnej stronie kresomózgowia (Ryc. 1B), tuż obok granicy z tectum optycznym.
    nuta: Ten krok należy wykonać ostrożnie, ponieważ otwór powinien być bardzo mały i powierzchowny, przenikający wyłącznie do czaszki, aby uniknąć uszkodzenia mózgu.
  7. W razie potrzeby przechyl rybę i skieruj końcówkę szklanej kapilary w kierunku czaszki pod odpowiednim kątem, aby ułatwić penetrację końcówki kapilary przez otwór.
  8. Ostrożnie przełóż końcówkę naczynia włosowatego przez otwór w czaszce, aż dotrze do komory kresomózgowia (patrz Rysunek 1B). Będzie to wymagało penetracji przez grzbietową warstwę komórek wyściółki. Zachowaj szczególną ostrożność, aby nie wprowadzić naczynia włosowatego zbyt głęboko, aby uniknąć kontaktu z tkanką mózgową. Utrzymuj naczynia włosowate dokładnie między półkulami, pozostając wewnątrz komory tuż po przebiciu grzbietowej warstwy wyściółki.
    nuta: To bardzo delikatny krok. Dokładność tej procedury jest poprawiona dzięki zmutowanym liniom pigmentacji, takim jak brassy24, co pozwala na lepszą wizualizację położenia szklanych naczyń włosowatych podczas iniekcji.
  9. Z końcówką kapilarną wewnątrz komory, wstrzyknąć roztwór plazmidu, naciskając pedałem nożnym przez około 10 s, co odpowiada około 1 μl roztworu plazmidu.
    nuta: W przypadku zmiany ściągacza igieł, kapilar lub wtryskiwacza, system powinien być skalibrowany tak, aby zawsze dostarczał 1 μl roztworu plazmidu. Kalibrację można przeprowadzić, mierząc średnicę kropelki plazmidu wydalanej do oleju mineralnego (np. oleju parafinowego), a następnie obliczając objętość kropli. Po 10 s od wstrzyknięcia do oleju mineralnego powinno zostać wydalone ~1 μL płynu plazmidowego.
  10. Potwierdź powodzenie poprzedniego kroku, obserwując rozprzestrzenianie się płynu w komorze.

5. Elektroporacja

  1. Wyjąć rybę z zestawu do wstrzykiwań, trzymając ją w gąbce.
  2. Zanurz wewnętrzną stronę końcówki elektrod w żelu ultradźwiękowym.
  3. Przykryj kresomózgowie ryb niewielką ilością żelu do ultradźwięków.
  4. Umieść głowę ryby między elektrodami, umieszczając elektrodę dodatnią po brzusznej stronie głowy ryby, a elektrodę ujemną po stronie grzbietowej (Rysunek 1C), nadal trzymając ciało ryby w gąbce. Wyznacza to kierunek przepływu prądu niezbędnego do elektroportowania wyściółki umieszczonej w strefie podkomorowej.
  5. Delikatnie i precyzyjnie dociśnij elektrody do kresomózgowia (Rysunek 1C). Zarządzaj prądem za pomocą pedału nożnego. Przytrzymaj elektrody na miejscu, aż wszystkie pięć impulsów zostanie zakończonych.

6. Odzyskiwanie ryb

  1. Pozwól rybie dojść do siebie w przygotowanym, stale napowietrzanym zbiorniku, aż się obudzi. Żel lidokainowy można nakładać na czaszkę w celu złagodzenia ewentualnego bólu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Opisana metoda elektroporacji umożliwia wprowadzenie plazmidowego DNA do komórek ependymoglialnych, które znajdują się powierzchownie w telencefalonie rybki danio-ostrego, tuż pod grzbietową warstwą komórek ependymalnych (Rycina 1A).

Jeśli wynik elektroporacji jest pozytywny, spośród innych komórek ependymoglialnych (białe w Ryc. 2A,B) można zaobserwować znakowane pojedyncze komórki...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Ten protokół elektroporacji jest wiarygodną metodą znakowania in vivo pojedynczych komórek wyściółki mózgowej. Protokół może wymagać dalszej adaptacji w celu oznakowania innych typów komórek, takich jak neurony lub oligodendrocyty. Aby osiągnąć skuteczne znakowanie, można zastosować plazmidy zawierające różne promotory. Promotor beta aktyny kurczaka, eF1alfa, CMV i promotor ubikwityny były wcześniej używane do kierowania ekspresją różnych transgenów w ependymoglia i ich potomstwie23. Zaobserwowano...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Specjalne podziękowania dla Jamesa Copti za redakcję rękopisu. Wyrażamy również wdzięczność za dofinansowanie dla JN przez Niemiecką Fundację Badawczą (DFG) przez SFB 870 i SPP "Integrative Analysis of Olfaction" i SPP 1738 "Emerging roles of non-coding RNAs in nervous system development, plasticity & disease" SPP1757 "Glial heterogeneity" oraz Strategię Doskonałości w ramach Monachijskiego Klastra Neurologii Systemowej (EXC 2145 SyNergy – ID 390857198).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Odczynnik/Materiał
Fast GreenSigma-AldrichF7258-25GDo barwienia roztworu plazmidu
MS222Sigma-AldrichA5040-25GMS222 należy przechowywać w temperaturze pokojowej (do dwóch tygodni) i chronić przed światłem
Żel do ultradźwiękówSignaGel, Parker laboratories INC.15-60Elektroda Żel
Sprzęt
Pompa powietrzaTetraTec APS 50, 10l-60lMożna kupić w sklepach zoologicznych
BTX Pęsety ElektrodyPlatynowa Pęseta, BTX Harvard Apparatus45-0486Średnica 1 mm
Urządzenie do elektroporacjiBTX ECM830 System elektroporacji fali prostokątnej, BTX Harvard Apparatus45-0662
Urządzenie iniekcyjneFemtoJet 4i, Eppendorf5252000013
Standardowa ścianka kapilarna ze szkła borokrzemianowegoWarner Instruments64-0766Model nr: G100-4
Końcówki do mikroładowarekEppendorf5242956003
MikronóżFine Science Tools10056-12
Mikromanipulator joystickaNarishige JapanMN - 151
Uchwyt na igłęFemtoJet 4i, Eppendorf5252000013Uchwyt na igłę dostarczany w zestawie z urządzeniem do wstrzykiwania
Urządzenie do wyciągania igiełNarishige JaponiaModel nr: PC-10PC-10 został wycofany przez Narishige w 2017 roku i zastąpiony przez
szalki PetriegoGreiner Bio-One International633161
PC-100

Bibliografia

  1. Kaslin, J., Ganz, J., Brand, M. Proliferation, neurogenesis and regeneration in the non-mammalian vertebrate brain. Philosophical Transactions of the Royal Society of London Series B Biological Sciences. 363 (1489), 101-122 (2008).
  2. Baumgart, E. V., Barbosa, J. S., Bally-Cuif, L., Gotz, M., Ninkovic, J. Stab wound injury of the zebrafish telencephalon: a model for comparative analysis of reactive gliosis. Glia. 60 (3), 343-357 (2012).
  3. Barbosa, J., et al. Live imaging of adult neural stem cell behavior in the intact and injured zebrafish brain. Science. 346 (6236), 789-793 (2015).
  4. Kishimoto, N., Shimizu, K., Sawamoto, K. Neuronal regeneration in a zebrafish model of adult brain injury. Disease Model and Mechanisms. 5 (2), 200-209 (2012).
  5. Kroehne, V., Freudenreich, D., Hans, S., Kaslin, J., Brand, M. Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors. Development. 138 (22), 4831-4841 (2011).
  6. Marz, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Strahle, U. Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon. Developmental Dynamics. 240 (9), 2221-2231 (2011).
  7. Ayari, B., Elhachimi, K. H., Yanicostas, C., Landoulsi, A., Soussi-Yanicostas, N. Prokineticin 2 expression is associated with neural repair of injured adult zebrafish telencephalon. Journal of Neurotrauma. , (2010).
  8. Skaggs, K., Goldman, D., Parent, J. M. Excitotoxic brain injury in adult zebrafish stimulates neurogenesis and long-distance neuronal integration. Glia. 62 (12), 2061-2079 (2014).
  9. Schmidt, R., Strahle, U., Scholpp, S. Neurogenesis in zebrafish - from embryo to adult. Neural Development. 8 (3), (2013).
  10. Alunni, A., Bally-Cuif, L. A comparative view of regenerative neurogenesis in vertebrates. Development. 143 (5), 741-753 (2016).
  11. Kizil, C., Kaslin, J., Kroehne, V., Brand, M. Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish. Developmetal Neurobiology. 72 (3), 429-461 (2012).
  12. Than-Trong, E., Bally-Cuif, L. Radial glia and neural progenitors in the adult zebrafish central nervous system. Glia. 63 (8), 1406-1428 (2015).
  13. Lyons, D. A., Talbot, W. S. Glial cell development and function in zebrafish. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (2), a020586(2014).
  14. Obermann, J., et al. The Surface Proteome of Adult Neural Stem Cells in Zebrafish Unveils Long-Range Cell-Cell Connections and Age-Related Changes in Responsiveness to IGF. Stem Cell Reports. 12 (2), 258-273 (2019).
  15. Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments. Interface Focus. 3 (3), 20130001(2013).
  16. Kusumanto, Y. H., et al. Improvement of in vivo transfer of plasmid DNA in muscle: comparison of electroporation versus ultrasound. Drug Delivery. 14 (5), 273-277 (2007).
  17. Zou, M., De Koninck, P., Neve, R. L., Friedrich, R. W. Fast gene transfer into the adult zebrafish brain by herpes simplex virus 1 (HSV-1) and electroporation: methods and optogenetic applications. Frontiers in Neural Circuits. 8 (41), (2014).
  18. Van Tendeloo, V. F., et al. Highly efficient gene delivery by mRNA electroporation in human hematopoietic cells: superiority to lipofection and passive pulsing of mRNA and to electroporation of plasmid cDNA for tumor antigen loading of dendritic cells. Blood. 98 (1), 49-56 (2001).
  19. Mars, T., et al. Electrotransfection and lipofection show comparable efficiency for in vitro gene delivery of primary human myoblasts. The Journal of Membrane Biology. 248 (2), 273-283 (2015).
  20. Barbosa, J. S., Di Giaimo, R., Gotz, M., Ninkovic, J. Single-cell in vivo imaging of adult neural stem cells in the zebrafish telencephalon. Nature Protocols. 11 (8), 1360-1370 (2016).
  21. Di Giaimo, R., et al. The Aryl Hydrocarbon Receptor Pathway Defines the Time Frame for Restorative Neurogenesis. Cell Reports. 25 (12), 3241-3251 (2018).
  22. Breunig, C. T., et al. One step generation of customizable gRNA vectors for multiplex CRISPR approaches through string assembly gRNA cloning (STAgR). PLoS One. 13 (4), e0196015(2018).
  23. Barbosa, J. S. In vivo single cell analysis reveals distinct behavior of neural stem and progenitor cells in homeostasis and regeneration in the adult brain. , University of Coimbra. Doctoral dissertation (2014).
  24. Kelsh, R. N., et al. Zebrafish pigmentation mutations and the processes of neural crest development. Development. 123, 369-389 (1996).
  25. Torper, O., et al. In Vivo Reprogramming of Striatal NG2 Glia into Functional Neurons that Integrate into Local Host Circuitry. Cell Reports. 12 (3), 474-481 (2015).
  26. Nguyen, L. T., Atobe, K., Barichello, J. M., Ishida, T., Kiwada, H. Complex formation with plasmid DNA increases the cytotoxicity of cationic liposomes. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 30 (4), 751-757 (2007).
  27. Chapouton, P., Godinho, L. Neurogenesis. Chapter IV in The Zebrafish: Cellular and Developmental Biology, Part A Developmental Biology. Detrich, H. W. III, Westerfield, M., Zon, L. 100, Academic Press. (2010).
  28. Zhu, P., et al. Optogenetic Dissection of Neuronal Circuits in Zebrafish using Viral Gene Transfer and the Tet System. Frontiers in Neural Circuits. 3 (21), (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Dostarczanie plazmidowego DNAkomórki ependymoglialneznakowanie komórekedycja genówwstrzykiwanie do naczyń kapilarnychżel ultradźwiękowypedał sterującystereomikroskop
Metoda elektroporacji do dostarczania in vivo plazmidowego DNA w kresomózgowiu dorosłego danio pręgowanego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.