Artykuł metodologiczny

Indukowana światłem adsorpcja molekularna białek z wykorzystaniem systemu PRIMO do mikrowzorcowania w celu zbadania odpowiedzi komórek na białka macierzy zewnątrzkomórkowej

DOI:

10.3791/60092

⸱

11 października 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Faculty of Biology, Medicine and Health. Division of Cell Matrix, Biology and Regenerative Medicine, Wellcome Trust Centre for Cell-Matrix Research, The University of Manchester, 2School of Materials, The University of Manchester, 3Blond McIndoe Laboratories, School of Biological Sciences, Faculty of Biology, Medicine and Health, Division of Cell Matrix Biology and Regenerative Medicine, The University of Manchester, Manchester Academic Health Science Centre, 4Department of Plastic Surgery & Burns, Wythenshawe Hospital, Manchester University NHS Foundation Trust, Manchester Academic Health Science Centre, 5Department of Pathology, UMC Utrecht

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Naszym ogólnym celem jest zrozumienie, w jaki sposób komórki wyczuwają sygnały zewnątrzkomórkowe, które prowadzą do ukierunkowanego wzrostu aksonów. W tym miejscu opisujemy metodologię indukowanej światłem adsorpcji molekularnej białek, używaną do wytwarzania zdefiniowanych mikrowzorów składników macierzy zewnątrzkomórkowej w celu zbadania określonych zdarzeń, które rządzą wzrostem aksonów i odnajdywaniem ścieżki.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki wyczuwają różne sygnały zewnątrzkomórkowe, w tym skład i geometrię macierzy zewnątrzkomórkowej, która jest syntetyzowana i przebudowywana przez same komórki. W tym miejscu przedstawiamy metodę indukowanej światłem adsorpcji molekularnej białek (LIMAP) z wykorzystaniem systemu PRIMO jako techniki modelowania do wytwarzania mikrowzorcowych substratów macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) przy użyciu pojedynczego białka lub kombinacji białek. Metoda umożliwia drukowanie wzorców ECM w rozdzielczości mikronowej z doskonałą odtwarzalnością. Przedstawiamy protokół krok po kroku i pokazujemy, w jaki sposób można go zastosować do badania procesów odnajdywania ścieżek neuronalnych. LIMAP ma znaczące zalety w porównaniu z istniejącymi metodami mikrodruku pod względem łatwości tworzenia wzorów więcej niż jednego komponentu oraz możliwości generowania wzoru o dowolnej geometrii lub nachyleniu. Protokół można łatwo dostosować do badania udziału prawie każdego składnika chemicznego w losie komórki i zachowaniu komórki. Na koniec omawiamy typowe problemy, które mogą się pojawić i jak można ich uniknąć.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ostatnich latach nauki biologiczne coraz częściej korzystają z osiągnięć nauk o materiałach. Jednym z wybitnych przykładów jest mikrowzorzec substratów, który można wykorzystać do badania odpowiedzi komórkowych, takich jak proliferacja komórek1,2, differentiation3,4,5,6, migracja komórek7,8,9 oraz pathfinding10,11. Dostępnych jest wiele technik, które umożliwiają mikrotworzenie wzorów na podłożach, takich jak fotochemia wzbudzona wieloma fotonami12, nanolitografia pióra zanurzeniowego AFM13, druk bezpośredni pin and inkjet14, litografia wiązką elektronów15 lub mikrofluidyka16. Jednak dwie techniki, które są szeroko stosowane w dziedzinie biologii, to druk mikrokontaktowy17,18,19 lub laserowo wspomagane modelowanie3 (Rysunek 1). Uważa się, że modelowanie wspomagane laserowo zapewnia bardziej wiarygodne wyniki pod względem stabilności białek i PEG oraz uwięzienia komórek na wzorach, w porównaniu z drukiem mikrokontaktowym20. Bardziej nowatorskim podejściem do mikrowzorców opisanym tutaj jest zastosowanie indukowanej światłem adsorpcji molekularnej białek21 (LIMAP, Rysunek 1D) przy użyciu dostępnego na rynku systemu (PRIMO, Tabela Materiałów). Każda z metod ma zalety i ograniczenia, które zostały pokrótce opisane poniżej. Druk mikrokontaktowy wykorzystuje formy (stemple) PDMS z pożądanymi mikrocechami, które są generowane z litografowanych wzorców. Znaczniki są inkubowane z wybranym białkiem, które jest następnie przenoszone (stemplowane) na substrat do hodowli komórkowej18 (Rysunek 1A). Modelowanie wspomagane laserowo wykorzystuje światło UV do rozszczepienia warstwy przeciwporostowej22,23,24,25, odsłaniając obszary, które mogą być następnie pokryte interesującym białkiem (Rysunek 1B). Podczas gdy rozdzielczość osiągana przy użyciu metod fotowzorcowania mieści się w zakresie mikronów25,26, większość tych technik wymaga fotomaski, która styka się z próbką lub znajduje się w płaszczyźnie obiektu mikroskopu objective23,27,28. Wymagania dotyczące masek zarówno w druku mikrokontaktowym, jak i fotowzornictwie mogą być ograniczeniem; Dla każdego wzoru geometrycznego i rozmiaru wymagane są określone maski, których wygenerowanie może być kosztowne i czasochłonne. W przeciwieństwie do tych technik, LIMAP nie wymaga maski (Rysunek 1D). Korzystanie z systemu PRIMO dla LIMAP może być na początku kosztowne, ponieważ wymaga zakupu sprzętu. Jednak oprogramowanie typu open source służy do projektowania wzorców o dowolnej pożądanej geometrii, dając znacznie większą swobodę i umożliwiając bardziej złożone eksperymenty, w tym wykorzystanie gradientów stężenia białek. Laser PRIMO jest sterowany i kierowany przez cyfrowo sterowane urządzenie mikrolustrzane (DMD) w celu tworzenia wzorów w dowolnej liczbie geometrii zdefiniowanych przez użytkownika. LIMAP wymaga, aby powierzchnia hodowli była pokryta cząsteczkami, które zapobiegają przyczepianiu się komórek. Glikol polietylenowy (PEG) jest najczęściej stosowany jako taki odczynnik "przeciwporostowy"; Tworzy gęstą warstwę antyadhezyjną na powierzchni szkła lub tworzywa sztucznego29. Następnie dodawany jest fotoinicjator, który umożliwia usunięcie folii PEG z dużą precyzją za pomocą mechanizmu fotoskopizacji30 poprzez miejscową ekspozycję na światło UV pod kontrolą DMD. Te wolne od PEG obszary mogą być pokryte białkami, które adsorbują się na wytrawionej laserowo powierzchni, generując mikrowzór. Zmieniając moc lasera, różne ilości PEG mogą być usuwane z powierzchni, co pozwala użytkownikowi na generowanie gradientów białek. Usuwanie PEG i procedurę powlekania można powtórzyć, aby stworzyć wzory z dwoma lub więcej odrębnymi białkami w tym samym micro-well21. Wygenerowane mikrowzory zapewniają komórkom powierzchnie adhezyjne, umożliwiając badanie ich zachowania. W naszych badaniach używamy mikrowzorców do badania neurytów lub aksonów odnajdywania ścieżki w linii komórek neuronalnych (CAD (Cathecholaminergic-a differentiated) komórkach 31) lub pierwotnych neuronach zwoju grzbietowo-korzeniowego szczura (DRG). Poniżej przedstawiamy krok po kroku protokół LIMAP (Rysunek 2) przy użyciu dostępnego na rynku systemu PRIMO i dołączonego oprogramowania Leonardo. Pokazujemy, w jaki sposób można go wykorzystać do generowania wzorców o zdefiniowanej geometrii i wielu białkach, których używamy do badania znajdowania ścieżki aksonalnej. Omawiamy typowe problemy, które mogą się pojawić, i sposoby ich unikania.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Projektowanie szablonów wzorów

UWAGA: Szablony do tworzenia wzorów są generowane za pomocą oprogramowania do rysowania cyfrowego (Tabela materiałów). Rysowanie różnych poziomów szarości określi intensywność lasera. Korzystanie z oprogramowania do projektowania szablonów wzorów pozwala na szybkie generowanie szablonów o dowolnej geometrii i gradientach (Rysunek 3).

  1. Narysuj cyfrowo żądany szablon wzoru za pomocą oprogramowania do rysowania. Wybierz rozmiar obrazu o długości 1824 pikseli i szerokości 1140 pikseli (co w tym badaniu odpowiada długości 415 μm i szerokości 260 μm). Zapisz szablon wzorca jako 8-bitowy plik Tiff.
    UWAGA: protokół krok po kroku do generowania szablonów jest dostępny na żądanie dla marki, która komercjalizuje sprzęt do mikro-modelowania (Tabela Materiałów).

2. Czyszczenie plazmowe

UWAGA: Optymalne wyniki wymagają plazmowego czyszczenia powierzchni przed wykonaniem wzoru, co usunie całą materię organiczną i aktywuje powierzchnię. W omawianym przypadku powietrze otoczenia jest wystarczające do aktywacji powierzchniowej. Zastosowano myjkę plazmową (Tabela Materiałów) o ciśnieniu procesowym 1000-1300 mTorr i mocy 29,6 W przez 1-5 min.

  1. Używaj naczyń ze szklanym dnem o średnicy wewnętrznej 20 mm i grubości szkła 0,16-0,19 mm. Do testowania wielu warunków użyj 6-dołkowego naczynia ze szklanym dnem. W przeciwnym razie użyj naczynia ze szklanym dnem z jedną studzienką (tabela materiałów).
    UWAGA: Protokół czyszczenia plazmowego krok po kroku jest dostępny na żądanie dla marki, która wprowadza na rynek sprzęt do czyszczenia plazmowego (tabela materiałów).

3. Pasywacja

UWAGA: Ten krok generuje powłokę przeciwporostową, która zapobiega adsorpcji białek na powierzchni szkła. PEG oferuje wysoką odporność na adsorpcję białek29 jako środek przeciwporostowy. LIMAP wykorzystuje fotoinicjator do miejscowego usuwania PEG poprzez fotofotoszczelinę UV. Interesujące nas białko będzie następnie adsorbować się na tych powierzchniach wolnych od PEG21, generując mikrowzorce.

  1. Pasywacja za pomocą PLL-PEG
    1. W sterylnych warunkach wytnij szablony PDMS (patrz Rysunek 4A,B i tabela materiałów), aby upewnić się, że pasują do wewnętrznej studzienki szklanego dna, a następnie usuń wewnętrzne wypełnienia mikrostudzienki za pomocą sterylnych kleszczy. Dobrze przyklej szablony do szkła za pomocą kleszczy.
    2. Upewnij się, że szablony dobrze przylegają do szkła, zapobiegając tworzeniu się pęcherzyków powietrza, które mogą powodować nieszczelności podczas procesu pasywacji.
      UWAGA: Wzorniki PDMS mogą być również wytwarzane wewnętrznie przy użyciu opublikowanych protokołów18,32.
    3. Przygotować roztwór PLL-PEG (tabela materiałów, 0,1 mg/ml) w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS). Dodać 20 μl roztworu PLL-PEG do każdej mikrostudzienki i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
    4. Usuń 15 μl PLL-PEG z mikrodołków i umyj je pięciokrotnie 20 μl PBS (Tabela Materiałów), nie dopuszczając do ich wyschnięcia.
      UWAGA: Zawsze zostawiaj około 5 μl PBS między praniami. Ze względu na ich małą objętość mikrostudzienki są szczególnie podatne na wysychanie. Suszenie spowoduje powstanie mikrowzorów o niskiej jakości.
    5. Albo przechowywać szalkę hodowlaną w PBS (3 ml na studzienkę) w temperaturze 4 °C przez okres do 3 dni, albo kontynuować następny krok (krok 3.1.5).
    6. Usuń 18 μl PBS z pojedynczej mikrostudzienki (na przykład lewy górny mikrostudzienka, patrz Rysunek 4D), dodaj 5 μl fotoinicjatora (PLPP, tabela materiałów) i pozostaw 20 μl PBS w pozostałych mikrostudzienkach. Ta mikrostudzienka z PLPP zostanie wykorzystana do stworzenia wzorca referencyjnego (patrz Rysunek 4D, E) podczas etapu kalibracji systemu (krok 4). Chroń PLPP przed światłem.
  2. Pasywacja z długotrwałym PEG-SVA
    UWAGA: Do wytworzenia powierzchni antyadhezyjnej można użyć: 1) PEG połączonego z poli-L-lizyną (PLL-PEG, krok 3.1) lub 2) N-hydroksoksyboksynimidu PEG-bursztynianu (PEG-SVA). Decyzja o wyborze jednej lub drugiej opcji pasywacji zależy od opcji przechowywania (patrz krok 10). Szalki hodowlane inkubowane z PEG-SVA wymagają podwójnej ilości czasu pasywacji i fotomodelowania.
    1. Przygotuj szablony zgodnie z opisem w kroku 3.1.1.
    2. Dodaj 20 μl 0,01% poli-L-lizyny (PLL, tabela materiałów) do każdej mikrostudzienki i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut w celu wstępnego pokrycia PLL.
    3. Usunąć 15 μl PLL z mikrostudzienek i umyć je trzykrotnie 20 μl 1 M buforu HEPES (tabela materiałów), nie dopuszczając do wyschnięcia studzienek.
      UWAGA: Zawsze zostawiaj około 5 μl HEPES lub PBS między praniami. Ze względu na ich małą objętość mikrostudzienki są szczególnie podatne na wysychanie. Suszenie spowoduje powstanie mikrowzorów o niskiej jakości.
    4. Przygotuj roztwór PEG-SVA. Roztwór PEG-SVA (50 mg/ml w buforze HEPES 1M) należy przygotowywać na świeżo za każdym razem bezpośrednio przed użyciem. Przygotuj 20 μl PEG-SVA na mikrostudzienkę.
    5. Bufor HEPES musi mieć pH między 8-8,5. Zbadaj pH HEPES przed przygotowaniem roztworu PEG-SVA za pomocą bibuły do pomiaru pH. Zważyć PEG-SVA w probówce wirówkowej za pomocą precyzyjnej wagi. Dodaj bufor HEPES i wiruj przez 30 s, aż się rozpuści. PEG-SVA ulega całkowitemu rozpuszczeniu, gdy roztwór jest przezroczysty.
      UWAGA: SVA jest estrem, który umożliwia wiązanie PEG z wcześniej powlekanym PLL. Po dodaniu buforu HEPES do PEG-SVA, SVA ma okres półtrwania wynoszący 15 minut i należy go natychmiast zużyć.
    6. Dodać 20 μl roztworu PEG-SVA do każdej mikrostudzienki i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Usunąć 15 μl PEG-SVA z mikrostudzienek i przemyć pięciokrotnie 20 μl PBS (tabela materiałów), nie dopuszczając do wyschnięcia studzienek.
    7. Przygotuj naczynie hodowlane do długotrwałego przechowywania (do 1 miesiąca, patrz krok 10.2) lub przejdź do następnego kroku (krok 3.2.8).
    8. Usuń 18 μl PBS z pojedynczej mikrostudzienki (na przykład lewa górna mikrostudzienka, patrz Rysunek 4D), dodaj 5 μl PLPP (Tabela materiałów) i pozostaw 20 μl PBS w pozostałych mikrostudzienkach. Ta mikrostudzienka zostanie wykorzystana do stworzenia wzorca referencyjnego (patrz rys. 4D, E). Upewnij się, że PLPP jest jednorodny na całej powierzchni mikrostudzienki. Chroń PLPP przed światłem.

4. Kalibracja systemu

UWAGA: W tych krokach, ostrość lasera zostanie dostosowana do konkretnego rodzaju naczynia hodowlanego (krok 4.1). Wzór referencyjny zostanie wygenerowany tylko w jednym mikrodołku (krok 4.2), a następnie nastąpi inkubacja z roztworem białka (etap 4.3) w celu zapewnienia optymalnych warunków ogniskowania lasera (etap 4.4), niezbędnych do uzyskania ostrych i zdefiniowanych wzorów.

  1. Kalibracja laserowa
    UWAGA: Podczas procesu kalibracji obraz lasera kalibracyjnego zostanie wyświetlony na fluorescencyjnie podświetloną szklaną powierzchnię (studnia kalibracyjna, oznaczona fluorescencyjnym zakreślaczem, Rysunek 4C), którą należy ustawić w ostrości pod mikroskopem.
    1. Użyj fluorescencyjnego zakreślacza (Tabela materiałów), aby oznaczyć pustą szklankę wewnętrzną.
      UWAGA: Studzienka kalibracyjna musi mieć taką samą grubość szkła (0,16-0,19 mm) jak naczynie hodowlane, na którym zostaną wygenerowane mikrowzory. Jeśli używane jest naczynie ze szklanym dnem 6-dołkowym, do kalibracji można użyć pustego dołka, który należy oznaczyć fluorescencyjnym zakreślaczem w sterylnych warunkach.
    2. Włącz mikroskop, stolik i komputer. Włącz sprzęt do mikrotworzenia mikrowzorów PRIMO, otwórz Micro-manager i oprogramowanie Leonardo. Oprogramowanie Leonardo jest obsługiwane przez Micro-managera w sekcji Wtyczki. Sprawdź marki/numery katalogowe sprzętu i oprogramowania w Tabeli materiałów.
    3. W menu początkowym Leonardo wybierz opcję Kalibruj. Sprawdź, czy dedykowana kostka filtra PRIMO znajduje się we właściwej pozycji (tor optyczny) w wieżyczce filtra; wybrać obiektyw 20X (0,75 DIC S Plan Fluor, bez pierścienia fazowego) zarówno w mikroskopie, jak i w oprogramowaniu Leonardo.
      UWAGA: Ten protokół jest dostosowany do wersji Leonardo 4.4. Protokół może wymagać dostosowania do innych wersji.
    4. Umieść wcześniej podświetloną studzienkę kalibracyjną (Rysunek 4C) nad obiektywem. Wybierz ścieżkę kamery. Dostosuj ostrość obiektywu, aż projekcja laserowa zarówno logo PRIMO, jak i sloganu Zadbaj o to, aby Twoje komórki były ostre.
    5. Pozostaw domyślny czas ekspozycji aparatu na 25 ms. Dostosuj intensywność lasera, aby widzieć literę I z projekcji logo PRIMO w kolorze szarym, a resztę liter w kolorze białym.
    6. Zapisz pozycję Z płaszczyzny ogniskowej (wysokość obiektywu do próbki), określaną później jako pozycja Z kalibracji. Będzie to przybliżenie optymalnej ostrości uzyskanej po wygenerowaniu wzorca odniesienia (patrz kroki 4.2-4.4).
  2. Wzorzec referencyjny
    1. Umieść szalkę hodowlaną z mikrostudzienką zawierającą fotoinicjator (wzór referencyjny mikro-studzienka, Rysunek 4D) nad obiektywem i wybierz Wzór teraz w oprogramowaniu Leonardo.
    2. Wizualizuj krawędź mikrostudzienki ze światłem przechodzącym przez kamerę i wybierz symbol ROI z menu po prawej stronie. Ustaw średnicę okręgu ROI na 4000 μm i wyrównaj krawędź cyfrowego ROI z krawędzią bieżącej mikrostudzienki.
    3. Upewnij się, że cyfrowy zwrot z inwestycji dokładnie nakłada się na bieżący mikrostudzienkę, przesuwając stolik wokół krawędzi mikrostudzienki. Pozycja ROI zostanie sprzężona z ruchami sceny.
    4. Wybierz opcję Zablokuj w oprogramowaniu Leonardo, aby zablokować zwrot z inwestycji w żądanej pozycji. Wyłącz przechodzące światło.
    5. Wybierz PRIMO, aby przesłać żądany szablon wzorca, który będzie rzutowany na ROI jako jednostka projektowa (patrz Rysunek 5). Wzorce pojawią się na liście rozwijanej nazywanej Akcjami i pokazanej w menu Akcje w oprogramowaniu.
      UWAGA: Szablony wzorów muszą być wcześniej zaprojektowane (patrz krok 1) i zapisane jako 8-bitowy plik Tiff przed załadowaniem szablonu do oprogramowania.
    6. Dla wzorca referencyjnego potrzebny jest tylko mały wzorzec, na przykład 3 wiersze, 1 kolumna (patrz Rysunek 4E i Rysunek 5B). W menu Replikacja ustaw żądaną liczbę kolumn i wierszy (Linie w oprogramowaniu Leonardo). Kliknij przycisk Odśwież, aby wyświetlić cyfrowy podgląd projektu wzoru.
    7. Ustaw dawkę lasera w menu Replikacja. Optymalna dawka lasera w tym ustawieniu i przy użyciu PLL-PEG wynosi 1390 mJ/mm2,
      UWAGA: Moc lasera może wahać się w granicach 5-7.5 mW/mm2. W tym przypadku jest to 7,5 mW/mm2, co daje około 30 s na wymodelowanie każdej jednostki konstrukcyjnej, przy użyciu dawki lasera 1390 mJ/mm2. Wyższe dawki lasera mogą być wymagane, jeśli powierzchnia szalki hodowlanej jest pasywowana PEG-SVA (w przybliżeniu podwójna dawka lasera w porównaniu z PLL-PEG). Należy to wcześniej przetestować.
    8. Przejdź do peryferyjnego obszaru mikrostudzienki (na przykład górnej części) z dala od głównego obszaru zainteresowania do generowania wzorca (obszar centralny) mikrodołka (patrz Rysunek 4E) i wybierz Zablokuj. Poczekaj, aż wzór zostanie wyświetlony.
    9. Ustaw ostrość w pozycji Z kalibracji (patrz krok 4.1.6).
      UWAGA: Zaleca się wykonanie dodatkowego kroku kalibracji systemu, jeśli inny użytkownik używa tego samego mikroskopu między rundami fotowzorów.
    10. Wybierz symbol Odtwórz, aby rozpocząć tworzenie wzoru. Upewnij się, że laser jest włączony w oprogramowaniu. Poczekaj, aż proces tworzenia wzoru zostanie zakończony. Czas trwania wzorca zostanie wyświetlony w panelu Szacowany czas. W oprogramowaniu Leonardo w wersji 4.4 tworzenie wzorów jest zakończone, gdy wszystkie działania są wyświetlane na niebiesko w menu Wizualizacji.
  3. Inkubacja białek według wzorca referencyjnego
    1. W sterylnych warunkach przemyć mikrostudzienkę wzorca referencyjnego trzykrotnie 20 μl PBS w celu usunięcia PLPP.
    2. Dodać 20 μl znakowanego fluorescencyjnie białka ECM (10 μg/ml lamininy, fibronektyny lub fibrynogenu w PBS, patrz tabela materiałów i krok 6) do mikrodołka wzorca referencyjnego. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10-20 minut (w zależności od białka) chronić przed światłem (zawinąć naczynie w folię aluminiową).
    3. Po inkubacji usunąć 18 μl roztworu białkowego i przemyć trzykrotnie 20 μl PBS; zachować mikro-studzienki, które nie są używane do tworzenia wzorca referencyjnego (patrz Rysunek 4D,E) w 20 μL PBS.
  4. Wizualizacja i ustawianie optymalnego ogniskowania lasera
    1. Wizualizacja wzorca referencyjnego za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego, obiektywu 20X i odpowiedniego oprogramowania (sprawdź oprogramowanie użyte w tym badaniu w Tabeli materiałów). Wzorzec odniesienia powinien być widoczny w obszarze peryferyjnym (na przykład w obszarze górnej studzienki), w którym został wygenerowany wzorzec odniesienia (patrz Rysunek 4E).
    2. Dostosuj ostrość na krawędziach wzoru na ścieżce kamery. Zapisz pozycję Z zgodnie z najlepszą ostrością na wzorcu odniesienia. Ta skorygowana pozycja Z będzie optymalnym ogniskiem lasera używanym do późniejszego modelowania.

5. Konfiguracja oprogramowania i fototworzenie wzorów

UWAGA: Po osiągnięciu kalibracji systemu (krok 4), użytkownik prześle żądane szablony wzorów (konfiguracja szablonu, Rysunek 5) do fotomodelowania, z opcją generowania wzorów dla jednego lub wielu białek w każdym mikrodołku. Proces mikro-wzorcowania obejmuje etapy fotowzorcowania i inkubacji białek (patrz Rysunek 2).

  1. W sterylnych warunkach usuń 18 μl PBS ze wszystkich mikrostudzienek i dodaj 5 μl PLPP do każdej mikrostudzienki. Upewnij się, że PLPP jest jednorodny na całej powierzchni mikrostudzienek.
  2. Umieść naczynie hodowlane z mikrostudzienką wzorca referencyjnego (Rysunek 4D,E) nad celem i wybierz teraz Wzór w oprogramowaniu Leonardo.
  3. Wizualizuj mikrostudzienkę ze światłem przechodzącym przez ścieżkę kamery i wybierz symbol ROI. Ustaw średnicę ROI na 4,000 μm i nałóż krawędź cyfrowego ROI na krawędź bieżącej mikrostudzienki. Wybierz Lock.
    UWAGA: kształt i średnica ROI zależy od projektu i rozmiaru używanego szablonu PDMS. Na przykład, jeśli używasz kwadratowych szablonów PDMS o wymiarach 5 000 x 5 000 μm, użyj kwadratowego zwrotu z inwestycji o wymiarach 5 000 x 5 000 μm.
  4. Powtórz nakładający się krok (krok 5.3) dla każdej mikrostudzienki naczynia. Po zakończeniu wyłącz przepuszczane światło.
  5. Przejdź do środka mikrostudzienki wzorca referencyjnego, z dala od obszaru wzorca referencyjnego, i wybierz PRIMO, aby przesłać żądany szablon wzorca, który będzie rzutowany na ROI jako jednostka projektowa (patrz Rysunek 5). Wzorce pojawią się na liście rozwijanej nazywanej Akcjami i pokazanej w menu Akcje w oprogramowaniu.
    UWAGA: Szablony wzorców muszą być zaprojektowane przed eksperymentem i zapisane jako 8-bitowy plik Tiff przed załadowaniem szablonu do oprogramowania.
  6. Aby stworzyć wzór w całej mikrostudzince, jednostka projektowa musi zostać odtworzona. Jednostka konstrukcyjna obejmuje około 0,1mm2 powierzchni mikrostudzienki. W menu Replikacja ustaw żądaną liczbę kolumn i wierszy (Wiersze w oprogramowaniu) (patrz Rysunek 5).
  7. Aby wygenerować wzór ciągły, należy dostosować odstępy między kolumnami i liniami; w tym badaniu wzory ciągłych pasków uzyskuje się przy użyciu odstępów od -20 do -35 μm (odstępy ujemne) między kolumnami. Ten ujemny odstęp powoduje nakładanie się jednostek projektowych ( Rysunek 5B, C).
  8. Ustaw dawkę lasera w menu Replikacja. Optymalna dawka lasera w tym ustawieniu i przy użyciu PLL-PEG wynosi 1390 mJ/mm2. Czas trwania wzorca zostanie wyświetlony w panelu Szacowany czas.
    UWAGA: W tym przypadku moc lasera wynosi 7,5 mW/mm2, a modelowanie każdej jednostki konstrukcyjnej zajmuje około 30 s przy użyciu dawki 1390 mJ/mm2. Na przykład jednostka projektowa (0,1 mm2) powielana w 4 kolumnach i 4 liniach (około 1,6 mm2) potrzebowałaby 8 minut, aby uzyskać wzór. Wyższe dawki lasera mogą być wymagane, jeśli powierzchnia szalki hodowlanej jest pasywowana PEG-SVA (w przybliżeniu podwójna dawka lasera w porównaniu z PLL-PEG).
  9. Wybierz opcję Zablokuj i poczekaj, aż wzór zostanie wirtualnie wyświetlony.
  10. Aby zaktualizować parametry wzoru, kliknij powiązaną akcję, a następnie odblokuj i zaktualizuj parametry. Wybierz opcję Zablokuj ponownie po zakończeniu aktualizacji wzorca.
  11. Modelowanie wielu białek w tej samej mikrostudzience (sekwencyjne rundy mikrowzorów) wymaga dokładnego wyrównania wzorców. Aby osiągnąć takie wyrównanie, należy jednocześnie przesłać wszystkie zestawy pożądanych szablonów wzorów (wzory pierwszej i drugiej rundy fotowzorów).
  12. Ustaw parametry replikacji i dawki szablonów wzorców. Po ustawieniu parametrów wzorce pojawią się jako Akcje na liście Akcje. Zapisz tę konfigurację szablonu jako plik w oprogramowaniu (patrz Rysunek 5D).
  13. Na liście Akcje wybierz tylko konkretne akcje, które mają być wzorowane podczas pierwszej rundy tworzenia wzorca i odznacz akcje, które będą wzorowane podczas drugiej rundy tworzenia wzorca (patrz Rysunek 5D).
  14. Przejdź do obszaru, w którym wzorzec odniesienia został utworzony w kroku 4.2 (na przykład górny obszar mikrostudzienki wzorca referencyjnego, patrz Rysunek 4E). Ustaw ostrość w optymalnej pozycji Z (uzyskanej w kroku 4.4).
    UWAGA: Zdecydowanie zaleca się wybór systemu idealnej ostrości w używanym mikroskopie (jeśli jest dostępny), który zapewnia utrzymanie optymalnej pozycji Z do tworzenia wzorów przez cały proces fotomodelowania.
  15. Wybierz symbol Odtwórz, aby rozpocząć tworzenie wzoru. Czas trwania wzorca zostanie wyświetlony w panelu Szacowany czas. W oprogramowaniu Leonardo w wersji 4.4 tworzenie wzorów jest zakończone, gdy wszystkie działania są wyświetlane na niebiesko w menu Wizualizacji.

6. Inkubacja białek

UWAGA: Mikrostudzienki są inkubowane z białkami ECM (najlepiej znakowanymi fluorescencyjnie). Będą one wiązać się tylko z obszarami, w których PEG został rozszczepiony w procesie fotowzorcowania opisanym w kroku 5. Każda studzienka zawiera szablon PDMS z 4 mikrodołkami, które pozwolą na jednoczesne testowanie 4 różnych warunków, na przykład inkubacja innego białka w każdym mikrodołku (patrz Rysunek 4D).

  1. Użyj białek znakowanych fluorescencyjnie (na przykład lamininy, fibronektyny lub fibrynogenu sprzężonych z czerwonymi lub zielonymi fluoroforami) w celu wizualizacji mikrowzorów (patrz kroki 6.7 i 9.4). Alternatywnie, zaadsorbowane nieznakowane białka można uwidocznić na późniejszych etapach za pomocą immunofluorescencji.
    UWAGA: Białka ECM (na przykład fibronektyna) mogą być znakowane przy użyciu istniejących protokołów33 i dostępnych na rynku zestawów do znakowania fluorescencyjnego (np. zestaw do znakowania Alexa 488) lub zakupione łatwo znakowane (na przykład sprzężony fibrynogen-488 lub rodamina fluorescencyjna z laminą na czerwono, patrz Tabela materiałów).
  2. W sterylnych warunkach przygotować pożądane stężenie białek ECM (10 μg/ml lamininy, fibronektyny lub fibrynogenu w PBS, patrz tabela materiałów i krok 4.3).
    UWAGA: Znakowane fluorescencyjnie białka ECM są wrażliwe na światło i powinny być chronione przed światłem (zawinąć naczynie w folię aluminiową) i powinny być przechowywane na lodzie przez cały czas.
  3. W sterylnych warunkach umyj mikrostudzienki trzykrotnie 20 μl PBS w celu usunięcia PLPP.
  4. Usuń 18 μl PBS ze wszystkich mikrodołków i dodaj 20 μl roztworu białka ECM do każdej mikrostudzienki. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 20-30 minut i chronić przed światłem.
    UWAGA: Optymalne czasy inkubacji powłoki mogą się różnić w zależności od rodzaju i stężenia białek.
  5. Po inkubacji usunąć 15 μl roztworu białka ECM i trzykrotnie przemyć mikrostudzienki 20 μl PBS.
    UWAGA: Zawsze zostawiaj około 5 μl PBS między praniami.
  6. W przypadku modelowania tylko jednego białka (jedna runda mikrowzorcowania), przejdź do przechowywania szalki hodowlanej (krok 10) lub do posiewu komórek (krok 11 i zobacz Rysunek 2). Jeśli wykonujesz drugą rundę mikrowzorców z innym białkiem w tym samym mikrodołku, przejdź albo do przechowywania szalki hodowlanej (krok 10), albo do blokowania niespecyficznych miejsc wiązania (krok 7 i patrz Rysunek 2).
  7. Opcjonalny etap kontroli jakości: wizualizacja i obraz wydrukowanych wzorów za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego przed posiewem komórek. Wybierz odpowiednie kanały fluorescencyjne i odpowiednio dostosuj czasy ekspozycji.
    UWAGA: Aby porównać intensywność fluorescencji wzorców między eksperymentami, konieczne jest użycie tych samych czasów ekspozycji dla tych samych białek.

7. Blokowanie niespecyficznych miejsc wiązania (tylko dla wielu wzorców białkowych)

UWAGA: Mikro-wzorcowanie z wieloma białkami w tym samym mikrodołku obejmuje sekwencyjne etapy tworzenia wzorów (zobacz Rysunek 2). Do mikrostudzienek dodaje się środek blokujący (PLL-PEG lub BSA), aby zapobiec wiązaniu krzyżowemu, które występuje, gdy drugie inkubowane białko (etap 9) wiąże się z pierwszym inkubowanym białkiem (etap 6), unikając w ten sposób mieszaniny białek w obrębie wzorów.

  1. W sterylnych warunkach dodaj 20 μl PLL-PEG (0,1 mg/ml w PBS) lub BSA (1% BSA w PBS) jako etap blokujący, aby zapobiec wiązaniu krzyżowemu.
    UWAGA: Skuteczność blokowania może się różnić w zależności od charakteru używanych białek i powinowactwa między nimi. Zaleca się wcześniejsze przetestowanie zarówno PLL-PEG, jak i BSA jako środków blokujących (Rysunek 10D-I).
  2. Inkubować środek blokujący w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę i chronić przed światłem. Usunąć 15 μl środka blokującego i przemyć wszystkie mikrostudzienki trzykrotnie 20 μl PBS. Zawsze zostawiaj około 5 μl PBS między praniami.
  3. Usunąć 18 μl PBS ze wszystkich mikrostudzienek i dodać 5 μl PLPP do każdej mikrostudzienki, upewniając się, że PLPP jest jednorodny na całej powierzchni mikrostudzienek.

8. Druga runda fotowzorców (tylko dla wielu wzorów białkowych)

UWAGA: Po pierwszej rundzie fotowzorca i inkubacji białek, generowany jest mikro-wzór. Podczas drugiej rundy fotomodelowania, wzór dla drugiego białka zostanie wygenerowany w tym samym mikrodołku (patrz Rysunek 2C i Rysunek 5D). W oprogramowaniu wybierz odpowiednie szablony wzorców (akcje), które zostaną utworzone podczas tej rundy (patrz Rysunek 5D).

  1. Przejdź do pierwszej mikrostudzienki (Rysunek 4D). Zapewnij odpowiednie nakładanie się cyfrowego zwrotu z inwestycji i mikrostudzienki.
  2. Załaduj zapisaną wcześniej konfigurację szablonu (krok 5.12) i wybierz akcje, które mają być wzorowane podczas drugiej rundy fototworzenia wzoru (odznacz akcje z pierwszej rundy, patrz Rysunek 5D).
  3. Wybierz symbol Odtwórz, aby rozpocząć tworzenie wzoru. Upewnij się, że laser jest włączony w oprogramowaniu.

9. Druga runda inkubacji białek (tylko dla wielu wzorców białkowych)

UWAGA: W tej części protokołu, białko/białka znakowane fluorescencyjnie będą inkubowane na szalce hodowlanej po drugiej rundzie fotowzorcowania.

  1. W sterylnych warunkach umyj mikrostudzienkę trzykrotnie 20 μl PBS w celu usunięcia PLPP. Usuń 18 μl PBS i dodaj 20 μl roztworu białka ECM do każdej mikrostudzienki. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 20-30 minut i chronić przed światłem.
    UWAGA: Optymalne czasy inkubacji powłoki mogą się różnić w zależności od rodzaju i stężenia białek.
  2. Po inkubacji usunąć 15 μl roztworu białka ECM i przemyć mikrostudzienki trzykrotnie 20 μl PBS. Zawsze zostawiaj około 5 μl PBS między praniami.
  3. Przejdź do przechowywania szalki hodowlanej (krok 10) lub do posiewu komórek (krok 11 i zobacz Rysunek 2).
  4. Opcjonalny etap kontroli jakości: za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego wizualizuj i obrazuj wydrukowane wzory przed posiewem komórek. Wybierz odpowiednie kanały fluorescencyjne i dostosuj czas ekspozycji.
    UWAGA: Aby porównać intensywność fluorescencji wzorców między eksperymentami, konieczne jest użycie tych samych czasów ekspozycji dla tych samych białek.

10. Przechowywanie mikro-wzorów

UWAGA: Mikrowzorce z zaadsorbowanymi białkami mogą być przechowywane podczas różnych etapów protokołu (zobacz Rysunek 2). W przypadku mikro-wzorów z wieloma białkami, mikro-wzorce mogą być przechowywane po pierwszej rundzie mikro-wzorca lub po zakończeniu dwóch kolejnych rund mikro-wzorców (patrz Rysunek 2B).

  1. W przypadku pasywacji PLL-PEG należy przechowywać mikrowzory w PBS (3 ml na studzienkę) w temperaturze 4 °C przez okres do 3 dni.
  2. Jeśli szalka hodowlana została pasywowana PEG-SVA, mikrowzory mogą być przechowywane do 1 miesiąca. W tym celu należy intensywnie spłukać mikrowzory podwójnie destylowaną wodą dejonizowaną i wysuszyć sterylnym pistoletem pneumatycznym z argonu lub azotu, chociaż można również użyć zwykłego powietrza. Po wyschnięciu mikrowzory mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca (zespół wsparcia systemu PRIMO, komunikacja osobista).

11. Komórki poszycia

UWAGA: Podczas następnych kroków, komórki zostaną posiane na przygotowanym mikrowzorze szalki hodowlanej. W tych badaniach wykorzystywana jest linia komórek neuronalnych (komórki CAD)31. Protokół ten można jednak dostosować do badania innych typów komórek będących przedmiotem zainteresowania (dostosować protokół posiewu komórek zgodnie z wymaganiami).

  1. Różnicuj komórki CAD przez 48 godzin przy użyciu pożywki różnicującej (DMEM uzupełniony 1% glutaminy, bez surowicy i z 1% Pen/Strep, patrz tabela materiałów).
  2. Płytkę o objętości 1 ml pożywki z komórkami w wewnętrznej szklanej studzince, przykrywając wszystkie mikrostudzienki i umieścić naczynie hodowlane w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO2 .

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Postępowanie zgodnie z powyższym protokołem skutkuje powstawaniem powierzchni pokrytych mikrowzorzyskami, pokrytymi interesującym białkiem ECM. Używamy tych wzorców do śledzenia neuronalnych ścieżek.

Wygenerowane wzorce powinny być dokładnym odwzorowaniem szablonu. Przykład jest pokazany w Rysunek 6, gdzie cyfrowy szablon wzorca (Rysunek 6A) reprezentujący jedną jednostkę projektową (Rysunek 5B), zaowocował zdefiniowanymi mikrowzorcami, o szerokości od 20 do 2 μm, pokrytymi oznaczonym Fibrynogenem (Rysunek 6B). Za pomocą ImageJ uzyskano pomiary intensywności fluorescencji zarówno w pionie (Rysunek 6C), jak i w poziomie (Rysunek 6E) wzdłuż paska i z odpowiadającego mu obszaru tła 15 μm nad każdym paskiem. Pomiary tła zostały odjęte od pomiarów wzoru dla każdej szerokości paska.

Jednym z ograniczeń systemu jest to, że efekt krawędzi można zaobserwować (Rysunek 6B, górny pasek) podczas drukowania cech ≥20 μm, z sygnałem o większej intensywności na krawędziach wzoru w porównaniu do środka (Rysunek 6D, pierwszy pik profilu natężenia fluorescencji). W naszych eksperymentach granica rozdzielczości wynosiła około 2 μm; przy tej szerokości zaobserwowaliśmy znaczny spadek (o około 50%) intensywności fluorescencji fibrynogenu w porównaniu z intensywnością szerszych pasków (Rysunek 6F,G). Wzorowanie przy użyciu systemu PRIMO i opisanego tutaj protokołu pozwoliło uzyskać powtarzalne wzory, z najwyższym odchyleniem standardowym średniej intensywności fluorescencji zmierzonej dla szerokości 2 μm z czterech indywidualnie powtórzonych jednostek konstrukcyjnych (Rysunek 6G). Stwierdzono również, że zmienność w obrębie wzorzystych pasków jest niewielka; Współczynnik zmienności wahał się od 3 do 10%, przy czym największe zróżnicowanie wewnętrzne miały paski 20 μm i 2 μm. Prawdopodobnie jest to wynikiem odpowiednio efektu krawędzi i limitu rozdzielczości systemu. Zwróć uwagę, że w przypadku tych pomiarów zmierzyliśmy tylko intensywność w środku pasków, aby uniknąć nierównomiernego oświetlenia wynikającego z obiektywu użytego do uzyskania tych obrazów (winietowanie, Rysunek 6E).

Niektóre eksperymenty mogą obejmować pytania, które wymagają określonych stężeń białka, co można osiągnąć na dwa sposoby: 1) różnicowanie stężenia białka (Rysunek 7A,B). Inkubacja z różnymi stężeniami lamininy powoduje znacznie różną intensywność fluorescencji, zwiększającą się wraz ze wzrostem stężenia białka (Rysunek 7B). 2) Dawka lasera używana do rozszczepiania folii antyadhezyjnej (PEG) może być zmieniana. Wyższe dawki lasera w większym stopniu usuną film przeciwporostowy, generując więcej miejsc wiązania dla interesujących białek ( Rysunek 7C,D), co skutkuje znacznie różną intensywnością fluorescencji, zwiększającą się wraz z wyższymi dawkami lasera ( Rysunek 7D).

Zmiana dawki lasera pozwala na generowanie gradientów białek w obrębie tego samego wzoru. Jest to wyświetlane w Rysunek 8A, gdzie szablon gradientu został zaprojektowany przy użyciu różnych poziomów skali szarości, od czarnego (brak mocy lasera) do białego (maksymalna moc lasera).

Intensywność lasera jest proporcjonalna do poziomu skali szarości szablonu (od 0 do 255 na obrazie 8-bitowym), generując gradienty oświetlenia UV. Pomiar profilu intensywności fluorescencji wzdłuż paska gradientu jest liniowy w szablonie wzoru (Rysunek 8B) oraz w wygenerowanym wzorze gradientu (Rysunek 8C,D). Jest to możliwe do odtworzenia wśród wszystkich gradientowych pasków w tym samym szablonie i wzorze gradientu ( Rysunek 8B, D). Generowanie takich gradientów jest niezwykle przydatne i pomaga naśladować środowiska in vivo, w których komórki często reagują na gradienty białek bioaktywnych34,35,36,37.

Komórki wyczuwają zmieniające się środowiska zewnątrzkomórkowe, ale testy, które umożliwiają badanie zachowania komórek, gdy komórki napotykają takie zmiany, są ograniczone. LIMAP może być używany do mikromodelowania z wieloma białkami w tej samej mikrostudzince. Przykłady są pokazane w Rysunek 9, gdzie wygenerowano wzory krzyżowe z paskami fibronektyny (poziomej) i lamininy (pionowej). Podczas tworzenia wzorców z wieloma białkami ważne jest, aby zastosować etap blokujący między pierwszą a drugą inkubacją białka, aby zapobiec wiązaniu krzyżowemu białek (patrz krok 7). Skuteczność blokowania może się różnić w zależności od charakterystyki biochemicznej białek używanych do powlekania i zalecamy przetestowanie kilku blokujących, w tym PLL-PEG (0,1 mg/ml) i BSA (1%). Aby ocenić ten efekt wiązania krzyżowego, przeprowadziliśmy pomiary intensywności fluorescencji za pomocą ImageJ (Rysunek 9) i wykazaliśmy, że wiązanie krzyżowe można znacznie zmniejszyć, stosując bufor PLL-PEG (0,1 mg / ml) dla wzorów krzyżowych fibronektyny i lamininy (Rysunek 9D,H).

Wygenerowane wzorce krzyżowe zostały wykorzystane do testów komórkowych z komórkami CAD (Rysunek 10A,B) lub neuronami zwoju grzbietowo-korzeniowego szczura (DRG) (Rysunek 10C). Ich neuryty (CAD) i aksony (DRG) rosną w różnych liniach. Komórki CAD są używane jako model neuronalny, ponieważ wykazują podobny profil ekspresji integryny w porównaniu z neuronami pierwotnymi i nadal wykazują stożki wzrostu bogate w aktynę po 48 godzinach w hodowli (Rysunek 10B), co czyni je odpowiednimi do badań nad odnajdywaniem ścieżki.

W celu zbadania możliwych cytotoksycznych efektów generowanych mikrowzorców w kierunku pierwotnych neuronów, neurony DRG zostały wyizolowane i wyhodowane na mikrowzorcach zgodnie z wcześniej opublikowanym protokołem38. Wyniki pokazują, że neurony pierwotne tolerują środowisko mikrowzorców (Rysunek 10C). Obecnie badamy, w jaki sposób różne białka ECM wpływają na odnajdywanie ścieżki aksonalnej (neurytowej). Wstępny dowód koncepcji znalezionych w komórkach CAD będzie dalej badany przy użyciu neuronów DRG. W celu sprawdzenia jakości generowanych mikrowzorów pożądane jest obrazowanie wzorów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, aby upewnić się, że krawędzie wzoru są dobrze zdefiniowane przed przystąpieniem do posiewu komórek. Podczas procesu obrazowania ważne jest, aby zapewnić regulację optyczną między mikroskopem a kamerą, aby uniknąć efektu przyciemnienia obwodowego (winietowania), który wpływa na późniejszą analizę i interpretację danych. Dodatkowo uzyskaj obraz obszaru wolnego od wzoru przy użyciu tych samych czasów ekspozycji, które zostaną użyte do zobrazowania wzorów, i odejmij ten obraz od obrazu wzoru.

Podsumowując, dla dobrej jakości generowania mikrowzorów, zaleca się ocenę stężenia białka (Rysunek 7A,B), dawki lasera (Rysunek 7C,D), poziomy tła białek (Rysunek 6E,F,H) oraz skuteczny krok blokujący (Rysunek 9) w przypadku stosowania wielu białek. Podsumowując, jakość mikrowzorów generowanych za pomocą LIMAP ma zasadnicze znaczenie dla uzyskania wiarygodnych i odtwarzalnych danych z testów komórkowych.

Diagram technik mikrowzorów; metody mikrokontaktowe, wspomagane laserowo, fotomodelingowe i LIMAP.
Rysunek 1: Schemat technik mikromodelowania: druk mikrokontaktowy i modelowanie wspomagane laserowo. (A) Drukowanie mikrokontaktowe wykorzystuje litografowany wzorzec ze zdefiniowanymi mikrocechami do wygenerowania stempla PDMS, który jest inkubowany z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania. Białko to jest następnie przenoszone (tłoczone) na szklaną powierzchnię, generując mikrowzory białek. (B) Techniki modelowania wspomaganego laserowo obejmują fotomodelowanie i bezpośrednie modelowanie laserowe. (C) Większość podejść do fotowzorców wykorzystuje źródło światła UV i fotomaskę (w kontakcie z powierzchnią podłoża lub w płaszczyźnie ogniskowej obiektywu) o pożądanej geometrii w celu rozszczepienia powierzchni przeciwporostowej PEG w określonych pozycjach, tworząc określony wzór. Kolejny etap inkubacji białka powoduje adsorpcję białka tylko w obszarach rozszczepionych laserowo. (D) LIMAP jest techniką fotomodelowania, która nie wymaga fotomaski w kontakcie z podłożem (tj. podejście bezmaskowe i bezkontaktowe). LIMAP wykorzystuje fotoinicjator, który jest aktywowany przez niskie dawki lasera, rozszczepiając naświetlone obszary PEG. W ten sposób powstają miejsca przyłączenia do sekwencyjnej adsorpcji białek. (E) Bezpośrednie modelowanie laserowe wykorzystuje światło o wysokiej energii do bezpośredniego wytrawiania folii PEG, umożliwiając wiązanie białek w tych wytrawionych obszarach. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Diagram mikrowzorów przedstawiający jedną i wiele rund białkowych. Proces od kalibracji do posiewu ogniw.
Rysunek 2: Schemat przedstawiający podsumowanie kroków w protokole mikrowzorców. (A) Mikro-modelowanie z jednym białkiem obejmuje tylko jedną rundę mikro-wzorcowania (foto-wzorcowanie i inkubacja białek) i może być wykonane w czasie krótszym niż 8 godzin. (B) Mikro-modelowanie z wieloma białkami wymaga dwóch sekwencyjnych rund mikro-wzorów i może być zakończone w ciągu 1-2 dni, w zależności od liczby przygotowywanych mikrowzorów. Możliwe jest przejście przez wersję B protokołu w ciągu 1 dnia pracy. Ciągłe strzałki wskazują bezpośredni przepływ kroków w protokole. Nieciągłe strzałki wskazują, że istnieje znaczna różnica czasu między jednym krokiem a drugim (patrz kroki 6.6 i 9.3). (C) Schematyczny widok przykładowych wzorów uzyskanych po jednej rundzie mikro-wzoru (czerwone paski) lub dwóch kolejnych rundach mikro-wzorów (czerwone i zielone paski). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Obraz mikroskopowy przedstawiający wzór białka fibrynogenu z literami AKCM, skala 50 μm, znakowane sekcje.
Rysunek 3: Generowanie szablonów wzorców jest wszechstronne dzięki LIMAP. Panie przewodniczący, panie i panowie! Przykłady szablonów wzorów zaprojektowanych za pomocą ImageJ (kusze A, litery B). Kształty narysowane w kolorze białym były wyświetlane z maksymalną mocą lasera, a kształty narysowane w kolorze czarnym nie były wyświetlane. (C,D) Mikrowzory uzyskane za pomocą LIMAP z matryc po inkubacji z 10 μg/ml fibrynogenu (zielony). (C) Kusze mają szerokość 50 μm i wysokość 50 μm w odstępach 75 μm w poziomie i 50 μm w pionie. (D) Litery mają szerokość 80 μm i wysokość 85 μm. Podziałka w C i D reprezentuje 50 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Hodowla komórkowa na płytkach wielodołkowych, schemat i wyniki; Zestaw do analizy testów biologicznych.
Rysunek 4: Podstawowe materiały do protokołu LIMAP. (A) Szablony używane w tym protokole to cienkie, okrągłe kawałki PDMS o średnicy 20 mm (grubość 250 μm) zawierające 4 mikrostudzienki (każda o średnicy 4 mm). Objętości stosowane w mikrostudzienkach wahają się od 5 do 20 μl, co znacznie zmniejsza ilość odczynników i białek potrzebnych do każdego eksperymentu. (B) 6-dołkowe naczynie ze szklanym dnem, w którym szablony zostały już umieszczone w każdej studzience. Mikrostudzienki zawierają 20 μl PBS, aby były widoczne. (C) Naczynie kalibracyjne, w którym wewnętrzna szklana studzienka została oznaczona zielonym zakreślaczem, który posłuży do kalibracji ostrości lasera. (D) Schematyczny widok lewego górnego dołka z 6-dołkowego szklanego dna w B (obrysowanego przerywanym czerwonym kółkiem). Wewnętrzna szklana studzienka dolna jest przedstawiona w kolorze białym, a szablon jest pokazany w kolorze szarym. Szablon zawiera 4 mikrodołki (ponumerowane od 1 do 4), do testowania 4 różnych warunków eksperymentalnych (np. różne stężenia białek, geometrie wzorów, kombinacje białek itp.). Gwiazdka oznacza mikrostudzienkę zawierającą wzór odniesienia. (E) Schematyczny widok mikrostudzienki, w której w górnej części został wygenerowany wzór odniesienia (strzałka z wypełnionym grotem strzałki). Ten wzór odniesienia jest wymagany do uzyskania optymalnej ostrości lasera do modelowania (patrz krok 4). Strzałka z pustym grotem strzałki wskazuje środkowy obszar mikrostudzienki, który zostanie wykorzystany do późniejszego modelowania po kalibracji systemu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Diagram mikrowzorców przedstawiający proces replikacji, odstępy między wierszami i sekwencyjne działania związane z tworzeniem wzorców.
Rysunek 5: Konfiguracja oprogramowania do mikromodelowania. (A) Szablon wzoru z równoległymi paskami zaprojektowany za pomocą ImageJ i zapisany jako 8-bitowy plik Tiff. (B-D) Schematyczny widok cyfrowych ROI (obszarów zainteresowania), które będą pokrywać się z obecnymi mikrodołkami, w których będą generowane mikrowzorce. (B) Szablon wzoru, który ma być użyty (długość 1824 piksel = 415 μm, szerokość 1140 pikseli = 260 μm) jest wybierany w Leonardo i jest rzutowany na ROI jako jednostka projektowa (czerwone paski w czarnym przerywanym prostokącie), która pokryje około 0,1mm2 obszaru mikrostudzienki. Jednostka projektowa jest powielana w 4 kolumnach i 4 wierszach w menu Replikacja (konfiguracja szablonu), tworząc wzór w poprzek mikrostudzienki. Zwróć uwagę na odstępy między kolumnami. (C) Aby utworzyć wzór ciągłych pasków, należy dostosować odstępy między kolumnami. W tym przypadku, aby uzyskać nakładanie się jednostek projektowych, odstępy między kolumnami są ustawiane w menu replikacji jako Odstępy ujemne, -20 μm. (D) Aby stworzyć model wielu białek w tej samej mikrostudzince, wymagane jest dokładne wyrównanie wzorców. Na etapie konfiguracji oprogramowania (krok 5) załaduj jednocześnie wszystkie żądane szablony wzorów. Na liście Akcje wybierz tylko te akcje, które mają być wzorcowane podczas każdej rundy tworzenia wzorca i odznacz pozostałe akcje (kroki 5.12, 5.13 i 8.2). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Analiza mikrowzorców za pomocą fibrynogenu; Diagramy pokazują profile linii, wykresy intensywności i zmienności.
Rysunek 6: Analiza zmienności wzorca przy użyciu LIMAP. (A) Szablon wzoru zaprojektowany za pomocą ImageJ używany do mikrowzoru czterech pasków o różnej szerokości (20, 10, 5, 2 μm, od góry do dołu). (B) Mikrowzór otrzymany po inkubacji z 10 μg/ml fibrynogenu znakowanego fluorescencyjnie (kolor zielony). (C) Pomiary intensywności wzdłuż pionowej linii przecinającej paski mikrowzoru. (D) Pionowy profil intensywności fluorescencji uzyskany na podstawie pomiaru w (C). ZAUWAŻ, że przy większych szerokościach (20 μm) występuje różnica w profilu pionowym spowodowana akumulacją białka na krawędziach prążka, co skutkuje dwoma wyraźnymi pikami intensywności fluorescencji (efekt krawędzi). Efekt ten jest widoczny tylko w szerokościach pasów ≥20 μm. (E) Pomiary intensywności wzdłuż przedstawionych linii poziomych (fluorescencja i tło). (F) Poziome profile intensywności fluorescencji uzyskane z pomiarów w (E). (G) Wykres przedstawiający średnią intensywność dla każdej szerokości paska, mierzoną na podstawie czterech pojedynczych powtórzonych jednostek konstrukcyjnych (zmienność między wzorami). UWAGA zmniejszona adsorpcja białek do wzorów o szerokości pasków 2 μm. (H) Zmienność w obrębie wzorzystych pasków (współczynnik zmienności) była niska dla wszystkich szerokości pasków i wynosiła od 3 do 10%. Dane w G i H pokazano jako średnią ± SD. Analizę statystyczną w G i H przeprowadzono przy użyciu jednoczynnikowego testu nieparametrycznego ANOVA (Kruskala-Wallisa) z wielokrotnymi porównaniami. Wartość P wynosi <0,001 dla ** istotności. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wpływ dawki białka i lasera; Laminina, paski fibronektyny; wykresy intensywności fluorescencji, eksperyment.
Rysunek 7: Wpływ zmian mocy lasera i stężenia białka na wydajność adsorpcji białek. (A) Powierzchnię PLL-PEG rozszczepiono laserowo stałą dawką lasera (1390 mJ/mm2) i inkubowano ze wskazanymi stężeniami znakowanej fluorescencyjnie lamininy (magenta). (B) Kwantyfikacja intensywności fluorescencji pasków lamininy w (A). (C) Zastosowano różne wskazane dawki lasera, a następnie inkubację o tym samym stężeniu (10 μg/ml) fibronektyny znakowanej fluorescencyjnie (kolor zielony). (D) Kwantyfikacja intensywności fluorescencji pasków fibronektyny w (C) wykazująca, że wyższe dawki lasera korelują z wyższymi poziomami zaadsorbowanego białka. Wszystkie pomiary są odejmowane w tle. Numery prób są wskazane na dole kolumn; dane są przedstawiane jako średnia ± SEM. Analizę statystyczną przeprowadzono przy użyciu nieparametrycznego testu Manna-Whitneya z obliczeniami dwustronnymi. Wartość P wynosi <0,0001 dla istotności ****. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wzór gradientu w fibronektynie; schemat, wykres; mikroskopia fluorescencyjna; analiza profilu intensywności.
Rysunek 8: Generowanie gradientu stężenia białka w mikrowzorze. (A) Szablon wzoru gradientu w skali szarości. (B) Profil intensywności fluorescencji mierzony od (A). (C) Wzór uzyskany za pomocą LIMAP z matrycy wzoru w (A) po inkubacji z 10 μg/ml fluorescencyjnie znakowanej fibronektyny (kolor zielony). (D) Profil intensywności fluorescencji n = 3 pasków i tła przedstawionego jako średnia ± SEM, pokazujący liniowy wzrost intensywności gradientu białka. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Modelowanie białek za pomocą BSA, blokowanie PLL-PEG; obrazowanie fluorescencyjne, analiza wykresu intensywności.
Ryc. 9: Efekt wiązania krzyżowego podczas sekwencyjnego modelowania kilku białek. (A-C, E-G) Wzory krzyżowe z paskami 10 μm znakowanej fluorescencyjnie fibronektyny (cyjan, poziomy) i fluorescencyjnie znakowanej lamininy (magenta, pionowa). (A-C) Próbki poddane działaniu buforu blokującego BSA. (E-F) Próbki poddane działaniu PLL-PEG w celu zablokowania niespecyficznych miejsc wiązania (krok 7). (A,E) Połączone kanały fluorescencyjne pokazujące zarówno fibronektynę, jak i lamininę. (B,F) Obraz przedstawiający tylko fibronektynę. (C,G) Obraz przedstawiający samą lamininę. W przypadku C należy zwrócić uwagę na obecność lamininy również na poziomych paskach fibronektyny dodatniej, co wynika z nieskutecznego blokowania wolnych miejsc wiązania za pomocą BSA. W przypadku G należy pamiętać, że blokowanie za pomocą PLL-PEG zapobiega skutecznemu wiązaniu lamininy z paskami fibronektyny. (D,H) Profile intensywności fluorescencji uzyskane ze wskazanych pomiarów (żółta linia ukośna) odpowiednio w A i E. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Schemat komórek CAD i neuronów DRG z etykietami lamininy, fibronektyny, tubuliny; Konfiguracja mikroskopowa.
Rysunek 10: Wzorce krzyżowe w celu zbadania znajdowania ścieżki neuryt/akson. (A-C) Wzory krzyżowe z paskami 10 μm znakowanej fluorescencyjnie fibronektyny (cyjan, poziomy) i fluorescencyjnie znakowanej lamininy (magenta, pionowa). Panie przewodniczący, panie i panowie! Fluorescencyjne obrazy komórek CAD z neurytami rosnącymi wzdłuż mikrowzorów. Aby uwidocznić neuryty, komórki hodowano przez 48 godzin, utrwalano 4% PFA i barwiono na tubulinę (A) lub tubulinę i aktynę (B). (C) Neurony zwoju grzbietowo-korzeniowego szczura (DRG) z aksonami rosnącymi wzdłuż mikrowzorców. Aby uwidocznić aksony, neurony DRG hodowano przez 72 godziny, utrwalano za pomocą 4% PFA i barwiono na tubulinę. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Fluorescencja fibrynogenu; wysuszone mikrostudzienki, nieciągłe, rozproszone paski na obrazach mikroskopowych.
Rysunek 11: Przykłady typowych ujemnych wyników uzyskiwanych podczas generowania mikrowzorców za pomocą LIMAP. (A-C) Nieoptymalne wzorzyste paski fibrynogenu znakowanego fluorescencyjnie (zielone) o stężeniu 10 μg/ml uzyskane w różnych warunkach. (A) Mikrostudzienka wyschła podczas generowania wzoru. Zwróć uwagę na wysoki poziom fluorescencji w tle (strzałka) i obecność kryształów PBS (gwiazdki). (B) Szwy między paskami nie zostały odpowiednio wyregulowane podczas konfiguracji oprogramowania, co spowodowało nieciągłe paski z przerwami (strzałkami) między jednostkami konstrukcyjnymi (patrz krok 3.4.7). (C) Ogniskowanie lasera było nieoptymalne, powodując powstawanie rozproszonych pasków (strzałek), które nie reprezentują rzeczywistych szerokości pasków szablonu wzoru, które powinny wynosić 20, 10, 5, 2 μm od góry do dołu, jak w (B). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zalety mikrowzorcowania LIMAP (PRIMO) i porównanie z drukiem mikrokontaktowym
Podczas gdy druk mikrokontaktowy jest prawdopodobnie najczęściej stosowaną techniką mikrowzorów w dziedzinie biologii39, wydaje się, że rośnie liczba badaczy korzystających z technologii LIMAP 40,41,42,43,44. W tym miejscu zaprezentowaliśmy protokół wykorzystujący PRIMO, dostępny na rynku system dla LIMAP. Poniżej pokrótce omówiono potencjalne zalety i ograniczenia druku mikrokontaktowego i fotowzorców LIMAP.

Druk mikrokontaktowy wymaga litografowanych wzorców wytwarzanych przez wirowanie maski fotograficznej (zwykle SU-8) na szklanej lub krzemowej płytce, która jest następnie trawiona laserowo z pożądanymi mikrocechami. Te wzorce są używane jako szablony do tworzenia pieczęci PDMS45. Stempel jest inkubowany z wybranym białkiem, które adsorbuje się do niego, a następnie jest przenoszony (stemplowany) na szalkę do hodowli komórkowej. Proces adsorpcji białka do stempla PDMS jest zależny od stężenia białka, buforu i czasu inkubacji. Aby uzyskać optymalne wyniki, parametry te należy wcześniej przebadać46.

Mastery mogą być używane w znacznej liczbie eksperymentów, trwających miesiące, a nawet lata, jeśli są prawidłowo zachowane. Czynnikiem ograniczającym tę technologię jest jednak konieczność przeprojektowywania nowych wzorców litografowanych dla każdej pożądanej modyfikacji. Zmiany w projektach eksperymentalnych mogą skutkować czasochłonną produkcją nowych wzorców (nawet do kilku tygodni), co opóźni eksperymenty. Dla porównania, fotowzorce LIMAP nie wymagają fizycznego wzorca; Wykorzystuje generowane programowo szablony szablonów, które można wykorzystać do elastycznego dostosowywania pożądanych geometrii mikrowzorów do zmieniających się pytań badawczych. LIMAP może być również używany do generowania gradientów białek w obrębie tego samego mikrowzoru (ryc. 8), który jest trudniejszy do uzyskania w powtarzalny sposób przy użyciu drukowania mikrokontaktowego47.

Co więcej, rozdzielczość mikrowzorów osiągnięta za pomocą LIMAP w naszym przypadku wynosi 2 μm (rysunek 6B).

Zbliżenie się do tej rozdzielczości zwiększyło zmienność wewnątrz i między wzorcami. Generowanie wzorów o szerokości około 10 μm lub większej było wysoce powtarzalne (rysunek 6G,H). Wręcz przeciwnie, w przypadku druku mikrokontaktowego trudno jest konsekwentnie uzyskiwać rozdzielczości poniżej 10 μm i często można znaleźć artefakty podczas stemplowania małych elementów (dane nie są pokazane).

Wykazaliśmy, że LIMAP może być używany do mikromodelowania wielu białek (ryc. 9) w tej samej mikrostudzience, co pozwala na dodanie dalszych poziomów złożoności do eksperymentów. Chociaż można to osiągnąć za pomocą druku mikrokontaktowego, wyrównywanie różnych białek z dużą precyzją może być dość wymagające z technicznego punktu widzenia. Podczas gdy modelowanie wielu białek za pomocą LIMAP wydaje się proste, ważne jest, aby wspomnieć, że wiązanie krzyżowe białek poprzez sekwencyjne procedury powlekania można zmniejszyć poprzez blokowanie odczynników, ale nie całkowicie wyeliminować (Figura 9).

Jeśli chodzi o koszt jednej lub drugiej techniki, LIMAP, jak opisano tutaj, wymaga zakupu sprzętu do mikrowzorcowania (PRIMO), który może być zainstalowany na różnych mikroskopach fluorescencyjnych i wymaga zmotoryzowanego stolika. Chociaż inwestycja ta jest początkowo kosztowna, na dłuższą metę nie ma żadnych dodatkowych zakupów poza materiałami eksploatacyjnymi (szablony, PEG i PLPP) związanymi z LIMAP. Alternatywnie, szablony PDMS mogą być również wyprodukowane w laboratorium przez własnego eksperymentatora zgodnie z opublikowanymi protokołami18,32. Największe koszty druku mikrokontaktowego mogą wiązać się z produkcją nowych wzorców, które mogą stać się znaczne, jeśli eksperymenty wymagają nowych wzorów.

Jedną z wad LIMAP jest stosunkowo niska przepustowość tej techniki. Druk mikrokontaktowy może szybko i wydajnie wytworzyć dużą liczbę mikrowzorów w jednoczesnym etapie tłoczenia, w porównaniu z wymaganym sekwencyjnym mikroszablonami laserowymi za pomocą LIMAP. Na przykład możliwe jest wyprodukowanie 6 szkiełek nakrywkowych tłoczonych w ciągu około 2 godzin z nadrukiem mikrokontaktowym przy użyciu stempli PDMS (bez przygotowania stempla); Ułożenie wzoru na podobnym obszarze (czasza 6-dołkowa) za pomocą LIMAP zajęłoby około 4 godzin, wyłączając procedurę pasywacji powierzchni (biorąc pod uwagę konfigurację szablonu wzoru opisaną w kroku 5.12 i patrz rysunek 5B).

Kolejnym czynnikiem ograniczającym szybkość technologii LIMAP jest długi czas oświetlenia wymagany do tworzenia wzorów na dużych obszarach (30 s na jednostkę konstrukcyjną w przypadku lasera o mocy 7,5 mW/mm2 ). W takich przypadkach preferowaną opcją może być druk mikrokontaktowy. Nowo dostępny fotoinicjator (żel PLPP, Tabela Materiałów) powinien znacznie skrócić czas potrzebny na wykonanie wzoru, umożliwiając wygenerowanie setek mikrowzorów na dużych obszarach (do 8mm2) w ciągu zaledwie kilku minut.

Innym ważnym czynnikiem, który należy wziąć pod uwagę przy mikrotworzeniu powierzchni do hodowli komórkowych, jest odtwarzalność mikrowzorów w różnych powtórzeniach eksperymentalnych, w porównaniu ze zmiennością uzyskaną przy drukowaniu mikrokontaktowym. Na przykład wykresy pokazane na rysunku 7B,D są reprezentatywnymi danymi trzech niezależnych powtórzeń eksperymentalnych z bardzo podobnymi wynikami (dane nie pokazane). Opierając się na naszym doświadczeniu i wcześniejszych publikacjach, ten poziom powtarzalności jest trudny do osiągnięcia przy druku mikrokontaktowym 48,49,50,51,52.

W przeciwieństwie do innych technik fotomodelowania, które wymagają albo dedykowanej chemii do inżynierii materiałów światłoczułych, albo stosowania fotouczulaczy, które na ogół nie są zbyt biokompatybilne3, światłoczuły składnik LIMAP (PLPP) jest biokompatybilny i dobrze tolerowany przez komórki21; w naszych rękach nie doświadczyliśmy żadnej cytotoksyczności w różnych komórkach, w tym CAD, neuronach DRG (ryc. 10), fibroblastach, komórkach nabłonka i komórkach czerniaka (dane nie pokazane). Kolejną zaletą LIMAP z wykorzystaniem PRIMO w porównaniu z innymi technikami tworzenia fotowzorów jest to, że nie jest wymagana fotomaska. Podobnie jak w przypadku druku mikrokontaktowego, nowe fotomaski musiałyby być zaprojektowane i wygenerowane dla każdego pożądanego wzoru.

Wszystkie wymienione powyżej ograniczenia dotyczące druku mikrokontaktowego odnoszą się do ręcznego podejścia do tej techniki. Możliwe jest jednak zwiększenie przepustowości i powtarzalności druku mikrokontaktowego przy użyciu zautomatyzowanego urządzenia z kontrolą obciążenia stempla i nacisku53.

Kluczowe kroki protokołu i rozwiązywanie problemów dla LIMAP za pomocą PRIMO
Jednym z najczęstszych problemów wykrywanych podczas tego protokołu jest wysoki poziom fluorescencji tła w mikrowzorcach. Może to być spowodowane wysychaniem mikrostudzienek, co często następuje ze względu na ich małą objętość. W takim przypadku kryształy PBS często pojawiają się wokół wzorców ECM (ryc. 11A).

Niewystarczające lub nieefektywne etapy mycia po inkubacji białek mogą również powodować wysoki poziom fluorescencji tła. Można to zaobserwować szczególnie przy stosowaniu stężeń białka 10 μg/ml (ryc. 11B) lub wyższych. Nadmiar białka w tle można zmniejszyć, włączając dodatkowe etapy prania za pomocą PBS.

Obecność tła białkowego musi być mierzona i charakteryzowana w każdym doświadczeniu, obliczając intensywność fluorescencji tła (Rysunek 6E) i odejmując ją od intensywności mikrowzorów (Rysunek 6F-H i Rysunek 7B, D). Wysokie tło białkowe może mieć wpływ na przyłączanie i kiełkowanie komórek CAD, utrudniając interpretację wyników.

Luki między jednostkami konstrukcyjnymi są częstym problemem, gdy użytkownicy mają ograniczone doświadczenie (Rysunek 11B), co wynika z niewystarczającego nakładania się wzorców. Aby temu zaradzić, w oprogramowaniu Leonardo można dostosować dwa parametry: 1) może być wymagany ujemny odstęp między kolumnami, w zależności od projektu wzoru (krok 5.7 i patrz rysunek 5B,C). Alternatywnie, 2) użyj opcji gradientu w menu Expert , aby zszyć kolumny. Szybki test w celu określenia optymalnych parametrów rozstawu można wykonać przy użyciu kleju UV (Tabela Materiałów). Niewielką kroplę tego kleju nakłada się na szklane szkiełko, które następnie przykrywa się szklanym szkiełkiem nakrywkowym, tworząc film. Osadzony klej UV jest fotomodelowany za pomocą interesującego szablonu wzoru przy użyciu niskiej dawki lasera (30 mJ/mm2). Obszary osadzonego kleju naświetlone promieniami UV zostaną utwardzone, stając się widoczne pod mikroskopią w jasnym polu. Wyniki testu są wizualizowane w celu oceny uzyskanych odstępów w obrębie wzoru. W naszych eksperymentach neuronalnych przerwa między paskami może niekorzystnie wpływać na zachowanie komórek, powodując zmiany w dynamice wzrostu (albo zmniejszona prędkość, albo porzucenie ścieżki).

W najnowszej aktualizacji oprogramowania Leonardo (w momencie publikacji Leonardo 4.11) możliwe jest wgranie wcześniej zaprojektowanych szablonów większych wzorów, które pokrywają znacznie większy obszar (do 8mm2 przy użyciu obiektywu 20X) powierzchni mikrostudzienki w porównaniu z obecnymi 0,1mm2 na jednostkę projektową, eliminując potrzebę zszywania ze sobą mniejszych jednostek konstrukcyjnych. Niezdefiniowane krawędzie mogą wynikać z braku regulacji ostrości lasera podczas generowania wzoru (Rysunek 11C). Dlatego tak ważne jest, aby skalibrować laser i wykonać kroki wzorca odniesienia (patrz krok 4) przed wykonaniem modelu. Słabo zdefiniowane paski powodują różnice w szerokości pasków, co utrudnia korelację między dynamiką wzrostu aksonów a szerokością pasków. Aksony mają również tendencję do porzucania pasków, które mają rozproszone krawędzie. Ponadto zmienność krawędzi można również znaleźć podczas drukowania pasków o szerokości 10-20 μm lub większej, co skutkuje wyższą zawartością białka na krawędziach w porównaniu z centralnymi obszarami wzoru (Rysunek 6B, D). Ten efekt krawędziowy jest wytwarzany przez niejednorodną dyfuzję fotoinicjatora podczas procesu fotowzorcowania. Reakcja fotoszczelinowania jest zależna od tlenu, który dyfunduje bardziej na krawędziach. Ten efekt krawędziowy można zminimalizować poprzez homogenizację fotoinicjatora za pomocą pipety w mikrostudzience podczas procesu fotomodelowania. Co więcej, nowy, skomercjalizowany fotoinicjator (żel PLPP) może również zmniejszyć efekt krawędzi (zespół wsparcia systemu PRIMO, komunikacja osobista).

Mikrodrukowanie więcej niż jednego białka może powodować wiązanie krzyżowe (ryc. 9A-D). Można to zminimalizować poprzez zwiększenie skuteczności blokowania, która jest wykorzystywana do zajmowania niespecyficznych miejsc wiązania między etapami inkubacji dla dwóch różnych białek. Wiązanie krzyżowe białek może zaburzać odtwarzalność wyników eksperymentalnych i może prowadzić do błędnej interpretacji danych, ponieważ trudno jest określić udział każdego białka w dynamice wzrostu aksonów i innych zachowaniach komórek.

Konkluzja
Mamy nadzieję, że dostarczony protokół z wykorzystaniem LIMAP ułatwi generowanie mikrowzorców białkowych poprzez zastosowanie systemu PRIMO. Podczas gdy nasz protokół koncentruje się na tym, jak niezawodnie wytwarzać mikrowzory na szklanych powierzchniach 2D, inni wykazali, że możliwe jest użycie LIMAP do mikro-wzorów miękkich podłoży54 i mikrostrukturalnych powierzchni do kultur3D 42. Te mikrowzorce mogą być wszechstronnym narzędziem do badania reakcji komórek na zmiany w ich mikrośrodowisku.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca jest wspierana przez BBSRC, EPSRC, MRC i Wellcome Trust. Laboratorium C.B. jest częścią Wellcome Trust Centre for Cell-Matrix Research na Uniwersytecie w Manchesterze, które jest wspierane przez fundusze Wellcome Trust (numer grantu 088785/Z/09/Z). Autorzy pragną podziękować za finansowanie udzielone przez Radę ds. Badań nad Biotechnologią i Naukami Biologicznymi (BBSRC) C.M., K.J. (BB/M020630/1) i P.A. (BB/P000681/1) oraz przez Radę ds. Badań Inżynieryjnych i Fizycznych (EPSRC) i Centrum Kształcenia Doktorantów Medycyny Regeneracyjnej Rady ds. Badań Medycznych (MRC) dla A.K. (EP/L014904/1). Autorzy dziękują Alvéole za korespondencję i zespół wsparcia posprzedażowego. Autorzy dziękują Peterowi Marchowi i Rogerowi Meadowsowi z Bioimaging Facility Uniwersytetu w Manchesterze za pomoc w mikroskopii. Mikroskopy Bioimaging Facility użyte w tym badaniu zostały zakupione dzięki grantom z BBSRC, Wellcome Trust i University of Manchester Strategic Fund.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zestaw do znakowania białek Alexa 488InvitrogenA10235Stężenie robocze: nie dotyczy
Zestaw do znakowania białek Alexa 647InvitrogenA20173Stężenie robocze: nie dotyczy
Komórki CADECACC8100805Stężenie robocze: nie dotyczy
Sprzężone sondy molekularnefibrynogenu-488F13191Stężenie robocze: 10 μ g/ml
pożywki hodowlanej DMEMGibco11320033Stężenie robocze: nie dotyczy
Mikroskop epifluorescencyjny**NikonEclipse Ti odwróconeStężenie robocze: nie dotyczy
FibronektynaSigmaF4759Stężenie robocze: 10 μ g/ml
(po znakowaniu za pomocą zestawu do znakowania białek Alexa 488, patrz wyżej)
(rozcieńczony w PBS)
Fiji-Image Jwww.imagej.nih.govWersja 2.0.0-rc-54/1.51fStężenie robocze: nie dotyczy
Fluorescencyjny rozświetlaczStabiloStabilo Boss OryginałStężenie robocze: nie dotyczy
HEPESGibco15630080Stężenie robocze: 1M
Oprogramowanie InkscapeSprawdźostatnią aktualizacjęStężenie robocze: N.A.
Cytoszkielet rodaminy w kolorze czerwonym laminy, Inc.LMN01Stężenie robocze: 10 μ g/ml
(rozcieńczony w PBS)
Oprogramowanie LeonardoAlvé olewersja 4.11Stężenie robocze: nie dotyczy
L-GlutaminaSigmaG7513Stężenie robocze: 1%
Oprogramowanie Micro-managerOtwórz obrazowanieSprawdź ostatnią aktualizacjęStężenie robocze: Nie dotyczy
Zmotoryzowany stopień x/yPRIOR ScientificProscan IIStężenie robocze: nie dotyczy
Oprogramowanie NIS ElementsNikonNIS Elements AR 4.60.00 64-bit (z zadaniami firmy Nikon)Koncentracja podczas pracy: nie dotyczy
PBS (bez Ca2+, Mg2+)SigmaD8537Stężenie robocze: 1X
Szablony PDMSAlvé olevisit www.alveolelab.comStężenie robocze: nie dotyczy
PEG-SVALaysan bio, Inc.MPEG-SVA-5000-1gStężenie robocze: 50 mg / ml
Phalloidin 405Abcamab176752Stężenie robocze: 1:1000
Fotoinicjator (PLPP)Alvé oleClassic PLPPStężenie robocze: 14,5 mg/ml
Fotoinicjator (żel PLPP)Alvé olePLPP żel Stężenierobocze: 4,76% rozcieńczony w etanolu
Środek do czyszczenia plazmyHarrick PlasmaPDC-32G (115V) | PDC-32G-2 (230V)Stężenie robocze: nie dotyczy
PLL-PEGSuSoS (dystrybuowany również przez Alvé ole)www.alveolelab.comStężenie robocze: 0,1 mg/ml (rozcieńczone w PBS)
Poly-L-LysineSigmaP4707Stężenierobocze: 0,01%
Sprzęt PrimoAlvé olewww.alveolelab.comStężenie robocze: nie dotyczy
Pióro/StrepThermo Fisher15140122Stężenie robocze: 1%
Przeciwciało anty-alfa tubulinyAbcamDM1AStężenie robocze: 1:1000
Komórki CAD
Przeciwciało tubuliny anty-beta 3SigmaT8660Stężenie robocze: 1:500
neurony
Klej UVNorland ProductsNOA81Stężenie robocze: nie dotyczy
Naczynie ze szklanym dnem 1 dołkowymCellvisD35-20-1.5-NStężenie robocze: nie dotyczy
Naczynie ze szklanym dnem 6-dołkowymCellvisP06-20-1.5-NStężenie robocze: nie dotyczy
Obiektyw 20x**Nikonbez pierścienia fazowego (sprawdź zaktualizowany katalog)Stężenie robocze: N.A.
**Mikroskop epifluorescencyjny: uzyskano obrazy i wygenerowano wzory na mikroskopie odwróconym Eclipse Ti (Nikon), sprzężonym ze sprzętem do mikrowzorcowania PRIMO (Alvé ole), przy użyciu obiektywu 20x (0,75 S Plan Fluor (bez fazowania, Nikon). Zastosowano zestawy filtrów specyficzne dla firmy Nikon dla GFP, mCherry i Cy5, a źródłem światła fluorescencyjnego była dioda LED (Lumencor), chociaż można stosować inne źródła fluorescencji i zestawy filtrów. Mikroskop jest wyposażony w zautomatyzowany stolik x/y (PRIOR Scientific) do drukowania wzorów wielopolowych oraz Nikon Perfect Focus, aby zapobiec dryfowaniu ostrości. Zdjęcia zostały wykonane za pomocą kamery Retiga R6 (Q-Imaging).
DRG

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Alamdari, O. G., Seyedjafari, E., Soleimani, M., Ghaemi, N. Micropatterning of ECM Proteins on Glass Substrates to Regulate Cell Attachment and Proliferation. Avicenna Journal of Medical Biotechnology. 5 (4), 234-240 (2013).
  2. Sunami, H., Yokota, I., Igarashi, Y. Influence of the pattern size of micropatterned scaffolds on cell morphology, proliferation, migration and F-actin expression. Biomaterials Science. 2 (3), 399-409 (2014).
  3. Thery, M. Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions. Journal of Cell Science. 123 (Pt 24), 4201-4213 (2010).
  4. Marino, A., et al. Two-photon polymerization of sub-micrometric patterned surfaces: investigation of cell-substrate interactions and improved differentiation of neuron-like cells. ACS Applied Materials & Interfaces. 5 (24), 13012-13021 (2013).
  5. Joo, S., et al. Effects of ECM protein micropatterns on the migration and differentiation of adult neural stem cells. Scientific Reports. 5, (2015).
  6. Morgani, S. M., Metzger, J. J., Nichols, J., Siggia, E. D., Hadjantonakis, A. K. Micropattern differentiation of mouse pluripotent stem cells recapitulates embryo regionalized cell fate patterning. Elife. 7, (2018).
  7. Javaherian, S., O'Donnell, K. A., McGuigan, A. P. A Fast and Accessible Methodology for Micro-Patterning Cells on Standard Culture Substrates Using Parafilm (TM) Inserts. Plos One. 6 (6), (2011).
  8. Smirnov, M. S., Cabral, K. A., Geller, H. M., Urbach, J. S. The effects of confinement on neuronal growth cone morphology and velocity. Biomaterials. 35 (25), 6750-6757 (2014).
  9. Albert, P. J., Schwarz, U. S. Dynamics of Cell Ensembles on Adhesive Micropatterns: Bridging the Gap between Single Cell Spreading and Collective Cell Migration. PLOS Computational Biology. 12 (4), (2016).
  10. Evans, A. R., et al. Laminin and fibronectin modulate inner ear spiral ganglion neurite outgrowth in an in vitro alternate choice assay. Developmental Neurobiology. 67 (13), 1721-1730 (2007).
  11. Nichol, R. H., Hagen, K. M., Lumbard, D. C., Dent, E. W., Gomez, T. M. Guidance of Axons by Local Coupling of Retrograde Flow to Point Contact Adhesions. Journal of Neuroscience. 36 (7), 2267-2282 (2016).
  12. Burdick, J. A., Khademhosseini, A., Langer, R. Fabrication of gradient hydrogels using a microfluidics/photopolymerization process. Langmuir. 20 (13), 5153-5156 (2004).
  13. Schwartz, P. V. Molecular transport from an atomic force microscope tip: A comparative study of dip-pen nanolithography. Langmuir. 18 (10), 4041-4046 (2002).
  14. Barbulovic-Nad, I., et al. Bio-microarray fabrication techniques--a review. Critical Reviews in Biotechnology. 26 (4), 237-259 (2006).
  15. Shafagh, R. Z., Vastesson, A., Guo, W. J., van der Wijngaart, W., Haraldsson, T. E-Beam Nanostructuring and Direct Click Biofunctionalization of Thiol-Ene Resist. Acs Nano. 12 (10), 9940-9946 (2018).
  16. Kobayashi, J., Yamato, M., Itoga, K., Kikuchi, A., Okano, T. Preparation of microfluidic devices using micropatterning of a photosensitive material by a maskless, liquid-crystal-display projection method. Advanced Materials. 16 (22), (2004).
  17. Bernard, A., et al. Printing patterns of proteins. Langmuir. 14 (9), 2225-2229 (1998).
  18. Ruiz, S. A., Chen, C. S. Microcontact printing: A tool to pattern. Soft Matter. 3 (2), 168-177 (2007).
  19. Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscale patterning. Nature Protocols. 5 (3), 491-502 (2010).
  20. Fink, J., et al. Comparative study and improvement of current cell micro-patterning techniques. Lab Chip. 7 (6), 672-680 (2007).
  21. Strale, P. O., et al. Multiprotein Printing by Light-Induced Molecular Adsorption. Advanced Materials. 28 (10), 2024-2029 (2016).
  22. Belisle, J. M., Correia, J. P., Wiseman, P. W., Kennedy, T. E., Costantino, S. Patterning protein concentration using laser-assisted adsorption by photobleaching, LAPAP. Lab Chip. 8 (12), 2164-2167 (2008).
  23. Belisle, J. M., Kunik, D., Costantino, S. Rapid multicomponent optical protein patterning. Lab Chip. 9 (24), 3580-3585 (2009).
  24. Heinz, W. F., Hoh, M., Hoh, J. H. Laser inactivation protein patterning of cell culture microenvironments. Lab Chip. 11 (19), 3336-3346 (2011).
  25. Azioune, A., Carpi, N., Tseng, Q., Thery, M., Piel, M. Protein Micropatterns: A Direct Printing Protocol Using Deep UVs. Microtubules: In Vivo. 97, 133-146 (2010).
  26. Vignaud, T., Ennomani, H., Thery, M. Polyacrylamide hydrogel micropatterning. Methods in Cell Biology. 120, 93-116 (2014).
  27. Waldbaur, A., Waterkotte, B., Schmitz, K., Rapp, B. E. Maskless projection lithography for the fast and flexible generation of grayscale protein patterns. Small. 8 (10), 1570-1578 (2012).
  28. Kang, J., Choi, J. C., Kim, M., Jung, H. R., Doh, J. Photopatterning with a printed transparency mask and a protein-friendly photoresist. Methods in Cell Biology. 119, 55-72 (2014).
  29. Falconnet, D., Csucs, G., Grandin, H. M., Textor, M. Surface engineering approaches to micropattern surfaces for cell-based assays. Biomaterials. 27 (16), 3044-3063 (2006).
  30. Morlat, S., Gardette, J. L. Phototransformation of water-soluble polymers. Part II: photooxidation of poly(ethylene oxide) in aqueous solution. Polymer. 44 (26), 7891-7897 (2003).
  31. Qi, Y., Wang, J. K., McMillian, M., Chikaraishi, D. M. Characterization of a CNS cell line, CAD, in which morphological differentiation is initiated by serum deprivation. Journal of Neuroscience. 17 (4), 1217-1225 (1997).
  32. Shrirao, A. B., et al. A Versatile Method of Patterning Proteins and Cells. Journal of Visualized Experiments. (120), (2017).
  33. Pankov, R., Momchilova, A. Fluorescent labeling techniques for investigation of fibronectin fibrillogenesis (labeling fibronectin fibrillogenesis). Methods in Molecular Biology. 522, 261-274 (2009).
  34. Dertinger, S. K., Jiang, X., Li, Z., Murthy, V. N., Whitesides, G. M. Gradients of substrate-bound laminin orient axonal specification of neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (20), 12542-12547 (2002).
  35. Chelli, B., et al. Neural cell alignment by patterning gradients of the extracellular matrix protein laminin. Interface Focus. 4 (1), (2014).
  36. Tang, Y., Qiu, Q. F., Zhang, F. L., Xie, M., Huang, W. H. Quantifying orientational regeneration of injured neurons by natural product concentration gradients in a 3D microfluidic device. Lab Chip. 18 (6), 971-978 (2018).
  37. Srinivasan, P., Zervantonakis, I. K., Kothapalli, C. R. Synergistic effects of 3D ECM and chemogradients on neurite outgrowth and guidance: a simple modeling and microfluidic framework. PLoS One. 9 (6), (2014).
  38. de Luca, A. C., Faroni, A., Reid, A. J. Dorsal root ganglia neurons and differentiated adipose-derived stem cells: an in vitro co-culture model to study peripheral nerve regeneration. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
  39. Khadpekar, A. J., Khan, M., Sose, A., Majumder, A. Low Cost and Lithography-free Stamp fabrication for Microcontact Printing. Scientific Reports. 9 (1), (2019).
  40. Delepine, C., et al. Altered microtubule dynamics and vesicular transport in mouse and human MeCP2-deficient astrocytes. Human Molecular Genetics. 25 (1), 146-157 (2016).
  41. Decock, J., Schlenk, M., Salmon, J. B. In situ photo-patterning of pressure-resistant hydrogel membranes with controlled permeabilities in PEGDA microfluidic channels. Lab Chip. 18 (7), 1075-1083 (2018).
  42. Stoecklin, C., et al. A New Approach to Design Artificial 3D Microniches with Combined Chemical, Topographical, and Rheological Cues. Advanced Biosystems. 2 (7), (2018).
  43. Toraille, L., et al. Optical Magnetometry of Single Biocompatible Micromagnets for Quantitative Magnetogenetic and Magnetomechanical Assays. Nano Letters. , (2018).
  44. Theodoly, O., et al. Live nanoscopic to mesoscopic topography reconstruction with an optical microscope for chemical and biological samples. PLoS One. 13 (12), (2018).
  45. Ermis, M., Antmen, E., Hasirci, V. Micro and Nanofabrication methods to control cell-substrate interactions and cell behavior: A review from the tissue engineering perspective. Bioactive Materials. 3 (3), 355-369 (2018).
  46. von Philipsborn, A. C., et al. Microcontact printing of axon guidance molecules for generation of graded patterns. Nature Protocols. 1 (3), 1322-1328 (2006).
  47. Ricoult, S. G., Kennedy, T. E., Juncker, D. Substrate-bound protein gradients to study haptotaxis. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 3, (2015).
  48. Bietsch, A., Michel, B. Conformal contact and pattern stability of stamps used for soft lithography. Journal of Applied Physics. 88 (7), 4310-4318 (2000).
  49. Hui, C. Y., Jagota, A., Lin, Y. Y., Kramer, E. J. Constraints on microcontact printing imposed by stamp deformation. Langmuir. 18 (4), 1394-1407 (2002).
  50. Sharp, K. G., Blackman, G. S., Glassmaker, N. J., Jagota, A., Hui, C. Y. Effect of stamp deformation on the quality of microcontact printing: theory and experiment. Langmuir. 20 (15), 6430-6438 (2004).
  51. Delamarche, E., Schmid, H., Michel, B., Biebuyck, H. Stability of molded polydimethylsiloxane microstructures. Advanced Materials. 9 (9), 741-746 (1997).
  52. Perl, A., Reinhoudt, D. N., Huskens, J. Microcontact Printing: Limitations and Achievements. Advanced Materials. 21 (22), 2257-2268 (2009).
  53. Chakra, E. B., Hannes, B., Dilosquer, G., Mansfield, C. D., Cabrera, M. A new instrument for automated microcontact printing with stamp load adjustment. Review of Scientific Instruments. 79 (6), (2008).
  54. Pasturel, A., Strale, P., Studer, V. Tailoring 3D cell culture templates with common hydrogels. bioRxiv. , (2019).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Wychodzenie akson woczyszczacz plazmowyszablony PDMSmikroskopia fluorescencyjnainkubacja bia ekczynnik blokuj cy

Powiązane artykuły