Generowanie zdefiniowanych modyfikacji genomowych z wykorzystaniem CRISPR-CAS9 w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych

Summary

Ten protokół zapewnia metodę ułatwiającą generowanie zdefiniowanych heterozygotycznych lub homozygotycznych zmian nukleotydowych za pomocą CRISPR-CAS9 w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych.

Abstract

Ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste oferują potężny system do badania funkcji genów i modelowania specyficznych mutacji związanych z chorobą. Generowanie precyzyjnych heterozygotycznych modyfikacji genetycznych jest trudne ze względu na tworzenie indel za pośrednictwem CRISPR-CAS9 w drugim allelu. W tym miejscu demonstrujemy protokół, który pomaga przezwyciężyć tę trudność, używając dwóch szablonów naprawczych, w których tylko jeden wyraża pożądaną zmianę sekwencji, podczas gdy oba szablony zawierają ciche mutacje, aby zapobiec ponownemu cięciu i tworzeniu się indel. Metodologia ta jest najbardziej korzystna dla edycji genów kodujących regiony DNA w celu wygenerowania izogenicznych linii kontrolnych i zmutowanych ludzkich komórek macierzystych do badania chorób i biologii człowieka. Ponadto przeprowadzono optymalizację metodologii transfekcji i badań przesiewowych w celu zmniejszenia nakładu pracy i kosztów eksperymentu edycji genów. Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten ma szerokie zastosowanie w wielu projektach edycji genomu z wykorzystaniem modelu ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych.

Introduction

Ludzkie embrionalne komórki macierzyste (hESC) i indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) są cennymi narzędziami do modelowania chorób ludzkich ze względu na ich zdolność do odnowy, przy jednoczesnym zachowaniu zdolności do generowania typów komórek o różnych liniach1^,2,3,4. Modele te otwierają możliwość zbadania funkcji genów i zrozumienia, w jaki sposób określone mutacje i fenotypy są powiązane z różnymi chorobami^5,6. Jednak, aby zrozumieć, w jaki sposób konkretna zmiana jest powiązana z określonym fenotypem, ważne jest użycie sparowanych izogenicznych linii kontrolnych i zmutowanych komórek w celu kontrolowania zmienności między liniami^7,8. Nukleazy efektorowe podobne do aktywatora transkrypcji (TALEN) i nukleazy palca cynkowego zostały wykorzystane do generowania mutacji insercji lub delecji (indeli) w różnych modelach genetycznych, w tym w komórkach pierwotnych; Ale te nukleazy mogą być kłopotliwe w użyciu i drogie9^{,10,11,12,13,14}. Odkrycie zgrupowanej, regularnie rozmieszczonej krótkiej powtórzeń palindromicznych (CRISPR)-CAS9 zrewolucjonizowało tę dziedzinę ze względu na wydajność tworzenia indel w praktycznie każdym regionie genomu, prostotę użycia i obniżenie kosztów^{15,16,17,18,19}.

Wyzwaniem w korzystaniu z technologii edycji genomu opartej na CRISPR-CAS9 było generowanie lub korygowanie określonych mutacji w jednym allelu bez tworzenia mutacji indel w drugim allelu²⁰. Głównym celem tego protokołu jest przezwyciężenie tego wyzwania poprzez zastosowanie dwóch jednoniciowych matryc naprawczych oligonukleotydów (ssODN) w celu zmniejszenia tworzenia się indelu w drugim allelu. Oba ssODN są zaprojektowane tak, aby zawierały ciche mutacje, aby zapobiec ponownemu cięciu przez nukleazę CAS9, ale tylko jeden zawiera zmianę będącą przedmiotem zainteresowania. Metoda ta zwiększa efektywność generowania specyficznej heterozygotycznej modyfikacji genetycznej bez indukowania tworzenia indeli w drugim allelu. Korzystając z tego protokołu, eksperymenty z edycją genów w sześciu niezależnych lokalizacjach genomowych wykazują precyzyjne wprowadzenie pożądanej zmiany genomowej w jednym allelu bez tworzenia indel w drugim allelu i zachodzi z ogólną wydajnością ~10%. Opisany protokół został zaadaptowany z Maguire et al.²¹.

Protocol

1. Projektowanie i budowa przewodnika RNA (gRNA)

UWAGA: Każdy gRNA składa się z dwóch oligonukleotydów o długości 60 par zasad (bp), które są wyżarzane w celu wytworzenia dwuniciowego (ds) oligonukleotydu o gęstości 100 pz (Rysunek 1A-C). Czas na projektowanie, generowanie i testowanie wydajności cięcia gRNA wynosi około 2 tygodni (Rysunek 2).

1. Wybierz region DNA interesujący Cię do edycji genomu i zidentyfikuj 3-4 sekwencje 23 pz, które pasują do formatu 5'-G(N₁₉)NGG-3'. Sekwencje te powinny znajdować się w odległości nie większej niż 20 pz od obszaru zainteresowania.
   UWAGA: Celowanie można wykonać na nici sense lub anti-sense.
2. Oceń sekwencje gRNA pod kątem redundancji genomu i prawdopodobieństwa niecelowania, korzystając z zasobu takiego jak CRISPOR (http://crispor.tefor.net).
3. Włącz sekwencję docelową 20 pz (z wyłączeniem motywu sąsiadującego z protospacerem lub PAM) do dwóch 60-merowych oligonukleotydów, jak pokazano (sekwencje mają od 5 'do 3', a czerwony i zielony są odwrotnymi dopełniaczami, jak pokazano na Rysunek 1C).
4. Zamów dwa oligonukleotydy 60 pz od wybranego dostawcy. Po otrzymaniu oligonukleotydów zawiesić każdy z nich do końcowego stężenia 100 μM w ddH₂O. Wykonać zapas roboczy o wielkości 10 μM.
5. Wyżarz dwa oligonukleotydy i wygeneruj fragment dsDNA o długości 100 pz za pomocą polimerazy DNA (tabela materiałów). Połączyć 5 μl oligonukleotydu 10 μM i 5 μl 10 μM odwróconego oligonukleotydu w probówce paskowej do reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) i inkubować w temperaturze 95 °C przez 5 min. Schłodzić reakcję przez 10 minut w temperaturze pokojowej (RT).
6. Skonfiguruj PCR zgodnie z opisem w Tabeli 1. Przeprowadzić amplifikację PCR w termocyklerze, stosując parametry przedstawione w tabeli 2.
7. Wizualizuj produkty PCR na 1,5% (w/v) bromku etydyny (EtBr) w żelu agarozowym elektroforezowanym pod napięciem 80-100 V przez 40 minut. Wytnij pasmo 100 pz (Rysunek 3A), wizualizowane na kasetonie LED, z żelu za pomocą żyletki i oczyść za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu (tabela materiałów).

2. Projektowanie starterów PCR do badań przesiewowych

1. Wykonaj badania przesiewowe edytowanego DNA przy użyciu starterów PCR do przodu i do tyłu, które są specjalnie zaprojektowane do amplifikacji regionu 400-500 pz interesującego genu (Tabela 2). Użyj DNA wyizolowanego z dowolnej kontrolnej linii iPSC, aby potwierdzić czysty amplikon podczas wykonywania przesiewowego PCR.
2. Wizualizacja produktów PCR na żelu 1,5% (w/v) po elektroforezie w napięciu 80-100 V przez 1 h.
   UWAGA: Sekwencjonowanie edytowanych klonów odbywa się przy użyciu zagnieżdżonego startera, który został zaprojektowany po potwierdzeniu zestawu starterów przesiewowych. Próbki są wysyłane do źródła komercyjnego w celu sekwencjonowania.

3. Przygotowanie plazmidu wektorowego gRNA_cloning

1. Aby zlinearyzować wektor klonujący, weź probówkę wirówkową o pojemności 1,5 ml i dodaj 1-5 μg DNA wektora gRNA_cloning wraz z 4 μl buforu enzymu restrykcyjnego AflII i 1,5 μl enzymu restrykcyjnego AflII. Doprowadzić reakcję do 24 μl_ddH2O. Wymieszać reakcję, pipetując w górę i w dół. Inkubować w temperaturze 37 °C przez noc (O/N).
2. Elektroforeza na 1% żelu agarozowym przy 80-100 V przez 1 h i pasma akcyzowe (przewidywana wielkość pasma to ~3519 pz).
3. Wyodrębnij i oczyść jak w kroku 1.6.

4. Składanie wektora gRNA

1. Ustaw reakcje i złóż fragmenty DNA za pomocą zestawu montażowego (tabela materiałów) w proporcjach 1:5 wektora klonowania gRNA strawionego AflII do oczyszczonej w żelu wstawki 100 pz, jak opisano w tabeli 3.
2. Inkubować reakcję w temperaturze 50 °C przez 15 minut. Rozcieńczyć reakcję w stosunku 1:3 w ddH₂O i użyć 3 μl do przemiany bakteryjnej, zgodnie z instrukcjami producenta (tabela materiałów). Płytki na płytkach z kanamycyną LB/agarem.
3. Wybierz 3-5 kolonii na gRNA. Zaszczepić każdą kolonię w 4 ml LB i hodować O/N w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wytrząsaniem orbitalnym.
4. Oczyść plazmidowe DNA za pomocą zestawu do izolacji plazmidu miniprep i zsekwencjonuj każde gRNA przy użyciu następujących starterów, aby zapewnić pomyślne klonowanie: Naprzód: GTACAAAAAAGCAGGCTTTAAAGG; Rewers: TGCCAACTTTGTACAAGAAAGCT.

5. Przetestuj skuteczność cięcia gRNA

1. Płytki hESC na napromieniowanych mysich fibroblastach embrionalnych (MEF) w 6-dołkowej płytce, jak wcześniej opisano²¹. Gdy komórki osiągną 70-80% konfluencji, przygotuj główną mieszankę transfekcji opisaną w Tabeli 4.
2. Mieszać pipetując i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Dodawać kroplami do komórek i inkubować w temperaturze 37 °C przez 48 godzin (z wymianą pożywki po 24 godzinach).
3. Zebrać komórki do sortowania po 48 godzinach.
   1. Usunąć MEF enzymatycznie (tabela materiałów) za pomocą 3-minutowej inkubacji RT.
   2. Przepłukać komórki 1x pożywką hESC (Tabela 5) i zeskrobać do pożywki hESC + 10 μM dichlorowodorku Y-27632 (tabela materiałów).
   3. Osadzać komórki w 300 x g przez 3 minuty i ponownie zamieszać w 0,5 ml pożywki hESC + 10 μM dichlorowodorku Y-27632.
   4. Przefiltrować do probówki o pojemności 5 ml przez nasadkę z sitkiem o pojemności 35 μm.
4. Korzystając z sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS), włącz żywe komórki i posortuj komórki dodatnie w kolorze zielonego białka fluorescencyjnego (GFP).
5. Przenieść maksymalnie 1,5 x 10⁴ posortowane komórki bezpośrednio do naczynia o średnicy 10^cm2 pokrytego matrycą błony podstawnej w stosunku 1:3 (tabela materiałów) i napromienionych MEF w pożywce hESC (tabela 5) zawierającej dichlorowodorek Y-27632.
6. Zmieniaj pożywkę codziennie za pomocą pożywki hESC (Tabela 5) bez dichlorowodorku Y-27632 i ręcznie wybieraj klony po 10-15 dniach, gdy kolonie mają średnicę ~1 mm.
   1. Za pomocą pipety P200 i mikroskopu ostrożnie zeskrob pojedynczy klon i wciągnij komórki do pipety.
   2. Rozproszyć komórki, delikatnie pipetując 3-4 razy w 96-dołkowej płytce w pożywce pobranej z kolonią.
   3. Dozować do probówek paskowych PCR w celu przesiewania i granulować komórki przez odwirowanie przy 10 000 x g przez 5 minut. Wybierz 20 kolonii na gRNA.

6. Pokaz klonów

1. Wyizolować DNA przez inkubację osadów komórkowych w 20 μl buforu proteinazy K (Tabela 5) (1 h w temperaturze 55 °C i 10 min w temperaturze 95 °C) i energicznie wirować. Wirować przy 10 000 x g przez 5 minut i zebrać supernatant.
2. Przeprowadzić przesiewową reakcję PCR (sekcja 2) w całkowitej objętości 20 μl, używając mieszanki wzorcowej zawierającej startery przeznaczone do amplifikacji obszaru zainteresowania i 5 μl trawienia proteinazy K. Użyj genomowego DNA wyizolowanego z linii komórkowej, która była edytowana genowo jako kontrola.
3. Oceń zmiany wielkości produktów PCR po 1-godzinnej elektroforezie przy napięciu 70-90 V na 2,5% (w/v) żelu agarozowym (Rysunek 3B, C). Każda różnica w wielkości wskazuje na łupliwość.

7. Precyzyjna edycja genomu w pluripotencjalnych komórkach macierzystych przy użyciu jednoniciowego oligo DNA (ssODNs)

1. Zaprojektuj 100 bp ssODN skoncentrowane wokół najbardziej wydajnej sekwencji gRNA, która ma najlepszą wydajność cięcia.
2. Zapobiegaj ponownemu rozszczepieniu rekombinowanego ODN poprzez wprowadzenie cichych mutacji w sekwencji gRNA. Wystarczy pojedyncza cicha mutacja w sekwencji PAM, ale jeśli nie jest to możliwe, zadziałają 3-4 ciche mutacje.
   UWAGA: Aby ułatwić badania przesiewowe docelowych klonów, idealnym rozwiązaniem jest wprowadzenie miejsca restrykcyjnego w obrębie ~20 pz sekwencji gRNA.
3. Zaprojektuj jeden ODN z pożądanymi zmianami zasadowymi, aby utworzyć mutację będącą przedmiotem zainteresowania i jeden ODN bez zmian zasadowych.
   UWAGA: Zmiany te nie powinny być większe niż ~20 pz od przewidywanego miejsca cięcia CRISPR/CAS9, ponieważ rekombinacja znacznie spada przy większych odległościach.
4. Zamów dwa ssODN od wybranego dostawcy i ponownie zanurz je w wodzie, aby uzyskać zapas 1 μg/μl. Przechowywać zapasy w temperaturze -20 °C.

8. Ustawienia transfekcji

1. Aby transfekować plazmidy ssODN i CRISPR-CAS9, należy umieścić docelową linię komórkową w 6-dołkowym naczyniu na napromieniowanych MEF-ach, aby osiągnąć 70-80% konfluencji po inkubacji O/N.
2. Ustawić reakcję transfekcji zgodnie z opisem w tabeli 6. Wymieszać reakcję pipetując i inkubować przez 15 minut w temperaturze suchej masy. Mieszaninę reakcji transfekcji dodawać kroplami do komórek.
3. Po 48 godzinach przygotować komórki do sortowania komórek zgodnie z opisem w sekcji 5.3.
4. Zbieraj kolonie ~10 dni po posianiu pojedynczych komórek za pomocą pipety o pojemności 200 μl. Przenieść 100 μl komórek do jednego dołka na 24- lub 48-dołkowej płytce uprzednio pokrytej żelatyną i napromienionych MEF w pożywce hESC dichlorowodorkiem Y-27632. Pozostałe 100 μl należy wykorzystać do izolacji DNA, jak opisano w punkcie 6.

9. Sprawdzanie mutacji w pojedynczych koloniach

1. Aby sprawdzić, czy integracja ssODN przebiegła pomyślnie, należy pobrać 5 μl DNA wyizolowanego z każdej kolonii w celu przeprowadzenia PCR przy użyciu starterów przesiewowych zaprojektowanych w sekcji 2. Oczyść produkty PCR (tabela materiałów) i przygotuj trawienie enzymem restrykcyjnym przy użyciu unikalnego miejsca enzymatycznego utworzonego w ssODN.
   UWAGA: To trawienie obejmuje również bufor enzymu restrykcyjnego i zalecane przez producenta stężenie enzymu restrykcyjnego w objętości 40 μl.
2. Wymieszać reakcję pipetując i inkubować w temperaturze zalecanej przez producenta przez 1-3 godziny.
3. Wizualizację strawionych produktów PCR na 1,5% (w/v) żelu agarozowym EtBr elektroforezowanym pod napięciem 80-100 V przez 40 minut. Jeśli nastąpiła pomyślna integracja ssODN, sekwencjonuj specyficzne mutacje za pomocą zagnieżdżonego startera.

Results

Generowanie gRNA i badania przesiewowe w kierunku indeli

Każdy gRNA zostanie sklonowany do wektora plazmidowego i poddany ekspresji za pomocą promotora U6. Enzym restrykcyjny AflII jest używany do linearyzacji plazmidu (addgene #41824) i znajduje się za promotorem U6. Pasmo 100 pz powstałe po wyżarzaniu dwóch oligonukleotydów o długości 60 pz klonuje się do wektora ekspresyjnego gRNA za pomocą zestawu DNA. Po wygenerowaniu plazmidów gRNA są one transfekowane do hESC l...

Discussion

W tym protokole wykazano zastosowanie CRISPR-CAS9 wraz z dwoma matrycami naprawczymi ssODN do generowania specyficznych heterozygotycznych lub homozygotycznych zmian genomu w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych. Metoda ta pozwoliła na pomyślne wygenerowanie izogenicznych linii komórkowych wyrażających heterozygotyczne zmiany genomowe ze skutecznością bliską 10%. Protokół ten został zoptymalizowany zarówno dla ludzkich ESC, jak i iPSC hodowanych na napromieniowanych MEF-ach, które wspomagają wzrost i przeż...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-ml polistyrenowa probówka okrągłodenna z nasadką sitkową	Corning	352235
6-dołkowe naczynia do hodowli tkanek polistyrenowych	Corning	353046
Endonukleaza restrykcyjna AflII	New England Biolabs	R0520
Agaroza	VWR	N605
DMEM/F12 podłoże	ThermoFisher	11320033
dNTPs	Roche	11969064001
Aparat
Zestaw do ekstrakcji żelu	Macherey-Nagel	740609
Zestaw montażowy Gibsona	New England Biolabs	E2611
gRNA_Cloning Vector	Addgene	41824
LB Płytki agarowe zawierające 50 μ g/ml kanamycyny
Lipofektamina Odczynnik macierzysty	ThermoFisher	(STEM00001)
Matrigel Czynnik wzrostu o zmniejszonej wartości (GFR)	Corning	354230
Mysie fibroblasty embrionalne (MEF)
Ekstrakcja żelu nukleospinowego i zestaw do czyszczenia PCR	740609		Macherey-Nagel
Inkubator z wytrząsaniem orbitalnym
pCas9_GFP wektor	Addgene	44719
Probówki paskowe do PCR	USA Scientific	1402-2900
Phusion Polimeraza DNA o wysokiej wierności i 5 razy; Bufor Phusion	New England Biolabs	M0530
PurelinkTM Szybki zestaw minipreparatu plazmidu	Invitrogen	K210011
Proteinaza K	Qiagen Qiagen	19133
StellarTM elektrokompetentne komórki Escherichia coli	Takara	636763
SOC Pożywka	New England Biolabs	B9020S
Enzym ekspresowy TrypLE	ThermoFisher	12605036
Y-27632 dichlorowodorek/inhibitor ROCK (ROCKi)	Tocris	1254