Hemogenne przeprogramowanie ludzkich fibroblastów poprzez wymuszoną ekspresję czynników transkrypcyjnych

Summary

Ten protokół demonstruje indukcję programu hemogennego w ludzkich fibroblastach skóry poprzez wymuszoną ekspresję czynników transkrypcyjnych GATA2, GFI1B i FOS w celu wytworzenia hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych.

Abstract

Mechanizmy komórkowe i molekularne leżące u podstaw specyfikacji ludzkich hematopoetycznych komórek macierzystych (HSC) pozostają nieuchwytne. Strategie mające na celu podsumowanie pojawienia się HSC u ludzi in vitro są niezbędne do przezwyciężenia ograniczeń w badaniu tego złożonego procesu rozwojowego. W tym miejscu opisujemy protokół generowania hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych z ludzkich fibroblastów skóry przy użyciu podejścia bezpośredniego przeprogramowania komórek. Komórki te przechodzą przez hemogenny typ komórek pośrednich, przypominający przejście śródbłonka do hematopoetycznego (EHT) charakterystyczne dla specyfikacji HSC. Fibroblasty przeprogramowano do komórek hemogennych poprzez transdukcję z czynnikami transkrypcyjnymi GATA2, GFI1B i FOS. Ta kombinacja trzech czynników wywołała zmiany morfologiczne, ekspresję markerów hemogennych i krwiotwórczych oraz dynamiczne programy transkrypcyjne EHT. Przeprogramowane komórki generują krwiotwórcze potomstwo i ponownie zasiedlają myszy z niedoborem odporności przez trzy miesiące. Protokół ten może być dostosowany do mechanistycznego rozbioru ludzkiego procesu EHT, czego przykładem jest zdefiniowanie celów GATA2 we wczesnych fazach przeprogramowania. W ten sposób przeprogramowanie hemogenne człowieka zapewnia proste i wykonalne podejście do identyfikacji nowych markerów i regulatorów pojawiania się HSC u ludzi. W przyszłości wierna indukcja losów hemogennych w fibroblastach może doprowadzić do wytworzenia specyficznych dla pacjenta HSC do przeszczepu.

Introduction

Ostateczne hematopoetyczne komórki macierzyste i progenitorowe (HSPC) wyłaniają się w regionie aorta-gonad-mesonephros (AGM) i łożysku z prekursorów śródbłonka o zdolności hemogennej, poprzez przejście śródbłonka do układu krwiotwórczego (EHT)^1,2. Prekursory hemogenne (HP) wyrażają zarówno markery śródbłonka, jak i hematopoetyczne, ale ich dokładna identyfikacja pozostaje nieuchwytna, szczególnie w układzie ludzkim. Pomimo tego, że jest to stosunkowo konserwatywny proces u ssaków, rozwój hematopoetycznych komórek macierzystych (HSC) nadal różni się znacznie między modelami ludzkimi i myszymi^3,4. W związku z tym potrzebne są podejścia in vitro w celu podsumowania rozwoju HSC u ludzi.

Różnicowanie pluripotencjalnych komórek macierzystych (PSC) do HSC, choć obiecujące, spotkało ograniczony sukces w ciągu ostatnich 20 lat, głównie ze względu na dostępne protokoły różnicowania, które skutkują prymitywnymi krwiotwórczymi komórkami progenitorowymi o słabej zdolności do wszczepienia5^,6,7. Alternatywnie, metodologie bezpośredniego przeprogramowania komórek zostały zastosowane do generowania komórek podobnych do HSPC z wielu typów komórek, przy użyciu czynników transkrypcyjnych (TF)^8,9. W szczególności nadekspresja trzech TF, Gata2, Gfi1b i cFos, przekształciła mysie fibroblasty embrionalne w HSPC za pomocą produktu pośredniego HP o określonym fenotypie (Prom1 + Sca-1 + CD34 + CD45-)¹⁰. Proces ten przypominał EHT, który występuje w zarodku i łożysku, podczas określania ostatecznej hematopoezy. Ten fenotyp umożliwił identyfikację i izolację populacji HP w łożysku myszy, która po krótkotrwałej hodowli i aktywacji Notch wygenerowała seryjnie przeszczepiane HSCs¹¹.

Jak dotąd, nie ustalono fenotypu, który odróżniałby ludzkie HSC od ich prekursorów, ale wiadomo, że niektóre cząsteczki ulegają ekspresji w powstających HSC. Integryna alfa 6 (ITGA6 lub CD49f) jest wysoce eksprymowana w długotrwale repopulujących HSC, najbardziej niedojrzałych komórkach w kompartmencie HSC¹², a enzym konwertujący angiotensynę (ACE lub CD143) jest obecny w ujemnych prekursorach hematopoetycznych CD34 w embrionalnych tkankach krwiotwórczych¹³.

Ostatnio wykazaliśmy, że ludzkie wersje trzech TF, GATA2, FOS i GFI1B, przeprogramowują ludzkie fibroblasty skórne (HDF) na HP o krótkotrwałej zdolności do wszczepienia¹⁴. W początkowych fazach przeprogramowania GATA2 angażuje otwartą chromatynę i rekrutuje GFI1B i FOS do tłumienia genów fibroblastów i aktywacji genów śródbłonka i hematopoetycznych. Komórki indukowane wykazywały wysoką ekspresję CD49f i ACE i zawierały niewielki odsetek komórek wyrażających marker HSPC CD34. Wykazano, że gen CD9, który ulega ekspresji w HSCs¹⁵ i jest ważny dla HSC homing¹⁶, okazał się być bezpośrednim celem GATA2 i jednym z najbardziej regulowanych w górę genów w przeprogramowanych komórkach¹⁴. CD9 może zatem stanowić dodatkowy marker dla HP ludzkiej ostatecznej hematopoezy.

W tym protokole opisujemy generowanie komórek podobnych do HSPC z ludzkich fibroblastów poprzez wymuszoną ekspresję GATA2, GFI1B i FOS, a także dostosowaną metodę analizy immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) i sekwencjonowania (seq) na początku przeprogramowania. TF kodowano w indukowanym doksycykliną (DOX) wektorze lentiwirusowym (pFUW-tetO), który zawiera element odpowiedzi tetracykliny (TRE) i minimalny promotor CMV, i transdukowano je razem z wektorem konstytutywnym zawierającym białko transaktywatora odwrotnej tetracykliny (pFUW-M2rtTA). Kiedy DOX (analog tetracykliny) jest dodawany po transdukcji, wiąże się z białkiem rtTA, które oddziałuje z TRE, umożliwiając transkrypcję TF (system Tet-On). Procedura trwa 25 dni. W eksperymentach ChIP-seq HDF transdukowano za pomocą oznakowanych wersji GATA2 (pFUW-tetO-3xFLAG-GATA2) i GFI1B (pLV-tetO-HA-GFI1B), a miejsca wiązania pFUW-tetO-FOS i TF analizowano dwa dni po suplementacji DOX.

Ostatecznie, hemogenne przeprogramowanie ludzkich fibroblastów dostarcza in vitro elastycznego systemu do badania mechanizmów leżących u podstaw ludzkiej hematopoezy rozwojowej i potencjalnego źródła specyficznych dla pacjenta HSPC do przyszłego zastosowania klinicznego.

Protocol

Ten protokół został przeprowadzony zgodnie z wytycznymi komitetu etyki badań naukowych Uniwersytetu w Lund i powinien być wykonany zgodnie z indywidualnymi wytycznymi instytucjonalnymi.

1. Przygotowanie odczynnika

1. W przypadku zmodyfikowanego Eagle's Medium (DMEM)/20% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) firmy Dulbecco, należy zmieszać DMEM o wysokiej zawartości glukozy zawierającą pirogronian sodu z 20% FBS, 1% penicyliny-streptomycyny (pióro/paciorkowca), 1% L-glutaminy, 1% aminokwasów endogennych i ^10-4-M 2-merkaptoetanolu.
2. Aby uzyskać kompletny DMEM, wymieszaj DMEM o wysokiej zawartości glukozy zawierający pirogronian sodu z 10% FBS, 1% Pen/paciorkowca i 1% L-glutaminy.
3. W przypadku pożywki krwiotwórczej należy zmieszać pożywkę krwiotwórczą (tabela materiałów) z ^10-6 M hydrokortyzonem i 1% pióra/paciorkowca.
4. Stosować sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) bez wapnia i magnezu.

2. Izolacja ludzkich fibroblastów skórnych

UWAGA: HDFy można nabyć od certyfikowanych dostawców (Tabela materiałów). W takim przypadku rozwiń fibroblasty i użyj ich bezpośrednio w eksperymentach z przeprogramowaniem (sekcja 4). Alternatywnie, HDF można wyizolować od dawców. Jeśli fibroblasty są izolowane od różnych dawców, należy trzymać próbki oddzielnie od siebie na wszystkich etapach protokołu. Oznaczyć tabliczki/studzienki i probówki do pobierania z numerem identyfikacyjnym każdego dawcy.

1. Uzyskać HDF z 3 mm okrągłych biopsji skóry wykonanych przez wykwalifikowanych lekarzy.
2. Pokryć trzy dołki 6-dołkowej płytki poddanej kulturze tkankowej 500 μl 0,1% żelatyny i inkubować przez 20 minut w temperaturze 37 °C.
3. Odessać pozostały roztwór żelatyny i dodać 750 μl DMEM/20% FBS do każdej studzienki. Cała powierzchnia studni powinna być pokryta podłożem.
4. Dodać 1,5 ml DMEM/20% FBS na wewnętrzną powierzchnię sterylnej pokrywki na szalkę Petriego o średnicy 100 mm i rozprowadzić kroplę za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 ml.
5. Umieścić biopsję skóry w pożywce na pokrywce za pomocą wysterylizowanych kleszczy.
6. Rozbiopsję skóry należy podzielić na dziewięć identycznych sekcji, używając jednego wysterylizowanego skalpela do przytrzymania biopsji na miejscu i drugiego skalpela do cięcia.
7. Umieść trzy kawałki biopsji w każdym dołku za pomocą spiczastych kleszczy. Upewnij się, że kawałki są przymocowane do dna studni.
8. Połóż szkiełko nakrywkowe o średnicy 22 mm na wierzchu kawałków i lekko dociśnij.
9. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ przez tydzień. Sprawdzaj komórki codziennie i dodawaj 200 μl DMEM/20% FBS co 2 dni, aby zastąpić odparowane podłoże.
10. Po tygodniu dodaj do 2 ml DMEM/20% FBS i wymieniaj pożywkę co 2-3 dni.
11. Komórki pasażowe w stosunku 1:4, gdy studzienki są zlewające się (około 4-8 tygodni).
    1. Przygotować 0,1% pokryte żelatyną płytki 6-dołkowe poddane kulturze tkankowej.
    2. Odessać pożywkę ze studzienek przy 80% zbiegu i przemyć raz 1 ml PBS.
    3. Usuń szkiełko nakrywkowe za pomocą sterylnych kleszczyków i umieść szkiełko nakrywkowe w nowym dołku na płytce 6-dołkowej, stroną z tkanką do góry.
       nuta: Komórki, które pozostały przyczepione do szkiełka nakrywkowego, również zostaną zebrane.
    4. Dodać 500 μl roztworu dysocjacyjnego (tabela materiałów) na studzienkę (w tym studzienki z szkiełkami nakrywkowymi) i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ przez 5-10 min. Sprawdzić, kiedy komórki zaczynają podnosić się z dna studzienki i dezaktywować roztwór dysocjacyjny, dodając 500 μl DMEM/20% FBS do każdego dołka.
    5. Zbierz fibroblasty ze wszystkich studzienek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Dodaj dodatkowe podłoże do dołków, aby zebrać pozostałe komórki. Odwirować probówkę o masie 350 x g przez 5 minut.
    6. W międzyczasie dodaj 500 μl DMEM/20% FBS do każdego dołka na płytkach wcześniej pokrytych żelatyną.
    7. Odessać pożywkę i ponownie zawiesić fibroblasty w 6 ml DMEM/20% FBS.
    8. Dodać 500 μl zawiesiny fibroblastów do każdej studzienki (łącznie dwie płytki 6-dołkowe na próbkę/dawcę). Inkubować komórki przez noc w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ .
12. Następnego dnia dodaj 1 ml DMEM/20% FBS do każdej studzienki. Zastąp pożywkę 2 ml DMEM/20% FBS co 2-3 dni, aż studzienki będą zlewać się w 80%.
13. Powtórzyć sekcję 2.11 dla trzech zlewających się studzienek, aż do osiągnięcia trzeciego przejścia.
14. Zamrozić fibroblasty z konfluentnych studzienek (przejścia 1 i 3).
    1. Odessać pożywkę ze studzienek i przemyć raz 1 ml PBS.
    2. Oddziel i zbierz fibroblasty zgodnie z opisem w krokach 2.11.4 i 2.11.5.
    3. Policz komórki za pomocą hemocytometru i odwiruj probówkę o sile 350 x g przez 5 minut.
    4. Po odwirowaniu odessać pożywkę i ponownie zawiesić fibroblasty w FBS z 10% DMSO o gęstości 5 x 10⁵ komórek/ml.
    5. Dodać 1 ml zawiesiny komórek na kriowialną i zamrozić komórki na noc w temperaturze -80 °C za pomocą pojemnika do zamrażania. Przenieść fiolki do temperatury -150 °C (ciekły azot) w celu długotrwałego przechowywania.

3. Produkcja lentiwirusowa

1. Hodować HEK293T komórek w naczyniu o średnicy 100 mm poddanym działaniu kultur tkankowych z 10 ml kompletnego DMEM, w temperaturze 37 °C, 5% CO_{2 ,} aż do osiągnięcia konfluencji.
2. W dniu poprzedzającym transfekcję należy odessać pożywkę i dokładnie umyć naczynie 5 ml PBS.
3. Po usunięciu PBS dodać 1,5 ml roztworu dysocjacyjnego i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ przez 5−10 minut, aby oddzielić komórki od naczynia.
   nuta: Zaleca się podgrzanie zarówno PBS, jak i roztworu dysocjacyjnego przed użyciem, aby ogniwa nie uległy szokowi termicznemu.
4. Inaktywować roztwór dysocjacyjny za pomocą 3 ml kompletnego DMEM i przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Umyj naczynie 5 ml kompletnego DMEM w celu usunięcia pozostałych przyłączonych komórek i przenieś tę objętość do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
5. Odwirować zawiesinę komórek w dawce 350 x g przez 5 min.
6. Odessać supernatant i równomiernie rozdzielić osad komórkowy między sześć 100-milimetrowych szalek poddanych kulturze tkankowej w końcowej objętości 10 ml kompletnego DMEM na szalkę. Komórki powinny zlewać się w około 60% do czasu transfekcji.
7. Następnego dnia transfekowane komórki z plazmidem mieszają się w następujący sposób:
   UWAGA: Ta część protokołu opisuje produkcję lentiwirusów w jednym naczyniu poddanym działaniu kultur tkankowych o średnicy 100 mm na mieszaninę plazmidów. Aby uzyskać większe objętości supernatantu lentiwirusowego do zagęszczenia, należy użyć co najmniej czterech naczyń do hodowli komórkowych o średnicy 100 mm HEK293T na mieszankę.
   1. W stożkowej probówce o pojemności 15 ml dodaj razem 10 μg trzech plazmidów transferowych: 3,33 μg pFUW-tetO-GATA2 (plazmid Addgene #125028)¹⁴, 3,33 μg pFUW-tetO-GFI1B (Addgene #125597)¹⁴ i 3,33 μg pFUW-tetO-FOS (Addgene #125598)¹⁴, plus 10 μg wektora pakowania psPAX2^{drugiej generacji} kodującego Gag, Geny Pol, Tat i Rev (Addgene #12260) oraz 5 μg wektora otoczki pMD2.G kodującego gen VSV-G (Addgene #12259). Dodać wodę do 500 μl.
   2. W dwóch nowych stożkowych probówkach o pojemności 15 ml dodaj 10 μg plazmidu FUW-M2rtTA (Addgene #20342)¹⁷, 10 μg wektora opakowania psPAX2 i 5 μg wektora koperty pMD2.G do każdej probówki. Dodać wodę do 500 μl. Jedna rurka będzie używana jako kontrola.
   3. Do każdej probówki dodać 62,5 μl 2 M CaCl₂. Następnie uwolnij bąbelki do każdej mieszaniny za pomocą pipety Pasteura włożonej do kontrolera pipet. Podczas tworzenia się pęcherzyków odpipetować pipetą 500 μl soli fizjologicznej z buforem kwasu N,N-bis(2-hydroksyetylo)-2-aminoetanosulfonowego (BES) (pH 7,1, 25 °C) pipetą P1000 kroplami do pipety Pasteura i na mieszaninę.
   4. Inkubować probówki w temperaturze pokojowej przez co najmniej 15 minut. Po pewnym czasie mieszanki będą wydawać się lekko mętne.
8. W międzyczasie odessać pożywkę z HEK293T szalek komórkowych (pasażowanych dzień wcześniej) i dodać 10 ml kompletnego DMEM bez antybiotyków. Zachowaj ostrożność i powoli dodawaj pożywkę HEK293T ponieważ komórki są częściowo przylegające.
9. Rozprowadzić każdą pojedynczą mieszaninę (około 1 ml) równomiernie i kroplami w oddzielnych naczyniach i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ .
10. Zastąp pożywkę 4 ml kompletnego DMEM, 24 godziny po inkubacji. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ . Jeśli to możliwe, inkubować w temperaturze 32 °C, 5% CO_{2 ,} ponieważ obniżona temperatura wydłuży okres półtrwania cząstek lentiwirusa.
11. Zebrać supernatant z cząstkami lentiwirusa trzykrotnie do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. W tym momencie nie mieszaj różnych cząstek lentiwirusa. Każde danie da 12 ml supernatantu lentiwirusowego. Cztery szalki tego samego preparatu wirusowego mieszczą się w jednej stożkowej probówce o pojemności 50 ml.
    UWAGA: Pobrać lentiwirusy w laboratorium poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2 w okapie z przepływem laminarnym przeznaczonym do pracy z lentiwirusami i umieścić odpady skażone wirusem (probówki, końcówki, naczynia) w odpowiednim pojemniku na materiały niebezpieczne biologicznie.
    1. Wykonaj pierwszy zbiór 16 godzin po ostatniej inkubacji i dodaj 4 ml kompletnego DMEM. Inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ .
    2. Drugą zbiórkę wykonać 8 godzin po pierwszej do tej samej probówki, dodać 4 ml kompletnego DMEM i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ .
    3. Wykonaj trzecie zbieranie 16 godzin po drugim do tej samej probówki i wyrzuć naczynia.
       nuta: Supernatanty lentiwirusowe przechowywać w temperaturze 4 °C po każdym pobraniu.
12. Przefiltrować każdy supernatant lentiwirusowy za pomocą niskobiałkowego filtra wiążącego 0,45 μm z membraną z octanu celulozy (tabela materiałów) do czystej probówki.
13. Dodać maksymalnie 15 ml przefiltrowanego supernatantu do odśrodkowego zespołu filtrującego z membraną z regenerowanej celulozy (tabela materiałów) i wirować z prędkością 4 000 x g przez 25 minut, w temperaturze 4 °C. Odrzucić przepływ. W jednostce filtrującej pozostanie lepka ciecz zawierająca lentiwirusy.
14. Powtórzyć krok 3.13, dodając 15 ml supernatantu na wierzch jednostki filtrującej, aż nie będzie już supernatantu lentiwirusowego.
    nuta: Gdy do zagęszczenia jest tylko kilka mililitrów supernatantu, skróć czas wirowania do 10 minut. Jeśli na filtrze nadal znajduje się dodatkowa ciecz (nielepka), odwiruj przez dodatkowe 10 minut.
15. Przygotować podwielokrotności (50−200 μl w zależności od początkowej objętości supernatantu) każdego typu skoncentrowanych lentiwirusów i przechowywać w temperaturze -80 °C do długotrwałego przechowywania (1−2 lata) lub w temperaturze 4 °C do krótkotrwałego przechowywania (1−2 tygodnie).
    nuta: Skoncentrowane lub nieskoncentrowane lentiwirusy mogą być również używane na świeżo. Nie zamrażaj i nie rozmrażaj ponownie, ponieważ powoduje to zmniejszenie miana.

4. Przeprogramowanie hemogeniczne

UWAGA: Używaj HDFów o numerze przejścia trzy (P3) lub wyższym (do P10) do przeprowadzania eksperymentów z przeprogramowywaniem.

1. Pokryć naczynie o średnicy 100 mm poddane kulturze tkankowej 5 ml 0,1% żelatyny i inkubować w temperaturze 37 °C przez 20 minut. Odessać pozostały roztwór żelatyny.
2. Rozmrozić fiolkę fibroblastów i komórki płytki w naczyniu pokrytym 0,1% żelatyną. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ . W razie potrzeby rozszerzaj fibroblasty przez dłuższy czas, aż do osiągnięcia pożądanego przejścia i zbiegu.
3. Pokryć 6-dołkową płytkę poddaną działaniu kultur tkankowych 500 μl 0,1% roztworu żelatyny i inkubować w temperaturze 37 °C przez 20 minut. Usunąć nadmiar żelatyny.
4. Płytki HDF o gęstości 150 000 komórek na płytkę (25 000 komórek na dołek) w 2 ml kompletnego DMEM na dołek. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C, 5% CO_{2 ,} aby umożliwić przyczepienie komórek.
5. Zastąp pożywkę 2 ml kompletnego DMEM plus 8 μg/ml polibrenu. Przygotuj mieszaninę lentiwirusów TF produkowanych w puli i M2rtTA w proporcji 1:1 w nowej probówce do mikrowirówki.
   nuta: W tym protokole odbywa się pulowa produkcja lentiwirusów dla trzech TF, co w rękach autorów skutkuje wyższą wydajnością przeprogramowywania. Alternatywnie sugeruje się przeprowadzenie miareczkowania poszczególnych cząstek lentiwirusa za pomocą qPCR¹⁸, na standardowej linii komórkowej. Zostanie to wykorzystane do zdefiniowania ilości poszczególnych wirusów niezbędnej do spełnienia wielości infekcji (MOI) optymalnej dla kotransdukcji i przeprogramowania hemogenicznego.
6. Rozprowadzić od 10 do 100 μl mieszaniny lentiwirusowej na studzienkę, aby wyprowadzić HDF. To jest dzień -2 przeprogramowania.
   nuta: Określenie optymalnej objętości mieszanki lentiwirusowej w celu skutecznego przeprogramowania, bez uszczerbku dla żywotności komórek, wymaga optymalizacji (więcej szczegółów na rysunku uzupełniającym 1). HDF z więcej niż 7 pasażami mogą wymagać większych objętości wirusów niż komórki z niższymi pasażami.
7. Po 16 godzinach inkubacji usuń wirusy i dodaj cały DMEM. Pozwól komórkom się zregenerować przez 6-8 godzin.
8. Po wyzdrowieniu odessać pożywkę i dodać 2 ml kompletnego DMEM z 8 μg/ml polibrenu.
9. Przeprowadzić drugą transdukcję zgodnie z opisem w kroku 4.6 i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ przez 16 godzin. To jest dzień -1 przeprogramowania. Mieszaninę lentiwirusową można przygotować w dniu -2 dla obu transdukcji i przechowywać w temperaturze 4 °C.
10. Następnego dnia usuń wirusy i dodaj cały DMEM uzupełniony o 1 μg/ml DOX. To jest dzień 0 przeprogramowania. Inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ przez 48 godzin.
11. W 2 dniu przeprogramowania podziel każdą studzienkę w stosunku 1:2.
    1. Odessać pożywkę i przemyć komórki 1 ml PBS.
    2. Odessać PBS i zdysocjować komórki za pomocą 500 μl roztworu dysocjacyjnego. Inkubować 5-10 min w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ .
    3. Dezaktywować roztwór dysocjacyjny za pomocą 1 ml kompletnego DMEM i zebrać komórki do stożkowej probówki. Wirować przy 350 x g przez 5 min.
    4. Zawiesić osad w pożywce krwiotwórczej (patrz krok 1.3), uzupełniony 1 μg/ml DOX, a komórki płytki umieścić na nowych 6-dołkowych płytkach poddanych hodowli tkankowej, pokrytych 0,1% żelatyną, do końcowej objętości 2 ml na studzienkę.
12. Zmieniaj pożywkę (pożywka krwiotwórcza plus DOX) dwa razy w tygodniu na czas przeprogramowania kultur (25 dni).
13. Analizuj powstałe przeprogramowane komórki w różnych punktach czasowych za pomocą mikroskopii jasnego pola lub mikroskopii fluorescencyjnej (patrz rysunek uzupełniający 2), cytometrii przepływowej, sekwencjonowania RNA masowych i jednokomórkowych oraz testów transplantacyjnych w celu uzyskania morfologii hematopoetycznej, obecności markerów śródbłonka i hematopoetycznych, nabycia profilu ekspresji genów śródbłonka/hematopoetycznych i zdolności regeneracji¹⁴.

5. Optymalizacja ekspansji fibroblastów do analizy ChIP-seq na początku przeprogramowania hemogennego

1. Płytka 300 000 HDF (2 .
2. Następnego dnia zastąp pożywkę kompletnym DMEM uzupełnionym 8 μg/ml polibrenu.
3. Transdukuj komórki za pomocą indywidualnych czynników: pFUW-tetO-FOS¹⁴, pLV-tetO-HA-GFI1B (Addgene #125599)¹⁴ i pFUW-tetO-3xFLAG-GATA2 (Addgene #125600)¹⁴ lub za pomocą puli trzech czynników plus FUW-M2rtTA w stosunku 1:1. Użyj 10−20 μL wirusa całkowitego (pojedynczy TF + M2rtTA lub trzy TF + M2rtTA). Inkubować komórki przez noc w temperaturze 37 °C, 5% CO₂,
   nuta: Zaleca się stosowanie dwunastu płytek 6-dołkowych na każdy warunek (dla każdego pojedynczego TF i trzech TF łącznie).
4. Usunąć lentiwirusy i dodać cały DMEM 16 godzin po pierwszej transdukcji. Pozwól komórkom zregenerować się przez 6-8 godzin.
5. Transdukować komórki po raz drugi z tą samą ilością wirusa na stan i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ .
6. Następnego dnia usuń wirusy i dodaj kompletny DMEM. Inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ przez 24 godziny.
7. Ponownie pokryć każdy dołek w 0,1% pokrytej żelatyną, poddanej kulturze tkankowej naczyniu o średnicy 100 mm z kompletnym DMEM, do końcowej objętości 10 ml na szalkę. Jest to w przybliżeniu fragment o skali 1:6.
8. Pozwól komórkom rosnąć przez 6 dni w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ .
9. W 6 dniu po ponownym posiewie odessać pożywkę i dodać kompletny DMEM z 1 μg/ml DOX. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ przez 2 dni.
10. Zbierz fibroblasty i przeanalizuj genomowe miejsca wiązania trzech TF transdukowanych pojedynczo lub w połączeniu, za pomocą ChIP-seq 2 dni po suplementacji DOX¹⁴.
    nuta: Ostatnie siedemdziesiąt dwie 100-milimetrowe szalki będą zawierały od 20 do 50 x 10⁶ komórek, co wystarczy do przeprowadzenia eksperymentów i powtórzeń ChIP-seq.

Results

Schematyczne przedstawienie podejścia do przeprogramowania za pomocą HDF jest zilustrowane w Rysunek 1A. Fibroblasty są pozyskiwane ze źródeł komercyjnych lub pobierane od ludzkich dawców i namnażane in vitro przed przeprogramowaniem. Po posianiu komórki są dwukrotnie transdukowane lentiwirusami GATA2, GFI1B i FOS (i M2rtTA), a doksycyklina jest dodawana w dniu 0 przeprogramowania. W 2. dniu komórki są dzielone i siane w pożywce krwiotwórczej do 25 dnia hodowli. Przeprogramowane komórki mogą być generowane w różnych punktach czasowych do wielu zastosowań, w tym do przeszczepu u myszy z obniżoną odpornością, sekwencjonowania jednokomórkowego RNA (scRNA-seq) oczyszczonych populacji komórek (dzień 2 niesortowany, dzień 15 CD49f ⁺ CD34 i dzień 25 komórki CD49f ⁺ CD34 ⁺), a także analiza mikroskopowa i cytometria przepływowa dla markerów powierzchniowych komórek CD49f, CD34, CD9 i CD143. Reprezentatywne wykresy cytometryczne pokazują ~17% przeprogramowanych komórek wykazujących ekspresję zarówno CD49f, jak i CD9 (Rysunek 1B, lewy panel), po 25 dniach przeprogramowania. Większość podwójnie dodatnich komórek wyraża CD143 (~ 86%), a niewielka populacja wyraża CD34 (0,9%), co sugeruje dynamiczną hemogenną indukcję losu. Markery te nie są aktywowane w transdukowanych M2rtTA HDF hodowanych przez 25 dni (Rysunek 1B, prawy panel). Obrazy immunofluorescencyjne potwierdzają ekspresję CD9 i CD143 w komórkach przylegających i okrągłych, morfologicznie różniących się od fibroblastów, które są ujemne dla tych markerów (Rysunek 1C). Ludzkie kolonie hemogenne również wyrażają CD49f i CD34¹⁴. Analiza sekwencyjna ScRNA HDF, niesortowanych komórek dnia 2 i oczyszczonych przeprogramowanych komórek w dniu 15 (CD49f ⁺ CD34^-) i dniu 25 (CD49f ⁺ CD34 ⁺) wykazuje stopniowy wzrost ekspresji CD49f, CD9 i CD143 od dnia 2 do dnia 25. Komórki CD49f i CD9-dodatnie pojawiają się najpierw podczas procesu przeprogramowywania, między 2 a 15 dniem, co wskazuje, że cząsteczki te mogą reprezentować markery wczesnej hemogenezy człowieka. Ekspresja CD143 zaczyna być wykrywana w 15 dniu, a komórki eksprymujące CD34 są wykrywane dopiero w późniejszych punktach czasowych (dzień 25). Jako odniesienie użyto komórek krwi pępowinowej CD34 ⁺ (UCB) (Ryc. 1D).

Rysunek 2A opisuje zmodyfikowany protokół w celu wygenerowania wystarczającej liczby komórek do analizy ChIP-seq w początkowych etapach przeprogramowania hemogenicznego (dzień 2). Po pierwsze, HDF są powlekane z gęstością dwukrotnie większą niż w standardowym protokole (300 000 komórek w porównaniu do 150 000 komórek na płytkę). Po transdukcji każda studzienka jest ponownie platerowana w naczyniu o średnicy 100 mm, co pozwala komórkom na rozszerzanie się przez 6 dni przed uzupełnieniem pożywki DOX. Komórki są analizowane 2 dni po dodaniu DOX i wynikającej z niego ekspresji TF. Rysunek 2B pokazuje profile przeglądarki genomu GATA2 wiążące się z genomowymi regionami regulatorowymi ITGA6 i ACE, gdy komórki są kotransdukowane z trzema czynnikami (3TF) lub GATA2 indywidualnie. GATA2 wiąże się również z otwartymi regionami chromatyny genów CD9 i CD34¹⁴.

Rycina 1: Indukcja losów hemogennych w ludzkich fibroblastach skóry. (A) Eksperymentalna strategia hemogennego przeprogramowania ludzkich fibroblastów skórnych (HDF). Fibroblasty z biopsji skóry są pobierane od dawców, namnażane i transdukowane lentiwirusami GATA2, GFI1B, FOS i M2rtTA. Doksycyklinę (DOX) dodaje się do hodowli w dniu 0 przeprogramowania, a komórki są analizowane w kilku punktach czasowych do 25 dnia. scRNA-seq, sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki. FACS, sortowanie komórek aktywowane fluorescencją. (B) Strategia bramkowania stosowana do oceny ekspresji markerów hemogenicznych/krwiotwórczych za pomocą cytometrii przepływowej w 25 dniu po transdukcji z trzema czynnikami transkrypcyjnymi (3TF). Wykresy cytometryczne pokazują odsetek podwójnie dodatnich komórek dla CD49f i CD9, bramkowanych w populacji żywych komórek (DAPI-ujemne). W populacji podwójnie dodatniej pokazano ekspresję CD143 i CD34. Jako kontrolę stosuje się HDF transdukowane tylko wirusem M2rtTA w tych samych warunkach hodowli. (C) Obrazy immunofluorescencyjne przeprogramowanych kolonii w dniu 25 potwierdzające ekspresję CD9 (górny panel) i CD143 (dolny panel). Komórki barwiono przeciwciałami (tabela materiałów) rozcieńczono w stosunku 1:100 w PBS/2% FBS surowicą mysim, inkubowano 20 minut w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ , trzykrotnie przemyto i obrazowano w PBS / 2% FBS. Faza, kontrast gradientu fazowego. Podziałka = 50 μm. (D) Analiza sekwencyjna ScRNA 253 komórek w różnych punktach czasowych. Ekspresja ITGA6, CD9, ACE i CD34 jest aktywowana podczas przeprogramowywania. Komórki zbiera się w 2 dniu (niesortowane), dniu 15 (CD49f ⁺ CD34^-) i dniu 25 (CD49f ⁺ CD34 ⁺). Jako odniesienia stosuje się HDF i komórki krwi pępowinowej CD34 ⁺ (34 + UCB). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Ekspansja ludzkich fibroblastów skórnych do analizy ChIP-seq. (A) Strategia eksperymentalna przedstawiająca zmodyfikowany protokół w celu wygenerowania dużej liczby transdukowanych ludzkich fibroblastów skórnych (HDF) dla ChIP-seq w 2 dniu przeprogramowania. 300 000 komórek jest sianych na płytkach 6-dołkowych i dwukrotnie transdukowanych pojedynczymi czynnikami (pFUW-tetO-FOS, pLV-tetO-HA-GFI1B lub pFUW-tetO-3xFLAG-GATA2) lub kombinacją trzech czynników (plus M2rtTA). Po usunięciu wirusów fibroblasty są namnażane przez sześć dni w naczyniach o średnicy 100 mm. Doksycyklinę (DOX) dodaje się w dniu 0, a komórki pobiera się dwa dni po dodaniu DEX. (B) Profile przeglądarki genomu podkreślające miejsca wiążące GATA2 (szare pola) w loci ITGA6 i ACE dwa dni po transdukcji z trzema czynnikami transkrypcyjnymi (3TF) lub z samym GATA2. Łączna liczba zmapowanych odczytów jest reprezentowana na osi y. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek uzupełniający 1: Definiowanie zoptymalizowanej objętości lentiwirusa w celu skutecznego przeprogramowania hemogenicznego. Zwiększające się objętości skoncentrowanych (od 10 do 100 μl) cząstek lentiwirusowych wytwarzanych w puli (3TF: GATA2, GFI1B i FOS) wykorzystuje się do transdukcji ludzkich fibroblastów skórnych (HDF) wraz z M2rtTA w stosunku 1:1, zgodnie z krokami 4,5−4.12 protokołu. Przeprogramowane komórki są analizowane w 25 dniu w celu określenia optymalnej objętości transdukcji dla przeprogramowania hemogenicznego, podanej przez procent komórek CD49f ⁺ CD9 ⁺ bramkowanych w żywych komórkach (DAPI-ujemne). Żywotność komórek można ocenić, określając ilościowo bezwzględną liczbę żywych komórek w 25 dniu. HDF transdukowane za pomocą M2rtTA (100 μL) są stosowane jako kontrola ujemna. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek uzupełniający 2: Zmiany morfologii podczas hemogennego przeprogramowania ludzkich fibroblastów skórnych. Hodowle ludzkich fibroblastów skórnych (HDF) są obrazowane w dniu pierwszej transdukcji (dzień -2), gdy DOX jest dodawany do kultur (dzień 0), dwa dni (dzień 2) i piętnaście dni (dzień 15) po suplementacji DOX oraz w punkcie końcowym eksperymentu (dzień 25). Podkreśla się kolonie hemogenne w dniach 15 i 25. Podziałka = 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

W artykule opisano metodę generowania hematopoetycznych komórek progenitorowych bezpośrednio z ludzkich fibroblastów, które przechodzą przez komórkę pośrednią HP, podobnie jak ostateczne HSC¹⁴.

Produkcja pulowa cząstek lentiwirusowych kodujących GATA2, GFI1B i FOS była preferowana w stosunku do produkcji indywidualnej, ponieważ w naszych rękach skutkuje to wyższą wydajnością przeprogramowania (dane niepublikowane). Lentiwirusy, jako członkowie rodziny Retroviridae, zwykle zawierają dwie kopie dodatniego jednoniciowego RNA¹⁹. Zwiększona wydajność przeprogramowania może wynikać z upakowania dwóch różnych transgenów w tej samej cząsteczce lentiwirusa, co skutkuje zwiększoną liczbą komórek współtransdukowanych z trzema czynnikami transkrypcyjnymi. Aby zapewnić powodzenie tego protokołu, konieczne jest przeprowadzenie transdukcji HDF odpowiednią ilością wirusa w zależności od pasażu komórkowego w celu uzyskania optymalnej równowagi między wydajnością przeprogramowania a żywotnością komórki, zgodnie z zaleceniami w kroku 4.6. Ponadto można stosować świeże, nieskoncentrowane wirusy. Zaleca się transdukcję komórek z 0,5-3 ml puli 3TF i M2rtTA. Również gęstość komórek należy dostosować do aplikacji. 150 000 HDF na płytkę 6-dołkową (etap 4.4) zapewniło optymalną gęstość do przeprowadzenia analizy FACS, transplantacji i cytometrii przepływowej przeprogramowanych komórek. W przypadku eksperymentów ChIP-seq od początku wymagana była większa liczba komórek (krok 5.1). Ważne jest, aby regularnie sprawdzać komórki pod kątem zmian morfologicznych i wymieniać pożywkę krwiotwórczą dwa razy w tygodniu, aby wspomóc powstawanie indukowanych komórek krwiotwórczych. Dodanie cytokin krwiotwórczych lub kokultury w warstwach zasilających może zwiększyć wydajność przeprogramowywania.

Dzięki tej metodzie możemy zidentyfikować nowe markery krwiotwórcze, które ulegają dynamicznej ekspresji podczas przeprogramowania hemogennego. CD9, który, jak wykazano, jest regulowany w górę w przeprogramowanych komórkach na poziomie^{transkrypcji 14}, ulega szybkiej ekspresji na powierzchni komórki w początkowych fazach przeprogramowania wraz z CD49f i CD143, służąc jako nowy marker ludzkich prekursorów HSC. Pokazujemy również, że ITGA6 i ACE są bezpośrednimi celami GATA2 podczas początkowych etapów przeprogramowania hemogennego, oprócz CD9 i CD34¹⁴, zapewniając bezpośrednie mechanistyczne powiązanie między ludzkim fenotypem prekursora hemogennego a GATA2.

Jedną z zalet tego systemu jest wykorzystanie stosunkowo jednorodnych kultur fibroblastów. Podczas gdy PSC są łatwo namnażane i utrzymywane in vitro, protokoły różnicowania generują heterogeniczne populacje, które obejmują hematopoetyczne komórki progenitorowe, które słabo się wszczepiają ^5,6,7. Ponadto istnieje ryzyko nowotworzenia podczas przeszczepiania HSPC pochodzących z PSC, ponieważ niezróżnicowane PSC mogą nadal pozostawać w hodowli nawet po zastosowaniu protokołów różnicowania. Alternatywnie do fibroblastów, bezpośrednie przeprogramowanie na HSC zastosowano do komórek progenitorowych zaangażowanych we krew²⁰ i komórek śródbłonka²¹. Jednak rozpoczęcie od komórek progenitorowych o ograniczonej liczbie krwi utrudnia terapeutyczne zastosowanie powstałych HSC, jeśli pacjent jest nosicielem mutacji, które wpływają na populację krwiotwórczą macierzystą/progenitorową²². W przypadku komórek śródbłonka są one trudniejsze do uzyskania w porównaniu z fibroblastami i stanowią bardzo niejednorodną populację komórek pod względem fenotypu, funkcji i struktury, które są zależne od narządów²³. W innych badaniach udało się przeprogramować mysie fibroblasty w wszczepialne hematopoetyczne komórki progenitorowe^24,25, jednak jak dotąd żaden inny protokół nie opisuje generowania komórek podobnych do HSPC z ludzkich fibroblastów.

To podejście, w połączeniu z farmakologicznym hamowaniem, nokautem genów lub knock-downem, pozwala na zdefiniowanie indywidualnych lub kombinacji czynników, które są wymagane do bezpośredniej indukcji ludzkich HSC. Zastosowanie wysokowydajnych metodologii badań przesiewowych opartych na najnowszych technologiach CRISPR-Cas9 w HDF przed przeprogramowaniem, stanowi ekscytujące przedsięwzięcie w celu zdefiniowania nowych regulatorów ostatecznej hematopoezy u ludzi. W przyszłości przeprogramowanie typów komórek ludzkich niezwiązanych z krwią, takich jak fibroblasty, posłuży jako platforma do generowania zdrowych, dostosowanych do potrzeb pacjenta hematopoetycznych komórek progenitorowych do zastosowań klinicznych.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,45 μ m niskobiałkowy filtr wiążący, 150 ml Butelkowy filtr próżniowy	Corning	#430625
2-merkaptoetanol	Sigma-Aldrich	#M6250
Alexa Fluor 488 anty-ludzki klon CD34 581	BioLegend	#343518
BD Pharmingen APC Mysi enzym konwertujący anty-ludzką angiotensynę (CD143) klon BB9	BD Biosciences	#557929
BES buforowana sól fizjologiczna	Sigma-Aldrich	#14280
Chlorek wapnia (CaCl2)	Sigma-Aldrich	#449709
Filtr odśrodkowy, Filtr odśrodkowy Amicon Ultra-15	Sigma-Aldrich	#UFC903096
Roztwór dysocjacyjny, Enzym ekspresowy TrypLE (1x) bez czerwieni fenolowej	Gibco	#12604-021
Hyklin doksycykliny (DOX)	Sigma-Aldrich	#D9891
eBioscience CD49f (integryna alfa 6) Przeciwciało monoklonalne (eBioGoH3 (GoH3)), PE-cyjanina7	Invitrogen	#25-0495-82
FUW-M2rtTA	Addgene	#20342
Żelatyna ze skóry świni typu A	Sigma-Aldrich	#G1890
Gibco L-Glutamina (200 mM)	ThermoFisher Scientific	#25030-024
Roztwór aminokwasów endogennych Gibco MEM (100x)	ThermoFisher Scientific	#11140-035
Pożywka hematopoetyczna, MyeloCult H5100	STEMCELL Technologies	#05150
Bromek heksadimetryny (polibren)	Sigma-Aldrich	#H9268
Ludzkie fibroblasty skórne (HDF)	ScienCell	#2320
Zmodyfikowany hyklon Dulbecco Eagles Medium (DMEM)	GE Healthcare	#SH30243.01
HyClone Płodowa surowica bydlęca (FBS)	GE Healthcare	#SV30160.03
HyClone Penicylina Streptomycyna 100x roztwór (Pen/Strep)	GE Healthcare	#SV30010
Hyklon Roztwór soli fizjologicznej buforowany fosforanem (PBS)	GE Healthcare	#SH30256.01
Hydrokortyzon	STEMCELL Technologies	#7904
Surowica surowica	Sigma-Aldrich	#M5905
PE anty-ludzkie przeciwciało CD9 klon HI9a	BioLegend	#312105
pFUW-tetO-3xFLAG-GATA2	Addgene	#125600
pFUW-tetO-FOS	Addgene	#125598
pFUW-tetO-GATA2	Addgene	#125028
pFUW-tetO-GFI1B	Addgene	#125597
pLV-tetO-HA-GFI1B	Addgene	#125599
pMD2.G	Addgene	#12259
psPAX2	Addgene	#12260