Celem tego protokołu jest stworzenie modelu 3D in vitro do badania różnicowania fibroblastów związanych z rakiem (CAF) w środowisku podobnym do masy guza, które mogą być adresowane w różnych systemach analizy, takich jak immunofluorescencja, analiza transkrypcyjna i obrazowanie żywych komórek.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Model sferoidalny 3D jako bardziej fizjologiczny system do różnicowania i inwazji fibroblastów związanych z rakiem w badaniach in vitro
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Zdefiniowanie idealnego modelu do badania in vitro jest niezbędne, głównie w przypadku badań nad procesami fizjologicznymi, takimi jak różnicowanie komórek. W zrębie guza fibroblasty gospodarza są stymulowane przez komórki rakowe do różnicowania. W ten sposób nabywają fenotyp, który przyczynia się do mikrośrodowiska guza i wspomaga progresję guza. Korzystając z modelu sferoidalnego, stworzyliśmy taki system modeli 3D in vitro, w którym przeanalizowaliśmy rolę lamininy-332 i jej integryny receptorowej α3β1 w tym procesie różnicowania. Ten sferoidalny system modelowy nie tylko odtwarza warunki mikrośrodowiska guza w dokładniejszy sposób, ale jest również bardzo wszechstronnym modelem, ponieważ umożliwia różne dalsze badania, takie jak barwienie immunofluorescencyjne zarówno markerów wewnątrzkomórkowych, jak i zewnątrzkomórkowych, a także zdeponowanych białek macierzy zewnątrzkomórkowej. Ponadto za pomocą tego modelu można badać analizy transkrypcyjne za pomocą qPCR, cytometrii przepływowej i inwazji komórkowej. W tym miejscu opisujemy protokół modelu sferoidalnego w celu oceny roli integryny α3β1 CAF i jej ektopowo zdeponowanego liganda, lamininy-332, w różnicowaniu i wspieraniu inwazji komórek raka trzustki.
Wprowadzenie
Mikrośrodowisko guza to bardzo złożona nisza i niezwykle ważna dla utrzymania i rozwoju komórek nowotworowych1. Tworzą go nie tylko komórki nowotworowe, ale także fibroblasty zrębu. Komórki nowotworowe są otoczone zrębem, który jest specyficzny i różni się od zrębu normalnych tkanek2. Laminina-332 jest białkiem macierzy zewnątrzkomórkowej eksprymowanym ektopowo w zrębie różnych nowotworów, takich jak gruczolakorak trzustki3. Co więcej, skład biochemiczny ECM, a także jego właściwości biofizyczne, takie jak sztywność i napięcie, zmieniają się w obrębie guza bulk4. Ten zrąb n....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Sferoidy 3D jako model in vitro różnicowania fibroblastów/CAF z wykorzystaniem różnych związków hamujących oddziaływanie komórka-macierz za pośrednictwem TGF-β1
- Wymieszać 1 część roztworu metylocelulozy o stężeniu 6 mg/mL i 3 części pożywki do hodowli komórkowej MEM uzupełnionej o 1% inaktywowanej ciepłem płodowej surowicy bydlęcej (FBS) oraz 1% penicyliny/streptomycyny, aby otrzymać roztwór do formowania sferoidów.
- Resuspendować świeżo rozmrożone unieśmiertelnione normalne fibroblasty (iNFs), unieśmiertelnione CAF (iCAFs) lub iCAF z knock-outem integryny α3β1 KO (pasaż do 25) w roztworze do formowania sferoidów. Przygotowując jedną płytkę 96-....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Wyniki tego projektu eksperymentalnego zostały opublikowane w pracy Martins Cavaco et al.13, która jest zalecana do dalszej lektury w celu zapoznania się z wnioskami wyciągniętymi z tych eksperymentów.
Rysunek 1, reprezentatywny obraz immunofluorescencyjny sferoidu, przedstawia barwienie immunocytochemiczne podjednostki α3 integryny zarówno w unieruchomionych prawidłowych fib.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opracowanie odpowiedniego modelu in vitro do badania różnicowania CAF jest trudnym zadaniem. Po zastosowaniu różnych podejść doszliśmy do wniosku, że model sferoidalny 3D jest bardziej praktycznym, fizjologicznym i klinicznie istotnym modelem, w którym można badać wzajemne oddziaływanie między komórkami raka trzustki z unieśmiertelnionymi CAF. Model ten zapobiegał spontanicznemu różnicowaniu się fibroblastów ze względu na artefaktowe czynniki stresogenne, takie jak sztywność plastyczności hodowli komórkowej, przynajmniej.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak konfliktu interesów. Niniejszy materiał odzwierciedla jedynie poglądy autora, a Unia Europejska nie ponosi odpowiedzialności za jakiekolwiek wykorzystanie zawartych w nim informacji.
Podziękowania
Dziękujemy za pomoc Barbary Schedding w przygotowaniu BM2 i lebein-1. Dziękujemy Àgnes Noel za podzielenie się swoją wiedzą specjalistyczną w zakresie testów sferoidalnych. Dziękujemy Sonji Schelhaas i Michaelowi Schäfersowi za pomoc w leczeniu transfekcji lentiwirusowej w warunkach S2. Dziękujemy Sabine von Rüden za pomoc w przygotowaniu CAF z tkanki raka trzustki.
Badania prowadzące do tych wyników otrzymały finansowanie z Programu Ludzie (Działania Marie Curie) Siódmego Programu Ramowego Unii Europejskiej FP7/2007-2013/ na podstawie umowy o grant REA n◦ (316610) dla J.A.E. Ponadto, J.A.E. i A.C.M.C. były wspierane finansowo przez Deutsch....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 4',6-diamidyn-2-fenyloindol, dichlorowodorek (DAPI) | SIGMA-ALDRICH | D9542-10 | |
| 6F12 anty-Laminina i beta; 3 podjednostka Mysz (monoklonalna) | Domowa | ||
| A3IIF5 Anti-α 3 podjednostka integryny Mysz (monoklonalna) | Uprzejmie dostarczone przez prof. M. Hemlera, Dana Faber-Cancer Institute, Boston | ||
| Aceton | SIGMA-ALDRICH | 32201 | |
| Frakcja albuminy V - BSA | AppliChem | A1391 | |
| Alexa fluor 488 Koza (poliklonalna) anty-Mouse | Invitrogen | A11029 | |
| Alexa fluor 488 Koza (poliklonalna) Królik | Invitrogen | A11034 | |
| Anty-laminina i gamma; 2 podjednostka Mysz (monoklonalna) | Santa Cruz | sc-28330 | |
| Anti-NG2 Królik (poliklonalny) Millipore, AB5320 | Milipor | AB5320 | |
| Mysz anty-&alfa;-SMA-Cy3 (monoklonalna) | SIGMA-ALDRICH | C6198 | |
| Linia komórkowa AsPC-1 | ATCC | Uprzejmie udzielone przez prof. Jörga Haiera Wirówka | |
| laboratoryjna | Fisher Scientific | 50-589-620 | Kiełki |
| BM2 anty-laminina α 3 podjednostka Mysz (monoklonalna) | Uprzejmie dostarczone przez prof. Patricię Rousselle, CNRS, Lyon | ||
| Chlorek wapnia (CaCl2) | Fluka | 21074 | |
| Wirówka | Thermo Scientific | Multifuge 1S-R | |
| Probówki wirówkowe 50 ml | Corning | 430290 | |
| Kolagenaza B | Roche | 11088831001 | |
| Collagen-I, ogon szczura | Gibco | A10483-01 | |
| Mikroskop konfokalny | Zeiss | LSM 700 i 800 | |
| DMEM (wysoka glukoza 4,5 g/L) | Lonza | BE12-604F | |
| Dnaza I | |||
| BD Biosciences | FACSCaliburTM | ||
| Matryca żelująca | ThermoFisher Scientific | A1413202 | Matrigel, Geltrex |
| Goat IgG, izotyp | DAKO | X 0907 | |
| Surowica końska | SIGMA-ALDRICH | 12449-C | |
| Ludzkie pierwotne fibroblasty trzustkowe | PELOBiotech | PB-H-6201 | |
| Inkubator | Heraeus | B6060 | |
| Laminin-332 | Biolamina | LN332 | |
| MEM | SIGMA-ALDRICH | M4655 | |
| Mikropłytka, 96 dołków, U-bottom | Greiner Bio-One | 650101 | |
| Szkiełka mikroskopowe | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Mouse IgG, izotyp | SIGMA-ALDRICH | I8765 | |
| Wieloosiowy mieszalnik obrotowy | CAT | RM5 80V | |
| PANC-I | ATCC | Uprzejmie udzielone przez prof. Jörga Laboratorium Haiera | |
| Paraformaldehyd | Riedel-de Haë n | 16005 | |
| Penicylina/streptomycyna | Gibco | 15140-122 | |
| Zestaw do odwrotnej transkrypcji QuantiTect | Qiagen | 205310 | |
| Rat IgG, izotyp | Invitrogen | 10700 | |
| Probówki reakcyjne, 1,5 ml | Greiner Bio-One | 616201 | |
| Cykler do PCR w czasie rzeczywistym | Qiagen | Rotor-Gene Q | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Rotor Gene SYBR Green PCR Kit | Qiagen | 204074 | |
| RPMI | Lonza | BE12-702F | Dodaj glukozę do 4,5 g (filtr 0,2 um) i 1% pirogronianu sodu |
| TritonX-100 | SIGMA-ALDRICH | X100RS | |
| Vó rtex | Scientific Industries | Vortex-Genie 2 | |
| μ-Slide Angiogeneza, niepowlekany | Ibidi | 81501 |
Bibliografia
- Pietilä, M., Ivaska, J., Mani, S. A. Whom to blame for metastasis, the epithelial-mesenchymal transition or the tumor microenvironment? Cancer Letters. 380 (1), 359-368 (2016).
- Heldin, C. -H., Rubin, K., Pietras, K., Ostman, A. High inters....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
