Artykuł metodologiczny

Mechanistyczny wgląd w rozwój zwłóknienia jelit za pośrednictwem TNBS i ocena hamującego działania rapamycyny

8.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60067

⸱

12 września 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Cellular Physiology, Albany Medical College, 2The IBD Center, Division of Gastroenterology, Department of Medicine, Albany Medical College, 3Department of Geriatrics, School of Medicine and Health Science, University of North Dakota, 4Department of Neuroscience and Experimental Therapeutics, Albany Medical College

W tym artykule

Podsumowanie

W tym badaniu szczegółowo opisujemy procedurę zwłóknienia jelit za pośrednictwem TNBS, które wykazuje porównywalną patofizjologię do zwłóknienia Leśniowskiego-Crohna. Omawiamy również to podejście w świetle hamującego działania rapamycyny na zwłóknienie jelit.

Streszczenie

Przeprowadzono znaczące badania mające na celu zrozumienie skutecznego leczenia zwłóknienia jelit. Jednak brak lepszej wiedzy na temat zwłóknienia utrudnił opracowanie leku zapobiegawczego. Przede wszystkim znalezienie odpowiedniego modelu zwierzęcego jest wyzwaniem w zrozumieniu mechanizmu patologii zwłóknienia jelit związanego z chorobą Leśniowskiego-Crohna. W tym przypadku przyjęliśmy skuteczną metodę, w której narażenie chemiczne TNBS na odbytnicę myszy powoduje znacznie głębokie owrzodzenie i przewlekły stan zapalny, a myszy następnie przewlekle rozwijają zwłóknienie jelit. Opisujemy również technikę, w której wstrzyknięcie rapamycyny wykazuje działanie hamujące na zwłóknienie za pośrednictwem TNBS w modelu mysim. Aby ocenić mechanizm leżący u podstaw zwłóknienia, metodycznie omawiamy procedurę oczyszczania komórek Cx3Cr1 + z blaszki właściwej myszy leczonych TNBS i kontrolnych. Ten szczegółowy protokół będzie pomocny dla badaczy, którzy badają mechanizm zwłóknienia i utorują drogę do znalezienia lepszego wynalazku terapeutycznego dla zwłóknienia jelit związanego z chorobą Leśniowskiego-Crohna.

Wprowadzenie

Dysregulacja homeostazy immunologicznej w jelitach prowadzi do patogennego stanu zapalnego i jest powszechnie znana z wywoływania choroby zapalnej jelit (IBD)1,2. Zwłóknienie jelit jest przewlekłą konsekwencją chorób zapalnych jelit (IBD), takich jak choroba Leśniowskiego-Crohna (CD)3. Nieodwracalna patofizjologia CD obejmuje zwężenie jelit lub zwężenie zwłóknienia, co ogranicza możliwości leczenia, a ponieważ obecnie nie ma dostępnych leków, jedynym sposobem leczenia jest operacja. Ostatecznie, opracowanie skutecznych terapii przeciwdziałających niewłaściwemu zapaleniu jest bardzo potrzebne do zbadania mechanizmu CD, a to przybliży nas do tego celu.

Do badania IBD dostępne są różne modele genetyczne myszy, w tym IL10 KO, SAMP/Yit i adoptywny transfer wysokokomórkowy CD45+RB do myszy SCID4,5,6. Tutaj pokazujemy procedurę zwłóknienia za pośrednictwem TNBS w mysim modelu CD, która jest porównywalna z patologią ludzkiego zwłóknienia Leśniowskiego-Crohna. Model indukowany przez TNBS ma pewne zalety. Ten model jest technicznie prosty; Początek choroby jest szybki, niedrogi i może być szeroko stosowany u różnych zwierząt (np. myszy, szczura i świnki morskiej7). Jednoczesne podawanie etanolu i TNBS (kwasu 2,4,6-trinitrobenzenosulfonowego) gwałtownie uszkadza barierę jelitową i naraża białko tkanki jelita grubego na TNBS i wywołuje znaczne reakcje immunologiczne8,9. Powtarzające się narażenie na TNBS prowadzi do nadreaktywnego procesu naprawy reagującego na stan zapalny i uraz oraz rozwija reakcję zwłóknieniową w jelitach. Tak więc model zwłóknienia wywołanego TNBS służy jako bardzo przekonujący model do badania zwłóknienia jelit związanego z chorobą Leśniowskiego-Crohna.

Ponadto, fagocyty jednojądrzaste są głównymi komórkami, które determinują wrodzoną odpowiedź immunologiczną na patogenezę i uszkodzenia w jelitach10,11,12,13. Aby wyjaśnić mechanizm komórkowy i ustalić rolę fagocytów jednojądrzastych Cx3Cr1+ w modelu zwłóknienia TNBS, przedstawiamy procedurę oczyszczania fagocytów jednojądrzastych. Analiza komórek Cx3Cr1+ jest niezbędnym krokiem w celu oceny markerów stanu zapalnego i określenia mechanizmu współistniejącego zwłóknienia jelit. Podsumowując, ta szczegółowa procedura zwłóknienia TNBS będzie pomocna w wyjaśnieniu komórkowych mechanizmów zwłóknienia jelit.

Protokół

Dla tego manuskryptu, wszystkie próbki ludzkie zostały pobrane zgodnie z zatwierdzonym protokołem przez Institute Review Board (IRB) oraz przez Committee on Human Research w Albany Medical College. Wszystkie badania na zwierzętach były ściśle przestrzegane zgodnie z zatwierdzonym protokołem przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt w Albany Medical College, a także Przewodnik National Institutes of Health dotyczący opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych.

1. Pobieranie próbek jelit ludzkich

  1. Pobieraj próbki tkanek ludzkich zgodnie z protokołami komitetu badawczego instytucji.
  2. Pobrać tkankę jelitową (jelito krętnicze) pacjenta z CD, u którego zdiagnozowano zwłóknienie oraz próbki kontrolne od pacjentów bez historii NZJ.
  3. Użyj części tkanki jelitowej do immunohistologii, innej części tkanki do analizy mRNA, a ostatniej części do ekspresji białek genów/markerów zwłóknienia i cytokin.
  4. Do analizy immunohistologicznej należy najpierw utrwalić próbkę tkanki ludzkiej w 4% paraformaldehydzie przez co najmniej 48 godzin, a następnie przenieść ją do probówki zawierającej 70% etanolu na co najmniej 16 godzin. Użyj tej utrwalonej tkanki do wykonania bloku zatopionego w parafinie i wytnij skrawki tkanki o grubości 5 μm za pomocą mikrotomu tkankowego.
  5. Za pomocą pędzla delikatnie rozprowadź każdą wyciętą sekcję na szkiełku w celu zabarwienia.
  6. Szkiełko do barwienia tkanki z barwieniem trichromowym w celu wykrycia odkładania się kolagenu oraz z barwieniem αSMA w celu wykrycia miofibroblastów (patrz sekcja 3 w celu uzyskania szczegółowych informacji na temat barwienia trichromem i αSMA). Zbadaj poplamione skrawki pod mikroskopem świetlnym.
  7. Inną część uzyskanej próbki tkanki ludzkiej należy przetworzyć w celu wytworzenia lizatu białkowego w celu wykrycia αSMA za pomocą western blot (szczegółowe informacje na temat analizy western blot znajdują się w sekcji 7).
  8. Uzyskać RNA z końcowej części próbki tkanki ludzkiej za pomocą odczynnika ekstrakcyjnego (tabela materiałów) i przekształcić mRNA w cDNA za pomocą RT-PCR.
  9. Analiza genów zwłóknienia i cytokin metodą qPCR (szczegółowe informacje na temat przygotowania mRNA znajdują się w punkcie 6).

2. Indukcja zwłóknienia TNBS i leczenie rapamycyną u myszy

  1. Przeprowadzaj badania na zwierzętach zgodnie z protokołami badań na zwierzętach zatwierdzonymi przez instytucję.
  2. Gol dorosłe myszy w okolicy szyi, aby wstępnie uwrażliwić na TNBS poprzez ekspozycję na skórę. Namocz TNBS w bawełnianym waciku, a następnie nałóż TNBS na ogolony obszar szyi myszy.
    UWAGA: Wstępne uczulenie jest bardzo ważnym krokiem, ponieważ poprawia opóźnioną reakcję nadwrażliwości w celu zainicjowania stanu zapalnego, w którym pośredniczy TNBS.
  3. Osiem dni po uczuleniu przed uczuleniem wywołaj zapalenie jelita grubego przez podanie doodbytnicze raz w tygodniu przez sześć tygodni. Zastosuj cztery mg TNBS (w 25% etanolu) za pomocą lewatywy 100 μl za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml podłączonej do 3,5 francuskiego cewnika poliuretanowego i podaj myszom kontrolnym 100 μl tylko 25% etanolu.
    1. Znieczulić myszy pentobarbitalem (25 mg/kg dootrzewnowym) lub wystawić je na działanie 2,5% izofluranu wraz z 1 l/min tlenu podczas podawania TNBS. Potwierdź znieczulenie, delikatnie szczypiąc palce u nóg i szukając braku odruchu.
  4. Użyj maści weterynaryjnej na oczy, aby zapobiec wysuszeniu, gdy myszy są pod narkozą.
  5. Wstrzykiwać rapamycynę w dawce 2 mg/kg / dobę lub nośnik (5% Tween-20 i 4% etanolu) co dzień tygodnia przez 3-6 tygodni, dootrzewnowo, zarówno myszom kontrolnym, jak i leczonym TNBS.
  6. Użyj 6-tygodniowego jelita myszy po leczeniu TNBS do analizy testów zewnątrzkomórkowych, w tym histologii, cytometrii przepływowej, western blottingu i ekstrakcji RNA. Aby pobrać narządy, należy poddać myszy eutanazji za pomocą inhalacji CO2 i potwierdzić eutanazję ze zwichnięciem szyjki macicy.
    1. Aby pobrać narządy, należy poddać myszy eutanazji za pomocą inhalacji CO2 i potwierdzić eutanazję ze zwichnięciem szyjki macicy. Po eutanazji otwórz podłużnie mysz po jej brzusznej stronie za pomocą nożyczek chirurgicznych i kleszczy. Usuń całą okrężnicę od odbytnicy do końcowej okolicy kości biodrowej. Szybko przenieś okrężnicę do lodowatego 1x HBSS i umyj okrężnicę za pomocą tego samego buforu.
    2. Zmierz i porównaj długość okrężnicy myszy kontrolnych i leczonych TNBS. Wykonaj ten krok tak szybko, jak to możliwe, aby uniknąć wysuszenia okrężnicy i uniknięcia śmierci komórek.
    3. Pokrój okrężnicę na małe kawałki i utrzymuj w temperaturze -80 °C do przechowywania do celów przyszłych (analiza RNA/western blot). Użyj innego fragmentu dwukropka do analizy FACS.
    4. Należy pamiętać o wycięciu i pobraniu próbek tkanki okrężnicy z podobnych obszarów okrężnicy zarówno u zwierząt kontrolnych, jak i leczonych TNBS.
      UWAGA: Oczekuje się, że śmiertelność wyniesie 10%-20% przy szczepieniu TNBS, chociaż wraz z doświadczeniem śmiertelność może być znacznie zmniejszona.

3. Immuno-histopatologiczna ocena zwłóknienia jelit

  1. Utrwal tkanki ludzkie i/lub myszy w 4% paraformaldehydzie przez 48 godzin, a następnie przenieś do 70% etanolu na 16 godzin
    UWAGA: Paraformaldehyd jest neurotoksyczną substancją chemiczną, więc unikaj wdychania; Używaj maski na twarz podczas korzystania z niego.
  2. Parafina zatapia utrwalone tkanki okrężnicy, kroi na grubość 5 μm i bezpośrednio umieszcza tkanki na szklanych szkiełkach w celu histologii.
  3. Wykonaj barwienie H&E i Trichrome Blue zgodnie z instrukcjami producenta, aby wykryć kolagen.
    1. Krótko mówiąc, najpierw odparafinować sekcje, zanurzając szkiełko zawierające sekcje w dwóch komorach ksylenu na 5 minut w każdej komorze.
    2. Płucz szkiełka 100% alkoholem przez 1 minutę; powtórz ten krok trzy razy. Ponownie spłucz wodą z kranu przez 1 minutę.
    3. Następnie zanurzyć szkiełka w podgrzanym roztworze Bouina w temperaturze 56 °C na 60 minut. Roztwór Bouina ma żółty wygląd; myć po wyjęciu szkiełek z roztworu Bouina w wodzie z kranu na 3 minuty lub do momentu, gdy szkiełka staną się bezbarwne.
    4. Zanurz szkiełka w zmodyfikowanym roztworze hematoksyliny Mayera na 7 minut w temperaturze pokojowej.
    5. Szkiełka można usunąć zanurzając w bejcy Trichrome na 5-8 min. Natychmiast spłucz szkiełka pod bieżącą wodą przez 5-10 s, aby usunąć nadmiar plamy Trichrome.
    6. Odwodnić szkiełka 100% alkoholem przez 1 minutę. Powtórz tę procedurę trzy razy.
    7. Wyczyść szkiełka ksylenem przez 1 minutę i powtórz krok 3 razy.
    8. Zamontuj prowadnice za pomocą nośników montażowych (Tabela materiałów).
  4. Ostrożnie przytrzymaj szkiełko nakrywkowe z jednej strony kleszkami i pozwól mu pokryć całą sekcję bez pęcherzyków. Jeśli są bąbelki, szybko je usuń, stukając w szkiełko nakrywkowe.
  5. Użyj barwienia immunologicznego, aby wykryć αSMA.
    1. Blokuj skrawki jelita grubego w buforze blokującym (0,2% Triton X-100 i 5% normalnej surowicy koziej w 1x PBS) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    2. Inkubować ze 100 μl rozcieńczonego pierwszorzędowego przeciwciała przeciwko αSMA (tabela materiałów) na roztworze szkiełka (0,2% Triton X-100 i 3% normalna surowica kozia w 1x PBS; anty-αSMA 1:200) w temperaturze 4 °C przez noc.
    3. Umyj sekcje trzy razy za pomocą 1x PBS.
    4. Użyj koziego anty-mysiego IgG (H + L) sprzężonego z Alexa Fluor 488 (tabela materiałów) jako przeciwciało drugorzędowe przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
    5. Umyj sekcje trzy razy za pomocą 1x PBS.
    6. Użyj DAPI, aby przeciwbarwić jądro przez 5 minut.
    7. Umyj sekcje trzy razy za pomocą 1x PBS.
    8. Zamontuj szkiełka za pomocą fluorescencyjnych nośników montażowych (tabela materiałów) i uszczelnij szkiełkiem nakrywkowym za pomocą lakieru do paznokci.
  6. Pozyskiwanie obrazów za pomocą mikroskopu konfokalnego LSM 880 i przetwarzanie obrazów za pomocą oprogramowania mikroskopowego.
  7. Określ ilościowo obrazy, uzyskując średnią z wielu wybranych obszarów w tej samej sekcji za pomocą ImageJ.

4. Izolacja blaszki właściwej jelitowej i oczyszczanie jednojądrzastych fagocytów Cx3Cr1+

  1. Wzdłużnie otwórz okrężnicę w lodowatym roztworze soli Hanka (HBSS; Tabela materiałów) i umyj okrężnicę tym samym buforem.
  2. Wytnij około 5 cm małe kawałki tkanek okrężnicy za pomocą sterylnych nożyczek w HBSS.
  3. Przenieść małe kawałki tkanki jelita grubego do stożkowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej 10 ml buforu do wstępnego trawienia (1x HBSS z 5% FBS, 5 mM EDTA i 1 mM DTT) i wstrząsać przez 20 minut przy 100 obr./min w inkubatorze o temperaturze 37 °C11.
    UWAGA: Inkubacja tkanki okrężnicy w temperaturze 37 °C przy 100 obr./min w warunkach wytrząsania pozwala na efektywne trawienie tkanek kolagenazy i wysoką wydajność żywotnych komórek.
  4. Wyrzuć oderwany nabłonek okrężnicy, przechodząc przez sitko do komórek o wielkości 40 μm.
  5. Zebrać pozostałą tkankę z sitka i dalej trawić ją w buforze wytrawiającym zawierającym kolagenazę typu IV i DNazę I (tabela materiałów) w 1x HBSS z 5% FBS przez 20 minut w temperaturze 37 °C przy 100 obr./min.
  6. Wirować strawione tkanki przez około 20 s i przepuścić przez sitko do komórek o wielkości 40 μm, aby uzyskać frakcje blaszki właściwej.
  7. Odwirować frakcje blaszki właściwej w celu osadzenia komórek w temperaturze 700 x g w temperaturze 4 °C
  8. Aby wykluczyć martwe komórki z blaszki właściwej, należy użyć gradientu gęstości (tabela materiałów).
    UWAGA: Zastosowane tutaj media o gradiencie gęstości (Tabela materiałów) mogą powodować utratę komórek jednojądrzastych; Jednak w znacznym stopniu usuwa martwe komórki z preparatu, co ogólnie zwiększa czystość.
    1. Przygotuj po 100 ml roztworów pożywek o gradiencie gęstości 30% i 70%. Ponownie zawiesić uzyskane komórki w 10 ml 30% roztworu i nałożyć na 5 ml 70% roztworu do probówki o pojemności 15 ml.
    2. Odwirować gradient w stanie wolnym od hamulców przy 1 000 x g i temperaturze pokojowej. Zbierz białą fazę pierścieniową zawierającą limfocyty blaszki właściwej, które będą znajdować się między warstwami gradientu od 30% do 70%.
  9. Otrzymane komórki przemyć przez ponowne zawieszenie w lodowatym HBSS i odwirować w temperaturze 500 x g, 20 °C, przez 10 minut. Ponownie zawiesić komórki w buforze FACS (sortowanie komórek aktywowane fluorescencją) (PBS, pH 7,4, z 1% BSA i 2 mM EDTA).
  10. Oczyść fagocyty jednojądrzaste z pobranych komórek, oczyszczając za pomocą kulek magnetycznych i/lub sortowania FACS.
    1. Oczyszczanie magnetyczne
      1. Przed barwieniem przeciwciałami najpierw zablokuj powierzchnię komórek blaszki właściwej przez inkubację z anty-mysim blokerem CD16 / CD32 Fc przez 15 minut na lodzie.
      2. Inkubować komórki z przeciwciałami anty-Cx3Cr1-PE (fikoerytryna) wraz z mikrogranulkami anty-PE (tabela materiałów) przez 30 minut na lodzie, w celu wychwycenia związanych komórek. Umyj komórki buforem FACS.
      3. Przepuść komórki związane z przeciwciałem/kulką przez aktywowaną magnetycznie kolumnę sortującą komórki w polu magnetycznym, aby usunąć niezwiązane komórki. Przemyć trzykrotnie buforem FACS. Usuń kolumnę z pola magnetycznego i wciśnij tłok w kolumnę, aby uzyskać komórki związane ze ściegami.
    2. Sortowanie FACS
      UWAGA: Sortowanie FACS może być stosowane zamiast oczyszczania magnetycznego. Mimo że oczyszczanie magnetyczne jest łatwą i opłacalną metodą, ogranicza się tylko do oczyszczania pojedynczych komórek, a nie subpopulacji komórek. Dlatego, aby wyizolować subpopulacje komórek, metoda sortowania FACS jest skuteczną metodą sortowania pojedynczych komórek, a także subpopulacji komórek.
      1. Zablokuj komórki blaszki właściwej za pomocą anty-mysiego blokera Fc CD16 / CD32 (tabela materiałów).
      2. Barwienie komórek przez inkubację z przeciwciałami anty-CD64, CD11c, CD11b, Cx3Cr1, Ly6C i MHCII.
      3. Sortuj za pomocą cytometru przepływowego FACS, bramkując dla komórek CD11c-CD64 + CD11b + Cx3Cr1 + Ly6C- w celu oczyszczenia populacji CX3Cr1 (P3 + P4).
  11. Liza posortowanych komórek w celu przygotowania całkowitego RNA i wykrycie cytokin i markerów zwłóknieniowych (patrz punkt 6 dotyczący przygotowania RNA i cDNA).
  12. Analiza ekspresji mRNA markerów zwłóknienia i analiza cytokin zapalnych z izolowanych zawiesin jednokomórkowych z oczyszczania magnetycznego.
  13. W przypadku analizy FACS należy zablokować komórki anty-mysim blokerem Fc CD16/CD32 (tabela materiałów) przed barwieniem przeciwciałami przeciwko markerom powierzchniowym lub wewnątrzkomórkowym.

5. Analiza cytometrii przepływowej

  1. Barwienie i analiza powierzchni komórek
    1. Ponownie zawiesić 5-10 ×10 5 wyizolowanych komórek blaszki właściwej w 50 ml buforu FACS (1% BSA, 2 mM EDTA w PBS, pH 7,4).
    2. Inkubować komórki z anty-mysim CD16/CD32 (tabela materiałów) w rozcieńczeniu 1:50 w celu zablokowania receptorów Fc na lodzie przez 10 minut.
    3. Umyj komórki 500 μl lodowatego buforu FACS w celu usunięcia niezwiązanego anty-CD16/CD32 przed barwieniem powierzchni komórek.
    4. Zawiesiny jednokomórkowe okrężnicy barwienia powierzchniowego (10,6 komórek/50 ml) z przeciwciałem znakowanym fluorescencyjnie w rozcieńczeniu 1:100 na lodzie przez 30 minut w celu oceny blaszki właściwej okrężnicy.
    5. Przemyć znakowane komórki dwukrotnie 500 μl lodowatego buforu FACS w celu usunięcia niezwiązanych przeciwciał.
    6. Analizuj znakowane komórki jednojądrzaste za pomocą cytometrii przepływowej. Bramka dla Live, następnie dla FSC+SSC+, a następnie CD11b+Cx3Cr1+, a następnie przeanalizuj inne markery aktywacji makrofagów, w tym MHCII, CD80, CD86 i CD40.
  2. Barwienie i analiza cytokin wewnątrzkomórkowych
    1. W przypadku barwienia cytokin wewnątrzkomórkowych należy utrwalić i przepuszczalnie komórki barwione powierzchniowo za pomocą zestawu roztworu do utrwalania/przepuszczalności (tabela materiałów); postępuj zgodnie z instrukcjami producenta, aby uzyskać szczegółowe instrukcje.
    2. Bramka blaszki właściwej komórek dla Live, następnie dla FSC+SSC+, a następnie CD11b+Cx3Cr1+IL23+, aby wykryć wewnątrzkomórkowy poziom cytokiny IL23 i CD11b+ Cx3Cr1+IL1β+, aby wykryć wewnątrzkomórkowy poziom cytokiny IL1β.
  3. Barwienie i analiza αSMA
    1. Przemyć komórki buforem FACS dwukrotnie, odwirowując w temperaturze 200 x g i w temperaturze 4 °C przez 5 minut, aby usunąć nadmiar buforu utrwalającego.
    2. Aby określić poziom αSMA, należy przeniknąć komórki za pomocą zestawu roztworu do utrwalania/przepuszczalności (tabela materiałów).
    3. Inkubować komórki z przeciwciałem anty-αSMA-AF488 (tabela materiałów) przy użyciu rozcieńczenia 1:1,000 na lodzie przez 30 minut.
    4. Umyj komórki dwukrotnie, a następnie wykonaj analizę FACS. Gate for Live, FSC+SSC+, a następnie wykrywanie komórek αSMA+ w komórkach okrężnicy.

6. Izolacja RNA, RT-PCR, PCR w czasie rzeczywistym

  1. Wyizolować RNA z oczyszczonych komórek MACS lub FACS lub tkanki wyciętej z okrężnicy, homogenizując je w odczynniku ekstrakcyjnym (tabela materiałów).
    UWAGA: Podczas pracy z tym odczynnikiem należy używać okularów ochronnych i innego laboratoryjnego sprzętu ochronnego, ponieważ działa on drażniąco na płuca i skórę. Bezpieczna praca w kapturze.
  2. Dodać 0,5 μl glikogenu wolnego od RNaz z 20 μg/ml roztworu podstawowego glikogenu (tabela materiałów), aby poprawić odzyskiwanie całkowitego RNA przed wytrąceniem RNA izopropanolem.
  3. Zawiesić osad RNA w 50 μl wody wolnej od RNaz (tabela materiałów) i inkubować w temperaturze 55 °C przez 5 minut, aby całkowicie rozpuścić podniebienie RNA.
  4. Odczyt stężeń RNA za pomocą spektrofotometru przy długości fali 260 nm.
  5. Zsyntetyzuj cDNA przy użyciu 1 μg całkowitego RNA i zestawu do syntezy odwrotnej transkrypcji (tabela materiałów).
  6. Analizuj ekspresję genów przy użyciu 2 μl cDNA jako matryc za pomocą PCR w czasie rzeczywistym. Użyj 96-dołkowej płytki do PCR qPCR Master Mix kit (tabela materiałów). Użyj wartości CT, aby obliczyć zmianę krotności obfitości RNA po normalizacji wartości GAPDH/HPRT.

7. Western blotting

  1. Liza tkanki jelita grubego za pomocą buforu do lizy RIPA (1% NP40).
  2. Rozpuścić lizat białkowy w 8% żelu bis-Tris przy stałym napięciu 80 V.
  3. Przenieść żel-białko do membrany(-ów) nitrocelulozowej (membran) w buforze do zimnego transferu pracującego przy stałym prądzie 50 mA przez 2 godziny w temperaturze 4 °C.
  4. Zablokuj niespecyficzne regiony na błonie przenoszonej białka za pomocą 5% mleka beztłuszczowego w TBST (25 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1,5 M NaCl, 0,05% Tween-20) przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  5. Aby wykryć poziomy αSMA, należy inkubować błonę (błony) z przeciwciałem do wykrywania pierwotnego αSMA w temperaturze 4 °C przez noc.
  6. Umyj membrany 3-4 razy za pomocą TBST w odstępach 15 minut.
  7. Inkubować z przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z HRP (1:10 000) w 5% mleku beztłuszczowym w TBST.
  8. Wywoływanie membran za pomocą zestawu do wywoływania ECL.
  9. Normalizuj intensywność sygnału białkowego za pomocą GAPDH jako kontroli obciążenia do analizy densytometrycznej.

8. Analiza statystyczna

  1. Analizuj dane za pomocą wybranego oprogramowania do analizy danych, porównując zwierzęta typu dzikiego i KO.
  2. Uznajmy, że wartość P <0,05 jest istotna (*P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001).
  3. Użyj testu t-Studenta, aby przetestować różnice między dwiema grupami i testu ANOVA do analizy między więcej niż dwiema grupami.

Wyniki

W celu zbadania i wyjaśnienia mechanizmów leżących u podstaw włóknienia jelit zastosowaliśmy mysi model zapalenia jelit indukowanego TNBS8. Przeprowadziliśmy szczegółowe badanie przebiegu czasowego zapalenia jelit wywołanego TNBS, w którym TNBS podawano doodbytniczo raz w tygodniu myszom typu dzikiego przez okres do sześciu tygodni, co przedstawiono schematycznie (Rysunek 1A). Po sześciu tygodniach leczenia TNBS zauważyliśmy, że długość okrężnicy skraca się progresywnie w trakcie terapii, ze średnio 5 ± 0.5 cm w grupie kontrolnej do 3 ± 0.5 cm w grupie TNBS; taka analiza ilościowa długości okrężnicy wskazuje na bardzo wyraźne skrócenie jelita grubego (Rysunek 1B). Aby upewnić się, że model choroby Crohna indukowany TNBS jest porównywalny z ludzkim modelem włóknienia w chorobie Crohna i nie stanowi artefaktu związanego z metodologią, przeanalizowaliśmy markery włóknienia na wielu poziomach w szczegółowym badaniu przebiegu czasowego po iniekcjach TNBS u zwierząt typu dzikiego. Nagromadzenie komórek dodatnich pod kątem aktyny mięśni gładkich alfa (αSMA) oraz odkładanie kolagenu w warstwach podśluzowych zgłaszano w większości przypadków włóknienia i uznaje się je za cechę charakterystyczną procesów włóknienia14. Stwierdziliśmy, że w przekrojach okrężnicy myszy traktowanych TNBS, zabarwionych na αSMA, widoczny był 4-6-krotny wzrost obszaru warstwy podśluzowej okrężnicy wykazującej pozytywne barwienie na αSMA (Rysunek 1C). Ponadto barwienie trichromem niebieskim tych przekrojów wykazało również 2-4-krotny wzrost, co sugeruje znaczne odkładanie kolagenu i potwierdza występowanie ciężkiego włóknienia jelit (Rysunek 1D). Aktywację miofibroblastów oceniliśmy dodatkowo poprzez wykrywanie komórek αSMA-dodatnich za pomocą analizy FACS w okrężnicy myszy traktowanych TNBS, stwierdzając znaczące nagromadzenie barwienia αSMA-dodatniego (Rysunek 1E). Co więcej, w analizie qPCR u myszy traktowanych TNBS stwierdzono istotną indukcję ekspresji αSMA, Col-I oraz Col-III (Rysunek 1F). Zwiększona ekspresja białka αSMA w analizie western blot ujawniła nasilenie włóknienia (Rysunek 1G). Podsumowując, kinetyka leczenia TNBS umożliwia ocenę domniemanej odpowiedzi immunologicznej w warunkach przewlekłych, co ściśle naśladuje fazę przewlekłą choroby Crohna i jest niezbędne do rozwoju włóknienia.

Aby porównać włóknienie indukowane TNBS z włóknieniem związanym z chorobą Crohna, przeanalizowano ekspresję markerów włóknienia i cytokin w świeżych biopsjach tkankowych z jelita krętego pobranych od pacjentów z aktywną postacią CD lub w stanie remisji. Co istotne, w przekrojach z aktywną postacią CD stwierdzono wyraźną indukcję pogrubienia warstw dodatnich dla αSMA oraz zwiększone odkładanie kolagenu, co wykazało barwienie trichromem (Rysunek 2A). Przeprowadzono również analizę Western blot, która potwierdziła indukcję ekspresji αSMA w próbkach z aktywną postacią CD (Rysunek 2B). Ponadto w analizie qPCR zaobserwowano znaczną indukcję markerów włóknienia, w tym αSMA i Col1 (Rysunek 2C).

Następnie, aby określić mechanizm ograniczający włóknienie wywołane TNBS, oceniliśmy efekty rapamycyny, farmakologicznego inhibitora aktywności mTOR15,16. W związku z tym traktowaliśmy myszy zarówno TNBS, jak i rapamycyną, a następnie przeanalizowaliśmy poziom αSMA i kolagenu w histologii jelita grubego; ilościowy pomiar αSMA i kolagenu przedstawiono na wykresie densytometrycznym (Rycina 3A). Nasze dane sugerują, że rapamycyna zmniejsza barwienie dodatnie dla αSMA w warstwie podśluzowej i ogranicza odkładanie kolagenu. Aby dalej zweryfikować i ilościowo ocenić odpowiedzi włóknistwe, określiliśmy ekspresję αSMA, kolagenu i TGFβ za pomocą qPCR, a ekspresję αSMA metodą cytometrii przepływowej w jelicie grubym traktowanym TNBS (Rycina 3B, 3C). Wykazaliśmy również, że jednojądrowe fagocyty Cx3Cr1+ indukują zapalną odpowiedź immunologiczną na uszkodzenie9. Chcieliśmy zatem sprawdzić, czy podanie rapamycyny u myszy traktowanych TNBS może odwrócić efekty zapalne i włóknistwe. W związku z tym wyizolowaliśmy rezydentne jednojądrowe fagocyty Cx3Cr1+ z zawiesin pojedynczych komórek jelita grubego, wykorzystując magnetyczne mikrokulki (Rycina 3D). W analizie western blot u myszy traktowanych TNBS stwierdziliśmy zwiększony poziom p-p70 i p-S6 w rezydentnych jednojądrowych fagocytach Cx3Cr1+, a poziom ten został zablokowany przez rapamycynę (Rycina 3E). Ponadto stwierdziliśmy, że leczenie rapamycyną obniża poziom IL-23 i IL-1β w grupie traktowanej TNBS (Rycina 3F). Co więcej, odkrycia te wyjaśniają skuteczny mechanizm zaangażowany w indukcję włóknienia wywołanego TNBS i wykazały, że rapamycyna łagodzi indukcję włóknienia.

Badanie równowagi statycznej; diagramy i wykresy modelu zapalenia jelita grubego indukowanego TNBS pokazujące ekspresję αSMA w ciągu tygodni.
Rysunek 1: Skuteczne podanie TNBS prowadzi do rozwoju włóknienia jelit u myszy. A. Schematyczne przedstawienie cotygodniowego podawania TNBS myszom typu dzikiego. B. Zdjęcia okrężnicy oraz pomiary długości okrężnicy u myszy traktowanych TNBS, pobranych w 0, 2, 4 i 6 tygodniu po podaniu TNBS. C-D. Analiza histologiczna przekrojów okrężnicy barwionych przeciwciałem anty-αSMA w celu wykrycia aktywacji miofibroblastów oraz barwienie trichromem Massona na kolagen; pasek skali 100 µm. E. Analiza FACS w celu identyfikacji komórek αSMA-dodatnich w okrężnicy oraz kwantyfikacja komórek αSMA-dodatnich. F. Markery włóknienia i cytokiny wykryte za pomocą qPCR. G. Analiza western blot białka αSMA z lizatu okrężnicy myszy traktowanych TNBS oraz myszy kontrolnych. Ten zmodyfikowany rysunek jest wykorzystywany za zgodą autorów poprzedniej publikacji9 w Mucosal Immunology, 2019 przez Mathur i wsp. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Analiza tkanki okrężnicy; barwione przekroje, ekspresja białek αSMA, GAPDH, wykres danych porównawczych.
Rysunek 2: Włóknienie indukowane TNBS jest porównywalne do włóknienia jelit towarzyszącego chorobie Crohna. A. Reprezentatywne obrazy biopsji okrężnicy grupy kontrolnej oraz grupy z aktywną CD, wykazujące istotny wzrost barwienia trichromem błękitnym oraz barwienia dodatniego dla αSMA w warstwach podśluzowych, pasek skali 50 µm. B. Analiza Western blot ekspresji αSMA oraz jej kwantyfikacja. C. Analiza qPCR markerów włóknienia i cytokin. Ten zmodyfikowany rysunek jest wykorzystywany za zgodą z wcześniejszej publikacji9 w Mucosal Immunology, 2019 przez Mathur i wsp. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Wyniki eksperymentu dotyczącego zapalenia jelita grubego; αSMA, barwienie trichromem przekrojów jelita grubego, analiza kulek CX3CR1, blotting białek.
Rysunek 3: Leczenie rapamycyną skutecznie łagodzi włóknienie wywołane przez TNBS. A. Analiza histologiczna jelita grubego – reprezentatywne obrazy barwienia miofibroblastów przeciwciałem anty-αSMA oraz barwienia kolagenu błękitnym trichromem, pasek skali 100 µm. B. Analiza qPCR ekspresji αSMA, kolagenu i TGFβ w jelitach grubych myszy kontrolnych oraz leczonych TNBS. C. Analiza FACS αSMA w zawiesinie pojedynczych komórek z jelita grubego myszy leczonej kontrolnie/TNBS. D. Schemat oczyszczania komórek Cx3Cr1+ z frakcji błony właściwej jelita grubego oraz analiza FACS oczyszczonych komórek. E. Analiza Western blot poziomu p-p70 i p-S6 w oczyszczonych jednojądrowych fagocytach Cx3Cr1+ z myszy leczonych TNBS i/lub rapamycyną. F. Analiza qPCR ekspresji w oczyszczonych jednojądrowych fagocytach Cx3Cr1+, które produkują IL-23 i IL-1β. Ten zmodyfikowany rysunek jest wykorzystywany za zgodą z poprzedniej publikacji9 w Mucosal Immunology, 2019 autorstwa Mathur et al. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Gojenie się ran lub naprawa tkanek jest ściśle regulowanym procesem biologicznym17. Podczas uszkodzenia tkanki w stanie chemicznym, mechanicznym i infekcyjnym reakcja zapalna uruchamia proces naprawy tkanek. Jednak rozregulowana i patologiczna reakcja zapalna prowadzi do rozwoju bliznowacenia lub reakcji zwłóknieniowej, co może upośledzać funkcję naprawy tkanek 9,18,19. Tutaj pokazujemy procedurę dla zwierzęcego modelu zwłóknienia wywołanego TNBS, który ma wiele wspólnego z patofizjologią ludzkiej choroby Leśniowskiego-Crohna. Kolejne inokulacje TNBS narażenie na chemikalia w celu uszkodzenia nabłonka myszy powoduje głębokie owrzodzenia i indukuje rozwój zwłóknienia. Dzięki niezawodnemu, taniemu i szybkiemu wywoływaniu początku choroby, metoda ta jest powszechnie akceptowana przez wiele grup badawczych zaangażowanych w badania nad uszkodzeniem tkanek, zapaleniem przezściennym i osią jelitowo-mózgową.

Aby skutecznie wdrożyć model zwłóknienia TNBS, należy wykonać kilka niezbędnych kroków. Na przykład bardzo ważne jest odpowiednie dawkowanie i czas podawania TNBS. 6-8-tygodniowa inokulacja TNBS pozwala na głębokie owrzodzenie tkanek i jest wysoce zalecana w badaniach przewlekłego zwłóknienia. Wychodzący stolec od myszy i odruch wsteczny zaszczepionego TNBS to dwa główne problemy, które mogą skutkować dostarczaniem myszom różnych dawek. Delikatny ucisk w pobliżu odbytnicy myszy może pomóc w uwolnieniu stolca przed podaniem TNBS. Przytrzymanie głowy zwierzęcia w dół przez kilka sekund radykalnie pomaga zatrzymać odwrotny refluks TNBS. Trzymanie myszy w klatce, umieszczanie klatki na poduszce grzewczej i dostarczanie myszom nektaru Napa może być również przydatnymi strategiami zapobiegania wysokiej śmiertelności.

W tym miejscu omawiamy również stan zapalny jelit podczas zwłóknienia TNBS i jego wpływ na odpowiedź zwłóknieniową. Rola mTOR/autofagii jest szeroko związana z homeostazą jelit i patogenezą IBD20,21. Stwierdziliśmy, że sygnalizacja mTOR / autofagii ma kluczowe znaczenie dla modulacji odpowiedzi prozapalnych z cytokin IL-23 i IL1β z jednojądrzastych fagocytów Cx3Cr1 +, które wpływają na profibrotyczną oś IL-23 / IL-22 (Figura 3A) 9. W związku z tym oczyszczanie pojedynczych komórek jednojądrzastych Cx3Cr1+ w celu immunoprofilowania i ekspresji genów jest krytycznym etapem modelu. Szczegółowo omawiamy protokół izolacji blaszki właściwej i przedstawiamy procedurę oczyszczania komórek jednojądrzastych Cx3Cr1+ za pomocą kulek magnetycznych.

Reasumując, pomimo obecności genetycznych i spontanicznych modeli choroby Leśniowskiego-Crohna, TNBS-colitis pozostaje silnym narzędziem do badania immunopatogenezy CD i ma potencjał do oceny leczenia zwłóknienia Leśniowskiego-Crohna. Głównym ograniczeniem stosowania chemicznie indukowanych modeli zwłóknienia, takich jak TNBS, jest prawdopodobieństwo dużej zmienności między użytkownikami oraz możliwość wystąpienia wartości odstających w danych. Wielkość próby wynosząca 5-8 zwierząt w grupie wraz z większym doświadczeniem użytkownika może zwiększyć spójność modelu. Jednak znalezienie odpowiedniego modelu genetycznego powodującego samoistne zwłóknienie choroby Leśniowskiego-Crohna jest i zawsze będzie uzasadnione.

Oświadczenia

Sprzeczne interesy: Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez R01NS093045 grantów NIH (Y.H.), K08DK088950 grantów NIH (X.Z.), R03DK099566 (X.Z.) oraz The Crohn's & Colitis Foundation of America research Fellowship (CCFA) 481637 (R.M.).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Anty-mysie aSMA, AF488 sprzężony, Klon#1A4e-bioscience53-9760-82
Anty-mysi aSMA, oczyszczony klon#M1/77e-bioscience149760-80
Anty-mysz CD11b, APCCy7 sprzężony, Klon#M1/70Biolegend Inc101226
Anty-mysz CX3cr1 PE sprzężony, Klon#SA011F11Biolegend149006
Anty-mysz oczyszczony blok CD16/32 FcBiolegend Inc14-9760-80
Mikrogranulki anty-PEMiltenyi130-105-639
anty-królicze IgG, związane z HRPe-bioscience7074
Albumina surowicy bydlęcejInvivoGentlrl-isdn
Kolagenaza typu IVRoche1088866001
DAPISIGMAD9542
DMEMCorning10013-CV
DNase I z trzustki bydłaRocheD263-5vl
Falcon® 40µ m Sitko do komórekCorning352340
Zestaw roztworu do utrwalania/przepuszczalności z zestawem BD GolgiPlugBD Bioscience555028
FlowJoFlowJo LLCa href="http://www.flowjo.com/">www.flowjo.com
GlycogenRoche10901393001
Kozie przeciwciało wtórne anty-króliczej IgG (H+L), Alexa Fluor 488 sprzężeniee-bioscience5018
Graphpad Prism 7GraphPad Software Incwww.graphpad.com
H& E zestawAmerykański zestaw MastertechHXMMHPT
Obraz JNIHa href="http://www.imagej.nih.gov/ij/">www.imagej.nih.gov/ij/
Mysz: C57BL/6JJackson Laboratories664
MS KolumnyMiltenyi130-042-201
PercolGE Healthcare17-0891-01
PMA/ Sól jonomycynySigmaP8139
PowerUp SYBR Green Master MixThermofisherA25777
Królik Anty mysz GAPDH, klon # D16H11Sygnalizacja komórkowa5174
Królik Kinaza anty myszy p70 S6, klon # 49D7Sygnalizacja komórkowa2708
Królik Anty mysz Fospho-p70 Kinaza S6, klon # S371Sygnalizacja komórkowa9208
Królicze białko rybosomalne Phospho-S6 przeciw myszom (Ser235/236), klon # D57.2.2ESygnalizacja komórkowa4858
Królik Anty mysz S6 Rybosomalne białko Sygnalizacjakomórkowa2217
RapamycynaLC LABORATORIES1003799
TNBSSigma92823
Zestaw do barwienia trichormuAmerykański zestaw MastertechSTOSTBPT
Technologie TRIzolLife15596018
Zestaw do syntezy cDNA VersoThermofisherAB1453B
Zen black 2.1Carl Zeisswww.zeis.com
Zen blue lite 2.3Carl Zeisswww.zeis.com
Przeciwciało <<

Bibliografia

  1. Garrett, W. S., Gordon, J. I., Glimcher, L. H. Homeostasis and inflammation in the intestine. Cell. 140, 859-870 (2010).
  2. Park, S. G., et al. T regulatory cells maintain intestinal homeostasis by suppressing gammadelta T cells. Immunity. 33, 791-803 (2010).
  3. Speca, S., Giusti, I., Rieder, F., Latella, G. Cellular and molecular mechanisms of intestinal fibrosis. World Journal of Gastroenterology. 18, 3635-3661 (2012).
  4. Keubler, L. M., Buettner, M., Hager, C., Bleich, A. A Multihit Model: Colitis Lessons from the Interleukin-10-deficient Mouse. Inflammatory Bowel Disease. 21, 1967-1975 (2015).
  5. Strober, W., Nakamura, K., Kitani, A. The SAMP1/Yit mouse: another step closer to modeling human inflammatory bowel disease. Journal of Clinical Investigation. 107, 667-670 (2001).
  6. Ostanin, D. V., et al. T cell transfer model of chronic colitis: concepts, considerations, and tricks of the trade. American Journal of Physiology-Gastroenterology and Liver Physiology. 296, G135-G146 (2009).
  7. Antoniou, E., et al. The TNBS-induced colitis animal model: An overview. Annals of Medicine and Surgery. 11, 9-15 (2016).
  8. Loeuillard, E., et al. 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid-induced chronic colitis with fibrosis and modulation of TGF-beta1 signaling. World Journal of Gastroenterology. 20, 18207-18215 (2014).
  9. Mathur, R., et al. Induction of autophagy in Cx3cr1(+) mononuclear cells limits IL-23/IL-22 axis-mediated intestinal fibrosis. Mucosal Immunology. 12, 612-623 (2019).
  10. Joeris, T., Muller-Luda, K., Agace, W. W., Mowat, A. M. Diversity and functions of intestinal mononuclear phagocytes. Mucosal Immunology. 10, 845-864 (2017).
  11. Mathur, R., et al. A mouse model of Salmonella typhi infection. Cell. 151, 590-602 (2012).
  12. Zhao, X., et al. Noninflammatory Changes of Microglia Are Sufficient to Cause Epilepsy. Cell Reports. 22, 2080-2093 (2018).
  13. Murugaiyan, G., et al. MicroRNA-21 promotes Th17 differentiation and mediates experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Clinical Investigation. 125, 1069-1080 (2015).
  14. Hinz, B., Celetta, G., Tomasek, J. J., Gabbiani, G., Chaponnier, C. Alpha-smooth muscle actin expression upregulates fibroblast contractile activity. Molecular Biology of the Cell. 12, 2730-2741 (2001).
  15. Yang, J., et al. Rapamycin Inhibition of mTOR Reduces Levels of the Na+/H+ Exchanger 3 in Intestines of Mice and Humans, Leading to Diarrhea. Gastroenterology. 149, 151-162 (2015).
  16. Mutalib, M., et al. The use of sirolimus (rapamycin) in the management of refractory inflammatory bowel disease in children. Journal of Crohns and Colitis. 8, 1730-1734 (2014).
  17. Shaw, T. J., Martin, P. Wound repair at a glance. Journal of Cell Science. 122, 3209-3213 (2009).
  18. Paul, J., et al. IL-17-driven intestinal fibrosis is inhibited by Itch-mediated ubiquitination of HIC-5. Mucosal Immunology. 11, 427-436 (2018).
  19. Sohail, I., Ghosh, S., Mukundan, S., Zelewski, S., Khan, M. N. Role of Inflammatory Risk Factors in the Pathogenesis of Streptococcus pneumoniae. Frontiers of Immunology. 9, 2275(2018).
  20. Laplante, M., Sabatini, D. M. mTOR signaling in growth control and disease. Cell. 149, 274-293 (2012).
  21. Xavier, R. J., Podolsky, D. K. Unravelling the pathogenesis of inflammatory bowel disease. Nature. 448, 427-434 (2007).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Model TNBSleczenie rapamycynąizolacja komórek Cx3cr1+analiza cytometrycznaalfa-aktyna mięśni gładkichodkładanie kolagenumagnetyczna separacja komórek (MACS)analiza cytokinWestern blot
Mechanistyczny wgląd w rozwój zwłóknienia jelit za pośrednictwem TNBS i ocena hamującego działania rapamycyny
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.