Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Model sferoidalny 3D jako bardziej fizjologiczny system do różnicowania i inwazji fibroblastów związanych z rakiem w badaniach in vitro

8.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60122

⸱

8 sierpnia 2019

 , 
1Institute of Physiological Chemistry and Pathobiochemistry, University of Münster, 2Instituto de Medicina Molecular, Lisbon

W tym artykule

Podsumowanie

Celem tego protokołu jest stworzenie modelu 3D in vitro do badania różnicowania fibroblastów związanych z rakiem (CAF) w środowisku podobnym do masy guza, które mogą być adresowane w różnych systemach analizy, takich jak immunofluorescencja, analiza transkrypcyjna i obrazowanie żywych komórek.

Streszczenie

Zdefiniowanie idealnego modelu do badania in vitro jest niezbędne, głównie w przypadku badań nad procesami fizjologicznymi, takimi jak różnicowanie komórek. W zrębie guza fibroblasty gospodarza są stymulowane przez komórki rakowe do różnicowania. W ten sposób nabywają fenotyp, który przyczynia się do mikrośrodowiska guza i wspomaga progresję guza. Korzystając z modelu sferoidalnego, stworzyliśmy taki system modeli 3D in vitro, w którym przeanalizowaliśmy rolę lamininy-332 i jej integryny receptorowej α3β1 w tym procesie różnicowania. Ten sferoidalny system modelowy nie tylko odtwarza warunki mikrośrodowiska guza w dokładniejszy sposób, ale jest również bardzo wszechstronnym modelem, ponieważ umożliwia różne dalsze badania, takie jak barwienie immunofluorescencyjne zarówno markerów wewnątrzkomórkowych, jak i zewnątrzkomórkowych, a także zdeponowanych białek macierzy zewnątrzkomórkowej. Ponadto za pomocą tego modelu można badać analizy transkrypcyjne za pomocą qPCR, cytometrii przepływowej i inwazji komórkowej. W tym miejscu opisujemy protokół modelu sferoidalnego w celu oceny roli integryny α3β1 CAF i jej ektopowo zdeponowanego liganda, lamininy-332, w różnicowaniu i wspieraniu inwazji komórek raka trzustki.

Wprowadzenie

Mikrośrodowisko guza to bardzo złożona nisza i niezwykle ważna dla utrzymania i rozwoju komórek nowotworowych1. Tworzą go nie tylko komórki nowotworowe, ale także fibroblasty zrębu. Komórki nowotworowe są otoczone zrębem, który jest specyficzny i różni się od zrębu normalnych tkanek2. Laminina-332 jest białkiem macierzy zewnątrzkomórkowej eksprymowanym ektopowo w zrębie różnych nowotworów, takich jak gruczolakorak trzustki3. Co więcej, skład biochemiczny ECM, a także jego właściwości biofizyczne, takie jak sztywność i napięcie, zmieniają się w obrębie guza bulk4. Ten zrąb nowotworowy lub "zrąb reaktywny" jest spowodowany adaptacją fibroblastów do sąsiednich komórek rakowych oraz rekrutacją innych bardzo ważnych graczy, którzy tworzą korzystne i wspierające środowisko dla progresji guza. Różnicowanie fibroblastów zrębu prowadzi do powstania fibroblastów związanych z rakiem (CAF). Komórki te można zidentyfikować za pomocą różnych markerów, takich jak aktyna mięśni gładkich α (αSMA)5 lub antygen neuronalny/glejowy 2 (NG2)6.

Najbardziej odpowiedni model in vitro do podsumowania mikrośrodowiska guza (TME) za pomocą CAF jest trudny do wyboru. W przypadku takiego systemu modelowego należy rozważyć metodę naśladowania parametrów fizjologicznych TME w sposób opłacalny i powtarzalny. W obrębie TME zachodzą różne procesy, takie jak proliferacja, różnicowanie, migracja i inwazja różnych typów komórek. Te procesy komórkowe można wykonywać indywidualnie różnymi metodami. Jednak warunki eksperymentalne muszą uwzględniać interakcje komórkowe z ECM zrębu guza, ponieważ sztywność podłoża wpływa na proces różnicowania CAF. R.G. Wells wypowiedział się na temat wpływu sztywności matrycy na zachowanie komórek i podkreślił, że organizacja cytoszkieletu i status różnicowania obserwowany w komórkach hodowanych in vitro może być sztuczny7. Wydaje się, że różne bodźce są zaangażowane w różnicowanie CAF, w tym napięcie mechaniczne5,7. Aby tego uniknąć, miękkie podłoża 2D mogą być możliwymi podejściami do badań różnicowania, ponieważ omijają one problem sztywnego plastiku w naczyniach hodowlanych. Miękką powierzchnią 2D, na której mogą rosnąć fibroblasty, mogą być żele poliakrylamidowe pokryte kolagenem I, przy czym sztywnością żelu można manipulować za pomocą stężenia poliakrylamidu i środka sieciującego żel. Adhezja i tworzenie włókien naprężeniowych bogatych w αSMA jest zwiększona w fibroblastach wraz ze sztywnością żelu8. Wyniki te podkreślają znaczenie rusztowań z miękkim podłożem dla bardziej fizjologicznych modeli różnicowania in vitro. Jednak w naszych rękach eksperymentalna odtwarzalność i obrazowanie tych żeli były wyzwaniem. Aby przezwyciężyć te niedociągnięcia, zmieniliśmy system miękkiego podłoża 2D na model sferoidalny 3D do badań różnicowania i inwazji. Model ten jest bardziej istotny klinicznie i, podobnie jak organoid in vitro, podsumowuje in vivo interakcje komórka-komórka, produkcję i depozycję ECM, a także zachowanie komórki9.

sferoidy powstają, gdy komórkom brakuje podłoża, do którego mogłyby się przyczepić. Kiedy komórki pozostają bez powierzchni adhezyjnej, agregują się, tworząc mniej lub bardziej kulistą strukturę. Jeśli sferoidy składają się z jednego typu komórki, nazywa się je homosferoidami; Jeśli składają się z dwóch lub więcej różnych typów komórek, tworzą heterosferoidy.

Wśród różnych metod przygotowania sferoidów, wykonujemy protokół przy użyciu nieprzylegających 96-dołkowych płytek z okrągłym dnem. Jest bardzo skuteczny pod względem kosztów. Tutaj produkujemy zarówno homosferoidy fibroblastów, CAF lub CAF pozbawione podjednostki integryny α3 w celu zbadania procesu różnicowania oraz heterosferoidy CAF lub integryny α3 KO CAF i komórek raka przewodu trzustkowego (AsPC-I i PANC-I) w celu zbadania inwazji do otaczającej macierzy.

Celem tych badań było użycie pierwotnych CAF wyizolowanych z biopsji ludzkiego raka trzustki. Jednak biopsje w celu uzyskania komórek są rzadkie i z tego powodu CAF użyte w tych badaniach zostały unieśmiertelnione przy użyciu lentiwirusa zawierającego HTERT. Nazywa się je iCAF, a ich normalne odpowiedniki, pierwotne ludzkie fibroblasty trzustki, są określane jako iNF. Ludzkie fibroblasty trzustki i komórki raka przewodu trzustkowego, AsPC-I i PANC-I, są dostępne na rynku.

Ten protokół został wykorzystany do zbadania wpływu interakcji laminina-332-integryna w procesie różnicowania CAF. Aby udowodnić swoistość tej interakcji i jej funkcję, zastosowano związki inhibitorowe: BM2, przeciwciało monoklonalne, które blokuje miejsce wiązania integryny łańcuch lamininy-332 α310, lub lebein 1, związek pochodzący z jadu węża, który blokuje integryny wiążące lamininy α3β1, α6β1 i α7β111, 12.

Do testu inwazji, komórki zostały transdukowane lentiwirusem zawierającym cDNA kodujące mCherry (iCAFs i integryna α3 KO iCAF) lub GFP (AsPC-I i PANC-I) w celu rozróżnienia różnych typów komórek w heterosferoidach. Transdukcja komórek w celu ich unieśmiertelnienia i/lub oznaczenia ekspresją białka fluorescencyjnego (mCherry i GFP) została opisana w poprzednim badaniu13, z którym należy się zapoznać w celu uzyskania dalszych informacji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Sferoidy 3D jako model in vitro różnicowania fibroblastów/CAF z wykorzystaniem różnych związków hamujących oddziaływanie komórka-macierz za pośrednictwem TGF-β1

  1. Wymieszać 1 część roztworu metylocelulozy o stężeniu 6 mg/mL i 3 części pożywki do hodowli komórkowej MEM uzupełnionej o 1% inaktywowanej ciepłem płodowej surowicy bydlęcej (FBS) oraz 1% penicyliny/streptomycyny, aby otrzymać roztwór do formowania sferoidów.
  2. Resuspendować świeżo rozmrożone unieśmiertelnione normalne fibroblasty (iNFs), unieśmiertelnione CAF (iCAFs) lub iCAF z knock-outem integryny α3β1 KO (pasaż do 25) w roztworze do formowania sferoidów. Przygotowując jedną płytkę 96-dołkową, należy przygotować nadmiar roztworu do formowania sferoidów, tj. 10 mL, i dodać 75 000 komórek, pamiętając, że każdy sferoid składa się z 750 komórek, a do każdego dołka płytki dystrybuuje się 100 µL.
  3. Jeśli w badaniu uwzględniono cytokiny lub inhibitory integryn, należy dodać te związki do zawiesiny komórkowej, aby zostały one włączone do sferoidów podczas ich formowania. Należy pamiętać, że iNFs są stymulowane 10 ng/mL TGF-β1 w celu wywołania różnicowania. W razie potrzeby dodać związki inhibitorowe wraz z TGF-β1, takie jak 20 µg/mL BM2 lub 10 µg/mL lebeiny 1.
  4. Homosferoidy CAF przygotować w ten sam sposób, ale bez stymulacji TGF-β1, ponieważ są one już zróżnicowane. Homosferoidy CAF z KO integryny α3 przygotować bez dodatku jakichkolwiek związków.
  5. Rozdzielić roztwór do formowania sferoidów na 96-dołkową płytkę z okrągłym dnem, dodając 100 µL roztworu do każdego dołka. Przy każdym rozdzielaniu roztworu sferoidów do dołków należy go dobrze wymieszać poprzez kilkukrotne pipetowanie w górę i w dół.
  6. Umieścić płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowej na 24 h, aby w każdym dołku uformował się jeden sferoid.
  7. Zebrać sferoidy po około 24 h i wykorzystać je do różnych dalszych analiz: barwienia immunofluorescencyjnego, RT q-PCR i cytometrii przepływowej. Do wykrywania ekspresji antygenów wewnątrz- i zewnątrzkomórkowych, w tym odkładania białek ECM wewnątrz sferoidu, należy zastosować barwienie immunofluorescencyjne. Po dezintegracji sferoidów do pojedynczych komórek, ilościowo określić receptory zakotwiczone w błonie za pomocą cytometrii przepływowej. W celu wykrycia aktywacji genów i zmian transkrypcyjnych należy zastosować RT q-PCR mRNA wyizolowanego z komórek sferoidu.

2. Barwienie immunofluorescencyjne sferoidów

  1. Zebrać sferoidy po około 24 h do jednej probówki reakcyjnej o pojemności 1,5 mL na warunek eksperymentalny lub na analizowane białko. Na przykład sferoidy iNF stymulowane TGF-β1 należy umieścić w probówce oddzielnej od kontrolnych iNF, które nie były traktowane. Aby uniknąć rozerwania sferoidów wskutek zbyt silnych sił ścinających, należy odciąć koniec końcówki pipety, aby powiększyć otwór. W jednej probówce reakcyjnej należy umieścić co najmniej 5-10 sferoidów, aby umożliwić wykonanie powtórzeń i uwzględnić możliwe straty podczas etapów płukania.
  2. Odwirować sferoidy w wirówce stołowej przez około 30-60 s przy 1,000 x g. Ostrożnie usunąć zawierający metylocelulozę nadsącz za pomocą pipety, nie naruszając osadu sferoidów.
  3. Przepłukać 50 µL 1x PBS. Powtórzyć etap wirowania i ostrożnie usunąć PBS za pomocą pipety, zgodnie z opisem w punkcie 2.2.
  4. W zależności od białka podlegającego barwieniu, utrwalić sferoidy za pomocą 50 µL 4% paraformaldehydu w PBS przez 20 minut w temperaturze pokojowej (dla αSMA, NG2 i integryny α3β1) lub 50 µL metanolu przez 10 min w temperaturze -20 °C (dla podjednostek lamininy-332).
  5. Powtórzyć etap płukania, jak opisano w krokach 2.2-2.3.
  6. Przeprowadzić permeabilizację komórek za pomocą 0,1% Triton-X w PBS przez 4 min w temperaturze pokojowej.
  7. Powtórzyć etap płukania, jak opisano w krokach 2.2-2.3, trzykrotnie.
  8. Inkubować sferoidy w PBS zawierającym 5% FBS i 2% BSA przez 1 h w temperaturze pokojowej w celu zablokowania nieswoistych miejsc wiązania białek.
  9. Inkubować sferoidy z 30 µL przeciwciał pierwszorzędowych w PBS, 2,5% FBS i 1% BSA w temperaturze 4 °C przez noc. Wykorzystano następujące przeciwciała pierwszorzędowe: anty-αSMA sprzężone z Cy-3 oraz anty-NG2 w stężeniu 5 µg/mL; BM2 anty-laminina α3, 6F12 anty-laminina β3 oraz anty-laminina γ2 w stężeniu 20 µg/mL.
  10. Powtórzyć etap płukania, jak opisano w krokach 2.2-2.3, trzykrotnie.
  11. Inkubować sferoidy z 30 µL przeciwciał wtórnych w PBS, 2,5% FBS i 1% BSA w temperaturze pokojowej przez 90 min. Wykorzystano następujące przeciwciała wtórne: Alexa 488 anty-królicze oraz anty-mysie (5 µg/mL).
  12. Powtórzyć etap płukania, jak opisano w krokach 2.2-2.3, trzykrotnie.
  13. Inkubować komórki z 30 µL roztworu barwiącego DAPI przez 4 min w temperaturze pokojowej.
  14. Powtórzyć etap płukania, jak opisano w krokach 2.2-2.3.
  15. Za pomocą szklanej pipety Pasteura nanieść sferoidy na szkiełko przedmiotowe w kropli PBS.
  16. Wykonać obrazowanie sferoidów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w konfokalnym mikroskopie laserowym przy powiększeniu 10x. Wykonać różne przekroje optyczne sferoidu w różnych płaszczyznach optycznych stosu z (z-stack, 15-20 płaszczyzn). W celu ustalenia ustawień lasera w mikroskopie należy użyć sferoidu złożonego z komórek negatywnych pod kątem badanego antygenu lub sferoidu zabarwionego tylko przeciwciałem wtórnym. Te same ustawienia należy zastosować dla wszystkich porównywanych próbek.
  17. Przeanalizować obrazy mikroskopowe za pomocą oprogramowania ImageJ zgodnie z wcześniejszą publikacją14. Kroki te podsumowano na Rysunku uzupełniającym 1. Jako tło wyznaczyć zintegrowaną gęstość sygnału w wolnym od komórek obszarze zainteresowania (ROI). Obliczyć całkowitą skorygowaną fluorescencję komórkową (TCCF) według wzoru:
    Równanie TCCF dla analizy danych fluorescencyjnych: zintegrowana gęstość sygnału na schemacie mikroskopowym.
  18. Wyznaczyć całkowitą skorygowaną fluorescencję (TCF) sferoidów jako TCCF znormalizowaną do powierzchni sferoidu i liczby płaszczyzn stosu.
    Wzór na statyczną równowagę TCF, przedstawiający relację powierzchni sferoidu, schemat edukacyjny.

3. RT q-PCR homosferoidów

  1. Aby przeprowadzić RT-qPCR, zebrać co najmniej 288 sferoidów (odpowiadających trzem płytkom 96-dołkowym) do probówki reakcyjnej o pojemności 50 mL. Wirować przez 5 min przy 1 000 x g i ostrożnie usunąć supernatant zawierający metylocelulozę za pomocą pipety, nie naruszając osadu sferoidów.
  2. Przemyć 1 mL 1x PBS i przenieść sferoidy do probówki reakcyjnej o pojemności 1,5 mL. Wirować sferoidy w wirówce stołowej przez około 30-60 s przy 1 000 x g. Ostrożnie usunąć PBS za pomocą pipety, nie naruszając osadu sferoidów.
  3. Dysocjować sferoidy w 250 µL roztworu zawierającego 4 mg/mL kolagenazy B, 50 µg/mL DNazy I, 2% BSA oraz 1 mM CaCl2 w PBS w temperaturze 37 °C przez około 30-45 min, delikatnie mieszając na wortexie i uruchamiając go przerywanie przez kilka sekund co 5 min.
  4. Powtórzyć etap płukania zgodnie z opisem w kroku 3.2.
  5. Wyizolować całkowite RNA z komórek zdezintegrowanych sferoidów przy użyciu komercyjnego zestawu do izolacji RNA, zgodnie z instrukcjami producenta.
  6. Przeprowadzić odwrotną transkrypcję wyizolowanego mRNA do cDNA za pomocą komercyjnego zestawu, zgodnie z instrukcjami producenta.
  7. Ilościowo określić poziomy transkrypcji w powtórzeniach metodą PCR w czasie rzeczywistym. Użyto następujących starterów: α-SMA: Fw 5′-CCGACCGAATGCAGAAG GA-3′, Rev 5′ ACAGAGTATTTGCGCTCCGAA-3′15; łańcuch lamininy α3: Fw 5′-GCTCAGCTGTTTGTGGTTGA-3′, Rev 5′-TGTCTGCATCTGCCAATAGC-3′16; łańcuch lamininy β3: Fw 5′-GGCAGATGATTAGGGCAGCCGAGGAA-3′ Rev 5′-CGGACCTGCTGGATTAGGAGCCGTGT-3′17; łańcuch lamininy γ2: Fw 5′-GATGGCATTCACTGCGAGAAG-3′ Rev 5′-TCGAGCACTAAGAGAACCTTTGG-3′ 16; NG2: Fw 5′-CTGCAGGTCTATGTCGGTCA-3′ Rev 5′-TTGGCTTTGACCCTGACTATG-3′18; podjednostka integryny α3: Fw 5’-AGGGGACCTTCAGGTGCA-3’ Rev 5’-TGTAGCCGGTGATTTACCAT-3’19; TOP-1: Fw 5′-CCAGACGGAAGCTCGGAAAC-3′ Rev 5′-GTCCAGGAGGCTCTATCTTGAA-3′20.
  8. Skorygować wartości Ct względem wartości Ct endogennego genu referencyjnego, takiego jak TOP-1, stosując równanie: 2- ΔΔCt. ΔΔCt = ΔCt (próbka badana) – ΔCt (próbka referencyjna), a ΔCt = Ct genu badanego lub genu referencyjnego – TOP-I.

4. Analiza ekspresji integryn metodą cytometrii przepływowej

  1. Do analizy cytometrycznej zbierz co najmniej 288 sferoidów (co odpowiada trzem płytkom 96-dołkowym) do probówki reakcyjnej o pojemności 50 mL. Wirować przez 5 min przy 1 000 x g i ostrożnie usunąć pipetą nadsącz zawierający metylocelulozę.
  2. Przemyć 1 mL 1x PBS i przenieść sferoidy do probówki reakcyjnej o pojemności 1,5 mL. Powtórzyć etap wirowania i ostrożnie usunąć PBS za pomocą pipety.
  3. Rozdysocjować sferoidy zgodnie z opisem w kroku 3.3.
  4. Powtórzyć etap przemywania, jak wyjaśniono w kroku 4.2.
  5. Aby zablokować nieswoiste miejsca wiązania i zapobiec wiązaniu przeciwciał detekcyjnych z receptorami Fcγ (CD16, CD32 i CD64), inkubować komórki w 100 µL PBS zawierającego 2% surowicy konia (lub surowicy innego gatunku zwierzęcia, którego przeciwciała nie będą używane w eksperymencie) oraz 0,1% BSA przez 20 min w 4 °C w rotacji.
  6. W przypadku barwienia markerów wewnątrzkomórkowych, utrwalić/permeabilizować komórki zgodnie z opisem w krokach 2.2-2.5.
  7. Inkubować komórki z przeciwciałami pierwszorzędowymi w 100 µL PBS zawierającego 2% surowicy konia i 0,1% BSA przez 30 min w 4 °C w rotacji. Rozcieńczyć przeciwciało pierwszorzędowe do stężenia 10 µg/mL.
  8. Przemyć trzykrotnie 100 µL PBS + 0,1% BSA, stosując pomiędzy etapami wirowanie w wirówce nakładkowej przy 1 000 x g.
  9. Inkubować komórki z przeciwciałami drugorzędowymi w 100 µL PBS zawierającego 2% surowicy konia i 0,1% BSA przez 30 min w 4 °C w rotacji. Rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe do stężenia 10 µg/mL.
  10. Powtórzyć etap przemywania, jak wyjaśniono w kroku 4.7.
  11. Przeanalizować 2,0 x 104 zabarwionych komórek za pomocą cytometru przepływowego. Wyznaczyć bramkę dla pojedynczych żywych komórek za pomocą wykresu kropkowego FSC-SSC i przeanalizować fluorescencję wybranych komórek na kanale odpowiednim dla zastosowanego fluoroforu.

5. Test inwazyjności z użyciem heterosferoidów

  1. Przygotować roztwór do tworzenia sferoidów dla heterosferoidów, zawierający różne typy komórek i odpowiadające im pożywki, zgodnie z podsumowaniem w Tabeli 1. Komórki zostały wcześniej transdukowane lentiwirusem zawierającym wektory dla ekspresji mCherry lub GFP.
  2. Napełnić każdą studzienkę płytki 100 µL roztworu do tworzenia sferoidów i inkubować płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych przez 24 h, aby umożliwić utworzenie jednej sferoidu w każdej studzience.
  3. Przygotować w probówce reakcyjnej o pojemności 1,5 mL 60 µL mieszaniny matrycy żelatynowej zawierającej 2 mg/mL kolagenu I z ogona szczura, 30% komercyjnej matrycy żelującej i 2,5 µg/mL lamininy-332. Szybko rozdzielić po 15 µL do 3 studzienek komory angiogenezy µ-slide. Osadzić jeden sferoid w każdej studzience zawierającej już żel.
  4. W razie potrzeby szybko skorygować położenie sferoidu do centrum studzienki za pomocą pipety pod mikroskopem.
  5. Powtórzyć kroki 5.2-5.3 dla kolejnych heterosferoidów, a następnie ponownie dla homosferoidów.
  6. Inkubować żele w inkubatorze przez 1 h do momentu zestalenia, a następnie delikatnie przykryć żele pożywką do hodowli komórkowych.
  7. Wykonać obrazowanie sferoidów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w konfokalnym mikroskopie skaningowym. Wykonać różne przekroje optyczne sferoidu w różnych płaszczyznach optycznych stosu z (z-stack) oraz w różnych punktach czasowych inwazji (np. 0 h, 24 h, 48 h i 72 h).
  8. Przeanalizować obrazy, licząc liczbę naciekających komórek nowotworowych. Za komórki naciekające uznaje się te, które opuściły sferoid i weszły w obszar inwazyjny. Obszar inwazyjny definiuje się jako obszar pierścienia pomiędzy obwodem zewnętrznym i wewnętrznym, wyznaczonymi odpowiednio przez najdalej oddaloną naciekającą komórkę oraz granicę sferoidu na początku eksperymentów inwazyjnych, zgodnie z opisem na Rysunku uzupełniającym 2.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wyniki tego projektu eksperymentalnego zostały opublikowane w pracy Martins Cavaco et al.13, która jest zalecana do dalszej lektury w celu zapoznania się z wnioskami wyciągniętymi z tych eksperymentów.

Rysunek 1, reprezentatywny obraz immunofluorescencyjny sferoidu, przedstawia barwienie immunocytochemiczne podjednostki α3 integryny zarówno w unieruchomionych prawidłowych fib...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opracowanie odpowiedniego modelu in vitro do badania różnicowania CAF jest trudnym zadaniem. Po zastosowaniu różnych podejść doszliśmy do wniosku, że model sferoidalny 3D jest bardziej praktycznym, fizjologicznym i klinicznie istotnym modelem, w którym można badać wzajemne oddziaływanie między komórkami raka trzustki z unieśmiertelnionymi CAF. Model ten zapobiegał spontanicznemu różnicowaniu się fibroblastów ze względu na artefaktowe czynniki stresogenne, takie jak sztywność plastyczności hodowli komórkowej, przynajmniej...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów. Niniejszy materiał odzwierciedla jedynie poglądy autora, a Unia Europejska nie ponosi odpowiedzialności za jakiekolwiek wykorzystanie zawartych w nim informacji.

Podziękowania

Dziękujemy za pomoc Barbary Schedding w przygotowaniu BM2 i lebein-1. Dziękujemy Àgnes Noel za podzielenie się swoją wiedzą specjalistyczną w zakresie testów sferoidalnych. Dziękujemy Sonji Schelhaas i Michaelowi Schäfersowi za pomoc w leczeniu transfekcji lentiwirusowej w warunkach S2. Dziękujemy Sabine von Rüden za pomoc w przygotowaniu CAF z tkanki raka trzustki.

Badania prowadzące do tych wyników otrzymały finansowanie z Programu Ludzie (Działania Marie Curie) Siódmego Programu Ramowego Unii Europejskiej FP7/2007-2013/ na podstawie umowy o grant REA n◦ (316610) dla J.A.E. Ponadto, J.A.E. i A.C.M.C. były wspierane finansowo przez Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) w ramach Cells-in-Motion Cluster of Excellence (EXC 1003-CiM). Projekt ten był również wspierany przez Wilhelm Sander Stiftung (grant: 2016.113.1 dla J.A.E.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
4',6-diamidyn-2-fenyloindol, dichlorowodorek (DAPI)SIGMA-ALDRICHD9542-10
6F12 anty-Laminina i beta; 3 podjednostka Mysz (monoklonalna)Domowa
A3IIF5 Anti-α 3 podjednostka integryny Mysz (monoklonalna)Uprzejmie dostarczone przez prof. M. Hemlera, Dana Faber-Cancer Institute, Boston
AcetonSIGMA-ALDRICH32201
Frakcja albuminy V - BSAAppliChemA1391
Alexa fluor 488 Koza (poliklonalna) anty-MouseInvitrogenA11029
Alexa fluor 488 Koza (poliklonalna) KrólikInvitrogenA11034
Anty-laminina i gamma; 2 podjednostka Mysz (monoklonalna)Santa Cruzsc-28330
Anti-NG2 Królik (poliklonalny) Millipore, AB5320MiliporAB5320
Mysz anty-&alfa;-SMA-Cy3 (monoklonalna)SIGMA-ALDRICHC6198
Linia komórkowa AsPC-1ATCCUprzejmie udzielone przez prof. Jörga Haiera Wirówka
laboratoryjnaFisher Scientific50-589-620Kiełki
BM2 anty-laminina α 3 podjednostka Mysz (monoklonalna)Uprzejmie dostarczone przez prof. Patricię Rousselle, CNRS, Lyon
Chlorek wapnia (CaCl2)Fluka21074
WirówkaThermo ScientificMultifuge 1S-R
Probówki wirówkowe 50 mlCorning430290
Kolagenaza BRoche11088831001
Collagen-I, ogon szczuraGibcoA10483-01
Mikroskop konfokalnyZeissLSM 700 i 800
DMEM (wysoka glukoza 4,5 g/L)LonzaBE12-604F
Dnaza I
BD BiosciencesFACSCaliburTM
Matryca żelującaThermoFisher ScientificA1413202Matrigel, Geltrex
Goat IgG, izotypDAKOX 0907
Surowica końskaSIGMA-ALDRICH12449-C
Ludzkie pierwotne fibroblasty trzustkowePELOBiotechPB-H-6201
InkubatorHeraeusB6060
Laminin-332BiolaminaLN332
MEMSIGMA-ALDRICHM4655
Mikropłytka, 96 dołków, U-bottomGreiner Bio-One650101
Szkiełka mikroskopoweThermo ScientificJ1800AMNZ
Mouse IgG, izotypSIGMA-ALDRICHI8765
Wieloosiowy mieszalnik obrotowyCATRM5 80V
PANC-IATCCUprzejmie udzielone przez prof. Jörga Laboratorium Haiera
ParaformaldehydRiedel-de Haë n16005
Penicylina/streptomycynaGibco15140-122
Zestaw do odwrotnej transkrypcji QuantiTectQiagen205310
Rat IgG, izotypInvitrogen10700
Probówki reakcyjne, 1,5 mlGreiner Bio-One616201
Cykler do PCR w czasie rzeczywistymQiagenRotor-Gene Q
RNeasy Mini KitQiagen74104
Rotor Gene SYBR Green PCR KitQiagen204074
RPMILonzaBE12-702FDodaj glukozę do 4,5 g (filtr 0,2 um) i 1% pirogronianu sodu
TritonX-100SIGMA-ALDRICHX100RS
Vó rtexScientific IndustriesVortex-Genie 2
μ-Slide Angiogeneza, niepowlekanyIbidi81501
Cytometr przepływowy Roche 10104159001

Bibliografia

  1. Pietilä, M., Ivaska, J., Mani, S. A. Whom to blame for metastasis, the epithelial-mesenchymal transition or the tumor microenvironment? Cancer Letters. 380 (1), 359-368 (2016).
  2. Heldin, C. -H., Rubin, K., Pietras, K., Ostman, A. High interstitial fluid pressure - an obstacle in cancer therapy. Nature Reviews. Cancer. 4 (10), 806-813 (2004).
  3. Tani, T., et al. Pancreatic carcinomas deposit laminin-5, preferably adhere to laminin-5, and migrate on the newly deposited basement membrane. The American Journal of Pathology. 151 (5), 1289-1302 (1997).
  4. Eble, J. A., Niland, S. The extracellular matrix in tumor progression and metastasis. Clinical & Experimental Metastasis. , (2019).
  5. Tomasek, J. J., Gabbiani, G., Hinz, B., Chaponnier, C., Brown, R. A. Myofibroblasts and mechano-regulation of connective tissue remodelling. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 3 (5), 349-363 (2002).
  6. Sugimoto, H., Mundel, T. M., Kieran, M. W., Kalluri, R. Identification of fibroblast heterogeneity in the tumor microenvironment. Cancer Biology & Therapy. 5 (12), 1640-1646 (2006).
  7. Wells, R. G. The role of matrix stiffness in regulating cell behavior. Hepatology (Baltimore, Md.). 47 (4), 1394-1400 (2008).
  8. Cavaco, A., Rezaei, M., Niland, S., Eble, J. A. Collateral Damage Intended-Cancer-Associated Fibroblasts and Vasculature Are Potential Targets in Cancer Therapy. International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2355(2017).
  9. Mehta, G., Hsiao, A. Y., Ingram, M., Luker, G. D., Takayama, S. Opportunities and challenges for use of tumor spheroids as models to test drug delivery and efficacy. Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 164 (2), 192-204 (2012).
  10. Rousselle, P., Lunstrum, G. P., Keene, D. R., Burgeson, R. E. Kalinin: an epithelium-specific basement membrane adhesion molecule that is a component of anchoring filaments. The Journal of Cell Biology. 114 (3), 567-576 (1991).
  11. Eble, J. A., Bruckner, P., Mayer, U. Vipera lebetina venom contains two disintegrins inhibiting laminin-binding beta1 integrins. The Journal of Biological Chemistry. 278 (29), 26488-26496 (2003).
  12. Kusuma, N., et al. Integrin-dependent response to laminin-511 regulates breast tumor cell invasion and metastasis. International Journal of Cancer. 130 (3), 555-566 (2012).
  13. Martins Cavaco,, C, A., et al. The Interaction between Laminin-332 and α3β1 Integrin Determines Differentiation and Maintenance of CAFs, and Supports Invasion of Pancreatic Duct Adenocarcinoma Cells. Cancers. 11 (1), 14(2019).
  14. Ansari, N., Müller, S., Stelzer, E. H. K., Pampaloni, F. Quantitative 3D cell-based assay performed with cellular spheroids and fluorescence microscopy. Methods in Cell Biology. 113, 295-309 (2013).
  15. Goldberg, M. T., Han, Y. -P., Yan, C., Shaw, M. C., Garner, W. L. TNF-alpha suppresses alpha-smooth muscle actin expression in human dermal fibroblasts: an implication for abnormal wound healing. The Journal of Investigative Dermatology. 127 (11), 2645-2655 (2007).
  16. Kim, B. G., et al. Laminin-332-Rich Tumor Microenvironment for Tumor Invasion in the Interface Zone of Breast Cancer. The American Journal of Pathology. 178 (1), 373-381 (2011).
  17. Chen, J., et al. Overexpression of β3 Chains of Laminin-332 is Associated With Clinicopathologic Features and Decreased Survival in Patients With Pancreatic Adenocarcinoma. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 23 (7), 516-521 (2015).
  18. Huang, C. -C., et al. Hypoxia-induced therapeutic neovascularization in a mouse model of an ischemic limb using cell aggregates composed of HUVECs and cbMSCs. Biomaterials. 34 (37), 9441-9450 (2013).
  19. Wang, L., Wang, L., Gu, Y., Shu, Y., Shen, Y., Xu, Q. Integrin α6high Cell Population Functions as an Initiator in Tumorigenesis and Relapse of Human Liposarcoma. Molecular Cancer Therapeutics. 10 (12), 2276-2286 (2011).
  20. Makizumi, R., Yang, W. -L., Owen, R. P., Sharma, R. R., Ravikumar, T. S. Alteration of Drug Sensitivity in Human Colon Cancer Cells after Exposure to Heat: Implications for Liver Metastasis Therapy using RFA and Chemotherapy. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 1 (2), 117-129 (2008).
  21. Saleh, F. A., Whyte, M., Genever, P. G. Effects of endothelial cells on human mesenchymal stem cell activity in a three-dimensional in vitro model. European Cells & Materials. 22, 242-257 (2011).
  22. Ito, K., Sakuma, S., Kimura, M., Takebe, T., Kaneko, M., Arai, F. Mechanical characterization system using on-chip probe with wide range actuation. 2016 International Symposium on Micro-NanoMechatronics and Human Science (MHS). , 1-2 (2016).
  23. Curcio, E., Salerno, S., Barbieri, G., De Bartolo, L., Drioli, E., Bader, A. Mass transfer and metabolic reactions in hepatocyte spheroids cultured in rotating wall gas-permeable membrane system. Biomaterials. 28 (36), 5487-5497 (2007).
  24. Lin, R. -Z., Lin, R. -Z., Chang, H. -Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnology Journal. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
  25. Nowicki, M. O., et al. Lithium inhibits invasion of glioma cells; possible involvement of glycogen synthase kinase-3. Neuro-Oncology. 10 (5), 690-699 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

3D model sferoid wintegryna alfa3 beta1laminina 332tworzenie sferoid wbarwienie immunofluorescencyjneanaliza qPCRcytometria przep ywowainwazja kom rkowafiksacja paraformaldehydem
Model sferoidalny 3D jako bardziej fizjologiczny system do różnicowania i inwazji fibroblastów związanych z rakiem w badaniach in vitro
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.