Artykuł metodologiczny

Wysokoprzepustowa metoda in situ do szacowania ploidalności jądrowej hepatocytów u myszy

DOI:

10.3791/60095

⸱

19 kwietnia 2020

 ,  ,  , 
1Centro de Investigación Príncipe Felipe (CIPF), 2Department of Physiology, Development and Neuroscience, University of Cambridge, 3Centro de Investigación Biomédica en Red de Diabetes y Enfermedades Metabólicas Asociadas (CIBERDEM)

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentujemy solidną, opłacalną i elastyczną metodę pomiaru zmian w liczbie hepatocytów i ploidalności jądrowej w stałych/kriokonserwowanych próbkach tkanek, która nie wymaga cytometrii przepływowej. Nasze podejście zapewnia potężną sygnaturę cytologii wątroby obejmującą całą próbkę, idealną do śledzenia postępu uszkodzenia wątroby i choroby.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gdy wątroba jest uszkodzona, liczba hepatocytów maleje, podczas gdy rozmiar komórki, rozmiar jądra i ploidalność wzrastają. Ekspansja komórek niemiąższowych, takich jak cholangiocyty, miofibroblasty, komórki progenitorowe i komórki zapalne, również wskazuje na przewlekłe uszkodzenie wątroby, przebudowę tkanek i postęp choroby. W tym protokole opisujemy proste, wysokoprzepustowe podejście do obliczania zmian w składzie komórkowym wątroby, które są związane z urazem, chorobami przewlekłymi i rakiem. Pokazujemy, w jaki sposób informacje uzyskane z dwuwymiarowych (2D) skrawków tkanek można wykorzystać do ilościowego określenia i kalibracji ploidalności jądrowej hepatocytów w próbce oraz umożliwienia użytkownikowi zlokalizowania określonych podzbiorów ploidalnych w wątrobie in situ. Nasza metoda wymaga dostępu do utrwalonego/zamrożonego materiału wątrobowego, podstawowych odczynników immunocytochemicznych oraz dowolnej standardowej platformy obrazowania o wysokiej zawartości. Służy jako potężna alternatywa dla standardowych technik cytometrii przepływowej, które wymagają zakłócenia świeżo pobranej tkanki, utraty informacji przestrzennych i potencjalnego odchylenia dezagregacji.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hepatocyty w wątrobie ssaków mogą ulegać zahamowanej cytokinezie w celu wytworzenia komórek dwujądrzastych, oraz endoreplikacji DNA w celu wytworzenia poliploidalnych jąder zawierających do 16N zawartości DNA. Ogólny wzrost ploidalności komórkowej i jądrowej podczas rozwoju pourodzeniowego, starzenia się i w odpowiedzi na różne stresy komórkowe1. Proces poliploidyzacji jest dynamiczny i odwracalny2, chociaż jego dokładna funkcja biologiczna pozostaje niejasna3. Zwiększona ploidalność wiąże się ze zmniejszoną zdolnością proliferacyjną4, różnorodność genetyczna2, adaptacja do przewlekłych urazów5 i ochrona przed rakiem6. Zmiany ploidalności hepatocytów występują w wyniku zmienionego rytmu okołodobowego7, oraz weaning8. Przede wszystkim profil ploidalny wątroby jest zmieniany przez uraz i chorobę9, a przekonujące dowody sugerują, że określone zmiany ploidalne, takie jak zwiększona liczba jąder ≥8N lub utrata hepatocytów 2N, dostarczają użytecznych sygnatur do śledzenia postępu niealkoholowej stłuszczeniowej choroby wątroby (NAFLD)3,10, lub różnicowy wpływ infekcji wirusowych11.

Ogólnie rzecz biorąc, uszkodzenie i regeneracja wątroby są związane ze zwiększonym rozmiarem komórek hepatocytów i obszarem jądrowym12, wraz ze zmniejszoną ogólną liczbą hepatocytów, szczególnie tych z zawartością DNA 2N10,11. Uszkodzeniu miąższu wątroby często towarzyszy również ekspansja komórek niemiąższowych (NPC), w tym miofibroblastów zrębu, komórek zapalnych i bipotencjalnych komórek progenitorowych wątroby. Metody wysokoprzepustowe, które zapewniają ilościowy profil cytologiczny liczby komórek miąższowych i ploidii jądrowej, a jednocześnie uwzględniają zmiany w NPC, mają zatem znaczny potencjał jako narzędzia badawcze i kliniczne do śledzenia reakcji wątroby podczas urazu i choroby. Przekonująca niedawna analiza in situ widm ploidalnych w ludzkich próbkach raka wątrobowokomórkowego pokazuje również, że ploidalność jądrowa jest dramatycznie zwiększona w obrębie guzów i jest specyficznie amplifikowana w bardziej agresywnych podtypach nowotworów ze zmniejszonym różnicowaniem i utratą TP5313. W związku z tym istnieje duże prawdopodobieństwo, że postęp metodologiczny w ilościowej ocenie ploidalności jądrowej pomoże w przyszłym profilowaniu prognostycznym raka wątroby.

W tym protokole opisana jest elastyczna metodologia wysokoprzepustowa do analizy porównawczej wycinków tkanki wątroby myszy, która zapewnia szczegółowe profilowanie cytometryczne liczby hepatocytów, odpowiedź NPC i wewnętrznie skalibrowaną metodę szacowania ploidalności jądrowej (Rysunek 1). Hepatocyty odróżnia się od NPC na podstawie znakowania immunologicznego czynnika jądrowego hepatocytów 4 alfa (HNF4α), przed scharakteryzowaniem wielkości jądra i morfometrii jądra. "Minimalną zawartość DNA" szacuje się dla wszystkich okrągłych masek jądrowych poprzez całkowanie średniej intensywności Hoechst 33342 (wskaźnik zastępczy dla gęstości DNA) z interpolowaną trójwymiarową (3D) objętością jądra. Minimalna zawartość DNA w hepatocytach jest następnie kalibrowana za pomocą NPC w celu wygenerowania profilu ploidalności jądrowej.

Akwizycja obrazu, segmentacja jądrowa i analiza obrazu są wykonywane za pomocą obrazowania o wysokiej zawartości, co umożliwia badanie przesiewowe dużych obszarów dwuwymiarowych (2D) odcinków wątroby zawierających dziesiątki tysięcy komórek. Dostępny jest specjalnie napisany program do automatycznego przetwarzania końcowego danych analizy obrazu o wysokiej zawartości w celu uzyskania profilu ploidalności dla całej próbki dla wszystkich okrągłych jąder hepatocytów. Odbywa się to za pomocą bezpłatnego oprogramowania do obliczania ploidalności jądrowej na podstawie stereologicznej analizy obrazu (SIA)10,11,14,15. Metodologia SIA została wcześniej zwalidowana przez cytometrię przepływową jako dokładna, choć pracochłonna, metoda szacowania ploidalności jądrowej hepatocytów w wątrobie14, przy założeniu kołowej morfologii jądra i monotonnego związku między wielkością jądra a zawartością DNA. W tym protokole oba parametry jądrowe są mierzone za pomocą oceny morfometrii jądrowej i znakowania Hoechst 33342. Po obliczeniu "minimalnej zawartości DNA" dla każdej maski jądrowej następuje kalibracja ploidalności jądrowej hepatocytów przy użyciu NPC, które mają znaną zawartość DNA 2-4N i dlatego służą jako użyteczna kontrola wewnętrzna.

W porównaniu z konwencjonalnymi metodami cytometrii przepływowej16 opisane podejście umożliwia ocenę ploidalności jądrowej hepatocytów in situ i nie wymaga dostępu do świeżej tkanki ani metod dezagregacji, które mogą zniekształcać wyniki i być trudne do standaryzacji. Podobnie jak w przypadku wszystkich podejść opartych na SIA, podklasy ploidalności jądrowej >2N są niedostatecznie reprezentowane przez próbkowanie 2D ze względu na przekrój większych jąder poza płaszczyznę równikową. Profil ploidalności obejmujący całą tkankę opisuje również minimalną zawartość DNA dla wszystkich okrągłych masek jądrowych hepatocytów i nie rozróżnia bezpośrednio hepatocytów jednojądrzastych i komórek dwujądrzastych, które mają dwa dyskretne ("niestykające się") jądra o tej samej ploidalności. Jednak prostota tego protokołu pozwala na znaczne możliwości jego dostosowania w celu uwzględnienia dodatkowych parametrów, takich jak odstępy międzyjądrowe lub analiza obwodu komórek, co ułatwiłoby identyfikację komórek dwujądrzastych, zapewniając bardziej szczegółową ocenę ploidalności komórkowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały wcześniej zatwierdzone przez komisję etyki CIPF. Myszy trzymano w wolnym od patogenów obiekcie w Centro de Investigación Príncipe Felipe (Walencja, Hiszpania), zarejestrowanym jako ośrodek hodowlany, użytkowy i zaopatrzeniowy (nr rej. ES 46 250 0001 002) zgodnie z obowiązującymi europejskimi i hiszpańskimi przepisami dotyczącymi dobrostanu zwierząt (RD 53/2013).

1. Pobieranie tkanek i przygotowanie próbek

UWAGA: Ten protokół opisuje, jak zamrozić tkankę bez uprzedniego utrwalenia lub kriokonserwacji. W przypadku próbek uprzednio utrwalonych/kriokonserwowanych należy przejść do sekcji 2 i pominąć krok 3.1. Wszystkie analizy przeprowadzono na dorosłych samicach myszy C57BL/6 w wieku 12-16 tygodni.

  1. Składanie zwierząt w ofierze przez dootrzewnowe wstrzyknięcie fentanylu/pentobarbitalu, a następnie zwichnięcie szyjki macicy. Trzymając mysz skierowaną brzusznie do góry, otwórz jamę brzuszną i odsłoń wątrobę, chwytając skórę pęsetą i wykonując pionowe nacięcie od podstawy dolnej części brzucha do podstawy mostka za pomocą nożyczek chirurgicznych.
  2. Ostrożnie usunąć pęcherzyk żółciowy za pomocą cienkiej pęsety, wyciąć wątrobę i wypłukać wybrany zrazik wątroby na 10-centymetrowej płytce Petriego wypełnionej solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS).
    UWAGA: Zaleca się porównanie tego samego płata wątroby dla każdego zwierzęcia, w tym przypadku użyto płata środkowego.
  3. Napełnij oznakowaną krioformę medium o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) w temperaturze pokojowej (RT). Unikaj pęcherzyków OCT. Jeśli się pojawią, popchnij je do krawędzi formy za pomocą igły lub końcówki pipety.
  4. Zanurz zrazik wątroby w wypełnionym kriomold OCT i natychmiast umieść go na suchym lodzie, aby zapewnić szybkie zamrożenie. Krioformy należy przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu kriosekcji.

2. Kriosekcja

  1. Transportuj krioformy na suchym lodzie, aby uniknąć degradacji tkanek. Przed kriosekcją należy zrównoważyć wewnątrz kriostatu nastawioną na -20 °C przez 20 min.
  2. Wyrzuć próbkę, wywierając nacisk na podstawę plastikowej krioformy. Nanieść płynny OCT na ciepły krążek próbki w temperaturze pokojowej, umieścić w kriostacie i dołączyć próbkę wątroby osadzoną w OCT. Delikatnie dociśnij i odczekaj 3 minuty, aż OCT zamarznie, upewniając się, że próbka przykleiła się do dysku.
    UWAGA: W miarę możliwości unikaj dotykania próbki palcami, aby uniknąć degradacji tkanek.
  3. Zablokuj próbkę w ramieniu kriostatu i dostosuj orientację tak, aby krawędź próbki była równoległa do ostrza kriostatu. Ciąć w próbce, aż do uzyskania tkanki.
  4. Próbkę należy podzielić na sekcje o grubości 6 μm. Umieścić oznakowane szkiełko pokryte poliamidem na próbce na 5 sekund, aby próbka przykleiła się do szkiełka. Umieść szkiełko w RT na 3−5 min, a następnie, aby uzyskać najlepsze wyniki, przejdź bezpośrednio do sekcji 3.
    UWAGA: W przypadku przetwarzania wielu świeżo mrożonych próbek powtarzalne wyniki uzyskano poprzez tymczasowe przechowywanie szkiełek w pudełku na szkiełka na suchym lodzie do czasu przetworzenia wszystkich próbek. Korzystając z tego podejścia, pozwól, aby wszystkie slajdy zrównoważyły się z RT przed przejściem do sekcji 3. Można stosować próbki zatopione w parafinie utrwalonej w formalinie (FFPE), chociaż ta metoda zwiększa autofluorescencję tła. Aby przejść z próbek FFPE, przekrój na 4 μm. Montaż poprzez wyłapywanie odcinków z kąpieli wodnej o temperaturze 40 °C na szkiełkach nasączonych poliamidem. Podgrzewać szkiełka przez 1 godzinę w temperaturze 60 °C, a następnie odparafinować przez seryjne płukanie RT (5 min) w słoikach z kopeliny zawierających ksylen (x2), etanol 100% (x2), 96% (x2), 70% (x1) i dH2O (x1). Aby naświetlić antygeny, umieść szkiełka w buforze cytrynianowym na 20 minut w temperaturze 90 °C, a następnie odpuszczaj szkiełka w PBS w temperaturze RT. Przejdź do kroku 3.2.

3. Fluorescencyjne znakowanie immunologiczne

  1. Utrwalić skrawki tkanek w dygestorium, nakładając 1 ml 4% paraformaldehydu (PFA) w PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Przenieś szkiełka do słoika Coplin wypełnionego PBS i myj przez 3 minuty, delikatnie mieszając (powtórz 3x).
    UWAGA: Od teraz do końca procesu barwienia immunologicznego należy unikać wysuszenia próbki.
  2. Osusz obszar wokół każdego odcinka tkanki i otocz go za pomocą hydrofobowego pisaka. Przepuszczalność 0,5% niejonowego środka powierzchniowo czynnego (tj. Triton X-100) w PBS przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Następnie umyj w słoiku Coplin wypełnionym PBS przez 3 minuty, delikatnie mieszając (powtórz 2x).
  3. Blok przy użyciu przefiltrowanego roztworu 1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA), 5% surowicy końskiej, 0,2% niejonowego środka powierzchniowo czynnego w PBS (przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze pokojowej).
  4. Inkubować z pierwszorzędowym przeciwciałem HNF4α rozcieńczonym w buforze blokującym przez noc w temperaturze 4 °C w ciemnej, wilgotnej komorze barwienia (patrz tabela materiałów dla przeciwciał i specyficznych rozcieńczeń).
  5. Umieść szkiełka w słoiku Coplin wypełnionym PBS i myj przez 3 minuty, delikatnie mieszając (powtórz 4x).
  6. Inkubować z sprzężonym przeciwciałem drugorzędowym Alexa-488 i Hoechstem rozcieńczonym w przefiltrowanym 1% BSA i 0,2% niejonowym środku powierzchniowo czynnym w PBS przez 2 godziny w temperaturze pokojowej w ciemnowilgotnej komorze barwienia (patrz Tabela materiałów dla przeciwciał i specyficznych rozcieńczeń).
  7. Umieść szkiełka w słoiku Coplin wypełnionym PBS i myj przez 3 minuty, delikatnie mieszając (powtórz 4x). Myć w ddH2O przez 3 minuty, delikatnie mieszając (powtórzyć 2x).
  8. Zamontuj szkiełka, umieszczając dwie krople fluorescencyjnego nośnika montażowego na szkiełku nakrywkowym (24 x 60 mm) i kładąc na nim szkiełka, eliminując pęcherzyki poprzez delikatny nacisk. W przypadku długotrwałego przechowywania należy uszczelnić szkiełko nakrywkowe na krawędziach przezroczystym lakierem do paznokci i przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C.
  9. Przed kontynuowaniem należy sprawdzić szkiełka za pomocą konwencjonalnego mikroskopu fluorescencyjnego, aby zapewnić dobre utrwalenie i znakowanie immunologiczne.
    UWAGA: Zobacz Rysunek 2A,B, aby uzyskać oczekiwane wyniki.

4. Akwizycja obrazu fluorescencyjnego

UWAGA: Do tego kroku wymagana jest platforma obrazowania o wysokiej zawartości (Tabela materiałów), która obsługuje automatyczną akwizycję obrazów fluorescencyjnych.

  1. Włącz system obrazowania i otwórz nowy protokół akwizycji.
  2. Wybierz obiektyw 10x, zwróć uwagę na obszar pola widzenia (w tym przypadku 0,6 mm2).
  3. Ustaw parametry, aby uzyskać obrazy fluorescencji przy użyciu odpowiednich filtrów wzbudzenia i emisji (zgodnie z krokiem 3.6). Dla Hoechst i Alexa-488 wybierz kanały "DAPI" i "GFP" o wzbudzeniu odpowiednio 390/18 i 438/24 nm oraz emisji 432.5/48 i 475/24 nm.
  4. Skoncentruj próbkę i upewnij się, że intensywność sygnału jest nienasycona. Upewnij się, że przechwytywanie obrazu odbywa się przy tym samym czasie naświetlania dla wszystkich obrazów lub użyj systemu, w którym intensywność fluorescencji jest korygowana o czas ekspozycji.
  5. Zeskanuj próbkę i uzyskaj wystarczającą ilość obrazów, aby uzyskać pełne pokrycie przekroju tkanki (około 20-50 pól widzenia, w zależności od wielkości próbki).
  6. Przejrzyj bazę danych obrazów, ręcznie eliminując (i) słabo skoncentrowane pola, (ii) te na granicach każdej sekcji tkanki (aby uniknąć stronniczych obliczeń gęstości komórek) oraz (iii) te zawierające pofałdowane/fizycznie uszkodzone obszary sekcji tkanki, jeśli są obecne.

5. Automatyczna analiza obrazu fluorescencyjnego

UWAGA: Ten krok wymaga odpowiedniego oprogramowania do analizy obrazu (Tabela Materiałów) zdolnego: (1) automatycznej identyfikacji jąder znakowanych Hoechstem na obrazach przy 405 nm (segmentacja jądrowa), (2) oceny średniej intensywności i morfometrii jądrowej Hoechsta, oraz (3) analizy progowej w celu określenia statusu +/- fluorescencji jądrowej przy 488 nm (HNF4α). Wymagane jest podstawowe szkolenie/wiedza specjalistyczna operatora, aby wizualnie ocenić i dostosować parametry segmentacji i progowania w programie, aby zapewnić, że jądra i stan HNF4α+/- są optymalnie bramkowane (Rysunek 2).

  1. W oprogramowaniu do analizy obrazu otwórz plik akwizycji zawierający obrazy Hoechst (405 nm) i HNF4α (488 nm) z kroku 4.5 i utwórz nowy protokół analizy.
  2. Zdefiniuj długości fal, które mają być używane do segmentacji jądra (Hoechst, 405 nm) oraz do analizy progu hepatocytów/NPC (HNF4α, 488 nm).
  3. Dostosuj parametry segmentacji jądrowej oprogramowania (takie jak "minimalna powierzchnia jądrowa" i "czułość" wykrywania jądra jądrowego), aby zapewnić optymalną segregację jąder.
    UWAGA: Dobra segmentacja hepatocytów powinna być ważniejsza niż segmentacja NPC. Jądra hepatocytów są charakterystycznie zaokrąglone (zakres wielkości międzykwartylowej: 40−64μm2). Jądra NPC, takie jak jądra śródbłonka sinusoidalnego, są spłaszczone/eliptyczne lub mają nieregularny kształt i są na ogół mniejsze i ściślej upakowane niż u hepatocytów (zakres wielkości międzykwartylowej: 30−43 μm2). W przypadku wątroby myszy zastosowano minimalną powierzchnię jądrową ≥23μm2 i "czułość" wykrywania 65% (patrz Rysunek 2C, D dla oczekiwanych wyników). Czułość określa, w jaki sposób klastry pikseli są rozpoznawane jako pojedyncze jądra na podstawie ich intensywności i powinny być testowane empirycznie dla każdej próbki ustawionej przez użytkownika przed przystąpieniem do automatycznej analizy obrazu.
  4. Zmodyfikuj intensywność progową przy 488 nm, aby zapewnić optymalne bramkowanie hepatocytów (HNF4α+) i komórek niemiąższowych (HNF4α-).
    UWAGA: Zobacz Rysunek 2C,D, aby uzyskać oczekiwane wyniki. Wartość intensywności progowej jest względna i będzie zależeć od skuteczności barwienia i ustawień akwizycji, takich jak intensywność lasera. W związku z tym powinien być ustandaryzowany przez użytkownika. Użyj znanych komórek HNF4α-, takich jak komórki śródbłonka i NPC okołowrotne, jako wewnętrznej kontroli negatywnej i dwujądrzastych jąder hepatocytów jako dodatniego odniesienia do barwienia. Przetestuj parametry analizy przy użyciu niewielkiej liczby obrazów, aby zapewnić dobrą segmentację jądrową i segregację progów intensywności przed zastosowaniem parametrów analizy do całego zestawu danych.
  5. Należy wybrać następujące parametry jądrowe do ilościowego określenia: (1) obszar jądrowy na podstawie barwienia Hoechsta (μm 2), (2) średnia intensywność jądra Hoechsta (RU), (3) współczynnik wydłużenia jądra (średni stosunek krótkiej osi jądra do długiej osi jądra, gdzie centralnie symetryczny [niewydłużony] obiekt ma wartość 1, (4) Nuc 1/(współczynnik kształtu), Średni wskaźnik "okrągłości" jądra obliczony na podstawie obwodu 2/(4π x powierzchnia). Wartości mieszczą się w zakresie od 1 do nieskończoności, gdzie 1 oznacza idealne koło, (5) stan HNF4α (dodatni-1 lub ujemny-0) i (6) jądrowe współrzędne x/y oparte na "środku ciężkości" (cg), metodzie lokalizowania środka obiektu na obrazach w skali szarości z precyzją subpikselową.
  6. Uruchom analizę dla wszystkich przykładowych zestawów danych i wyeksportuj dane liczbowe z kroku 5.5 do oprogramowania arkusza kalkulacyjnego.

6. Analiza danych

UWAGA: Krok analizy danych może być wykonany przy użyciu dowolnego standardowego oprogramowania do obsługi arkuszy kalkulacyjnych.

  1. Oblicz liczbę komórek hepatocytów i niehepatocytów.
    1. Obliczyć całkowitą powierzchnię przekroju wątroby analizowaną dla każdej próbki, mnożąc liczbę pól widzenia przez obszar pola widzenia (krok 4.2).
      figure-protocol-1
    2. Pracując z plikami arkuszy kalkulacyjnych wygenerowanymi dla każdego odcinka wątroby, filtruj dane, wybierając tylko jądra HNF4α+. Oblicz całkowitą liczbę analizowanych jąder HNF4α+ i podziel ją przez całkowitą analizowaną powierzchnię, aby uzyskać średnią gęstość hepatocytów dla każdej próbki (Rysunek 2F).
      figure-protocol-2
    3. Wykonaj te same obliczenia dla komórek niemiąższowych, filtrując arkusz kalkulacyjny pod kątem komórek HNF4α- (Rysunek 2E).
  2. Obliczać rozkład wielkości jądra hepatocytów.
    1. Korzystając z arkusza kalkulacyjnego, przefiltruj dane, aby wybrać tylko jądra HNF4α+.
    2. Wykreśl wartości obszaru jądrowego na histogramie (Rysunek 2G). Ustaw szerokość pojemnika na 5 μm2.
      UWAGA: Wartości częstotliwości można skorygować dla pola powierzchni (jądra/mm2) zgodnie z krokiem 6.1.1.
  3. Wykonaj analizę ploidalności jądrowej hepatocytów.
    UWAGA: Dane z arkusza kalkulacyjnego z kroku 5.6 są używane do generowania profilu ploidalności jądrowej dla każdej próbki. Proces ten został zautomatyzowany i może być przeprowadzony za pomocą niestandardowego oprogramowania, które jest dostępne do pobrania bezpłatnie wraz z informacjami pomocniczymi i zestawami danych demonstracyjnych pod adresem https://github.com/lukeynoon (patrz Pliki uzupełniające). Kod źródłowy jest udostępniany dla użytkowników, którzy chcą dostosować metodologię. Opis algorytmu wraz z instrukcjami instalacji i użytkowania znajduje się poniżej. Program wykorzystuje dane z arkusza kalkulacyjnego do automatycznego rozdzielania jąder hepatocytów na dwie grupy; (1) te z "prostymi" jądrami kolistymi i (2) "złożonymi" jądrami niekolistymi reprezentatywnymi dla komórek dwujądrzastych z ploidią >2c. Minimalna zawartość jądrowego DNA (funkcja powierzchni jądrowej i gęstości DNA) jest następnie obliczana dla wszystkich "prostych" jąder. Kolejnym krokiem jest automatyczna kalibracja ploidalności jądrowej hepatocytów HNF4α+ przy użyciu jąder HNF4α- jako znanej kontroli wewnętrznej 2−4N.
    1. Pobierz i zainstaluj oprogramowanie.
      1. Pobierz spakowaną aplikację ze strony: https://github.com/lukeynoon
      2. Uruchom program MATLAB. Przejdź do zakładki APP na pasku narzędzi, kliknij Zainstaluj aplikację i otwórz pobraną aplikację o nazwie "Ploidy_Application.mlappinstall". Pojawi się komunikat potwierdzający pomyślną instalację.
        UWAGA: Aplikacja jest teraz gotowa do użycia i pozostanie w zakładce APP na pasku narzędzi.
    2. Formatuj dane wejściowe.
      UWAGA: Przed zautomatyzowaną analizą ploidalności jądrowej wszystkie pliki arkuszy kalkulacyjnych zawierające dane obrazowania o wysokiej zawartości (krok 5.6) powinny być przechowywane i formatowane zgodnie z poniższymi instrukcjami.
      1. W każdym wyeksportowanym pliku danych (skoroszyt .XLS 97-2004) z kroku 5.6 dołącz arkusz o nazwie "Miary komórek" zawierający wszystkie dane wymagane do analizy ploidalnej określone w kolumnach (Rysunek 3A). Upewnij się, że układ arkusza kalkulacyjnego, w tym nazwy nagłówków kolumn, pozostaje niezmieniony w stosunku do układu Rysunek 3A, ponieważ metoda analizy znajduje poprawne dane kolumny, wyszukując te nazwy (zobacz zestawy danych demonstracyjnych w plikach uzupełniających w celach informacyjnych). Jeśli na przykład oprogramowanie do analizy obrazów o wysokiej zawartości nie tworzy kolumny "Strumień światła" (Rysunek 3A), ręcznie wstaw kolumnę "Strumień światła" w tym samym miejscu, tj. kolumnę K i wypełnij ją zerami.
      2. Dla każdego warunku eksperymentalnego (np. "Uszkodzony-d14") należy podać zestaw danych kontrolnych, który zostanie wykorzystany do obliczenia kontroli wewnętrznej dla kalibracji ploidalności jądrowej 2−4N (krok 6.3.4.3). Tutaj wybierz próbki wątroby od nieleczonych dorosłych rodzeństwa ("Control-d0"; Rysunek 3B−D).
      3. W przypadku replik biologicznych (według warunku) każdy arkusz kalkulacyjny należy przechowywać w osobnym folderze (jak w Rysunek 3B). Nazwij prefiksy folderów przyrostowo, np. "Sample1, Sample2, Sample3... SampleN", zgodnie z zawartymi w nim nazwami plików. W związku z tym każdy folder zestawu danych (np. "Control-d0") powinien zawierać serię podfolderów ("Sample1", "Sample2" itp.), z których każdy zawiera plik arkusza kalkulacyjnego o tej samej odpowiadającej nazwie.
    3. Uruchom aplikację.
      1. W MATLAB uruchom "Ploidy_Application", klikając ikonę w zakładce MOJE APLIKACJE na pasku narzędzi (Rysunek 3C). Pojawi się Ploidy_Application graficzny interfejs użytkownika (GUI) (Rysunek 3C).
      2. Kliknij przycisk Ścieżka do danych kontrolnych, aby przejść do folderu, w którym znajdują się replikowane dane kontrolne (np. "Control-d0"). Ta ścieżka danych pojawi się następnie w interfejsie (np. /Users/Desktop/Control-d0).
      3. Następnie w polu "prefiks folderu" wpisz nazwę, która ma być nadana plikom wyjściowym (np. "Przykład").
        UWAGA: Ten prefiks można zmienić na dowolny tekst, pod warunkiem, że nazwy folderów i plików pozostaną przyrostowe.
      4. Kliknij przycisk Ścieżka do innych danych i przejdź do folderu, w którym znajdują się repliki danych porównawczych (np. "Ranny-d14"). Ta ścieżka danych pojawi się następnie w interfejsie (np. /Users/Desktop/Injured-d14).
      5. Kliknij Uruchom!. Po zakończeniu analizy na pasku stanu pojawi się komunikat "Analiza zakończona.. ".
        UWAGA: Aplikacja poda, dla każdej próbki, stratyfikację "prostych" jąder na ≤2n, 2n−4n, 4n−8n i 8n+ pod względem liczb bezwzględnych i jako procent całkowitej (Rysunek 3D). Pliki te zostaną automatycznie zapisane w każdym folderze próbki jako: "Count_2n.txt", "Count_2n_to_4n.txt", "Count_4n_to_8n.txt", "Count_8n_and_higher.txt", "Percentage_2n.txt", "Percentage_2nto4n.txt", "Percentage_4nto8n.txt", "Percentage_8n_and_higher.txt". Ploidy_Application automatycznie zapisze listę dla każdej próbki wszystkich indywidualnych oszacowań ploidalności dla "prostych" jąder hepatocytów i niehepatocytów w "Ploidy_All_Hepatocytes.txt" i "Ploidy_NonHepatocytes.txt". W przypadku zestawu danych kontrolnych metoda zapisuje również minimalne progi zawartości DNA obliczone dla stratyfikacji ploidalności (patrz krok 6.3.4.3.7) w pliku o nazwie "Normalised_Thresholds_Control". Na koniec aplikacja utworzy folder zarówno dla kontroli, jak i wybranych danych porównawczych warunku o nazwie "Podsumowanie". Ten folder zawiera dwa podfoldery, "Ploidy" i "Stratyfikacja", które zawierają średnie ze wszystkich dostarczonych próbek (Rysunek 3D).
    4. Opis metodyki.
      UWAGA: Poniższa sekcja szczegółowo opisuje metodologię stosowaną przez oprogramowanie do analizy ploidalności jądrowej. Jeśli użytkownik zdecyduje się nie korzystać z aplikacji, następujące kroki można wykonać za pomocą arkusza kalkulacyjnego, aby ręcznie obliczyć profil ploidalności jądrowej.
      1. Podziel jądra na "proste" lub "złożone" zgodnie z morfometrią jądrową.
        1. Obliczyć "wskaźnik kołowości" dla wszystkich jąder, zdefiniowany jako "współczynnik wydłużenia" jądra podzielony przez "współczynnik Nuc 1/(współczynnik kształtu)", gdzie wartość 1,0 oznacza idealne koło.
          UWAGA: "Wydłużenie jądrowe" i "Nuc 1/(współczynnik kształtu)" to dwie dyskretne miary "okrągłości" obiektu, które oceniają uzupełniające się, nienakładające się kryteria morfometryczne. Pierwsza z nich mierzy długie i krótkie osie obiektu, podczas gdy druga porównuje długość obwodu obiektu z długością jego obszaru. Aby wzmocnić definicję obiegu jądrowego zastosowaną w tym protokole, te dwa pomiary zostały połączone w jeden "wskaźnik obiegu zamkniętego". Poprzednie podejście do szacowania ploidalności jądrowej przy użyciu opisanej metodologii wykorzystywało tylko wydłużenie jądrowe17. Chociaż przy użyciu tego podejścia uzyskano akceptowalne wyniki, autorzy zaobserwowali, że złożony "wskaźnik kolistości" poprawia rozróżnianie ręcznie wybranych jąder od hepatocytów jednojądrzastych i dwujądrzastych (dane nie pokazane).
        2. Jądra o wskaźniku cyrkularności ≤ 0,8 należy klasyfikować jako "złożone", a te > 0,8 jako "proste".
      2. Oszacuj "minimalną" zawartość DNA (m) dla wszystkich "prostych" jąder.
        1. Oblicz promień jądra (r) za pomocą wzoru:
          figure-protocol-3
        2. Obliczać objętość jądra (v) za pomocą wzoru na objętość kuli:
          figure-protocol-4
        3. Wygeneruj względną wartość dla minimalnej zawartości DNA (m) za pomocą wzoru:
          figure-protocol-5
      3. Skalibruj zestaw danych, używając jąder NPC (HNF4α-) jako wewnętrznej kontroli 2−4N.
        UWAGA: NPC mają zawartość DNA 2-4N w zależności od statusu cyklu komórkowego. W związku z tym średnia wartość "minimalnej" zawartości DNA NPC (NPCm) wzrasta wraz z urazem (Rysunek 4A). Błąd kalibracji jest minimalizowany poprzez ustalenie górnej granicy NPCm reprezentującej próg 4c (Rysunek 4B).
        1. W arkuszu kalkulacyjnym wybierz tylko jądra NPC z wartościami "m", które mieszczą się w granicach 1 odchylenia standardowego (SD) trybu (odfiltrowuje to szum od możliwego błędu segmentacji).
        2. W tym przefiltrowanym zakresie zbadaj obszary jądrowe i odpowiadające im średnie intensywności Hoechsta (Rysunek 4C).
        3. Oszacuj najmniejszy obszar jądrowy w tym filtrowanym zakresie z maksymalną intensywnością jądrową Hoechsta (tj. punktem, w którym linia krzywej zmienia kierunek w przefiltrowanym zbiorze danych, jak pokazano czerwonym kółkiem w Rysunek 4C). Wartość ta reprezentuje stan przejściowy 2N−4N (t), powyżej którego próbkowanie jąder 4c przeważa nad jądrami 2c, co skutkuje maksimami o średniej intensywności Hoechsta.
          UWAGA: Ta wartość jest automatycznie określana przez oprogramowanie; Jednak użytkownicy arkuszy kalkulacyjnych mogą ręcznie wybrać ten punkt jako rozmiar przejściowy.
        4. Obliczyć minimalną zawartość DNA reprezentowaną przez tę wielkość przejściową (tm), postępując zgodnie z krokiem 6.3.4.2.
        5. Aby oszacować ramię 4N w zestawie danych NPCm, dodaj 1 SD do wartości tm. Otrzymana liczba (Rysunek 4B) opisuje górną granicę minimalnej zawartości DNA NPC, która ma być użyta do stratyfikacji ploidalności jądrowej (S4c).
        6. Powtórzyć kroki 6.3.4.3.1−6.3.4.3.5 dla wszystkich próbek "kontrolnych".
          UWAGA: Na przykład w Rysunek 3, nieuszkodzone wątroby kontrolne ("Control-d0") są używane jako warunek kontrolny.
        7. Obliczyć średni próg stratyfikacji 4c (S4c) dla próbek "kontrolnych" i wykorzystać go do ekstrapolacji granic 2c (S2c) i 8c (S8c) dla minimalnej zawartości DNA (m). Progi stratyfikacji są automatycznie generowane i przechowywane przez oprogramowanie (krok 6.3.3.3).
          UWAGA: W zależności od projektu badania, średnie wartości progowe stratyfikacji mogą być obliczane dla każdego stanu lub dla określonych stanów (np. zdrowa wątroba kontrolna). Jednak oprogramowanie do analizy ploidalności jądrowej wymaga, aby jeden z zestawu 2 plików był oznaczony jako "kontrola" w celu obliczenia względnych wartości ploidalności.
        8. Obliczyć wartość ploidalności dla wszystkich jąder, korzystając z wartości S2c wygenerowanej w kroku 6.3.4.3.7 zgodnie z:
          figure-protocol-6
        9. Stratyfikować "proste" jądra hepatocytów (HNF4α+) na nawiasy 2c/4c/8c/>8c zgodnie z następującymi kryteriami: "2c" HNF4α+ = p ≤ 2; "4c" HNF4α+ = 2 < p ≤ 4; "8c" HNF4α+ = 4 < p ≤ 8; ">8c" HNF4α+ = 8 < p.
        10. Aby zrekonstruować wzorzec przestrzenny podgrup ploidalnych, oddziel dane jądrowe w każdym arkuszu kalkulacyjnym próbki zgodnie z odpowiednimi polami, w których zostały pozyskane. Następnie użyj powiązanych współrzędnych jądrowych x/y (z kroku 5.5), aby wykreślić podgrupy ploidalne w 2D (Rysunek 5C).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta metoda została użyta do zmierzenia wpływu uszkodzenia cholestatycznego na wątrobę dorosłej myszy poprzez karmienie zwierząt przez 0−21 dni dietą hepatotoksyczną zawierającą 0,1% 3,5-diethoksykarbonylo-1,4-dihydrokolidyny (DDC)17. Przewlekłe karmienie DDC powoduje uszkodzenie komórek wątroby, zwiększoną ploidalność i ekspansję okołoportalową NPC. Użytkownik powinien być świadomy, że w ploidalności jądrowej mogą występować różnice w odmianie myszy i wieku oraz że ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisano wysokozawartościowe, wysokoprzepustowe podejście do analizy przebudowy tkanek i szacowania ploidalności jądrowej hepatocytów w wątrobie myszy. Po zapoznaniu się z procedurą użytkownik może przetwarzać, obrazować i analizować wiele próbek w ciągu 3-5 dni, generując duże testowalne zestawy danych, które zapewniają szczegółową sygnaturę zdrowia wątroby. Biorąc pod uwagę prostotę metody przygotowania próbki, a także dużą liczbę analizowanych komórek i powierzchni tkanek (średnio 14mm2 na próbkę), wyniki są...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została sfinansowana przez hiszpański rząd MINECO BFU2014-58686-P (LAN) i SAF-2017-84708-R (DJB). LAN był wspierany przez krajowe stypendium MINECO Ramón y Cajal Fellowship RYC-2012-11700 i nagrodę Plan GenT (Comunitat Valenciana, CDEI-05/20-C), a FMN przez regionalne stypendium ValI+D Valencian Generalitat ACIF/2016/020. RP dziękuje prof. Ewie K. Paluch za dofinansowanie. Dziękujemy dr Alicii Martínez-Romero (CIPF Cytometry service) za pomoc w korzystaniu z platformy IN Cell Analyzer.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Dieta 3,5-diethoksykarboksyno-1,4-dihydrokolidynowa (DDC)TestDiet1810704Zmodyfikowana dieta myszy LabDiet 5015 z 0,1% DDC
Alexa Fluor 488 anty-kozi IgG osła (H + L)InvitrogenA11055Rozcieńczenie 1:500
Albumina surowicy bydlęcejSigma-AldrichA7906
Kriostat Leica CM1850 UVLeica biosystemsCM1850 UVSekcja tkanek
Fluorescencyjny Medium montażoweDakoS3023
GraphPad PrismGraphPad SoftwarePrism 8Oprogramowanie statystyczne do wykresów
danych Hoechst 33342Sigma-AldrichB2261Stężenie końcowe 5 &mikro; Analizator komórek g/mL
IN 1000GE Healthcare Bio-Sciences CorpSystem obrazowania i analizy komórkowej o wysokiej zawartości MATLAB
MathWorksR2019aOprogramowanie do analizy danych do automatycznej analizy ploidalności jądrowej
Szkiełka nakrywkowe mikroskopuVWR International630-2864Rozmiar 24 x 60 mm
Microsoft Office ExcelMicrosoftSpeadsheet oprogramowanie
OCT Tissue TekPascual y Furió4583
ParaformaldehydPanreac AppliChem141451.121
Długopis do barwienia immunologicznegoSigma-AldrichZ377821-1EA
Szkiełka mikroskopowe polisynoweVWR International631-0107
Poliklonalny królik anty-HNF4&alfa;Thermo Fisher ScientificPA5-79380Rozcieńczenie 1:250 (alternatywnie)
Rabit poliklonalny anty-HNF4&alfa;Santa Cruz Biotechnologysc-6556Rozcieńczenie 1:200 (przeciwciało użyte w badaniu)
Tween 20Sigma-AldrichP5927
o szerokości 5 mm

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gentric, G., Desdouets, C. Polyploidization in liver tissue. American Journal of Pathology. 184 (2), 322-331 (2014).
  2. Duncan, A. W., et al. The ploidy conveyor of mature hepatocytes as a source of genetic variation. Nature. 467 (7316), 707-710 (2010).
  3. Gentric, G., Desdouets, C. Liver polyploidy: Dr Jekyll or Mr Hide? Oncotarget. 6 (11), 8430-8431 (2015).
  4. Wilkinson, P. D., et al. The Polyploid State Restricts Hepatocyte Proliferation and Liver Regeneration in Mice. Hepatology. 69 (3), 1242-1258 (2019).
  5. Wilkinson, P. D., et al. Polyploid Hepatocytes Facilitate Adaptation and Regeneration to Chronic Liver Injury. The American Journal of Pathology. 189 (6), 1241-1255 (2019).
  6. Zhang, S., et al. The Polyploid State Plays a Tumor-Suppressive Role in the Liver. Developmental Cell. 44 (4), 447-459 (2018).
  7. Chao, H. W., et al. Circadian clock regulates hepatic polyploidy by modulating Mkp1-Erk1/2 signaling pathway. Nature Communications. 8 (1), 2238(2017).
  8. Celton-Morizur, S., Merlen, G., Couton, D., Margall-Ducos, G., Desdouets, C. The insulin/Akt pathway controls a specific cell division program that leads to generation of binucleated tetraploid liver cells in rodents. Journal of Clinical Investigation. 119 (7), 1880-1887 (2009).
  9. Wang, M. J., Chen, F., Lau, J. T. Y., Hu, Y. P. Hepatocyte polyploidization and its association with pathophysiological processes. Cell Death & Disease. 8 (5), e2805(2017).
  10. Gentric, G., et al. Oxidative stress promotes pathologic polyploidization in nonalcoholic fatty liver disease. Journal of Clinical Investigation. 125 (3), 981-992 (2015).
  11. Toyoda, H. Changes to hepatocyte ploidy and binuclearity profiles during human chronic viral hepatitis. Gut. 54 (2), 297-302 (2005).
  12. Miyaoka, Y., et al. Hypertrophy and Unconventional Cell Division of Hepatocytes Underlie Liver Regeneration. Current Biology. 22 (13), 1166-1175 (2012).
  13. Bou-Nader, M., et al. Polyploidy spectrum: a new marker in HCC classification. Gut. , (2019).
  14. Danielsen, H., Lindmo, T., Reith, A. A method for determining ploidy distributions in liver tissue by stereological analysis of nuclear size calibrated by flow cytometric DNA analysis. Cytometry. 7 (5), 475-480 (1986).
  15. Guidotti, J. E., et al. Liver Cell Polyploidization: A Pivotal Role for Binuclear Hepatocytes. Journal of Biological Chemistry. 278 (21), 19095-19101 (2003).
  16. Severin, E., Meier, E. M., Willers, R. Flow cytometric analysis of mouse hepatocyte ploidy - I. Preparative and mathematical protocol. Cell and Tissue Research. 238 (3), 643-647 (1984).
  17. Manzano-Núñez, F., et al. Insulin resistance disrupts epithelial repair and niche-progenitor Fgf signaling during chronic liver injury. PLoS Biology. 17 (1), e2006972(2019).
  18. Morales-Navarrete, H., et al. A versatile pipeline for the multi-scale digital reconstruction and quantitative analysis of 3D tissue architecture. eLife. 4, e11214(2015).
  19. Baratta, J. L., et al. Cellular organization of normal mouse liver: A histological, quantitative immunocytochemical, and fine structural analysis. Histochemistry and Cell Biology. 131 (6), 713-726 (2009).
  20. Pandit, S. K., et al. E2F8 is essential for polyploidization in mammalian cells. Nature Cell Biology. 14 (11), 1181-1191 (2012).
  21. Vinogradov, A. E., Anatskaya, O. V., Kudryavtsev, B. N. Relationship of hepatocyte ploidy levels with body size and growth rate in mammals. Genome. 44 (3), 350-360 (2001).
  22. Tanami, S., et al. Dynamic zonation of liver polyploidy. Cell and Tissue Research. 368 (2), 405-410 (2017).
  23. Kudryavtsev, B. N., Kudryavtseva, M. V., Sakuta, G. A., Stein, G. I. Human hepatocyte polyploidization kinetics in the course of life cycle. Virchows Archiv B Cell Pathology Including Molecular Pathology. 64 (1), 387-393 (1993).
  24. Gentric, G., Celton-Morizur, S., Desdouets, C. Polyploidy and liver proliferation. Clinics and Research in Hepatology and Gastroenterology. 36 (1), 29-34 (2012).
  25. Uhlén, M., et al. Tissue-based map of the human proteome. Science. 347 (6220), 1260419(2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Hepatocyte Nuclear PloidyHigh Throughput ImagingLiver Tissue SectionsImmunocytochemistryNuclear SegmentationHNF4 alpha AntibodyHoechst StainingPloidy QuantificationFluorescence MicroscopyCellular Composition Analysis

Powiązane artykuły