Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Generowanie zdefiniowanych modyfikacji genomowych z wykorzystaniem CRISPR-CAS9 w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych

7.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60085

⸱

25 września 2019

 ,  ,  , 
1Center for Cellular and Molecular Therapeutics, The Children's Hospital of Philadelphia, 2Department of Pathology and Laboratory Medicine, The Children's Hospital of Philadelphia, 3Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of Pennsylvania

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół zapewnia metodę ułatwiającą generowanie zdefiniowanych heterozygotycznych lub homozygotycznych zmian nukleotydowych za pomocą CRISPR-CAS9 w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych.

Streszczenie

Ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste oferują potężny system do badania funkcji genów i modelowania specyficznych mutacji związanych z chorobą. Generowanie precyzyjnych heterozygotycznych modyfikacji genetycznych jest trudne ze względu na tworzenie indel za pośrednictwem CRISPR-CAS9 w drugim allelu. W tym miejscu demonstrujemy protokół, który pomaga przezwyciężyć tę trudność, używając dwóch szablonów naprawczych, w których tylko jeden wyraża pożądaną zmianę sekwencji, podczas gdy oba szablony zawierają ciche mutacje, aby zapobiec ponownemu cięciu i tworzeniu się indel. Metodologia ta jest najbardziej korzystna dla edycji genów kodujących regiony DNA w celu wygenerowania izogenicznych linii kontrolnych i zmutowanych ludzkich komórek macierzystych do badania chorób i biologii człowieka. Ponadto przeprowadzono optymalizację metodologii transfekcji i badań przesiewowych w celu zmniejszenia nakładu pracy i kosztów eksperymentu edycji genów. Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten ma szerokie zastosowanie w wielu projektach edycji genomu z wykorzystaniem modelu ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych.

Wprowadzenie

Ludzkie embrionalne komórki macierzyste (hESC) i indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) są cennymi narzędziami do modelowania chorób ludzkich ze względu na ich zdolność do odnowy, przy jednoczesnym zachowaniu zdolności do generowania typów komórek o różnych liniach1,2,3,4. Modele te otwierają możliwość zbadania funkcji genów i zrozumienia, w jaki sposób określone mutacje i fenotypy są powiązane z różnymi chorobami5,6. Jednak, aby zrozumieć, w jaki sposób konkretna zmiana jest powiązana z określonym fenotypem, ważne jest użycie sparowanych izogenicznych linii kontrolnych i zmutowanych komórek w celu kontrolowania zmienności między liniami7,8. Nukleazy efektorowe podobne do aktywatora transkrypcji (TALEN) i nukleazy palca cynkowego zostały wykorzystane do generowania mutacji insercji lub delecji (indeli) w różnych modelach genetycznych, w tym w komórkach pierwotnych; Ale te nukleazy mogą być kłopotliwe w użyciu i drogie9,10,11,12,13,14. Odkrycie zgrupowanej, regularnie rozmieszczonej krótkiej powtórzeń palindromicznych (CRISPR)-CAS9 zrewolucjonizowało tę dziedzinę ze względu na wydajność tworzenia indel w praktycznie każdym regionie genomu, prostotę użycia i obniżenie kosztów15,16,17,18,19.

Wyzwaniem w korzystaniu z technologii edycji genomu opartej na CRISPR-CAS9 było generowanie lub korygowanie określonych mutacji w jednym allelu bez tworzenia mutacji indel w drugim allelu20. Głównym celem tego protokołu jest przezwyciężenie tego wyzwania poprzez zastosowanie dwóch jednoniciowych matryc naprawczych oligonukleotydów (ssODN) w celu zmniejszenia tworzenia się indelu w drugim allelu. Oba ssODN są zaprojektowane tak, aby zawierały ciche mutacje, aby zapobiec ponownemu cięciu przez nukleazę CAS9, ale tylko jeden zawiera zmianę będącą przedmiotem zainteresowania. Metoda ta zwiększa efektywność generowania specyficznej heterozygotycznej modyfikacji genetycznej bez indukowania tworzenia indeli w drugim allelu. Korzystając z tego protokołu, eksperymenty z edycją genów w sześciu niezależnych lokalizacjach genomowych wykazują precyzyjne wprowadzenie pożądanej zmiany genomowej w jednym allelu bez tworzenia indel w drugim allelu i zachodzi z ogólną wydajnością ~10%. Opisany protokół został zaadaptowany z Maguire et al.21.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Projektowanie i budowa przewodnika RNA (gRNA)

UWAGA: Każdy gRNA składa się z dwóch oligonukleotydów o długości 60 par zasad (bp), które są wyżarzane w celu wytworzenia dwuniciowego (ds) oligonukleotydu o gęstości 100 pz (Rysunek 1A-C). Czas na projektowanie, generowanie i testowanie wydajności cięcia gRNA wynosi około 2 tygodni (Rysunek 2).

  1. Wybierz region DNA interesujący Cię do edycji genomu i zidentyfikuj 3-4 sekwencje 23 pz, które pasują do formatu 5'-G(N19)NGG-3'. Sekwencje te powinny znajdować się w odległości nie większej niż 20 pz od obszaru zainteresowania.
    UWAGA: Celowanie można wykonać na nici sense lub anti-sense.
  2. Oceń sekwencje gRNA pod kątem redundancji genomu i prawdopodobieństwa niecelowania, korzystając z zasobu takiego jak CRISPOR (http://crispor.tefor.net).
  3. Włącz sekwencję docelową 20 pz (z wyłączeniem motywu sąsiadującego z protospacerem lub PAM) do dwóch 60-merowych oligonukleotydów, jak pokazano (sekwencje mają od 5 'do 3', a czerwony i zielony są odwrotnymi dopełniaczami, jak pokazano na Rysunek 1C).
  4. Zamów dwa oligonukleotydy 60 pz od wybranego dostawcy. Po otrzymaniu oligonukleotydów zawiesić każdy z nich do końcowego stężenia 100 μM w ddH2O. Wykonać zapas roboczy o wielkości 10 μM.
  5. Wyżarz dwa oligonukleotydy i wygeneruj fragment dsDNA o długości 100 pz za pomocą polimerazy DNA (tabela materiałów). Połączyć 5 μl oligonukleotydu 10 μM i 5 μl 10 μM odwróconego oligonukleotydu w probówce paskowej do reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) i inkubować w temperaturze 95 °C przez 5 min. Schłodzić reakcję przez 10 minut w temperaturze pokojowej (RT).
  6. Skonfiguruj PCR zgodnie z opisem w Tabeli 1. Przeprowadzić amplifikację PCR w termocyklerze, stosując parametry przedstawione w tabeli 2.
  7. Wizualizuj produkty PCR na 1,5% (w/v) bromku etydyny (EtBr) w żelu agarozowym elektroforezowanym pod napięciem 80-100 V przez 40 minut. Wytnij pasmo 100 pz (Rysunek 3A), wizualizowane na kasetonie LED, z żelu za pomocą żyletki i oczyść za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu (tabela materiałów).

2. Projektowanie starterów PCR do badań przesiewowych

  1. Wykonaj badania przesiewowe edytowanego DNA przy użyciu starterów PCR do przodu i do tyłu, które są specjalnie zaprojektowane do amplifikacji regionu 400-500 pz interesującego genu (Tabela 2). Użyj DNA wyizolowanego z dowolnej kontrolnej linii iPSC, aby potwierdzić czysty amplikon podczas wykonywania przesiewowego PCR.
  2. Wizualizacja produktów PCR na żelu 1,5% (w/v) po elektroforezie w napięciu 80-100 V przez 1 h.
    UWAGA: Sekwencjonowanie edytowanych klonów odbywa się przy użyciu zagnieżdżonego startera, który został zaprojektowany po potwierdzeniu zestawu starterów przesiewowych. Próbki są wysyłane do źródła komercyjnego w celu sekwencjonowania.

3. Przygotowanie plazmidu wektorowego gRNA_cloning

  1. Aby zlinearyzować wektor klonujący, weź probówkę wirówkową o pojemności 1,5 ml i dodaj 1-5 μg DNA wektora gRNA_cloning wraz z 4 μl buforu enzymu restrykcyjnego AflII i 1,5 μl enzymu restrykcyjnego AflII. Doprowadzić reakcję do 24 μlddH2O. Wymieszać reakcję, pipetując w górę i w dół. Inkubować w temperaturze 37 °C przez noc (O/N).
  2. Elektroforeza na 1% żelu agarozowym przy 80-100 V przez 1 h i pasma akcyzowe (przewidywana wielkość pasma to ~3519 pz).
  3. Wyodrębnij i oczyść jak w kroku 1.6.

4. Składanie wektora gRNA

  1. Ustaw reakcje i złóż fragmenty DNA za pomocą zestawu montażowego (tabela materiałów) w proporcjach 1:5 wektora klonowania gRNA strawionego AflII do oczyszczonej w żelu wstawki 100 pz, jak opisano w tabeli 3.
  2. Inkubować reakcję w temperaturze 50 °C przez 15 minut. Rozcieńczyć reakcję w stosunku 1:3 w ddH2O i użyć 3 μl do przemiany bakteryjnej, zgodnie z instrukcjami producenta (tabela materiałów). Płytki na płytkach z kanamycyną LB/agarem.
  3. Wybierz 3-5 kolonii na gRNA. Zaszczepić każdą kolonię w 4 ml LB i hodować O/N w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wytrząsaniem orbitalnym.
  4. Oczyść plazmidowe DNA za pomocą zestawu do izolacji plazmidu miniprep i zsekwencjonuj każde gRNA przy użyciu następujących starterów, aby zapewnić pomyślne klonowanie: Naprzód: GTACAAAAAAGCAGGCTTTAAAGG; Rewers: TGCCAACTTTGTACAAGAAAGCT.

5. Przetestuj skuteczność cięcia gRNA

  1. Płytki hESC na napromieniowanych mysich fibroblastach embrionalnych (MEF) w 6-dołkowej płytce, jak wcześniej opisano21. Gdy komórki osiągną 70-80% konfluencji, przygotuj główną mieszankę transfekcji opisaną w Tabeli 4.
  2. Mieszać pipetując i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Dodawać kroplami do komórek i inkubować w temperaturze 37 °C przez 48 godzin (z wymianą pożywki po 24 godzinach).
  3. Zebrać komórki do sortowania po 48 godzinach.
    1. Usunąć MEF enzymatycznie (tabela materiałów) za pomocą 3-minutowej inkubacji RT.
    2. Przepłukać komórki 1x pożywką hESC (Tabela 5) i zeskrobać do pożywki hESC + 10 μM dichlorowodorku Y-27632 (tabela materiałów).
    3. Osadzać komórki w 300 x g przez 3 minuty i ponownie zamieszać w 0,5 ml pożywki hESC + 10 μM dichlorowodorku Y-27632.
    4. Przefiltrować do probówki o pojemności 5 ml przez nasadkę z sitkiem o pojemności 35 μm.
  4. Korzystając z sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS), włącz żywe komórki i posortuj komórki dodatnie w kolorze zielonego białka fluorescencyjnego (GFP).
  5. Przenieść maksymalnie 1,5 x 104 posortowane komórki bezpośrednio do naczynia o średnicy 10cm2 pokrytego matrycą błony podstawnej w stosunku 1:3 (tabela materiałów) i napromienionych MEF w pożywce hESC (tabela 5) zawierającej dichlorowodorek Y-27632.
  6. Zmieniaj pożywkę codziennie za pomocą pożywki hESC (Tabela 5) bez dichlorowodorku Y-27632 i ręcznie wybieraj klony po 10-15 dniach, gdy kolonie mają średnicę ~1 mm.
    1. Za pomocą pipety P200 i mikroskopu ostrożnie zeskrob pojedynczy klon i wciągnij komórki do pipety.
    2. Rozproszyć komórki, delikatnie pipetując 3-4 razy w 96-dołkowej płytce w pożywce pobranej z kolonią.
    3. Dozować do probówek paskowych PCR w celu przesiewania i granulować komórki przez odwirowanie przy 10 000 x g przez 5 minut. Wybierz 20 kolonii na gRNA.

6. Pokaz klonów

  1. Wyizolować DNA przez inkubację osadów komórkowych w 20 μl buforu proteinazy K (Tabela 5) (1 h w temperaturze 55 °C i 10 min w temperaturze 95 °C) i energicznie wirować. Wirować przy 10 000 x g przez 5 minut i zebrać supernatant.
  2. Przeprowadzić przesiewową reakcję PCR (sekcja 2) w całkowitej objętości 20 μl, używając mieszanki wzorcowej zawierającej startery przeznaczone do amplifikacji obszaru zainteresowania i 5 μl trawienia proteinazy K. Użyj genomowego DNA wyizolowanego z linii komórkowej, która była edytowana genowo jako kontrola.
  3. Oceń zmiany wielkości produktów PCR po 1-godzinnej elektroforezie przy napięciu 70-90 V na 2,5% (w/v) żelu agarozowym (Rysunek 3B, C). Każda różnica w wielkości wskazuje na łupliwość.

7. Precyzyjna edycja genomu w pluripotencjalnych komórkach macierzystych przy użyciu jednoniciowego oligo DNA (ssODNs)

  1. Zaprojektuj 100 bp ssODN skoncentrowane wokół najbardziej wydajnej sekwencji gRNA, która ma najlepszą wydajność cięcia.
  2. Zapobiegaj ponownemu rozszczepieniu rekombinowanego ODN poprzez wprowadzenie cichych mutacji w sekwencji gRNA. Wystarczy pojedyncza cicha mutacja w sekwencji PAM, ale jeśli nie jest to możliwe, zadziałają 3-4 ciche mutacje.
    UWAGA: Aby ułatwić badania przesiewowe docelowych klonów, idealnym rozwiązaniem jest wprowadzenie miejsca restrykcyjnego w obrębie ~20 pz sekwencji gRNA.
  3. Zaprojektuj jeden ODN z pożądanymi zmianami zasadowymi, aby utworzyć mutację będącą przedmiotem zainteresowania i jeden ODN bez zmian zasadowych.
    UWAGA: Zmiany te nie powinny być większe niż ~20 pz od przewidywanego miejsca cięcia CRISPR/CAS9, ponieważ rekombinacja znacznie spada przy większych odległościach.
  4. Zamów dwa ssODN od wybranego dostawcy i ponownie zanurz je w wodzie, aby uzyskać zapas 1 μg/μl. Przechowywać zapasy w temperaturze -20 °C.

8. Ustawienia transfekcji

  1. Aby transfekować plazmidy ssODN i CRISPR-CAS9, należy umieścić docelową linię komórkową w 6-dołkowym naczyniu na napromieniowanych MEF-ach, aby osiągnąć 70-80% konfluencji po inkubacji O/N.
  2. Ustawić reakcję transfekcji zgodnie z opisem w tabeli 6. Wymieszać reakcję pipetując i inkubować przez 15 minut w temperaturze suchej masy. Mieszaninę reakcji transfekcji dodawać kroplami do komórek.
  3. Po 48 godzinach przygotować komórki do sortowania komórek zgodnie z opisem w sekcji 5.3.
  4. Zbieraj kolonie ~10 dni po posianiu pojedynczych komórek za pomocą pipety o pojemności 200 μl. Przenieść 100 μl komórek do jednego dołka na 24- lub 48-dołkowej płytce uprzednio pokrytej żelatyną i napromienionych MEF w pożywce hESC dichlorowodorkiem Y-27632. Pozostałe 100 μl należy wykorzystać do izolacji DNA, jak opisano w punkcie 6.

9. Sprawdzanie mutacji w pojedynczych koloniach

  1. Aby sprawdzić, czy integracja ssODN przebiegła pomyślnie, należy pobrać 5 μl DNA wyizolowanego z każdej kolonii w celu przeprowadzenia PCR przy użyciu starterów przesiewowych zaprojektowanych w sekcji 2. Oczyść produkty PCR (tabela materiałów) i przygotuj trawienie enzymem restrykcyjnym przy użyciu unikalnego miejsca enzymatycznego utworzonego w ssODN.
    UWAGA: To trawienie obejmuje również bufor enzymu restrykcyjnego i zalecane przez producenta stężenie enzymu restrykcyjnego w objętości 40 μl.
  2. Wymieszać reakcję pipetując i inkubować w temperaturze zalecanej przez producenta przez 1-3 godziny.
  3. Wizualizację strawionych produktów PCR na 1,5% (w/v) żelu agarozowym EtBr elektroforezowanym pod napięciem 80-100 V przez 40 minut. Jeśli nastąpiła pomyślna integracja ssODN, sekwencjonuj specyficzne mutacje za pomocą zagnieżdżonego startera.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Generowanie gRNA i przesiewanie pod kątem indeli

Każde gRNA zostanie sklonowane do wektora plazmidowego i wyekspresowane przy użyciu promotora U6. Do linearyzacji plazmidu (addgene #41824) wykorzystuje się enzym restrykcyjny AflII , którego miejsce cięcia znajduje się za promotorem U6. Fragment o długości 10 bp, powstały po wyżyglowaniu dwóch 60-bp oligosów, jest klonowany do wektora ekspresyjnego gRNA za pomocą metody assembly DNA. Po otrzymaniu plazmidów gRNA są one...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym protokole wykazano zastosowanie CRISPR-CAS9 wraz z dwoma matrycami naprawczymi ssODN do generowania specyficznych heterozygotycznych lub homozygotycznych zmian genomu w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych. Metoda ta pozwoliła na pomyślne wygenerowanie izogenicznych linii komórkowych wyrażających heterozygotyczne zmiany genomowe ze skutecznością bliską 10%. Protokół ten został zoptymalizowany zarówno dla ludzkich ESC, jak i iPSC hodowanych na napromieniowanych MEF-ach, które wspomagają wzrost i przeż...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez fundusze z National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI), National Institutes of Health poprzez granty U01HL099656 (P.G. i D.L.F.) oraz U01HL134696 (P.G. i D.L.F.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
5-ml polistyrenowa probówka okrągłodenna z nasadką sitkowąCorning352235
6-dołkowe naczynia do hodowli tkanek polistyrenowychCorning353046
Endonukleaza restrykcyjna AflIINew England BiolabsR0520
AgarozaVWRN605
DMEM/F12 podłożeThermoFisher11320033
dNTPsRoche11969064001
Aparat
Zestaw do ekstrakcji żeluMacherey-Nagel740609
Zestaw montażowy GibsonaNew England BiolabsE2611
gRNA_Cloning VectorAddgene41824
LB Płytki agarowe zawierające 50 μ g/ml kanamycyny
Lipofektamina Odczynnik macierzystyThermoFisher(STEM00001)
Matrigel Czynnik wzrostu o zmniejszonej wartości (GFR)Corning354230
Mysie fibroblasty embrionalne (MEF)
Ekstrakcja żelu nukleospinowego i zestaw do czyszczenia PCR740609Macherey-Nagel
Inkubator z wytrząsaniem orbitalnym
pCas9_GFP wektorAddgene44719
Probówki paskowe do PCRUSA Scientific1402-2900
Phusion Polimeraza DNA o wysokiej wierności i 5 razy; Bufor PhusionNew England BiolabsM0530
PurelinkTM Szybki zestaw minipreparatu plazmiduInvitrogenK210011
Proteinaza KQiagen Qiagen19133
StellarTM elektrokompetentne komórki Escherichia coliTakara636763
SOC PożywkaNew England BiolabsB9020S
Enzym ekspresowy TrypLEThermoFisher12605036
Y-27632 dichlorowodorek/inhibitor ROCK (ROCKi)Tocris1254
do sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS)

Bibliografia

  1. Srivastava, D., Dewitt, N. Review In Vivo Cellular Reprogramming: The Next Generation. Cell. 166 (6), 1386-1396 (2016).
  2. Clevers, H. Review Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  3. Murry, C. E., Keller, G. Differentiation of Embryonic Stem Cells to Relevant Populations: Lessons from Embryonic Development. Cell. 132 (4), 661-680 (2008).
  4. Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond. Development. 145 (5), 1-6 (2018).
  5. Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (3), 170-182 (2016).
  6. Tiyaboonchai, A., et al. GATA6 Plays an Important Role in the Induction of Human Definitive Endoderm, Development of the Pancreas, and Functionality of Pancreatic β Cells. Stem Cell Reports. 8 (3), 589-604 (2017).
  7. Guo, M., et al. Using hESCs to Probe the Interaction of the Diabetes-Associated Genes CDKAL1 and MT1E. Cell Reports. 19 (8), 1512-1521 (2017).
  8. Zeng, H., et al. An Isogenic Human ESC Platform for Functional Evaluation of Genome-wide-Association-Study-Identified Diabetes Genes and Drug Discovery. Cell Stem Cell. 19 (3), 326-340 (2016).
  9. Wang, Y., et al. Genome editing of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells with zinc finger nucleases for cellular imaging. Circulation Research. 111, 1494-1503 (2012).
  10. Xue, H., Wu, J., Li, S., Rao, M. S., Liu, Y. Genetic Modification in Human Pluripotent Stem Cells by Homologous Recombination and CRISPR/Cas9 System. Methods in Molecular Biology. 1307, 173-190 (2014).
  11. Huang, X., et al. Production of gene-corrected adult beta globin protein in human erythrocytes differentiated from patient iPSCs after genome editing of the sickle point mutation. Stem Cells. 33 (5), 1470-1479 (2015).
  12. Wang, X., et al. Unbiased detection of off-target cleavage by CRISPR-Cas9 and TALENs using integrase-defective lentiviral vectors. Nature Biotechnology. 33 (2), 175-178 (2015).
  13. Sim, X., Cardenas-Diaz, F. L., French, D. L., Gadue, P. A Doxycycline-Inducible System for Genetic Correction of iPSC Disease Models. Methods in Molecular Biology. 1353, 13-23 (2015).
  14. Hockemeyer, D., Jaenisch, R. Review Induced Pluripotent Stem Cells Meet Genome Editing. Stem Cell. 18 (5), 573-586 (2016).
  15. Byrne, S. M., Mali, P., Church, G. M. Genome editing in human stem cells. Methods in Enzymology. 546, 119-138 (2014).
  16. Zhu, Z., González, F., Huangfu, D. The iCRISPR platform for rapid genome editing in human pluripotent stem cells. Methods in Enzymology. 546, 215-250 (2014).
  17. Hou, Z., et al. Efficient genome engineering in human pluripotent stem cells using Cas9 from Neisseria meningitidis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (39), 15644-15649 (2013).
  18. Cong, L., Zhang, F. Genome engineering using CRISPR-Cas9 system. Methods in Molecular Biology. 1239, Clifton, N.J. 197-217 (2015).
  19. Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. Cas9 as a versatile tool for engineering biology. Nature Methods. 10 (10), 957-963 (2013).
  20. Richardson, C. D., Ray, G. J., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. Enhancing homology directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA. Nature Biotechnology. 34 (3), 339-344 (2016).
  21. Maguire, J. A., Cardenas-Diaz, F. L., Gadue, P., French, D. L. Highly efficient crispr cas9-mediated genome editing in human pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 48 (1), 64(2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Edycja genówizogeniczne linie komórkowemutacje heterozygotycznematryce naprawczeoptymalizacja transfekcjiselekcja koloniisortowanie komórek aktywowane fluorescencjątrawienie enzymami restrykcyjnymi
Generowanie zdefiniowanych modyfikacji genomowych z wykorzystaniem CRISPR-CAS9 w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.