Artykuł metodologiczny

Izolacja nienaruszonej gałki ocznej w celu uzyskania integralnej tkanki powierzchni oka do badania histologicznego i immunohistochemii

8.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60086

⸱

20 października 2019

 , 
1State Key Laboratory of Ophthalmology, Zhongshan Ophthalmic Center, Sun Yat-sen University

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje metodę izolacji gałki ocznej myszy z powieką, powierzchnią oka, przednimi i tylnymi segmentami w względnie nienaruszonej pozycji.

Streszczenie

Powierzchnia oka (OS) składa się z arkusza nabłonka z trzema połączonymi częściami: spojówką powiekową, spojówką opuszkową i nabłonkiem rogówki. Zaburzenie OS prowadziłoby do zapalenia rogówki, zapalenia spojówek lub obu tych rodzajów (zapalenie rogówki i spojówki). W eksperymentalnych modelach zwierzęcych z pewnymi modyfikacjami genetycznymi lub sztucznymi operacjami przydatne jest zbadanie wszystkich części arkusza nabłonka OS w celu oceny względnych zmian patogenetycznych każdej części równolegle. Jednak sekcja tkanki OS jako całości bez zniekształceń lub uszkodzeń była wyzwaniem, przede wszystkim ze względu na miękkość i cienkość OS przymocowanego do fizycznie oddzielonych, ale ruchomych powiek i gałki ocznej. Dodatkowo głęboki oczodół utworzony przez twardą czaszkę/kości oczodołu jest w całości zajęty przez gałkę oczną, pozostawiając ograniczoną przestrzeń do wykonywania sekcji operacyjnych. W rezultacie, bezpośrednie rozwarstwienie gałki ocznej wraz z powiązanymi tkankami OS od strony twarzy często prowadziłoby do uszkodzeń tkanek, zwłaszcza powiekowej i opuszkowej spojówki. W tym protokole opisaliśmy metodę sekwencyjnego usuwania czaszki i kości oczodołu z przeciętej na pół głowy myszy, pozostawiając powieki, powierzchnię oka, soczewkę i siatkówkę całkowicie w jednym kawałku. Integralność arkusza OS była dobrze zachowana i mogła być badana za pomocą histologii lub barwienia immunologicznego w jednym przekroju.

Wprowadzenie

Powierzchnia oka składa się z ciągłego arkusza regionalnego nabłonka, w tym spojówki powiekowej, spojówki opuszkowej i rogówki1. Wiele struktur gruczołowych jest związanych z nabłonkiem powierzchni oka i razem tworzą warstwę filmu łzowego chroniącego powierzchnię rogówki przed wysuszeniem i inwazją środowiska2. Zaburzenie OS prowadziłoby do zapalenia rogówki, zapalenia spojówek lub obu tych rodzajów (zapalenie rogówki i spojówki). Zarówno czynniki genetyczne, jak i drażniące środowisko lub ich interakcje przyczyniają się do patologicznych zmian w OS3,4. W związku z tym do badania procesów chorobowych ludzkiego systemu operacyjnego wykorzystano szereg genetycznie zmodyfikowanych i fizycznie lub chemicznie indukowanych modeli zwierzęcych.

Struktura i funkcja systemu operacyjnego myszy jest pod wieloma względami podobna do ludzkiej. Składniki filmu łzowego wydzielane przez gruczoły oczne są również podobne u myszy i ludzi. Przeprowadzono wiele badań z wykorzystaniem modeli mysich w celu wyjaśnienia mechanizmów chorób ludzkiego systemu operacyjnego5,6,7. W wielu przypadkach kluczowe znaczenie ma analiza globalnych, a nie lokalnych zmian molekularnych OS w celu uzyskania wyczerpujących informacji w ramach tego samego leczenia eksperymentalnego. W związku z tym konieczne jest przygotowanie próbki z dobrą integralnością, aby zapewnić, że każda część systemu operacyjnego będzie analizowana jednocześnie.

Mysi system operacyjny ściśle kojarzy się z gałką oczną, która była osadzona w oczodole/oczodole (kościsty kubek wykonany z kilku różnych kości czaszki) i łączy się z nim za pomocą cienkich tkanek łącznych. Istnieje ogromne wyzwanie związane z wypreparowaniem całej powierzchni oka bez uszkodzenia spojówki powiekowej lub opuszkowej. Wyzwania te wynikają z: (i) system operacyjny jest miękki i cienki oraz przymocowany do fizycznie oddzielonych, ale ruchomych powiek i gałki ocznej, a zatem podatny na zniekształcenia i uszkodzenia; oraz (ii) ograniczona przestrzeń między kośćmi oczodołu a gałką oczną ogranicza operacje preparacji. Wyzwania są znacznie większe dla dorosłej myszy. U myszy embrionalnej kostnienie kości oczodołu nie jest całkowite, a otaczające tkanki są względnie luźne8. Głowę można zdjąć i przeciąć na pół, a następnie bezpośrednio poddać utrwalaniu paraformaldehydu (PFA) i osadzaniu9. Natomiast kości oczodołowe myszy po urodzeniu i u dorosłych myszy są w pełni skostniałe z grubymi otaczającymi tkankami, co sprawia, że penetracja utrwalaczy jest mniej wydajna. Ponadto kości oczodołu/czaszki są twarde i łamliwe, łatwo się łamią podczas krojenia ich w miękkie związki osadzające, takie jak parafina. Złamane kawałki kości jednogłośnie rozerwą pobliskie tkanki, powodując gorszą morfologię tkanek.

Wiele opublikowanych badań często wykazywało częściową powierzchnię oka, co może być wystarczające dla ich szczególnych celów badawczych10,11. Gruntowne badanie literatury wykazało tylko kilka badań pokazujących całą nienaruszoną powierzchnię oka bez szczegółowego opisu protokołów sekcji12,13. W tym protokole szczegółowo opisaliśmy metodę preparacji w celu uzyskania integralnej poporodowej powierzchni oka, w której kości oczodołu i czaszki zostały uporządkowanie usunięte, pozostawiając nietkniętą powierzchnię oka wraz z gałką oczną i powiekami, minimalizując uszkodzenia fizyczne. Następnie zbadaliśmy histologię OS i przeprowadziliśmy immunohistochemię przy użyciu skrawków tkanek przygotowanych za pomocą tego protokołu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury związane z wykorzystaniem myszy zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Centrum Okulistycznego Zhongshan i przestrzegały Oświadczenia ARVO dotyczącego wykorzystania zwierząt w badaniach okulistycznych i wzrokowych.

1. Sekcja gałki ocznej z nienaruszoną powierzchnią oka i powiekami

  1. Rozetnij głowę.
    1. Poddaj eutanazji myszy w 10. dniu po urodzeniu (P10) i P28 (patrz Tabela materiałów dla szczepów myszy) przez zwichnięcie szyjki macicy, odetnij głowę od szyi za pomocą ostrych nożyczek.
    2. Przeciąć głowę na pół parą prostych nożyczek wzdłuż strzałkowej linii środkowej, zaczynając od kości międzyciemieniowej rostrycznie do nosa (Rysunek 1A,B).
      UWAGA: Kość czaszki twardnieje wraz ze starzeniem się myszy, należy uważać, aby nożyczki cięły wzdłuż linii środkowej tak bardzo, jak to możliwe.
    3. Umieść każdą połówkę przeciętej na pół głowy na czystej szalce Petriego, najpierw odetnij szczękę i język ostrymi nożyczkami. Uwolnij nerw wzrokowy, odcinając go od mózgu przed lokalizacją skrzyżowania wzrokowego i usuń wszystkie tkanki mózgowe, w tym opuszkę węchową przyczepioną do ściany czaszki.
    4. Teraz pozostałe tkanki powinny mieć wszystkie kości czaszki/oczodołu związane z gałką oczną (Rysunek 1C,D). Umyj pozostałą część PBS, aby usunąć krew i resztki włosów.
    5. Przedrostek tkanek z 4% paraformaldehydem (PFA, w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanem [PBS], pH 7,4) w stożkowej probówce o pojemności 50 ml w temperaturze pokojowej (RT) z rotacją. Przybliżony czas utrwalenia jest następujący: ~10 min dla P0 do P7; ~20 min dla P8 do P28; i ~30 min dla P29 i starszych.
      UWAGA: Prefiksacja zapewnia sztywność tkanki, co ułatwia późniejsze rozwarstwienie. Dodatkowo, prefiksacja pozwala uniknąć pozostawiania świeżej tkanki nieutrwalonej zbyt długo przed zakończeniem sekcji.
      UWAGA: PFA jest niebezpieczny i należy obchodzić się z nim ostrożnie.
  2. Usuń czaszkę/kości oczodołu.
    1. Po prefiksacji szybko umyj wypreparowaną głowę w PBS trzy razy, aby jeszcze bardziej wyeliminować złamane włoski i utrwalacze, aby przystąpić do dalszej sekcji.
      UWAGA: Narażenie na utrwalacze podczas sekcji może być szkodliwe dla zdrowia.
    2. Umieść tkankę na 10 cm szalce Petriego, przetnij czaszkę na trzy części wzdłuż płaszczyzn wskazanych w Rysunek 1D,E. Gałka oczna w oczodole jest ukryta w środkowej części czaszki pod kośćmi sitowymi, czołowymi i szczękowymi (Ryc. 1D,E).
    3. Użyj dwóch par kleszczy prostych nr 4, aby odkleić kość sitową, aby w pełni odsłonić kości czołowe i szczękowe (Ryc. 1F).
    4. Geograficznie podziel powierzchnię czaszki (w tym kości szczękowe i czołowe) na 4 obszary (Rysunek 1F). Włóż końcówkę zakrzywionych kleszczy poziomo w każdy obszar, aby kolejno usunąć kości szczęki i czołowe (Rysunek 1F).
      UWAGA: Nie można usunąć wszystkich kości szczęki za jednym razem. Cierpliwie analizuj je kawałek po kawałku. Kość czołowa jest bezpośrednio połączona z gałką oczną poprzez miękkie tkanki łączne. Zachowaj ostrożność podczas wyjmowania go z gałki ocznej, aby zapobiec rozciąganiu gałki ocznej i uszkodzeniu spojówki.
    5. Po usunięciu częściowej kości szczęki i całej kości czołowej, leżące poniżej kości łzowe i szyjne zostałyby odsłonięte (Rysunek 1G). Usuń dwie kości i związane z nimi podskórne mięśnie i tłuszcze otaczające gałkę oczną, przytnij gałkę oczną z dołączonymi powiekami i skórą w mały kwadratowy blok, aby zmniejszyć objętość tkanki i ułatwić orientację tkanki podczas osadzania (Rysunek 1H).
    6. Umieść gałkę oczną i związane z nią tkanki z powrotem w 4% PFA i kontynuuj utrwalanie przez noc w temperaturze 4 °C. Utrwalona tkanka może być przechowywana przez co najmniej jeden miesiąc w temperaturze 4 °C w PBS z dodatkiem 0,02% NaN3. Alternatywnie natychmiast przystąp do analizy histologicznej.
      UWAGA: Jeśli tkanka musi być przechowywana przez dłuższy czas, można ją łatwo przechowywać w 70% etanolu.

2. Analiza histologiczna

  1. Wycinek parafinowy i barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E)
    1. Postępuj zgodnie ze standardowym protokołem opisanym gdzie indziej9, aby wykonać zatapianie i cięcie parafiny.
  2. Immunohistochemia (IHC)
    1. Odparafinować skrawki parafiny ksylenem i ponownie uwodnić skrawki za pomocą serii alkoholowych (100%, 95%, 80%) do wody destylowanej (dH2O).
    2. Przeprowadzić pobieranie antygenu przez obróbkę mikrofalową szkiełek tkankowych w 0,01 M buforze kwasu cytrynowego (3 g cytrynianu trisodowego, 0,4 g kwasu cytrynowego na 1 l podwójnie destylowanegoH2O) w szklanym szkiełku o niskiej mocy (120 W). Energia powinna być dostarczana z przerwami przez łącznie 5-10 minut, przy czym każda przerwa trwa około 2 minut.
      UWAGA: Mikrofale o dużej mocy lub stałe podgrzewanie doprowadziłoby do oderwania się skrawków tkanki od szkiełka.
    3. Wyjmij szkiełka ze szklanego słoika, ostrożnie zetrzyj resztki płynu otaczającego każdą sekcję za pomocą chusteczek do twarzy i umieść je na stojaku na szkiełka w pudełku histologicznym. Narysuj kwadrat wokół każdej sekcji wodoodpornym pisakiem histologicznym. Umieścić 100 μl buforu blokującego (0,1% triton X-100 i 10% surowicy osła w 1x PBS) na każdym kwadracie i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
    4. Ostrożnie usunąć roztwór blokujący za pomocą próżni, dodać przeciwciało pierwszorzędowe (patrz tabela materiałów) z pożądanym rozcieńczeniem w buforze blokującym i kontynuować inkubację szkiełek w temperaturze 4 °C przez 24 godziny lub dłużej.
      UWAGA: Stężenie każdego przeciwciała pierwszorzędowego stosowanego w IHC jest różne i musi być testowane w eksperymentach pilotażowych.
    5. Umyj szkiełka tkankowe PBST (0,1% Triton w PBS) trzy razy, po 10 minut każde. Powtórzyć krok 2.2.4, stosując przeciwciało drugorzędowe (patrz tabela materiałów) wraz z 4',6-diamidyno-2-fenyloindolem (DAPI) zastępującym bufor blokujący. Kontynuuj inkubację przez co najmniej 4 godziny lub dłużej w temperaturze pokojowej (RT).
    6. Usunąć przeciwciało wtórne, przemyć skrawki tkanek roztworem PBST trzy razy przez 10 minut każda, a następnie przemyć czystym PBS przez kolejne 5 minut.
    7. Zetrzeć resztki PBS otaczające skrawki tkanki, zamontować szkiełka nakrywkowe na skrawkach z podłożem montażowym. Wykonaj mikroskopię fluorescencyjną, aby uzyskać obrazy (patrz tabela materiałów).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Główne kości czaszki ukazane z różnych perspektyw przedstawiono na Rysunku 1A-E, gdzie kolory oznaczają poszczególne kości. Do demonstracji procesów sekcji wykorzystano czterotygodniowe zwierzęta. Po wykonaniu kroków sekcji 1.1.1-1.1.3 oraz krótkiej prefiksacji (krok 1.1.4), gałka oczna wraz z powiązanymi kośćmi twarzy została przedstawiona na Rysunku 1E. Dalsze przycinanie w celu usunięcia kości...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Jednym z kluczowych przypomnień dotyczących przygotowania nienaruszonej gałki ocznej jest to, że wszystkie kości oczodołu muszą zostać całkowicie usunięte, zwłaszcza kości juga i łzowe, które są małe i znajdują się w pobliżu dna oczodołu. Wszelkie resztki kości mogą skomplikować późniejszą histologię. W przypadku, gdy maleńki kawałek kości nie został przypadkowo całkowicie usunięty z sekcji, można go pobrać z zatapiającego bloku parafiny za pomocą pęsety. Pozostawiony otwór po tej operacji należy wypełnić stopioną parafi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują prof. Rong Ju za krytyczną lekturę manuskryptu, a wszystkim członkom laboratorium za pomoc techniczną. Prace te były wspierane przez granty z Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (NSFC: 31571077; Pekin, Chiny), Projekt Innowacji w Dziedzinie Nauk i Technologii Miasta Kanton (201707020009; Guangzhou, prowincja Guangdong, Chiny), "Plan 100 osób" z Uniwersytetu Sun Yat-sen (8300-18821104; Guangzhou, prowincja Guangdong, Chiny) oraz finansowanie badań z Państwowego Kluczowego Laboratorium Okulistyki w Centrum Okulistycznym Zhongshan (303060202400339; Guangzhou, prowincja Guangdong, Chiny).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1 i razy; Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Transgen BiotechFG701-01
50ml probówka wirówkowaCorning430829
Adhezyjne szkiełka mikroskopoweRóżne
Alexa Fluor 488 PhalloidinInvitrogen/Life TechnologiesA12379Sugerowane stężenie 1:500 - 1,000
Alexa Fluor 568 PhalloidinInvitrogen/Life TechnologiesA12380Sugerowane stężenie 1:500 - 1,000
Przeciwciało anty-K12Abcamab124975Sugerowane stężenie 1:1,000
Przeciwciało anty-K14Abcamab7800Sugerowane stężenie 1:800
Kwas cytrynowyRóżne
Slajd okładkowyRóżne
Kleszcze zakrzywioneWorld Precision Instruments14127
Mikroskop preparacyjny.OlmpusSZ61
Alkohol etylowyRóżne
mikroskopy fluorescencyjneZeissAxioImager.Z2
Fluoromount-G Nośniki montażoweSouthernBiotech0100-01
Nożyczki do mikropreparacji z prostym ostrzemWorld Precision Instruments503242
Kuchenki mikrofaloweGalanzP70D20TL-D4
Szczepy myszyC57 / BL6 i Sv129 mieszane
kleszcze proste nr 4World Precision Instruments501978-6
Normalna surowica koziaRóżne
paraformaldehydy (PFA)RóżnePrzygotuj 4% roztwór w 1 i razy; PBS i filtr o 0,45μ m membrana filtracyjna
Naczynie do hodowli tkankowychRóżne
Cytrynian trisodowyRóżne
Triton X-100Sigma-AldrichSLBW6818

Bibliografia

  1. Swamynathan, S. K. Ocular surface development and gene expression. Journal of Ophthalmology. 2013, (2013).
  2. Arita, R., Fukuoka, S., Morishige, N. Functional Morphology of the Lipid Layer of the Tear Film. Cornea. 36 Suppl 1, S60-S66 (2017).
  3. Guo, D., et al. Ocular surface pathogenesis associated with precocious eyelid opening and necrotic autologous tissue in mouse with disruption of Prickle 1 gene. Experimental Eye Research. 180, 208-225 (2018).
  4. Knop, E., Knop, N. Anatomy and immunology of the ocular surface. Chemical Immunology and Allergy. 92, 36-49 (2007).
  5. Mizoguchi, S., et al. Ocular surface alkali injury damages meibomian glands in mice. The Ocular Surface. 15 (4), 713-722 (2017).
  6. Gipson, I. K. Goblet cells of the conjunctiva: A review of recent findings. Progress in Retinal and Eye Research. 54, 49-63 (2016).
  7. Nowell, C. S., et al. Chronic inflammation imposes aberrant cell fate in regenerating epithelia through mechanotransduction. Nature Cell Biology. 18 (2), 168-180 (2016).
  8. Nagata, M., Ohashi, Y., Ozawa, H. A histochemical study of the development of premaxilla and maxilla during secondary palate formation in the mouse embryo. Archives of Histology and Cytology. 54 (3), 267-278 (1991).
  9. Zhang, L., et al. A role for MEK kinase 1 in TGF-beta/activin-induced epithelium movement and embryonic eyelid closure. The Embo Journal. 22 (17), 4443-4454 (2003).
  10. Sharov, A. A., et al. Noggin overexpression inhibits eyelid opening by altering epidermal apoptosis and differentiation. The Embo Journal. 22 (12), 2992-3003 (2003).
  11. Setala, N. L., Metso, J., Jauhiainen, M., Sajantila, A., Holopainen, J. M. Dry eye symptoms are increased in mice deficient in phospholipid transfer protein (PLTP). The American Journal of Pathology. 178 (5), 2058-2065 (2011).
  12. Zhang, Y., et al. Mastermind-like transcriptional co-activator-mediated Notch signaling is indispensable for maintaining conjunctival epithelial identity. Development. 140 (3), 594-605 (2013).
  13. McCauley, H. A., et al. TGFbeta signaling inhibits goblet cell differentiation via SPDEF in conjunctival epithelium. Development. 141 (23), 4628-4639 (2014).
  14. Guo, D., et al. Ocular surface pathogenesis associated with precocious eyelid opening and necrotic autologous tissue in mouse with disruption of Prickle 1 gene. Experimental Eye Research. 180, 208-225 (2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Izolacja ga ek ocznychusuwanie czaszkisekcja ko ci oczodo owejintegralno tkankiprzekrawanie g owy myszyprzemywanie w PBSutrwalanie paraformaldehydem

Powiązane artykuły