Artykuł metodologiczny

Charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z komórek odpornościowych i badanie funkcjonalnego wpływu na środowisko komórkowe

DOI:

10.3791/60118

⸱

2 czerwca 2020

 ,  ,  ,  , 
1U1192-Laboratoire Protéomique, Réponse Inflammatoire et Spectrométrie de Masse (PRISM), Univ. Lille, INSERM

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niniejszy raport podkreśla chronologiczne wymagania dotyczące izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) od mikrogleju lub makrofagów krwi. EV pochodzące z mikrogleju oceniano jako regulatory wzrostu neurytów, podczas gdy EV pochodzące z makrofagów krwi badano w kontroli inwazji komórek glejaka C6 w testach in vitro. Celem jest lepsze zrozumienie tych funkcji EV jako mediatorów immunologicznych w określonych mikrośrodowiskach.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stan neurozapalny ośrodkowego układu nerwowego (OUN) odgrywa kluczową rolę w stanach fizjologicznych i patologicznych. Mikroglej, rezydujące komórki odpornościowe w mózgu, a czasem naciekające makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego (BMDM), regulują profil zapalny swojego mikrośrodowiska w OUN. Obecnie przyjmuje się, że populacje pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) z komórek odpornościowych działają jako mediatory immunologiczne. W związku z tym ich zbieranie i izolowanie są ważne dla identyfikacji ich zawartości, ale także oceny ich wpływu biologicznego na komórki biorcy. Obecne dane podkreślają chronologiczne wymagania dotyczące izolacji EV z komórek mikrogleju lub makrofagów krwi, w tym etapy ultrawirowania i chromatografii wykluczania wielkości (SEC). Nieukierunkowana analiza proteomiczna pozwoliła na walidację sygnatur białkowych jako markerów EV i scharakteryzowanie biologicznie aktywnej zawartości EV. EV pochodzące z mikrogleju wykorzystano również funkcjonalnie w pierwotnej hodowli neuronów, aby ocenić ich znaczenie jako mediatorów immunologicznych w rozroscie neurytów. Wyniki pokazały, że EV pochodzące z mikrogleju przyczyniają się do ułatwienia wzrostu neurytów in vitro. Równolegle, EV pochodzące z makrofagów krwi były funkcjonalnie wykorzystywane jako mediatory immunologiczne w sferoidalnych kulturach komórek glejaka C6, a wyniki pokazują, że te EV kontrolują inwazję komórek glejaka in vitro. Raport ten podkreśla możliwość oceny funkcji komórek odpornościowych, w których pośredniczy EV, ale także zrozumienia molekularnych podstaw takiej komunikacji. To rozszyfrowanie może sprzyjać stosowaniu naturalnych pęcherzyków i/lub przygotowywaniu in vitro pęcherzyków terapeutycznych w celu naśladowania właściwości immunologicznych w mikrośrodowisku patologii OUN.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wiele neuropatologii jest związanych ze stanem neurozapalnym, który jest złożonym mechanizmem, który jest coraz częściej rozważany, ale wciąż słabo poznany, ponieważ procesy immunologiczne są zróżnicowane i zależą od środowiska komórkowego. Rzeczywiście, zaburzenia OUN nie obejmują systematycznie tych samych sygnałów aktywacji i populacji komórek odpornościowych, a zatem odpowiedzi pro- lub przeciwzapalne są trudne do oceny jako przyczyny lub konsekwencje patologii. Makrofagi rezydujące w mózgu, zwane "mikroglejem", wydają się znajdować na styku układu nerwowego i odpornościowego1. Mikroglej ma pochodzenie szpikowe i pochodzi z woreczka żółtkowego podczas prymitywnej hematopoezy w celu kolonizacji mózgu, podczas gdy makrofagi obwodowe pochodzą z wątroby płodu podczas ostatecznej hematopoezy, aby stać się makrofagami obwodowymi2. Komórki mikrogleju komunikują się z neuronami i komórkami glejowymi pochodzącymi z neuronów, takimi jak astrocyty i oligodendrocyty3. Kilka ostatnich badań wykazało, że mikroglej bierze udział w plastyczności neuronów podczas rozwoju OUN i homeostazy tkanek dorosłych, a także w stanie zapalnym związanym z chorobami neurodegeneracyjnymi4,5. W przeciwnym razie integralność bariery krew-mózg może być zagrożona w innych patologiach OUN. Odpowiedzi immunologiczne, zwłaszcza w raku glejaka wielopostaciowego, nie są wspierane tylko przez komórki mikrogleju, ponieważ bariera krew-mózg jest reorganizowana przez procesy angiogenne i obecność naczyń limfatycznych6,7. W związku z tym w guzie mózgu występuje duża infiltracja makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego (BMDM) w mechanizmach angiogenezy zależnej od nowotworu8. Komórki nowotworowe wywierają znaczący wpływ na infiltrowane BMDM, co prowadzi do właściwości immunosupresyjnych i wzrostu guza9. W związku z tym komunikacja między komórkami odpornościowymi a ich mikrośrodowiskiem mózgu jest trudna do zrozumienia, ponieważ pochodzenie komórek i sygnały aktywacji są zróżnicowane10,11. W związku z tym interesujące jest zrozumienie funkcji sygnatur molekularnych związanych z komórkami odpornościowymi w warunkach fizjologicznych. W związku z tym komunikację komórka-komórka między komórkami odpornościowymi a mikrośrodowiskiem komórki można badać poprzez uwalnianie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV).

EVs są coraz częściej badane pod kątem regulacji funkcji immunologicznych zarówno w zdrowych, jak i patologicznych warunkach12,13. Można wziąć pod uwagę dwie populacje, egzosomy i mikropęcherzyki. Prezentują one różną biogenezę i zakresy wielkości. Egzosomy są pęcherzykami o średnicy ~30–150 nm i są generowane z układu endosomalnego i wydzielane podczas fuzji ciał wielopęcherzykowych (MVB) z błoną plazmatyczną. Mikropęcherzyki mają średnicę około 100–1000 nm i są generowane przez pączkowanie na zewnątrz z błony komórkowej plazmatycznej14. Ponieważ rozróżnienie między egzosomami a mikropęcherzykami jest nadal trudne do zrealizowania w zależności od wielkości i wzorców molekularnych, w niniejszym raporcie będziemy używać terminu EV. Komunikacja związana z EV w OUN stanowi mechanizm pradawny, ponieważ badania wykazały ich udział w gatunkach bezkręgowców, w tym nicieniach, owadach lub pierścienicach15,16. Co więcej, wyniki pokazujące, że EV mogą komunikować się z komórkami różnych gatunków, pokazują, że mechanizm ten jest systemem kluczowym, opartym najpierw na rozpoznawaniu cząsteczki powierzchniowej między pęcherzykami a komórkami biorcy, a następnie umożliwiającym wychwyt mediatorów16,17. Rzeczywiście, EV zawierają wiele cząsteczek, takich jak białka (np. enzymy, transdukcja sygnału, czynnik biogenezy), lipidy (np. ceramidy, cholesterol) lub kwasy nukleinowe (np. DNA, mRNA lub miRNA) działające jako bezpośrednie lub pośrednie regulatory aktywności komórki biorcy14. Dlatego też przeprowadzono badania metodologiczne na komórkach odpornościowych, aby wyizolować EV i w pełni scharakteryzować ich sygnatury białkowe18,19.

Najwcześniejsze badania wykazały uwalnianie egzosomów z mikrogleju szczurów z hodowli pierwotnej jako indukowalny mechanizm po aktywacji zależnej od Wnt3a- lub serotoniny20,21. Funkcjonalnie w OUN, EV pochodzące z mikrogleju regulują uwalnianie pęcherzyków synaptycznych przez zakończenia presynaptyczne w neuronach, przyczyniając się do kontroli pobudliwości neuronów22,23. EV pochodzące z mikrogleju mogą również propagować odpowiedź zapalną za pośrednictwem cytokin w dużych obszarach mózgu24,25. Co ważne, różnorodne ligandy dla rodziny receptorów toll-like mogą aktywować specyficzną produkcję EV w klasie mikrogleju26. Na przykład badania in vitro pokazują, że linie komórkowe mikrogleju BV2 aktywowane LPS wytwarzają zróżnicowaną zawartość EV, w tym cytokin prozapalnych27. W związku z tym funkcjonalna różnorodność subpopulacji komórek odpornościowych w OUN, mikrogleju i naciekających BMDM może być oceniana na podstawie ich własnych populacji EV, w tym wpływu EV na komórki biorcze i identyfikacji zawartości EV.

Wcześniej opisaliśmy metody oceny właściwości funkcjonalnych EV pochodzących z mikrogleju i BMDM po ich izolacji16,19. W niniejszym raporcie proponujemy niezależną ocenę wpływu EV pochodzących z mikrogleju na wzrost neurytów oraz wpływu EV pochodzących z makrofagów na kontrolę agregatów komórek glejaka. W badaniu tym zaproponowano również szeroką analizę proteomiczną frakcji EV w celu walidacji procedury izolacji EV, a także identyfikacji biologicznie aktywnych sygnatur białkowych. Korzystne efekty i molekularne rozszyfrowanie zawartości EV mogą pomóc w ich ewentualnej manipulacji i wykorzystaniu jako środków terapeutycznych w zaburzeniach mózgu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Pierwotna hodowla mikrogleju/makrofagów

  1. Pierwotna kultura mikrogleju
    1. Hodowla komercyjnego pierwotnego mikrogleju szczura (2 x 106 komórek) (patrz tabela materiałów) w zmodyfikowanym pożywce Eagle (DMEM) firmy Dulbecco, uzupełnionej 10% surowicą wolną od egzosomów, 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny i 9,0 g/l glukozy w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
    2. Zebrać kondycjonowaną pożywkę po 48 godzinach posiewu i przystąpić do izolacji EV.
  2. Pierwotna hodowla makrofagów
    1. Hodowla komercyjnych pierwotnych makrofagów szczurów (1 x 106 komórek) w pożywce dostarczonej przez producenta (patrz tabela materiałów) w temperaturze 37 °C i 5% CO2 z surowicą wolną od egzosomów.
    2. Zebrać kondycjonowaną pożywkę po 24-godzinnej hodowli i przystąpić do izolacji EV.

2. Izolacja EV

  1. Wstępna izolacja pojazdów elektrycznych od kondycjonowanego podłoża
    1. Przenieść kondycjonowaną pożywkę hodowlaną z kultur mikrogleju lub makrofagów (etapy 1.1.2 lub 1.2.2) do stożkowej probówki.
    2. Wirować przy 1 200 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej (RT) w celu osadzenia komórek.
    3. Przenieść supernatant do nowej stożkowej probówki. Wirować przy 1,200 x g przez 20 minut w temperaturze pokojowej w celu wyeliminowania ciał apoptotycznych.
    4. Przenieść supernatant do probówki z poliwęglanu o pojemności 10,4 ml i przenieść probówkę do wirnika 70,1 Ti. Ultrawirowanie przy 100 000 x g przez 90 minut w temperaturze 4 °C w celu granulowania EVs.
    5. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad zawierający EV w 200 μl 0,20 μm przefiltrowanego buforu fosforanowego soli fizjologicznej (PBS).
  2. Izolacja pojazdów elektrycznych
    1. Przygotowanie domowej roboty kolumny do chromatografii wykluczającej wielkość (SEC)
      1. Szklaną kolumnę chromatograficzną (długość: 26 cm; średnica: 0,6 cm) należy opróżnić (patrz tabela materiałów), umyć ją i wysterylizować.
      2. Umieść filtr 60 μm na dole kolumny.
      3. Ułóż kolumnę z usieciowaną matrycą filtracyjną z żelu agarozowego, aby utworzyć fazę stacjonarną o średnicy 0,6 cm i wysokości 20 cm.
      4. Przepłukać fazę 50 ml przefiltrowanego PBS o stężeniu 0,20 μm. Przechowywać w temperaturze 4 °C do późniejszego użycia w razie potrzeby.
    2. Umieść zawieszony granulat EV na górze nieruchomej fazy kolumny SEC.
    3. Zebrać 20 sekwencyjnych frakcji po 250 μl, kontynuując dodawanie 0,20 μm przefiltrowanego PBS na wierzchu fazy stacjonarnej, aby zapobiec wysuszeniu kolumny. W razie potrzeby należy przechowywać frakcje w temperaturze -20 °C.
      nuta: Przechowywanie w temperaturze -80 °C może być przechowywane dłużej niż tydzień, aby zachować integralność EV do analizy molekularnej.
  3. Spektrometria mas frakcji SEC wspomagana desorpcją laserową i jonizacją wspomaganą matrycą (MALDI)
    1. Przejdź do izolacji EV zgodnie z opisem w sekcji 2.2.
    2. Zawiesić osad EV z 200 μl roztworu mieszającego do kalibracji peptydów (patrz Tabela materiałów).
    3. Przejdź do odbioru EV zgodnie z opisem w sekcjach 2.2.1 do 2.2.3.
    4. Całkowicie wysuszyć frakcję za pomocą koncentratora próżniowego.
    5. Rozpuścić frakcje w 10 μl 0,1% kwasu trifluorooctowego (TFA).
    6. Zmieszać 1 μl frakcji rozpuszczonej z 1 μl matrycy kwasu α-cyjano-4-hydroksycynamonowego (HCCA) na tarczy tarczowej z polerowanej stali MALDI.
    7. Analizuj wszystkie frakcje za pomocą spektrometru mas MALDI.
    8. Analizuj wygenerowane widma za pomocą dedykowanego oprogramowania (patrz Tabela Materiałów).

3. Charakterystyka EV

  1. Analiza śledzenia nanocząstek (NTA)
    UWAGA:     Analizę NTA przeprowadza się za pomocą przyrządu do analizy śledzenia nanocząstek (patrz Tabela materiałów) i zautomatyzowanej pompy strzykawkowej.
    1. Wykonać rozcieńczenie (w zakresie od 1:50 do 1:500) każdej frakcji SEC z kroku 2.2.3 za pomocą przefiltrowanego PBS 0,20 μm.
    2. Wiruj rozwiązanie, aby wyeliminować agregaty EV.
    3. Umieścić rozcieńczony roztwór w strzykawce o pojemności 1 ml i umieścić go w automatycznej pompie strzykawkowej.
    4. Dostosuj ustawienia kamery do poziomu wzmocnienia ekranu (3) i poziomu kamery (13).
    5. Kliknij Uruchom i uruchom następujący skrypt.
      1. Załadować próbkę do komory analitycznej (szybkość infuzji: 1 000 przez 15 s).
      2. Zmniejsz i ustabilizuj prędkość przepływu podczas nagrywania wideo (szybkość infuzji: 25 przez 15 s). Uchwyć trzy kolejne filmy z 60 sekund przedstawiające przepływ cząstek.
      3. Dostosuj poziom kamery (13) i próg wykrywania (3) przed analizą filmów. Kliknij Ustawienia| Ok, aby rozpocząć analizę i kliknąć Eksportuj po zakończeniu analizy.
    6. Pomiędzy każdą analizą frakcji przemyć 1 ml przefiltrowanego PBS o stężeniu 0,20 μm.
  2. Analiza pod mikroskopem elektronowym (EM)
    1. Odizolować EV zgodnie z opisem w sekcji 2.
      nuta: Sterylne warunki nie są wymagane.
    2. Powtórzyć sekcję 3.1, aby określić ilościowo EVs.
      nuta: Do analizy EM zostaną użyte tylko frakcje dodatnie.
    3. Użyj filtra odśrodkowego o sile 50 kDa (patrz tabela materiałów), aby zagęścić frakcje SEC zawierające EV.
    4. Zawiesić skoncentrowane EV w 30 μl 2% paraformaldehydu (PFA).
    5. Załadować 10 μl próbki na siatkę miedzianą pokrytą węglem.
    6. Inkubować przez 20 minut w wilgotnym środowisku.
    7. Powtórzyć kroki 3.2.5 i 3.2.6 w celu dobrego wchłonięcia próbki na siatce.
    8. Przenieś siatkę do kropli 1% aldehydu glutarowego w PBS przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    9. Kilkakrotnie przemyć próbkę ultraczystą wodą.
    10. Badać próbkę przez 10 minut na lodzie z mieszaniną 4% octanu uranylu i 2% metylocelulozy (1:9, v/v). Usunąć nadmiar mieszaniny za pomocą bibuły filtracyjnej.
    11. Wysuszyć próbkę i obserwować ją pod transmisyjnym mikroskopem elektronowym pod napięciem 200 kV (patrz tabela materiałów).
  3. Analiza Western blot
    1. Ekstrakcja białek
      1. Powtórzyć kroki od 3.2.1 do 3.2.3 w celu wyizolowania i zagęszczenia EV.
      2. Zmieszać 50 μl buforu RIPA (150 mM chlorku sodu [NaCl], 50 mM Tris, 5 mM glikolu etylenowego-bis(2-aminoetyloeter)-N,N,N′,N′-kwasu tetraoctowego [EGTA], 2 mM kwasu etylenodiamino-tetraoctowego [EDTA], 100 mM fluorku sodu [NaF], 10 mM pirofosforanu sodu, 1% Nonidetu P-40, 1 mM fluorku fenylometanosulfonylu [PMSF], 1x inhibitor proteazy) z próbką EV (25 μL wynikającą ze stężenia EV na filtrze) przez 5 min na lodzie do Ekstrakcja białek.
      3. Sonikuj przez 5 s (amplituda: 500 W; częstotliwość: 20 kHz), 3 razy na lodzie.
      4. Usunąć resztki pęcherzykowe przez odwirowanie w temperaturze 20 000 x g przez 10 minut, w temperaturze 4 °C.
      5. Zebrać supernatant i zmierzyć stężenie białka za pomocą metody oznaczania białek Bradforda.
    2. Elektroforeza w żelu poliakryloamidowym dodecylosiarczanu sodu (SDS-PAGE) i western blot
      1. Zmieszać ekstrakty białkowe (30 μg) z 5c buforem próbki Laemmli (v/v).
      2. Załaduj mieszankę białkową na 12% żel poliakrylamidowy.
      3. Migrować białka w żelu za pomocą buforu TGS (25 mM Tris pH 8,5, 192 mM glicyny i 0,1% SDS), przy 70 V przez 15 minut i 120 V przez 45 minut.
      4. Przenieść białka na membranę nitrocelulozową w systemie półsuchym pod napięciem 230 V przez 30 minut.
      5. Nasycać membranę przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej buforem blokującym (0,05% Tween 20 w/v, 5% mleka w proszku w/v w 0,1 M PBS, pH 7,4).
      6. Inkubować błonę przez noc w temperaturze 4 °C z mysim przeciwciałem monoklonalnym przeciwko ludzkiemu białku szoku cieplnego 90 (HSP90) rozcieńczonym w buforze blokującym (1:100).
      7. Umyj membranę trzykrotnie za pomocą PBS-Tween (PBS, 0,05% Tween 20 w/v) przez 15 minut.
      8. Inkubować błonę przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z kozio-chrzanową peroksydazą chrzanową sprzężonym z mysią przeciwciałem drugorzędowym IgG, rozcieńczonym w buforze blokującym (1:10 000).
        nuta: Kontrolę ujemną przeprowadza się przy użyciu samego przeciwciała drugorzędowego.
      9. Powtórzyć etap prania (krok 3.3.2.7).
      10. Odsłoń membranę za pomocą zestawu substratów do western blottingu o wzmocnionej chemiluminescencji (ECL) (patrz tabela materiałów).
  4. Analiza proteomiczna
    1. Ekstrakcja białka i trawienie w żelu
      1. Powtórzyć kroki od 3.2.1 do 3.2.3 w celu wyizolowania i zagęszczenia EV. Powtórzyć krok 3.3.1 dla ekstrakcji białka EV.
      2. Przeprowadzić migrację białek w żelu do układania w stos 12% żelu poliakrylamidowego.
      3. Utrwal białka w żelu za pomocą coomassie blue przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
      4. Wyciąć każdy kolorowy kawałek żelu i pokroić go na małe kawałki o średnicy 1 mm3.
      5. Kawałki żelu przemywać kolejno 300 μl każdego roztworu: wodą ultraczystą przez 15 min, 100% acetonitrylem (ACN) przez 15 min, 100 mM wodorowęglanu amonu (NH4HCO3) przez 15 min, ACN: 100 mM NH4HCO3 (1:1, v/v) przez 15 min i 100% ACN przez 5 min z ciągłym mieszaniem.
      6. Wysuszyć całkowicie żelowe kawałki za pomocą koncentratora próżniowego.
      7. Przeprowadzić redukcję białka za pomocą 100 μL 100 mM NH4HCO3 zawierającego 10 mM ditiotreitolu przez 1 godzinę w temperaturze 56°C.
      8. Przeprowadzić alkilowanie białek za pomocą 100 μl 100 mM NH4HCO3 zawierającego 50 mM jodoacetamidu przez 45 minut w ciemności w temperaturze pokojowej.
      9. Przemywać kawałki żelu kolejno 300 μl każdego roztworu: 100 mM NH4HCO3 przez 15 min, ACN: 20 mM NH4HCO3 (1:1, v/v) przez 15 min i 100% ACN przez 5 min, ciągle mieszając.
      10. Całkowicie wysusz kawałki żelu za pomocą koncentratora próżniowego.
      11. Przeprowadzić trawienie białek z 50 μl trypsyny (12,5 μg/ml) w 20 mM NH4HCO3 przez noc w temperaturze 37 °C.
      12. Ekstrahować strawione białka z żelu za pomocą 50 μl 100% ACN przez 30 minut w temperaturze 37 °C, a następnie 15 minut w temperaturze pokojowej, ciągle mieszając.
      13. Powtórz następujące procedury ekstrakcji dwukrotnie: 50 μl 5% TFA w 20 mM roztworze NH4HCO3 przez 20 minut, ciągle mieszając.
      14. Dodawać 100 μl 100% ACN przez 10 minut, ciągle mieszając.
      15. Białka trawione na sucho za pomocą koncentratora próżniowego i ponownie zawieszone w 20 μl 0,1% TFA.
      16. Odsalić próbkę za pomocą końcówki pipety o pojemności 10 μl z pożywką C18 z odwróconymi fazami do odsalania i zagęszczania peptydów (patrz tabela materiałów) i eluować peptydy za pomocą ACN:0,1% kwasu mrówkowego (FA) (80:20, v/v).
      17. Całkowicie wysuszyć próbkę za pomocą koncentratora próżniowego i ponownie zawiesić w 20 μl ACN:0,1% FA (2:98, v/v) do chromatografii cieczowej z tandemową spektrometrią mas (LC-MS/MS).
    2. Analiza LC-MS/MS
      1. Załaduj strawiony peptyd do urządzenia LC-MS/MS i wykonaj analizę próbki i danych zgodnie z parametrami opisanymi szczegółowo w innym miejscu42.
    3. Analiza danych surowych
      1. Przetwarzaj dane ze spektrometrii mas w celu identyfikacji białek i porównania zidentyfikowanych białek każdej próbki z ilościowym pakietem oprogramowania proteomicznego przy użyciu standardowych parametrów.
      2. Eksport, przy użyciu standardowych parametrów, listę wyłącznych i nadreprezentowanych białek z próbek dodatnich EV w oprogramowaniu przewidującym sieci białkowe i procesy biologiczne.
      3. Porównaj listę zidentyfikowanych białek we frakcjach ze 100 najlepszymi markerami EV z ogólnodostępnej bazy danych Exocarta (patrz Tabela materiałów).

4. Test efektów funkcjonalnych EVs

  1. Test wzrostu neurytów na linii komórkowej PC-12
    1. Hodowla linii komórkowej PC12 w kompletnym pożywce DMEM (2 mM L-glutamina, 10% płodowa surowica końska (FHS), 5% płodowa surowica bydlęca (FBS), 100 UI/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny).
      nuta: Surowice są wolne od egzosomów w całej procedurze.
    2. Dodaj szklankę nakrywkową (wszystkie studzienki) do 24-dołkowej płytki; pokryj płytkę poli-D-lizyną (0,1 mg / ml) i zasiej 260 000 komórek / basenik.
    3. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w temperaturze 5% CO2 .
    4. Po 24 godzinach inkubacji zmień pożywkę na pożywkę różnicującą DMEM (DMEM z 2 mM L-glutaminą, 0,1% FHS, 100 UI/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny) z 1 x 106 EV mikrogleju (od kroku 1.1.2).
      nuta: Warunek kontrolny przeprowadza się bez EV mikrogleju w ośrodku różnicującym.
    5. W 4 dniu po wysiewie załadować wszystkie studzienki 100 μl kompletnego podłoża DMEM.
    6. W 7 dniu po wysianiu utrwalić komórki 4% PFA przez 20 minut w temperaturze pokojowej i przepłukać trzy razy (po 10 minut) PBS.
    7. Wybarwić komórki falloidyną sprzężoną z rodaminą przez 30 minut w temperaturze 4 °C i spłukać 3 razy (po 10 minut) PBS.
    8. Wybarwić komórki rozcieńczonym Hoechst 33342 (1:10 000) przez 30 minut w temperaturze pokojowej i spłukać 3 razy (po 10 minut) PBS.
    9. Zamontuj szkiełko nakrywkowe na szkiełku z fluorescencyjnym medium montażowym (patrz Tabela materiałów).
    10. Przeanalizuj szkiełko za pomocą mikroskopu konfokalnego, zrób 5 losowych obrazów każdego szkiełka.
    11. Zmierz wzrost neurytów za pomocą automatycznego oprogramowania do oceny ilościowej (całkowita długość neurytu), jak szczegółowo opisano w innym miejscu43.
  2. Przerost neurytów na pierwotnych neuronach szczura
    1. Pokryj 8-dołkowe szkiełko szkiełkowe poli-D-lizyną (0,1 mg/ml) i lamininą (20 μg/ml).
    2. Hodowla komercyjnych neuronów pierwotnych szczura w odpowiedniej pożywce hodowlanej (patrz tabela materiałów) poprzez posiew 50 000 komórek na studzienkę i inkubację komórek w temperaturze 37 °C poniżej 5% CO2 przez 48 godzin
      nuta: Surowice są wolne od egzosomów w całej procedurze.
    3. Dodać 1 x 106 mikrogleju EV do pożywki do hodowli neuronów i inkubować w temperaturze 37 °C poniżej 5% CO2 przez 48 godzin dłużej.
      nuta: Warunek kontrolny przeprowadza się bez EV mikrogleju w pożywce do hodowli neuronów.
    4. Wykonaj kroki od 4.1.6 do 4.1.9, aby naprawić i wybarwić komórki.
    5. Wykonaj kroki 4.1.10 i 4.1.11, aby przeanalizować slajd.
  3. Inwazja komórek glejaka
    1. Zawiesić komórki glejaka szczura C6 w kompletnym pożywce DMEM (DMEM z 10% FBS, 2 mM L-glutaminy, 1x antybiotykami) zawierającej 5% kolagenu w końcowym stężeniu 8 000 komórek w 20 μL.
      nuta: Surowice są wolne od egzosomów w całej procedurze.
    2. Umieść 5 ml PBS na dnie naczynia do hodowli tkankowej o średnicy 60 mm. Odwróć pokrywkę i umieść krople 20 μl (8 000 komórek) zawiesiny komórek na dnie pokrywy.
    3. Odwrócić pokrywkę na dolną komorę wypełnioną PBS i inkubować płytkę w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 72 godziny, aż utworzą się sferoidy komórek.
    4. Dodaj 1 x 108 makrofagów EV (z kroku 1.2.2) do mieszaniny kolagenu o stężeniu 2,2 mg/ml (2 ml roztworu kolagenu bydlęcego typu I [3 mg/ml] z 250 μl 10x minimalnej pożywki niezbędnej (MEM) i 500 μl 0,1 M wodorotlenku sodu).
      nuta: Warunek kontrolny przeprowadza się bez EV makrofagów w mieszaninie kolagenu.
    5. Rozprowadź mieszaninę kolagenu zawierającą EV w 24-dołkowej płytce do zatopienia sferoid komórkowych.
    6. Wszczep nowo utworzone sferoidy komórkowe w środku każdej studzienki.
    7. Inkubować płytkę przez 30 minut w temperaturze 37°C i 5% CO2 w celu zestalenia żelu.
    8. Następnie nałóż 400 μl kompletnego podłoża DMEM na matrycę kolagenową w każdym dołku.
    9. Inkubować cały system przez łącznie 6 dni w temperaturze 37 °C i 5% CO2,
      nuta: Inwazja komórek poza sferoidę jest monitorowana za pomocą fotografii cyfrowej przy użyciu mikroskopu światła odwróconego przy użyciu obiektywu 4x/0,10 NA.
    10. Codziennie rób zdjęcia każdej studni.
    11. Przetwarzaj obrazy i określaj ilościowo inwazję obszarów sferoidalnych komórek za pomocą oprogramowania, jak opisano wcześniej szczegółowo42.
      nuta: Obszary inwazji i sferoidy zostały znormalizowane dla każdego dnia do obszarów inwazji i sferoidów zmierzonych w dniu 0.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jednym z głównych wyzwań związanych z przypisywaniem efektów biologicznych pęcherzykom zewnątrzkomórkowym (EVs) jest możliwość izolowania EVs z całej pożywki hodowlanej. W niniejszym raporcie przedstawiamy metodę wykorzystującą ultrawirowanie (UC) i chromatografię wykluczania wielkości (SEC), która jest sprzężona z wielkoskalową analizą sygnatur białkowych w celu walidacji markerów EV i identyfikacji związków bioaktywnych. EV pochodzące z makrofagów lub mikrogleju wyizolowano z kondycjonowanej pożywki po odpowiednio 24 l...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ośrodkowy układ nerwowy (OUN) jest złożoną tkanką, w której komunikacja międzykomórkowa reguluje normalne funkcje neuronalne niezbędne do homeostazy30. Pojazdy elektryczne są obecnie szeroko badane i opisywane jako ważne ładunki molekularne dla komunikacji między komórkami31. W szczególności dostarczają one koktajl mediatorów do komórek biorcy, wpływając w ten sposób na ich funkcje w zdrowych i patologicznych warunkach32. Ostatnie badania wskazują, ż...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentowana praca była wspierana przez Ministère de L'Education Nationale, de L'Enseignement Supérieur et de la Recherche oraz INSERM. Serdecznie dziękujemy BICeL- Campus Scientific City Facility za dostęp do instrumentów i porad technicznych. Serdecznie dziękujemy Jean-Pascalowi Gimeno, Soulaimane Aboulouardowi i Isabelle Fournier za pomoc w zakresie spektrometrii mas. Wyrażamy wdzięczność Taninie Arab, Christelle van Camp, Francoise le Marrec-Croq, Jacopo Vizioli i Pierre'owi-Ericowi Sautière'owi za ich znaczący wkład w rozwój naukowy i techniczny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
12% Mini-PROTEAN  TGX Prefabrykowane żele białkoweBio-rad4561045EDU 
AcetonitrylFisher ChemicalsA955-1 
Filtr odśrodkowy Amicon 50 kDaMerckUFC505024 
Wodorowęglan amonuSigma-Aldrich9830 
Przeciwciało HSP90 α/&beta (RRID: AB_675659)Santa-cruzsc-13119 
B27 Plus suplementGibcoA3582801 
Mikser wirowy BenchMixer V2Benchmark ScientificBV1003 
Bio-Rad Koncentrat odczynnika do oznaczania białek (Bradford)Bio-Rad5000006 
Końcówki C18 MerckMilliporeZTC18S096 
C6 komórka glejaka szczuraATCCATCC CCL-107 
Rurki kanoniczneSarstedt62.554.002 
WirówkaEppendorf5804000010 
Inkubator CO2ThermoFisher  
Mikroskop konfokalny LSM880Carl ZeissLSM880 
Szkło nakrywkoweMarienfeld111580 
Naczynie hodowlane (60 mm)Sarstedt82.1473 
DithiothreitolSigma-Aldrich43819 
DMEMGibco41966029 
Chromatograf cieczowy EASY-nLC 1000ThermoFisher  
Mikroskop elektronowy JEM-2100JEOL  
Kwas glikolu etylenowego-bis(2-aminoetyloeter)-N,N,N′,N′-tetraoctowySigma-Aldrich03777-10G 
Kwas etylenodiaminotetraoctowySigma-AldrichED-100G 
Exo-FBSOzymeEXO-FBS-50A-1Baza danych ExoCarta FBS zubożona w egzosomy
(100 najlepszych białek Evs)  http://www.exocarta.org/
Surowica bydlęca płoduGibco16140071 
Płodowa surowica dla koniBiowestS0960-500 
Filtropur S 0.2Sarstedt83.1826.001 
Marka rybacka  Sonikator Q500 z sondąFisherbrand12893543 
FlexAnalysisBrucker  
Fluorescencyjny nośnik montażowyAgilentS3023 
Kwas mrówkowySigma-Aldrich695076 
Siatki miedziane powlekane węglem Agarscientific LtdAGS162-3 
GlukozaSigma-AldrichG8769 
Aldehyd glutarowySigma-Aldrich340855 
Hoechst 33342Euromedex17535-AAT 
IdoacetamidSigma-AldrichI1149 
InstantBlue Coomassie Barwnik BiałkowyExpedeonISB1L 
Mikroskop światła odwróconego CKX53Olympus  
L-glutaminaGibco25030-024 
LabTek II 8 dołków  Nunc154534 
Laemmli 2xBio-Rad1610737 
LamininCorning354232 
Oprogramowanie MaxQuant (oprogramowanie do identyfikacji białek)  https://maxquant.net/maxquant/
Czołg podstawowy Polska StalBrucker8268711 
MEM 10xGibco21090-022 
MetylocelulozaSigma-AldrichM6385-100G 
MiliQ wodaMerck Millipore  
Rejestracja mlekaREGILAIT300 
Pionowe ogniwo do elektroforezy Mini PROTEANBio-Rad1658000FC 
Kolumna MonoP FPLCGE Healthcare Nie jest już dostępny
Nanosight NS300Malvern PanalyticalNS300 
Oprogramowanie NanoSight NTA v3.2Malvern Panalytical  
Pompa strzykawkowa NanoSightMalvern Panalytical  
NeuropodstawowyGibco21103-049 
Membrana nitrocelulozowaGE Healthcare10600007 
Nonidet P-40Fluka56741 
Nunc wielotalerzowy 24 dołkiThermoFisher82.1473 
ParaformaldehydElektromikroskopia Nauka15713 
Linia komórkowa PC-12ATCCATCC CRL-1721 
Penicylina-StreptomycynaGibco15140-122 
Mieszanka kalibracyjna peptydówLaserBio LabsC101 
Peroksydaza AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch115-035-003 
Oprogramowanie Perseus (Przetwarzanie zidentyfikowanych białek)  https://maxquant.net/perseus/
Koniugat falloidyny-tetrametylorodaminySanta-cruzsc-362065 
Fluorek fenylometanosulfonyluSigma-Aldrich78830 
Bufor fosforanowy SolankaInvitrogen14190094bez wapnia, bez magnezu
pluriSitko M/ 60 µ mpluriSelect43-50060 
Poli-D-lizynaSigma-AldrichP6407 
Probówki wirówkowe z poliwęglanuBeckman Coulter355651 
Inhibitor proteazySigma-AldrichS8830-20TAB 
Systemy komórkowePureCol5005 
Spektrometr masowy Q-ExactiveThermoFisher  
spektrometr masowy rapifleXBrucker  
Neurony korowe szczuraZastosowania komórkoweR882N-20Pochodzenie komórkowe : Pochodzące z kory mózgowej dnia 18 embrionalne mózgi szczurów Sprague Dawley
Makrofagi szczurów i Pożywka do hodowli mikrogleju ZastosowaniakomórkoweR620K-100Orgina komórkowa: Normalna zdrowa Szpik kostny
Szczur Pierwotne makrofagiZastosowania komórkoweR8818-10a 
Pierwotny mikroglej szczuraLonzaRG535 
Sepharose CL-2BGE Healthcare17014001 
Zmodyfikowana trypsyna klasy sekwencjonowaniaPromegaV5111 
Zjeżdżalniakurzu100204 
Chlorek soduScharlauSO0227 
Dodecylosiarczan soduSigma-AldrichL3771 
Fluorek soduSigma-AldrichS7920-100G 
Wodorotlenek soduScharlabSO0420005P 
Pirofosforan soduSigma-AldrichS6422-100G 
Koncentrator próżniowy SpeedVacThermoFisher  
Oprogramowanie łańcuchowe (funkcjonalne sieci asocjacyjne białek)  https://string-db.org/
Podłoże SuperSignal West Dura o wydłużonym czasie trwaniaThermoFisher34075 
Strzykawka 1,0 mlTerumo8SS01H1 
Półsucha komórka transferowa Trans-Blot SDBio-Rad1703940 
Kwas trifluorooctowySigma-AldrichT6508 
TrisInterchimUP031657 
Tris-GlycineEuromedexEU0550 
Tween 20Sigma-AldrichP2287 
Redlica ultrawirówkowaBeckmanA95765 
Wirnik ultrawirówkowy 70,1 TiBeckman Coulter342184 
Octan uranyluAgar Scientific LtdAGR1260A 
Bibuła filtracyjna WhatmanSigma-AldrichWHA10347510 
&alfa;-Kwas cyjano-4-hydroksycynamonowySigma-AldrichC2020-25G 
do

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thion, M. S., Ginhoux, F., Garel, S. Microglia and early brain development: An intimate journey. Science. 362 (6411), 185-189 (2018).
  2. Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), New York, N.Y. 841-845 (2010).
  3. Sankowski, R., Mader, S., Valdes-Ferrer, S. I. Systemic Inflammation and the Brain: Novel Roles of Genetic, Molecular, and Environmental Cues as Drivers of Neurodegeneration. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, (2015).
  4. Chakrabarty, S., Kabekkodu, S. P., Singh, R. P., Thangaraj, K., Singh, K. K., Satyamoorthy, K. Microglia in health and disease. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 43 (3), 25-29 (2015).
  5. Sankowski, R., Mader, S., Valdés-Ferrer, S. I. Systemic inflammation and the brain: novel roles of genetic, molecular, and environmental cues as drivers of neurodegeneration. Frontiers in cellular neuroscience. 9, 28(2015).
  6. Engelhardt, B., Vajkoczy, P., Weller, R. O. The movers and shapers in immune privilege of the CNS. Nature Immunology. 18 (2), 123-131 (2017).
  7. Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).
  8. Domingues, P., et al. Tumor infiltrating immune cells in gliomas and meningiomas. Brain, Behavior, and Immunity. 53, 1-15 (2016).
  9. Hambardzumyan, D., Gutmann, D. H., Kettenmann, H. The role of microglia and macrophages in glioma maintenance and progression. Nature Neuroscience. 19 (1), 20-27 (2016).
  10. Thion, M. S., et al. Microbiome Influences Prenatal and Adult Microglia in a Sex-Specific Manner. Cell. 172 (3), 500-516 (2018).
  11. Hammond, T. R., et al. Single-Cell RNA Sequencing of Microglia throughout the Mouse Lifespan and in the Injured Brain Reveals Complex Cell-State Changes. Immunity. 50 (1), 253-271 (2019).
  12. Rajendran, L., et al. Emerging Roles of Extracellular Vesicles in the Nervous System. The Journal of Neuroscience. 34 (46), 15482-15489 (2014).
  13. Gupta, A., Pulliam, L. Exosomes as mediators of neuroinflammation. Journal of Neuroinflammation. 11 (1), 68(2014).
  14. van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).
  15. Budnik, V., Ruiz-cañada, C., Wendler, F. Extracellular vesicles round off communication in the nervous system. Nature Reviews Neurosciences. 17, 160-172 (2016).
  16. Raffo-Romero, A., et al. Medicinal Leech CNS as a Model for Exosome Studies in the Crosstalk between Microglia and Neurons. International Journal of Molecular Sciences. 19 (12), 4124(2018).
  17. Zhou, Y., et al. Exosomes Transfer Among Different Species Cells and Mediating miRNAs Delivery. Journal of Cellular Biochemistry. 118 (12), 4267-4274 (2017).
  18. Arab, T., et al. Proteomic characterisation of leech microglia extracellular vesicles (EVs): comparison between differential ultracentrifugation and OptiprepTM density gradient isolation. Journal of extracellular vesicles. 8 (1), 1603048(2019).
  19. Murgoci, A. -N., et al. Brain-Cortex Microglia-Derived Exosomes: Nanoparticles for Glioma Therapy. ChemPhysChem. 19 (10), 1205-1214 (2018).
  20. Glebov, K., et al. Serotonin stimulates secretion of exosomes from microglia cells. Glia. 63 (4), 626-634 (2015).
  21. Hooper, C., et al. Wnt3a induces exosome secretion from primary cultured rat microglia. BMC Neuroscience. 13 (1), 144(2012).
  22. Gabrielli, M., et al. Active endocannabinoids are secreted on extracellular membrane vesicles. EMBO reports. 16 (2), 213-220 (2015).
  23. Antonucci, F., et al. Microvesicles released from microglia stimulate synaptic activity via enhanced sphingolipid metabolism. The EMBO Journal. 31 (5), 1231-1240 (2012).
  24. Frühbeis, C., Fröhlich, D., Kuo, W. P., Krämer-Albers, E. -M. Extracellular vesicles as mediators of neuron-glia communication. Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, 182(2013).
  25. Prada, I., et al. Glia-to-neuron transfer of miRNAs via extracellular vesicles: a new mechanism underlying inflammation-induced synaptic alterations. Acta neuropathologica. 135 (4), 529-550 (2018).
  26. Takenouchi, T., et al. Extracellular ATP induces unconventional release of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from microglial cells. Immunology Letters. 167 (2), 116-124 (2015).
  27. Yang, Y., Boza-Serrano, A., Dunning, C. J. R., Clausen, B. H., Lambertsen, K. L., Deierborg, T. Inflammation leads to distinct populations of extracellular vesicles from microglia. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 168(2018).
  28. Duhamel, M., et al. Paclitaxel Treatment and Proprotein Convertase 1/3 (PC1/3) Knockdown in Macrophages is a Promising Antiglioma Strategy as Revealed by Proteomics and Cytotoxicity Studies. Molecular & Cellular Proteomics. 17 (6), 1126-1143 (2018).
  29. Pool, M., Thiemann, J., Bar-Or, A., Fournier, A. E. NeuriteTracer: A novel ImageJ plugin for automated quantification of neurite outgrowth. Journal of Neuroscience Methods. 168 (1), 134-139 (2008).
  30. Domingues, H. S., Portugal, C. C., Socodato, R., Relvas, J. B. Oligodendrocyte, Astrocyte, and Microglia Crosstalk in Myelin Development, Damage, and Repair. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 71(2016).
  31. Rashed, M. H., et al. Exosomes: From Garbage Bins to Promising Therapeutic Targets. Int. J. Mol. Sci. Int. J. Mol. Sci. 18 (18), (2017).
  32. Yuana, Y., Sturk, A., Nieuwland, R. Extracellular vesicles in physiological and pathological conditions. Blood Reviews. 27 (1), 31-39 (2013).
  33. Frohlich, D., et al. Multifaceted effects of oligodendroglial exosomes on neurons: impact on neuronal firing rate, signal transduction and gene regulation. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369 (1652), (2014).
  34. Krämer-Albers, E. -M., et al. Oligodendrocytes secrete exosomes containing major myelin and stress-protective proteins: Trophic support for axons. Proteomics. Clinical applications. 1 (11), 1446-1461 (2007).
  35. Verderio, C., et al. Myeloid microvesicles are a marker and therapeutic target for neuroinflammation. Annals of Neurology. 72 (4), 610-624 (2012).
  36. Prada, I., Furlan, R., Matteoli, M., Verderio, C. Classical and Unconventional Pathways of Vesicular Release in Microglia. GLIA. 61, 1003-1017 (2013).
  37. Prinz, M., Priller, J. The role of peripheral immune cells in the CNS in steady state and disease. Nature Neuroscience. 20 (2), 136-144 (2017).
  38. Li, Q., Barres, B. A. Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. , (2017).
  39. Kennedy, B. C., et al. Tumor-Associated Macrophages in Glioma: Friend or Foe. Journal of Oncology. 2013, 1-11 (2013).
  40. Potolicchio, I., Carven, G. J., Xu, X., Stipp, C., Riese, R. J., Stern, L. J., Santambroggio, L. Proteomic Analysis of Microglia-Derived Exosomes: Metabolic Role of the Aminopeptidase CD13 in Neuropeptide Catabolism1. The Journal of Immunology. 175, 2237-2243 (2005).
  41. Turola, E., Furlan, R., Bianco, F., Matteoli, M., Verderio, C. Microglial microvesicle secretion and intercellular signaling. Frontiers in Physiology. 3, (2012).
  42. Cocucci, E., Meldolesi, J. Ectosomes and exosomes : shedding the confusion between extracellular vesicles. Trends in Cell Biology. 25 (6), 364-372 (2015).
  43. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  44. de Vrij, J., et al. Glioblastoma-derived extracellular vesicles modify the phenotype of monocytic cells. International Journal of Cancer. 137 (7), 1630-1642 (2015).
  45. van der Vos, K. E., et al. Directly visualized glioblastoma-derived extracellular vesicles transfer RNA to microglia/macrophages in the brain. Neuro-Oncology. 18 (1), 58-69 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Extracellular VesiclesImmune CellsUltracentrifugationSize Exclusion ChromatographyNanoparticle Tracking AnalysisWestern BlotProteomics AnalysisNeurite OutgrowthGlioma Cell InvasionMicroglia derived EVs

Powiązane artykuły