Method Article

Charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z komórek odpornościowych i badanie funkcjonalnego wpływu na środowisko komórkowe

DOI:

10.3791/60118

⸱

June 2nd, 2020

 ,  ,  ,  , 
1U1192-Laboratoire Protéomique, Réponse Inflammatoire et Spectrométrie de Masse (PRISM), Univ. Lille, INSERM

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niniejszy raport podkreśla chronologiczne wymagania dotyczące izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) od mikrogleju lub makrofagów krwi. EV pochodzące z mikrogleju oceniano jako regulatory wzrostu neurytów, podczas gdy EV pochodzące z makrofagów krwi badano w kontroli inwazji komórek glejaka C6 w testach in vitro. Celem jest lepsze zrozumienie tych funkcji EV jako mediatorów immunologicznych w określonych mikrośrodowiskach.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stan neurozapalny ośrodkowego układu nerwowego (OUN) odgrywa kluczową rolę w stanach fizjologicznych i patologicznych. Mikroglej, rezydujące komórki odpornościowe w mózgu, a czasem naciekające makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego (BMDM), regulują profil zapalny swojego mikrośrodowiska w OUN. Obecnie przyjmuje się, że populacje pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) z komórek odpornościowych działają jako mediatory immunologiczne. W związku z tym ich zbieranie i izolowanie są ważne dla identyfikacji ich zawartości, ale także oceny ich wpływu biologicznego na komórki biorcy. Obecne dane podkreślają chronologiczne wymagania dotyczące izolacji EV z komórek mikrogleju lub makrofagów krwi, w tym etapy ultrawirowania i chromatografii wykluczania wielkości (SEC). Nieukierunkowana analiza proteomiczna pozwoliła na walidację sygnatur białkowych jako markerów EV i scharakteryzowanie biologicznie aktywnej zawartości EV. EV pochodzące z mikrogleju wykorzystano również funkcjonalnie w pierwotnej hodowli neuronów, aby ocenić ich znaczenie jako mediatorów immunologicznych w rozroscie neurytów. Wyniki pokazały, że EV pochodzące z mikrogleju przyczyniają się do ułatwienia wzrostu neurytów in vitro. Równolegle, EV pochodzące z makrofagów krwi były funkcjonalnie wykorzystywane jako mediatory immunologiczne w sferoidalnych kulturach komórek glejaka C6, a wyniki pokazują, że te EV kontrolują inwazję komórek glejaka in vitro. Raport ten podkreśla możliwość oceny funkcji komórek odpornościowych, w których pośredniczy EV, ale także zrozumienia molekularnych podstaw takiej komunikacji. To rozszyfrowanie może sprzyjać stosowaniu naturalnych pęcherzyków i/lub przygotowywaniu in vitro pęcherzyków terapeutycznych w celu naśladowania właściwości immunologicznych w mikrośrodowisku patologii OUN.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wiele neuropatologii jest związanych ze stanem neurozapalnym, który jest złożonym mechanizmem, który jest coraz częściej rozważany, ale wciąż słabo poznany, ponieważ procesy immunologiczne są zróżnicowane i zależą od środowiska komórkowego. Rzeczywiście, zaburzenia OUN nie obejmują systematycznie tych samych sygnałów aktywacji i populacji komórek odpornościowych, a zatem odpowiedzi pro- lub przeciwzapalne są trudne do oceny jako przyczyny lub konsekwencje patologii. Makrofagi rezydujące w mózgu, zwane "mikroglejem", wydają się znajdować na styku układu nerwowego i odpornościowego1. Mikroglej ma pochodzenie szpikowe i pochodzi z woreczka żółtkow....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Pierwotna hodowla mikrogleju/makrofagów

  1. Pierwotna kultura mikrogleju
    1. Hodowla komercyjnego pierwotnego mikrogleju szczura (2 x 106 komórek) (patrz tabela materiałów) w zmodyfikowanym pożywce Eagle (DMEM) firmy Dulbecco, uzupełnionej 10% surowicą wolną od egzosomów, 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny i 9,0 g/l glukozy w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
    2. Zebrać kondycjonowaną pożywkę po 48 godzinach posiewu i przystąpić do izolacji EV.
  2. Pierwotna hodowla makrofagów
    1. Hodowla komercyjnych pierwotnych makrofagów szczurów (1 x....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jednym z głównych wyzwań związanych z przypisywaniem efektów biologicznych pęcherzykom zewnątrzkomórkowym (EVs) jest możliwość izolowania EVs z całej pożywki hodowlanej. W niniejszym raporcie przedstawiamy metodę wykorzystującą ultrawirowanie (UC) i chromatografię wykluczania wielkości (SEC), która jest sprzężona z wielkoskalową analizą sygnatur białkowych w celu walidacji markerów EV i identyfikacji związków bioaktywnych. EV pochodzące z makrofagów lub mikrogleju wyizolowano z kondycjonowanej pożywki po odpowiednio 24 l.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ośrodkowy układ nerwowy (OUN) jest złożoną tkanką, w której komunikacja międzykomórkowa reguluje normalne funkcje neuronalne niezbędne do homeostazy30. Pojazdy elektryczne są obecnie szeroko badane i opisywane jako ważne ładunki molekularne dla komunikacji między komórkami31. W szczególności dostarczają one koktajl mediatorów do komórek biorcy, wpływając w ten sposób na ich funkcje w zdrowych i patologicznych warunkach32. Ostatnie badania wskazują, ż.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentowana praca była wspierana przez Ministère de L'Education Nationale, de L'Enseignement Supérieur et de la Recherche oraz INSERM. Serdecznie dziękujemy BICeL- Campus Scientific City Facility za dostęp do instrumentów i porad technicznych. Serdecznie dziękujemy Jean-Pascalowi Gimeno, Soulaimane Aboulouardowi i Isabelle Fournier za pomoc w zakresie spektrometrii mas. Wyrażamy wdzięczność Taninie Arab, Christelle van Camp, Francoise le Marrec-Croq, Jacopo Vizioli i Pierre'owi-Ericowi Sautière'owi za ich znaczący wkład w rozwój naukowy i techniczny.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
12% Mini-PROTEAN  TGX Prefabrykowane żele białkoweBio-rad4561045EDU 
AcetonitrylFisher ChemicalsA955-1 
Filtr odśrodkowy Amicon 50 kDaMerckUFC505024 
Wodorowęglan amonuSigma-Aldrich9830 
Przeciwciało HSP90 α/&beta (RRID: AB_675659)Santa-cruzsc-13119 
B27 Plus suplementGibcoA3582801 
Mikser wirowy BenchMixer V2Benchmark ScientificBV1003 
Bio-Rad Koncentrat odczynnika do oznaczania białek (Bradford)Bio-Rad5000006 
Końcówki C18 MerckMilliporeZTC18S096 
C6 komórka glejaka szczuraATCCATCC CCL-107 
Rurki kanoniczneSarstedt62.554.002 
WirówkaEppendorf5804000010 
Inkubator CO2ThermoFisher  
Mikroskop konfokalny LSM880Carl ZeissLSM880 
Szkło nakrywkoweMarienfeld111580 
Naczynie hodowlane (60 mm)Sarstedt82.1473 
DithiothreitolSigma-Aldrich43819 
DMEMGibco41966029 
Chromatograf cieczowy EASY-nLC 1000ThermoFisher  
Mikroskop elektronowy JEM-2100JEOL  
Kwas glikolu etylenowego-bis(2-aminoetyloeter)-N,N,N′,N′-tetraoctowySigma-Aldrich03777-10G 
Kwas etylenodiaminotetraoctowySigma-AldrichED-100G 
Exo-FBSOzymeEXO-FBS-50A-1Baza danych ExoCarta FBS zubożona w egzosomy
(100 najlepszych białek Evs)  http://www.exocarta.org/
Surowica bydlęca płoduGibco16140071 
Płodowa surowica dla koniBiowestS0960-500 
Filtropur S 0.2Sarstedt83.1826.001 
Marka rybacka  Sonikator Q500 z sondąFisherbrand12893543 
FlexAnalysisBrucker  
Fluorescencyjny nośnik montażowyAgilentS3023 
Kwas mrówkowySigma-Aldrich695076 
Siatki miedziane powlekane węglem Agarscientific LtdAGS162-3 
GlukozaSigma-AldrichG8769 
Aldehyd glutarowySigma-Aldrich340855 
Hoechst 33342Euromedex17535-AAT 
IdoacetamidSigma-AldrichI1149 
InstantBlue Coomassie Barwnik BiałkowyExpedeonISB1L 
Mikroskop światła odwróconego CKX53Olympus  
L-glutaminaGibco25030-024 
LabTek II 8 dołków  Nunc154534 
Laemmli 2xBio-Rad1610737 
LamininCorning354232 
Oprogramowanie MaxQuant (oprogramowanie do identyfikacji białek)  https://maxquant.net/maxquant/
Czołg podstawowy Polska StalBrucker8268711 
MEM 10xGibco21090-022 
MetylocelulozaSigma-AldrichM6385-100G 
MiliQ wodaMerck Millipore  
Rejestracja mlekaREGILAIT300 
Pionowe ogniwo do elektroforezy Mini PROTEANBio-Rad1658000FC 
Kolumna MonoP FPLCGE Healthcare Nie jest już dostępny
Nanosight NS300Malvern PanalyticalNS300 
Oprogramowanie NanoSight NTA v3.2Malvern Panalytical  
Pompa strzykawkowa NanoSightMalvern Panalytical  
NeuropodstawowyGibco21103-049 
Membrana nitrocelulozowaGE Healthcare10600007 
Nonidet P-40Fluka56741 
Nunc wielotalerzowy 24 dołkiThermoFisher82.1473 
ParaformaldehydElektromikroskopia Nauka15713 
Linia komórkowa PC-12ATCCATCC CRL-1721 
Penicylina-StreptomycynaGibco15140-122 
Mieszanka kalibracyjna peptydówLaserBio LabsC101 
Peroksydaza AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch115-035-003 
Oprogramowanie Perseus (Przetwarzanie zidentyfikowanych białek)  https://maxquant.net/perseus/
Koniugat falloidyny-tetrametylorodaminySanta-cruzsc-362065 
Fluorek fenylometanosulfonyluSigma-Aldrich78830 
Bufor fosforanowy SolankaInvitrogen14190094bez wapnia, bez magnezu
pluriSitko M/ 60 µ mpluriSelect43-50060 
Poli-D-lizynaSigma-AldrichP6407 
Probówki wirówkowe z poliwęglanuBeckman Coulter355651 
Inhibitor proteazySigma-AldrichS8830-20TAB 
Systemy komórkowePureCol5005 
Spektrometr masowy Q-ExactiveThermoFisher  
spektrometr masowy rapifleXBrucker  
Neurony korowe szczuraZastosowania komórkoweR882N-20Pochodzenie komórkowe : Pochodzące z kory mózgowej dnia 18 embrionalne mózgi szczurów Sprague Dawley
Makrofagi szczurów i Pożywka do hodowli mikrogleju ZastosowaniakomórkoweR620K-100Orgina komórkowa: Normalna zdrowa Szpik kostny
Szczur Pierwotne makrofagiZastosowania komórkoweR8818-10a 
Pierwotny mikroglej szczuraLonzaRG535 
Sepharose CL-2BGE Healthcare17014001 
Zmodyfikowana trypsyna klasy sekwencjonowaniaPromegaV5111 
Zjeżdżalniakurzu100204 
Chlorek soduScharlauSO0227 
Dodecylosiarczan soduSigma-AldrichL3771 
Fluorek soduSigma-AldrichS7920-100G 
Wodorotlenek soduScharlabSO0420005P 
Pirofosforan soduSigma-AldrichS6422-100G 
Koncentrator próżniowy SpeedVacThermoFisher  
Oprogramowanie łańcuchowe (funkcjonalne sieci asocjacyjne białek)  https://string-db.org/
Podłoże SuperSignal West Dura o wydłużonym czasie trwaniaThermoFisher34075 
Strzykawka 1,0 mlTerumo8SS01H1 
Półsucha komórka transferowa Trans-Blot SDBio-Rad1703940 
Kwas trifluorooctowySigma-AldrichT6508 
TrisInterchimUP031657 
Tris-GlycineEuromedexEU0550 
Tween 20Sigma-AldrichP2287 
Redlica ultrawirówkowaBeckmanA95765 
Wirnik ultrawirówkowy 70,1 TiBeckman Coulter342184 
Octan uranyluAgar Scientific LtdAGR1260A 
Bibuła filtracyjna WhatmanSigma-AldrichWHA10347510 
&alfa;-Kwas cyjano-4-hydroksycynamonowySigma-AldrichC2020-25G 
do

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thion, M. S., Ginhoux, F., Garel, S. Microglia and early brain development: An intimate journey. Science. 362 (6411), 185-189 (2018).
  2. Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330<....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Extracellular VesiclesImmune CellsUltracentrifugationSize Exclusion ChromatographyNanoparticle Tracking AnalysisWestern BlotProteomics AnalysisNeurite OutgrowthGlioma Cell InvasionMicroglia derived EVs

Related Articles