Artykuł metodologiczny

Wskaźniki uwalniania i wychwytu glutaminianu w pojedynczych synapsach w ostrych wycinkach mózgu od myszy normalnych i myszy z chorobą Huntingtona

DOI:

10.3791/60113

⸱

11 marca 2020

 , 
1Synaptic Dysfunction Group, Neuroscience Research Center, Charité - University Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiamy protokół do oceny równowagi między uwalnianiem glutaminianu a klirensem w pojedynczych synapsach glutaminergicznym korowo-prążkowych w ostrych wycinkach od dorosłych myszy. Protokół ten wykorzystuje czujnik fluorescencyjny iGluu do wykrywania glutaminianu, kamerę sCMOS do akwizycji sygnału oraz urządzenie do ogniskowego oświetlenia laserowego.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Synapsy to wysoce podzielone jednostki funkcjonalne, które działają niezależnie od siebie. W chorobie Huntingtona (HD) i innych zaburzeniach neurodegeneracyjnych ta niezależność może być zagrożona z powodu niewystarczającego klirensu glutaminianu i wynikających z tego efektów rozlewania się i wylewania. Zmienione pokrycie astrocytarne zakończeń presynaptycznych i / lub kolców dendrytycznych, a także zmniejszony rozmiar klastrów transportera glutaminianu w miejscach uwalniania glutaminianu są zaangażowane w patogenezę chorób powodujących objawy dys-/hiperkinezji. Jednak mechanizmy prowadzące do dysfunkcji synaps glutaminergicznego w chorobie Huntingtona nie są dobrze poznane. Udoskonalając i stosując obrazowanie synaps, uzyskaliśmy dane rzucające nowe światło na mechanizmy utrudniające inicjację ruchów. W tym miejscu opisujemy podstawowe elementy stosunkowo niedrogiego podejścia do osiągnięcia rozdzielczości pojedynczej synapsy przy użyciu nowego genetycznie kodowanego ultraszybkiego czujnika glutaminianu iGluu, optyki szerokokątnej, naukowej kamery CMOS (sCMOS), lasera 473 nm i laserowego systemu pozycjonowania do oceny stanu synaps korowo-prążkowych w ostrych wycinkach od zdrowych lub chorych myszy odpowiednich do wieku. Stan przejściowy glutaminianu skonstruowano z jednego lub wielu pikseli, aby uzyskać szacunki i) uwalniania glutaminianu na podstawie maksymalnego wzrostu stężenia glutaminianu [Glu] obok strefy aktywnej oraz ii) wychwytu glutaminianu odzwierciedlonego w stałej czasowej rozpadu (TauD) perysynaptyki [Glu]. Różnice w spoczynkowej wielkości butonu i kontrastujące wzorce krótkotrwałej plastyczności posłużyły jako kryteria identyfikacji zakończeń korowo-prążkowych jako należących do szlaku śródmózgowiowego (IT) lub drogi piramidowej (PT). Korzystając z tych metod, odkryliśmy, że u objawowych myszy HD ~40% synaps korowo-prążkowych typu PT wykazywało niewystarczający klirens glutaminianu, co sugeruje, że synapsy te mogą być narażone na uszkodzenia ekscytotoksyczne. Wyniki podkreślają przydatność TauD jako biomarkera dysfunkcyjnych synaps u myszy z chorobą Huntingtona o fenotypie hipokinetycznym.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Względny wpływ każdego zakończenia synaptycznego należącego do "unitarnego połączenia" (tj. połączenia między 2 komórkami nerwowymi) jest zazwyczaj oceniany na podstawie jego wpływu na początkowy segment neuronu postsynaptycznego1,2. Zapisy somatyczne i/lub dendrytyczne z neuronów postsynaptycznych stanowią najpowszechniejszy i do tej pory również najbardziej produktywny sposób wyjaśniania przetwarzania informacji w perspektywie odgórnej lub pionowej3,4,5. Jednak obecność astrocytów z ich dyskretnymi i (u gryzoni) nienakładającymi się terytoriami może przyczynić się do perspektywy horyzontalnej, która opiera się na lokalnych mechanizmach wymiany, integracji i synchronizacji sygnałów w miejscach synaptycznych6,7,8,9,10.

Ponieważ wiadomo, że astroglej odgrywa, ogólnie rzecz biorąc, główną rolę w patogenezie chorób neurodegeneracyjnych11,12 a w szczególności rolę w utrzymaniu i plastyczności synaps glutaminergiczne13,14,15,16, można sobie wyobrazić, że zmiany w wydajności synaps ewoluują zgodnie ze stanem astrocytów we wspólnym obszarze docelowym włókien doprowadzających o różnym pochodzeniu. Aby dokładniej zbadać lokalne mechanizmy regulacyjne w zdrowiu i chorobie pochodzące od celu/astrogleju, konieczna jest ocena poszczególnych synaps. Niniejsze podejście zostało opracowane w celu oszacowania zakresu funkcjonalnych wskaźników uwalniania i klirensu glutaminianu oraz zdefiniowania kryteriów, które mogą być wykorzystane do identyfikacji dysfunkcyjnych (lub odzyskanych) synaps w obszarach mózgu najściślej związanych z inicjacją ruchu (tj. przede wszystkim w korze ruchowej i prążkowiu grzbietowym).

Prążkowie nie posiada wewnętrznych neuronów glutaminergicznym. Dlatego stosunkowo łatwo jest zidentyfikować aferenty glutaminergiczne pochodzenia pozaprążkowiowego. Te ostatnie pochodzą głównie z przyśrodkowego wzgórza i kory mózgowej (zobacz17,18,19,20 po więcej). Synapsy korowo-korowe są tworzone przez aksony neuronów piramidowych zlokalizowanych w warstwach korowych 2/3 i 5. Odpowiednie aksony tworzą obustronne połączenia śródmózgowiowe (IT) lub połączenia ipsilateralne za pośrednictwem systemu światłowodowego, który bardziej doogonowo tworzy drogę piramidową (PT). Zasugerowano ponadto, że terminale typu IT i PT różnią się charakterystyką wydania i rozmiarem21,22. W świetle tych danych można również spodziewać się pewnych różnic w obchodzeniu się z glutaminianem.

Prążkowie jest najbardziej dotkniętym obszarem mózgu w chorobie Huntingtona (HD)5. Choroba Huntingtona u ludzi jest ciężką chorobą neurodegeneracyjną dziedziczoną genetycznie. Mysi model Q175 daje możliwość zbadania komórkowych podstaw hipokinetycznie sztywnej postaci HD, stanu, który ma wiele wspólnego z parkinsonizmem. Począwszy od wieku około 1 roku, homozygoty Q175 myszy (HOM) wykazują oznaki hipokinezji, co ujawniono poprzez pomiar czasu spędzonego bez ruchu na otwartym polu23. Obecne eksperymenty na heterozygotach Q175 (HET) potwierdziły wcześniejsze deficyty motoryczne obserwowane w HOM, a ponadto wykazały, że obserwowanym deficytom motorycznym towarzyszył obniżony poziom białka astrocytowego transportera aminokwasów pobudzających 2 (EAAT2) w bezpośrednim sąsiedztwie korowo-striatalicznych zakończeń synaptycznych 24. W związku z tym wysunięto hipotezę, że deficyt wychwytu glutaminianu astrocytarnego może prowadzić do dysfunkcji, a nawet utraty odpowiednich synaps25,26.

Tutaj opisujemy nowe podejście, które pozwala ocenić klirens glutaminianu pojedynczej synapsy w stosunku do ilości uwolnionego neuroprzekaźnika. Nowy czujnik glutaminianu iGluu uległ ekspresji w neuronach piramidowych kory mózgowej. Został opracowany przez Katalin Török27 i stanowi modyfikację wcześniej wprowadzonego czujnika glutaminianu o wysokim powinowactwie, ale powolnym iGluSnFR28. Oba czujniki są pochodnymi wzmocnionego białka zielonej fluorescencji (EGFP). Aby zapoznać się z charakterystykami spektralnymi i kinetycznymi, zobacz Helassa et al.27. Krótko mówiąc, iGluu jest czujnikiem o niskim powinowactwie z kinetyką szybkiej dezaktywacji i dlatego szczególnie dobrze nadaje się do badania klirensu glutaminianu na końcach synaptycznych uwalniających glutaminian. Stała czasowa dysocjacji iGluu została wyznaczona w urządzeniu z zatrzymanym przepływem, które dało wartośćTau off 2,1 ms w 20 °C, ale 0,68 ms przy ekstrapolacji do temperatury 34 °C27. Pojedyncze końcówki poboczne Schaffera badane w temperaturze 34 °C za pomocą spiralnego skaningu laserowego w regionie CA1 organtypowych kultur hipokampa pod mikroskopem 2-fotonowym wykazywały średnią stałą czasową rozpadu wynoszącą 2,7 ms.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie prace zostały przeprowadzone zgodnie z Dyrektywą UE 2010/63/UE dotyczącą doświadczeń na zwierzętach i zostały zarejestrowane w Berlińskim Urzędzie Ochrony Zdrowia i Bezpieczeństwa Technicznego (G0233/14 i G0218/17).

UWAGA: Nagrania z Q175 typu dzikiego (WT) i heterozygot (HETs) mogą być wykonywane w każdym wieku i każdej płci. Tutaj badaliśmy mężczyzn i kobiety w wieku od 51 do 76 tygodni.

1. Wstrzykiwanie czujnika glutaminianu iGluu do ekspresji w aksonach korowo-korowych

  1. Za pomocą ściągacza do pipet (tryb jednoetapowy) przygotuj pipety ze szkła borokrzemianowego do wstrzyknięcia wirusa. Po pociągnięciu należy ręcznie rozbić pipetę, aby uzyskać średnicę końcówki 30–50 μm. Autoklaw pipetę i narzędzia chirurgiczne, w tym wiertło do otwierania czaszki.
  2. Przechowywać wirusa AAV9-CaMKIIa.iGluu. WPRE-hGH (7,5 x 1013gc/ml) w temperaturze -80 °C w podwielokrotnościach 10 μl. Jeśli wstrzyknięcie jest wykonywane krótko po wytworzeniu wirusa (w ciągu 6 miesięcy), należy przechowywać w temperaturze 5 °C. Przed zabiegiem należy wyjąć fiolkę i utrzymywać ją w temperaturze pokojowej.
  3. Napełnij szklaną pipetę i usuń wszelkie pęcherzyki.
  4. Znieczulić zwierzę wstrzyknięciem dootrzewnowym roztworu zawierającego 87,5 mg/kg ketaminy i 12,5 mg/kg ksylazyny. Wstrzyknąć podskórnie 0,25% bupiwakainy (8 mg/kg) w celu dodatkowej ulgi w bólu. Sprawdź głębokość znieczulenia, monitorując napięcie mięśniowe i obserwując brak odruchów wywołanych bólem.
  5. Ogol skórę na głowie i wysterylizuj ją 70% alkoholem. Dopasuj mysz do ramki stereotaktycznej.
  6. Użyj skalpela, aby usunąć skórę i wiertła o dużej prędkości (38 000 obr./min), aby wykonać otwór o średnicy 1,2 mm w kości nad korą ruchową.
  7. Zamontować strzykawkę z dołączoną pipetą iniekcyjną w uchwycie precyzyjnego manipulatora. Włóż pionowo zorientowaną pipetę do kory mózgowej w 4 różnych miejscach. Współrzędne iniekcji w stosunku do bregmy (w mm): przednia 1,5, boczna 1,56, 1,8, 2,04, 2,28. Głębokość w stosunku do opony twardej wynosi (w mm): 1,5–1,7.
  8. Za pomocą systemu iniekcyjnego wstrzyknąć 0,3 μl na miejsce nierozcieńczonego roztworu wirusa z prędkością 0,05 μl/min. Po każdym wstrzyknięciu należy pozostawić pipetę na miejscu na 1 minutę, a następnie powoli ją wyjmować (1 mm/min).
  9. Na koniec zamknij ranę pooperacyjną nylonowym szwem.
  10. Pozostaw mysz na 0,5 do 1 godziny na poduszce grzewczej w czystej klatce przed powrotem do oryginalnej klatki.
  11. Utrzymuj mysz w 12-godzinnym cyklu dnia i nocy przez 6 do 8 tygodni przed przygotowaniem ostrych wycinków mózgu.
    UWAGA: Aby uniknąć reakcji immunologicznych prowadzących do uszkodzenia komórek i utraty synaps, wstrzyknięcie wielu konstruktów wirusowych musi być wykonane jednocześnie lub w ciągu 2-3 godzin po pierwotnym wstrzyknięciu. Współrzędne do wstrzyknięcia iGluu zostały wybrane zgodnie z atlasem mózgu Paxinos i Franklin29. Odpowiadają one korze ruchowej M1. Barwienie immunologiczne mózgów, którym wstrzyknięto implanty, uwidoczniło liczne, ale w większości dobrze izolowane aksony i żylaki aksonów w prążkowiu ipsi i przeciwległym oraz w przeciwległej korze M1 i S1.

2. Szukaj końcówek glutaminergiczne, które wyrażają czujnik glutaminianu iGluu

  1. Tryb kalibracji
    1. Przygotuj kamerę sCMOS i oprogramowanie sterujące kamerą z następującymi ustawieniami. Na stronie Odczyt ustaw Szybkość odczytu pikseli: 560 MHz (= najszybszy odczyt), Czułość/Zakres dynamiki: bit, Filtr szumów pozornych: Tak, Odczyt nakładania: Tak. Na stronie Binning/ROI wybierz opcję Pełny ekran.
    2. Przygotować szkiełko podstawowe zawierające kroplę 5 mg/ml Lucifer Yellow (LY) pod szkiełkiem nakrywkowym.
    3. Umieść suwak LY pod obiektywem 63x, otwórz migawkę lasera i wykonaj akwizycję szeregową przy użyciu następujących ustawień: Binning pikseli: 1x1, Tryb wyzwalania: wewnętrzny, Czas ekspozycji: minimalny (do ustalenia).
    4. Dostosuj moc lasera, aby wytworzyć plamkę fluorescencyjną o średnicy 4 μm (obraz nie powinien zawierać nasyconych pikseli).
    5. Aby przeprowadzić kalibrację systemu pozycjonowania laserowego, wybierz następujące ustawienia w oprogramowaniu do pozycjonowania laserowego: Średnica plamki: 10, Prędkość skanowania: 43.200 kHz. Kliknij przycisk Rozpocznij pobieranie obrazu w prawym panelu. Ustaw Przebiegi: 0, Opóźnienie uruchomienia: 0 i wybierz opcję Uruchom po wygaśnięciu na stronie Sekwencja. Kliknij przycisk Kalibruj na stronie Kalibracja i skalibruj oprogramowanie sterujące laserem zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi w lewym górnym rogu ekranu akwizycji.
    6. Jeśli konfiguracja korzysta z niezależnego oprogramowania do sterowania kamerą i laserem, pobierz zrzuty ekranu z okna akwizycji kamery i wyślij je do oprogramowania sterującego laserem w celu ponownego obliczenia współrzędnych XY. Jeśli oprogramowanie jest zainstalowane na różnych komputerach, użyj narzędzia do przechwytywania wideo, aby zaimportować obraz do oprogramowania sterującego laserem. Oprogramowanie sterujące laserem będzie potrzebowało informacji o współczynnikach skalowania i przesunięciach XY. W tym celu należy określić współrzędne lewego górnego, lewego dolnego i prawego dolnego rogu obrazu w oknie akwizycji programu sterującego laserem. Oblicz współczynniki skalowania zgodnie z następującymi równaniami: współczynnik X = (X na dole w prawo – X w lewym dolnym rogu)/2048, przesunięcie X = X w lewo, współczynnik Y = (Y w lewym górnym rogu – Y na dole w lewo)/2048, przesunięcie Y = Y w lewym dolnym rogu.
    7. Na końcu procedury kalibracji utwórz prostokątny obszar zainteresowania (ROI) o wymiarach 267x460 pikseli, przesuń go na środek ekranu i kliknij przycisk Rozpocznij sekwencję.
    8. Wróć do następujących ustawień oprogramowania sterującego aparatem: Binning: 2x2, Tryb wyzwalania: Ekspozycja zewnętrzna, Czas ekspozycji: Minimalny (do ustalenia).
  2. Tryb korekcji autofluorescencji
    UWAGA: Poziom spoczynku [Glu] w środowisku aktywnych końców synaptycznych jest zwykle poniżej 100 nM14,30,31,32,33,34. W związku z tym każdy czujnik glutaminianu, zwłaszcza czujnik o niskim powinowactwie, taki jak iGluu, będzie raczej przyciemniony przy braku uwalniania glutaminianu synaptycznego. Niemniej jednak pewna fluorescencja iGluu może być wykryta nawet w spoczynku, ale należy ją odróżnić od autofluorescencji tkankowej. Oświetlenie o długości fali 473 nm wywołuje zarówno fluorescencję iGluu, jak i autofluorescencję (Rysunek 1A–C). Ten ostatni zajmuje szeroki zakres długości fal, podczas gdy fluorescencja iGluu jest ograniczona do 480–580 nm (z maksimum przy 510 nm). Korekcja autofluorescencji opiera się na akwizycji dwóch obrazów z różnymi filtrami górnoprzepustowymi.
    1. Przygotuj wycinki mózgu z wyprzedzeniem, jak opisano w innym miejscu35. Trzymaj plastry otrębów w gotowości.
    2. Przenieś plastry do komory rejestracyjnej, zanurzając je w natlenionym sztucznym płynie mózgowo-rdzeniowym (ACSF) zawierającym 125 mM NaCl, 3 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 25 mM NaHCO3, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM glukozy (pH 7,3, 303 mOsm/L), uzupełnionym 0,5 mM pirogronianem sodu, 2,8 mM askorbinianem sodu i 0,005 mM glutationem. Stosować natężenie przepływu 1–2 ml/min. Utrzymuj temperaturę kąpieli na poziomie 28–30 °C.
    3. Zlokalizuj prążkowie grzbietowe pod obiektywem 20-krotnego zanurzenia w wodzie. Przymocuj plastry nylonową siatką na platynowej harfie, aby zminimalizować ruch tkanki. Przełącz się na obiektyw 63x /NA 1.0 do zanurzenia w wodzie. Wybierz filtry odbijające światło o długości fali 473 nm (zwierciadło dichroiczne) i przechodzące światło o długości fali >510 nm (filtr emisyjny).
    4. Synchronizuj oświetlenie, stymulację i akwizycję obrazu za pomocą płytki AD/DA z odpowiednim oprogramowaniem sterującym. Ustaw program wyzwalający tak, aby sterował akwizycją z czasem naświetlania lasera 180 ms i czasem akwizycji obrazu 160 ms. Użyj laserowego urządzenia pozycjonującego, aby wysłać wiązkę laserową do określonej liczby punktów i zdefiniować ustawienia prędkości skanowania i rozmiaru plamki.
    5. Uzyskaj obraz zarówno autofluorescencji, jak istruktur u-dodatnich iGlu za pomocą filtra górnoprzepustowego przy 510 nm ("żółty obraz").
    6. Uzyskaj obraz za pomocą samej autofluorescencji za pomocą filtra górnoprzepustowego przy 600 nm ("czerwony obraz").
    7. Skaluj obrazy czerwony i żółty, używając średnich intensywności 10 najjaśniejszych i 10 najciemniejszych pikseli, aby zdefiniować zakres. Wykonaj odejmowanie "żółty minus czerwony obraz" i przeskaluj odjęty obraz, aby wygenerować standardowy 8-bitowy plik tif do wygodnej wizualizacji interesującego go obrazu (Rysunek 1D). Zawiera jasne piksele ze strukturu-dodatnich iGlu, szare piksele z tła i ciemne piksele ze struktur z autofluorescencją.
      UWAGA: Przy danym sprzęcie średnia fluorescencja spoczynkowa (F) będzie poniżej 700 A.U.
  3. Tryb wyszukiwania Boutona
    UWAGA:U-dodatnie piksele iGlu mogą należeć do funkcjonalnie różnych elementów drzewa aksonalnego, takich jak gałęzie aksonów różnego rzędu, miejsca rozwidlenia, żylaki po wyczerpaniu pęcherzyków lub w pełni aktywne żylaki. Jednak identyfikacja funkcjonalnych zakończeń synaptycznych jest prawie niemożliwa tylko na podstawie oględzin. Dlatego każdy glutaminergiczny koniec synaptyczny wymaga identyfikacji na podstawie jego reakcji na depolaryzację elektryczną. Strony, które nie reagują na stymulację, należy wyrzucić. Fizjologicznym sposobem indukowania uwalniania glutaminianu z aksonów korowo-prążkowych jest wywołanie potencjału czynnościowego. Można to osiągnąć za pomocą rodopsyny kanałowej o odpowiedniej charakterystyce spektralnej lub poprzez elektryczną stymulację aksonu wizualizowaną przez sam iGluu. Aby uniknąć przypadkowej aktywacji opsyny, wybraliśmy tę drugą metodę
    1. Za pomocą ściągacza do mikropipet (w trybie czterostopniowym) można wytwarzać pipety stymulacyjne z kapilar ze szkła borokrzemianowego. Wewnętrzna średnica końcówki powinna wynosić około 1 μm. Po napełnieniu ACSF rezystancja elektrody powinna wynosić około 10 MΩ.
    2. Aby indukować zależne od potencjału czynnościowego uwalnianie glutaminianu z zestawu bultonów synaptycznych przyłączonych do tego samego aksonu, użyj 63-krotnego powiększenia, filtra emisyjnego 510 nm i odjętego obrazu, aby umieścić szklaną elektrodę stymulacyjną obok fluorescencyjnego żylaku. Unikaj bliskości dodatkowych aksonów.
    3. Włącz stymulator, aby dostarczyć depolaryzujące impulsy prądu do pipety stymulacyjnej. Stosować natężenia prądu około 2 μA (nie więcej niż 10 μA).
    4. Włącz wielokanałowy system aplikacji kąpieli, w którym jeden kanał dostarcza standardowy roztwór do kąpieli, a drugi kanały dostarczają niezbędne blokery kanałów jonowych, transportery lub receptory błonowe. Kontroluj przepływ w miejscu rejestracji, a następnie przełącz się na kanał tetrodotoksyny (TTX) (roztwór do kąpieli plus 1 μM TTX). Po 2–3 minutach ponownie stymuluj interesujący nas bouton, ale tym razem przy braku generowania potencjału czynnościowego. Uwalnianie jest bezpośrednio spowodowane napływem wapnia przez kanały wapniowe zależne od napięcia.
    5. Przekręcając intensywności na stymulatorze, dostosuj prąd stymulacji, aby uzyskać reakcje podobne do tych wywoływanych przez potencjały czynnościowe. Zazwyczaj prąd stymulacji wynosi około 6 μA dla depolaryzacji 0,5 ms.
    6. Do podstawowych badań preparatu należy zastosować 0,5 mM CdCl2. Obecność tego blokera kanału wapniowego uwalniania glutaminianu całkowicie zapobiega synaptycznemu uwalnianiu glutaminianu, potwierdzając w ten sposób zależność od wapnia bezpośrednio wywołanego sygnału glutaminianu.
      UWAGA: Poniższe ogólne zalecenie może pomóc w zwiększeniu wskaźnika powodzenia eksperymentów z pojedynczą synapsą w prążkowiu. Aby wybrać glutaminergiczne zakończenia synaptyczne z nienaruszoną maszynerią uwalniającą, żylak powinien: (i) mieć gładki kształt przypominający wrzeciono; (ii) nie być związane z bifurkacją aksonów; (iii) być jaśniejsze od innych struktur na "żółtym obrazie"; (iv) Przebywać w neuropilu prążkowia, a nie w drogach włóknistych; (v) Przebywać na bardzo cienkiej gałęzi aksonu; (vi) Nie mogą znajdować się w głębszych częściach kawałka.

3. Wizualizacja uwalniania i usuwania glutaminianu

  1. Tryb nagrywania
    UWAGA: Po odjęciu autofluorescencji (krok 2.2) i kilku wstępnych testach na reakcję interesującego nas impulsu (krok 2.3), można rozpocząć akwizycję danych. Reakcje na elektryczną aktywację uwalniania glutaminianu z pojedynczych zakończeń aksonów można zaobserwować bezpośrednio na obrazie (Rysunek 2), bez stosowania dalszych narzędzi analitycznych. Okazało się jednak, że bardzo wygodne jest natychmiastowe wyodrębnienie kilku podstawowych wskaźników wydajności synaps (Rysunek 3). Informacje te są potrzebne do podejmowania decyzji o dalszym przebiegu eksperymentu, takich jak wybór poszczególnych typów terminali, szybka ocena zmian związanych z HD, liczba i częstotliwość prób lub leków, które mają być stosowane w systemie superfuzji. Może być również konieczne poradzenie sobie z ostatecznie pojawiającymi się artefaktami. Po pierwsze, opisano standardowe ustawienia zapisu danych.
    1. Korzystając z mikroskopowych napędów XY, umieść badany iGluu-dodatni bouton blisko środka viewfield. Zatrzymaj pobieranie obrazu za pomocą przycisku Przerwij pozyskiwanie. Na ostatnim uzyskanym obrazku określ pozycję XY spoczywającego centrum bouton, klikając na nie lewym przyciskiem myszy. Współrzędne XY ustawionego kursora zostaną pokazane w dolnym panelu stanu okna akwizycji.
    2. Korzystając z danych kalibracyjnych (krok 2.1.6), oblicz współrzędne miejsca, do którego powinna zostać wysłana wiązka laserowa w celu wzbudzenia fluorescencji iGluu. Użyj następujących równań: laser X = kamera X * współczynnik X + przesunięcie X, laser Y = przesunięcie Y – kamera Y * współczynnik Y. Podczas wykonywania tego przeliczania zwróć uwagę na ustawienia odwracania w pionie lub poziomie aparatu.
    3. Utwórz jednopunktową sekwencję w oprogramowaniu do sterowania laserem, korzystając z obliczonych współrzędnych. W tym celu wybierz opcję Punkt w polu Dodaj do sekwencji na stronie Sekwencja w oprogramowaniu do sterowania laserem. Wybierz 10 μs dla opóźnienia rozpoczęcia wyzwolenia i 180 ms dla czasu impulsu laserowego. Przesuń mysz do obliczonych współrzędnych i kliknij lewym przyciskiem.
    4. Wybierz następujące ustawienia w oprogramowaniu sterującym laserem: Przebieg: 0, Opóźnienie biegu: 0, Sekwencja: Uruchom z czasem wygaśnięcia. Następnie kliknij przycisk Rozpocznij sekwencję.
    5. W oprogramowaniu do sterowania kamerą wybierz następujące ustawienia: Na stronie Binning/ROI ustaw Obszar obrazu: Niestandardowy, Binning pikseli: 2x2, Wysokość: 20, Szerokość: 20, Po lewej: współrzędna X spoczynkowegopunktu u-dodatniego iGlu minus 10 px, Dół: współrzędna Y spoczynkowegopunktu u-dodatniego iGlu minus 10 px, Tryb akwizycji: Seria kinetyczna, Długość serii kinetycznej: 400, czas ekspozycji: 0,0003744s (wartość minimalna). Przy takich ustawieniach szybkość akwizycji wyniesie 2,48 kHz.
    6. Wybierz Tryb wyzwalania: Zewnętrzny. Kliknij opcję Odbierz sygnał w oprogramowaniu do sterowania kamerą. Rozpocząć postępowanie w protokole doświadczalnym ustanowionym dla urządzenia spustowego.
    7. Wdrożenie protokołu eksperymentalnego Próba z następującą osią czasową: 0 ms – rozpoczęcie próby, 1 ms – rozpoczęcie oświetlenia laserowego, 20 ms – rozpoczęcie akwizycji obrazu za pomocą kamery, 70 ms – rozpoczęcie stymulacji elektrycznej 1, 120 – rozpoczęcie stymulacji elektrycznej 2, 181 ms – zakończenie próby (laser i kamera wyłączone). W ten sposób podczas jednej próby kamera rejestruje 400 klatek z częstotliwością 2,48 kHz. Patrz kroki 2.3.3 i 2.3.5. aby uzyskać szczegółowe informacje na temat stymulacji elektrycznej.
    8. Aby umożliwić wystarczającą regenerację puli pęcherzyków presynaptycznych, należy zastosować protokół Próba z częstotliwością powtarzania 0,1 Hz lub niższą.
  2. Budowa off-line przejściowego glutaminianu i szybka ocena uwalniania i klirensu glutaminianu w celu identyfikacji patologicznych synaps
    1. Włącz procedury oceny. Tutaj używamy napisanego przez nas oprogramowania SynBout v. 3.2. (autor: Anton Dworżak). Następujące kroki są potrzebne do skonstruowania stanu nieustalonego ΔF/F z pikseli o podwyższonej fluorescencji iGluu, jak na filmie Rysunek 2.
    2. Aby określić wielkość boutonu, należy obliczyć średnią i odchylenie standardowe (SD) intensywności fluorescencji ROI w spoczynku (F), przed rozpoczęciem stymulacji. Określ i obramuj obszar zajmowany przez piksele za pomocą F>mean + 3 SD (Rysunek 3A). Określ wirtualną średnicę (w μm) przyjmując okrągłą formę obszaru nadprogowego.
    3. Wyznacz ΔF jako różnicę między szczytową wartością natężenia a F. Wykreśl prąd stymulujący i ΔF/F w funkcji czasu (Rysunek 3B). Obliczyć SD ΔF/F w spoczynku (przed rozpoczęciem stymulacji) i "amplitudę szczytową". Użyj piksela o amplitudzie piku większej niż 3 SD ΔF/F, aby wykonać monowykładnicze dopasowanie dla zaniku od szczytu. Wyznacz stałą czasową rozpadu TauD ΔF/F.
    4. Aby oszacować "Maksymalną amplitudę" w danej synapsie, wybierz piksel o najwyższej wartości ΔF/F. Zazwyczaj znajduje się w obrębie lub obok granic spoczynkowego bouton iGluu fluorescencji. "Maksymalna amplituda" byłaby najlepszym wskaźnikiem obciążenia glutaminianu prezentowanego maszynerii klirensu pojedynczej synapsy.
    5. Aby oszacować rozciągłość przestrzenną sygnału iGluu, należy określić średnicę obszaru wszystkich pikseli ponadprogowych połączonych w wirtualny okrąg. Odpowiednia średnica nazywa się "Spread". Termin "rozpiętość szczytowa" odnosi się zatem do wartości szczytowej uśrednionego spreadu przejściowego (Rysunek 3C, różnica między przerywanymi czerwonymi liniami).
  3. Poprawki możliwych artefaktów
    UWAGA: Depolaryzacja elektryczna jest związana z przepływem na zewnątrz roztworu wewnątrz pipety. Może to spowodować niewielkie przemieszczenie tkanki. Aby rozróżnić wywołane stymulacją zmiany iGluu od nieostrych przesunięć obrazu, można użyć następującego podejścia do identyfikacji i eliminacji artefaktów przemieszczenia (Rysunek 4).
    1. Przeanalizuj charakterystykę przestrzenną pikseli ponadprogowych pochodzących z ROI ze znakami przemieszczenia (Rysunek 4F–H).
    2. Znajdź piksele poza początkowo ustalonymi granicami bouton w spoczynku (Rysunek 4F–H, w czerwonej ramce).
    3. Zidentyfikuj ostatecznie istniejące ujemne wartości intensywności pikseli (Rysunek 4I, J). Każdy ΔF/F w kierunku ujemnym o amplitudzie większej niż średnia sprzed stymulacji ± 3 SD powinien być traktowany jako artefakt, a zapis powinien zostać odrzucony.
    4. Aby uniknąć artefaktów nieostrych, umieść elektrodę stymulacyjną po przednio-bocznej stronie bulionu synaptycznego, zastosuj dwufazową stymulację elektryczną i zminimalizuj intensywność/czas trwania stymulacji.
      UWAGA: Artefakty braku ostrości mogą również pochodzić z aparatu. Jeśli ten ostatni nie jest optymalnie przymocowany do mikroskopu, może wytwarzać oscylacje, najprawdopodobniej z powodu niewielkich wibracji układu chłodzenia aparatu. Takie drgania tworzą wzór "yin i yang" w obrazach ΔF/F obracających się z częstotliwością 50 Hz. Drgania można matematycznie odjąć od sygnału fluorescencji, ale ostateczna jakość pomiarów będzie wtedy krytycznie zależała od czasu nagrywania.
    5. Przymocuj kamerę do mikroskopu w taki sposób, aby nie było wibracji. Jeśli te ostatnie pozostaną, umieść gumową uszczelkę między aparatem a adapterem mikroskopu.
      UWAGA: Nie można pominąć możliwości, że neuropil prążkowia wokół interesującej nas synapsy zawiera żylaki glutaminergiczne, które nie wyrażają iGluu i dlatego pozostają niewidoczne. W przypadku ich koaktywacji (bardziej prawdopodobnej przy braku TTX) stany nieustalone uzyskane z boutonów będących przedmiotem zainteresowania mogą być dotknięte skutkiem rozlaniania się. To samo dotyczy końcówek iGlu z ekspresjąu, które były nieostre. Charakterystycznym zjawiskiem byłoby w tym przypadku to, że transjenty fluorescencji pochodzą ze znacznie szerszego obszaru. Ponieważ ta odpowiedź jest eliminowana przez TTX, można ją interpretować jako niespecyficzną reakcję wywołaną przez nieuzasadnioną aktywację wielowłóknową.
    6. Aby skorygować tę niespecyficzną odpowiedź wielowłóknową, postępuj zgodnie z procedurą opisaną w Rysunek 5. Użyj sygnału fluorescencji pikseli na granicach pola widzenia. Aby zminimalizować reakcję tła, zminimalizuj intensywność i czas trwania stymulacji lub użyj TTX.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Identyfikacja dwóch typów żylaków glutaminergicznego korowo-prążkowego
Aferenty IT i PT pochodzą odpowiednio z warstwy 2/3 i 5 i wykazują zróżnicowane rozgałęzienia i wzorce zakończenia w prążkowiu ipsilateralnym i przeciwległym (tylko terminale IT). Wciąż niewiele wiadomo na temat właściwości uwalniania i klirensu glutaminianu w powtarzających się warunkach aktywacji, co obserwuje się podczas inicjacji ruchów, ale jest dobrze udokumentowane, że odpowiednie żylaki uwalniające glutaminian różnią się r...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eksperymenty dotyczą kwestii o znaczeniu ogólnym - niezależności synaps i jej możliwej utraty w przebiegu neurodegeneracji, a my opisujemy nowe podejście do identyfikacji dotkniętych synaps w ostrych wycinkach mózgu od starszych (>1 roku) myszy. Wykorzystując ulepszone właściwości kinetyczne niedawno wprowadzonego czujnika glutaminianu iGluu , eksperymenty rzucają światło na związek między uwalnianiem a wychwytem glutaminianu synaptycznego w sposób, który wcześniej nie był możliwy.

...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez CHDI (A-12467), Niemiecką Fundację Badawczą (Exc 257/1 i DFG Project-ID 327654276 - SFB 1315) oraz wewnętrzne fundusze badawcze Charité. Dziękujemy K. Törökowi z St. George's z Uniwersytetu Londyńskiego i N. Helassa z Uniwersytetu w Liverpoolu za plazmid iGluu i wiele pomocnych dyskusji. D. Betances i A. Schönherr zapewnili doskonałą pomoc techniczną.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Stereo microsopeWPIPZMIIIPrecyzyjny mikroskop lornetkowy stereo Zoom
Ramka stereotaktycznaStoelting51500DDigital Lab Nowy standard stereotaktycznej ramki
Wiertarka szybkobieżnaStoelting514439VForedom K1070 cromoter Kit
System wtryskowyStoelting53311Kwintesencja wtryskiwacza stereopodatkowego (QSI)
Strzykawka Hamilton 5 i mikro; lHamilton8793075RN Syr (26s/51/2)
Laserowy system pozycjonowaniaRapp OptoElectronicUGA-40UGA-40
Niebieski laser do wzbudzenia iGluuRapp OptoElectronicDL-473-020-SLustro
dichroiczne 473 nm do 473 nmRapp OptoElectronicROE TB-355-405-473Dichroiczny
mikroskop pionowy 1PCarl Zeiss000000-1066-600Axioskop 2 FS
Plus Obiektyw 63x/1.0Carl Zeiss421480-9900W Plan-apochromat
4xobiektyw Carl Zeiss44-00-20Achroplan 4x/0,10
Lustro dichroiczne do iGluuOmega optyczneXF2030
Filtr emisyjny do iGluuOmega optyczneXF3086
Zwierciadło dichroiczneOmega optyczne
Filtr emisyjny do autofluorescencji subtr.Kamera optyczna OmegaQMAX EM600-650
sCMOSAndorZYLA4.2PCL10ZYLA 4.2MP Plus
Oprogramowanie do pozyskiwaniaAndor4.30.30034.0Solis
AD/DA konwerterHEKA Elektronik895035InstruTECH LIH8+8
Oprogramowanie AquisitionHEKA Elektronik895153TIDA5.25
System pozycjonowania elektrodSutter InstrumentMPC-200Mikromanipulator
Stymulator elektrycznyWarsztaty ChariteSTIM-26
KrajalnicaLeicaVT1200 SŚciągacz wibrotomiczny
/płomieniowySutter InstrSU-P1000P-1000
Szklane rurki do pipet iniekcyjnychWPI1B100F3
Szklane rurki do stymulacji pipetyWPIR100-F3
TetrodotoksynaAbcamab120054TTX
iGluu plazmidAddgene106122myszy pCI-syn-iGluu
Q175Lab27410Z-Q175-KI
QMAX_DI580LP Jackson

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Magee, J. C. Dendritic integration of excitatory synaptic input. Nature Reviews Neuroscience. 1, 181-190 (2000).
  2. Thome, C., et al. Axon-carrying dendrites convey privileged synaptic input in hippocampal neurons. Neuron. 83, 1418-1430 (2014).
  3. Larkum, M. E., Petro, L. S., Sachdev, R. N. S., Muckli, L. A Perspective on Cortical Layering and Layer-Spanning Neuronal Elements. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 56(2018).
  4. Spruston, N. Pyramidal neurons: dendritic structure and synaptic integration. Nature Reviews Neuroscience. 9, 206-221 (2008).
  5. Khakh, B. S., et al. Unravelling and exploiting astrocyte dysfunction in Huntington's disease. Trends in Neurosciences. 40, 422-437 (2017).
  6. Perea, G., Navarrete, M., Araque, A. Tripartite synapses: astrocytes process and control synaptic information. Trends in Neurosciences. 32, 421-431 (2009).
  7. Perea, G., Araque, A. Astrocytes potentiate transmitter release at single hippocampal synapses. Science. 317, 1083-1086 (2007).
  8. Savtchenko, L. P., et al. Disentangling astroglial physiology with a realistic cell model in silico. Nature Communications. 9, 3554(2018).
  9. Octeau, J. C., et al. An optical neuron-astrocyte proximity assay at synaptic distance scales. Neuron. 98, 49-66 (2018).
  10. Verkhratsky, A., Nedergaard, M. Physiology of astroglia. Physiological Reviews. 98, 239(2018).
  11. Xie, Z., Yang, Q., Song, D., Quan, Z., Qing, H. Optogenetic manipulation of astrocytes from synapses to neuronal networks: A potential therapeutic strategy for neurodegenerative diseases. Glia. 10, (2019).
  12. Verkhratsky, A., Parpura, V., Pekna, M., Pekny, M., Sofroniew, M. Glia in the pathogenesis of neurodegenerative diseases. Biochemical Society Transactions. 42, 1291-1301 (2014).
  13. Dvorzhak, A., Melnick, I., Grantyn, R. Astrocytes and presynaptic plasticity in the striatum: Evidence and unanswered questions. Brain Research Bulletin. , 17-25 (2017).
  14. Rose, C. R., et al. Astroglial Glutamate Signaling and Uptake in the Hippocampus. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 451(2018).
  15. Scimemi, A., Diamond, J. S. Deriving the time course of glutamate clearance with a deconvolution analysis of astrocytic transporter currents. Journal of Visualized Experiments. (10), (2013).
  16. Theodosis, D. T., Poulain, D. A., Oliet, S. H. Activity-dependent structural and functional plasticity of astrocyte-neuron interactions. Physiological Reviews. 88, 983-1008 (2008).
  17. Reiner, A., Deng, Y. P. Disrupted striatal neuron inputs and outputs in Huntington's disease. CNS Neuroscience & Therapeutics. 24, 250-280 (2018).
  18. Plotkin, J. L., Surmeier, D. J. Corticostriatal synaptic adaptations in Huntington's disease. Current Opinion in Neurobiology. 33, 53-62 (2015).
  19. Villalba, R. M., Smith, Y. Loss and remodeling of striatal dendritic spines in Parkinson's disease: from homeostasis to maladaptive plasticity. Journal of Neural Transmission (Vienna). 125, 431-447 (2018).
  20. Huerta-Ocampo, I., Mena-Segovia, J., Bolam, J. P. Convergence of cortical and thalamic input to direct and indirect pathway medium spiny neurons in the striatum. Brain Structure and Function. 219, 1787-1800 (2014).
  21. Kincaid, A. E., Zheng, T., Wilson, C. J. Connectivity and convergence of single corticostriatal axons. Journal of Neuroscience. 18, 4722-4731 (1998).
  22. Reiner, A., Hart, N. M., Lei, W., Deng, Y. Corticostriatal projection neurons - dichotomous types and dichotomous functions. Frontiers in Neuroanatomy. 4, 142(2010).
  23. Rothe, T., et al. Pathological gamma oscillations, impaired dopamine release, synapse loss and reduced dynamic range of unitary glutamatergic synaptic transmission in the striatum of hypokinetic Q175 Huntington mice. Neuroscience. 311, 519-538 (2015).
  24. Dvorzhak, A., Helassa, N., Torok, K., Schmitz, D., Grantyn, R. Single synapse indicators of impaired glutamate clearance derived from fast iGluu imaging of cortical afferents in the striatum of normal and Huntington (Q175) mice. Journal of Neuroscience. 39, 3970-3982 (2019).
  25. Rebec, G. V. Corticostriatal network dysfunction in Huntington's disease: Deficits in neural processing, glutamate transport, and ascorbate release. CNS Neuroscience & Therapeutics. 10, (2018).
  26. Friedman, A., et al. Chronic Stress Alters Striosome-Circuit Dynamics, Leading to Aberrant Decision-Making. Cell. 171, 1191-1205 (2017).
  27. Helassa, N., et al. Ultrafast glutamate sensors resolve high-frequency release at Schaffer collateral synapses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, 5594-5599 (2018).
  28. Marvin, J. S., et al. An optimized fluorescent probe for visualizing glutamate neurotransmission. Nature Methods. 10, 162-170 (2013).
  29. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Elsevier. (2003).
  30. Marcaggi, P., Attwell, D. Role of glial amino acid transporters in synaptic transmission and brain energetics. Glia. 47, 217-225 (2004).
  31. Bergles, D. E., Diamond, J. S., Jahr, C. E. Clearance of glutamate inside the synapse and beyond. Current Opinion in Neurobiology. 9, 293-298 (1999).
  32. Papouin, T., Dunphy, J., Tolman, M., Foley, J. C., Haydon, P. G. Astrocytic control of synaptic function. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 372, 20160154(2017).
  33. Tzingounis, A. V., Wadiche, J. I. Glutamate transporters: confining runaway excitation by shaping synaptic transmission. Nature Reviews Neuroscience. 8, 935-947 (2007).
  34. Nedergaard, M., Verkhratsky, A. Artifact versus reality--how astrocytes contribute to synaptic events. Glia. 60, 1013-1023 (2012).
  35. Octeau, J. C., Faas, G., Mody, I., Khakh, B. S. Making, Testing, and Using Potassium Ion Selective Microelectrodes in Tissue Slices of Adult Brain. Journal of Visualized Experiments. (10), (2018).
  36. Shrivastava, A. N., Aperia, A., Melki, R., Triller, A. Physico-Pathologic Mechanisms Involved in Neurodegeneration: Misfolded Protein-Plasma Membrane Interactions. Neuron. 95, 33-50 (2017).
  37. Langfelder, P., et al. Integrated genomics and proteomics define huntingtin CAG length-dependent networks in mice. Nature Neuroscience. 19, 623-633 (2016).
  38. Pal, B. Involvement of extrasynaptic glutamate in physiological and pathophysiological changes of neuronal excitability. Cellular and Molecular Life Sciences. 75, 2917-2949 (2018).
  39. Pekny, M., et al. Astrocytes: a central element in neurological diseases. Acta Neuropathologica. 131, 323-345 (2016).
  40. Bading, H. Therapeutic targeting of the pathological triad of extrasynaptic NMDA receptor signaling in neurodegenerations. Journal of Experimental Medicine. 214, 569-578 (2017).
  41. Pajarillo, E., Rizor, A., Lee, J., Aschner, M., Lee, E. The role of astrocytic glutamate transporters GLT-1 and GLAST in neurological disorders: Potential targets for neurotherapeutics. Neuropharmacology. 10, (2019).
  42. Jensen, T. P., Zheng, K., Tyurikov, aO., Reynolds, J. P., Rusakov, D. A. Monitoring single-synapse glutamate release and presynaptic calcium concentration in organised brain tissue. Cell Calcium. 64, 102-108 (2017).
  43. Reynolds, J. P., Zheng, K., Rusakov, D. A. Multiplexed calcium imaging of single-synapse activity and astroglial responses in the intact brain. Neuroscience Letters. 10, (2018).
  44. Kuo, H. Y., Liu, F. C. Synaptic Wiring of Corticostriatal Circuits in Basal Ganglia: Insights into the Pathogenesis of Neuropsychiatric Disorders. eNeuro. 6, 19(2019).
  45. Untiet, V., et al. Glutamate transporter-associated anion channels adjust intracellular chloride concentrations during glial maturation. Glia. 65, 388-400 (2017).
  46. Burgold, J., et al. Cortical circuit alterations precede motor impairments in Huntington's disease mice. Scientific Reports. 9, 6634(2019).
  47. Jensen, T. P., et al. Multiplex imaging relates quantal glutamate release to presynaptic Ca (2+) homeostasis at multiple synapses in situ. Nature Communications. 10, 1414(2019).
  48. Inoue, M., et al. Rational Engineering of XCaMPs, a Multicolor GECI Suite for In Vivo Imaging of Complex Brain Circuit Dynamics. Cell. 177, 1346-1360 (2019).
  49. Durst, C. D., et al. High-speed imaging of glutamate release with genetically encoded sensors. Nature Protocols. 14, 1401-1424 (2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Wychwyt glutaminianuobrazowanie pojedynczej synapsysynapsy koro pr kowiatesensor iGlupomiar TauDkamera sCMOSpozycjonowanie laserowekorekcja autofluorescencji

Powiązane artykuły