Pomiar rytmów dobowych w strumieniu autofagicznym i proteasomalnym

Podsumowanie

Opisujemy nasz protokół pomiaru rytmów biologicznych w katabolizmie białek poprzez autofagię i proteasom w wątrobie myszy.

Streszczenie

Komórki stosują kilka metod recyklingu niechcianych białek i innego materiału, w tym szlaków lizosomalnych i nielizosomalnych. Główny szlak zależny od lizosomów nazywa się autofagią, podczas gdy podstawową nielizosomalną metodą katabolizmu białek jest układ ubikwityna-proteasom. Ostatnie badania na organizmach modelowych sugerują, że aktywność zarówno autofagii, jak i układu ubikwityna-proteasom nie jest stała w ciągu dnia, ale zmienia się zgodnie z rytmem dobowym (okołodobowym). Możliwość pomiaru rytmów biologicznych w obrocie białek jest ważna dla zrozumienia, w jaki sposób osiąga się kontrolę jakości komórkowej i dla zrozumienia dynamiki określonych białek będących przedmiotem zainteresowania. W tym miejscu przedstawiamy ustandaryzowany protokół ilościowego określania strumienia autofagicznego i proteasomalnego in vivo, który wychwytuje okołodobowy składnik obrotu białek. Nasz protokół zawiera szczegółowe informacje na temat obchodzenia się z myszami, przetwarzania tkanek, frakcjonowania i kwantyfikacji strumienia autofagicznego przy użyciu wątroby myszy jako materiału wyjściowego.

Wprowadzenie

Rytmy okołodobowe odnoszą się do codziennych, przewidywalnych zmian w funkcjach biologicznych, które są widoczne w całej przyrodzie. Istnieją w każdej skali biologicznej, od makroskopowych zachowań, takich jak cykle snu i czuwania, po zjawiska molekularne, takie jak rytmiczna obfitość biomolekuł. W ostatnich latach badania nad rytmami okołodobowymi uległy zmianie dzięki odkryciu "genów zegara", które mają kluczowe znaczenie dla generowania rytmu okołodobowego. Badania na myszach z nokautem genów zegarowych ujawniły kluczową rolę rytmów okołodobowych w czasowym organizowaniu podstawowych procesów komórkowych, takich jak metabolizm¹. Jednym ze sposobów, w jaki rytmy okołodobowe sprawiają, że tak się dzieje, jest nadanie katabolizmowi białek struktury czasowej.

Kilka grup, w tym nasza, wykazało, że dwie główne drogi katabolizmu białek komórkowych, autofagia i system ubikwityna-proteasom, podlegają rytmom dobowym^2,3,4,5. Autofagia reprezentuje zależne od lizosomów ramię katabolizmu białek, w którym interesujące białka są dostarczane do tej degradującej organelli albo poprzez budowę nowego pęcherzyka (makroautofagia), albo poprzez bezpośrednią translokację przez kanał (autofagia za pośrednictwem białka opiekuńczego)6. Układ ubikwityna-proteasom jest głównym szlakiem nielizosomalnym, w którym białka są poliubikwitynowane, a następnie wprowadzane do proteasomu, makromolekularnej maszyny degradacyjnej, znajdującej się w całej cytoplazmie i jądrze^7,8. Rytmy aktywności autofagicznej i proteasomalnej są ważne, ponieważ prawdopodobnie odgrywają rolę w utrzymaniu czystości komórkowej. W związku z tym cenne jest posiadanie ustandaryzowanej procedury, która może wykrywać codzienne oscylacje katabolizmu białek, która jest zgodna z przedklinicznymi modelami choroby.

Tutaj udostępniamy nasz protokół do ilościowego określania dobowych zmian w przepływie autofagicznym w wątrobie myszy, który posłużył jako podstawa do pracy w naszym laboratorium^3,9. Nasza metoda jest klasyfikowana jako "test obrotu"¹⁰, podejście używane przez wiele grup do pomiaru aktywności proteolitycznej (lub strumienia). W tym podejściu inhibitory proteazy specyficzne dla lizosomów lub proteasomów podaje się myszom, a następnie po ustalonym czasie uzyskuje się próbki tkanek. Równolegle pobiera się próbki tkanek od myszy poddanych pozorowanym zastrzykom. Próbki tkanek są homogenizowane, a następnie biochemicznie rozdzielane w celu uzyskania frakcji wzbogaconej w lizosomy i cytoplazmatycznej. Frakcje te są następnie analizowane równolegle za pomocą western blot przy użyciu przeciwciał specyficznych dla markerów makroautofagii (LC3b i p62) lub substratów proteasomalnych (białko poliubikwitynowane). Z biegiem czasu zwierzęta, którym wstrzyknięto inhibitory proteazy, gromadzą białka, które normalnie zostałyby poddane recyklingowi. W rezultacie, szybkość obrotu wnioskuje się przez porównanie obfitości białek markerowych w próbkach traktowanych inhibitorem proteazy z próbkami pozorowanymi. Powtarzając tę metodę w stałych odstępach czasu w ciągu dnia, można zrekonstruować okołodobowe zmiany proteolizy (Rysunek 1A).

Protokół

Opisany tutaj protokół został zatwierdzony przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Waszyngtońskiego w St. Louis (IACUC).

1. Hodowla myszy i projekt eksperymentalny

1. Aby wykryć dobowy rytm obrotu białkami, myszy domowe (samiec lub samica C57BL/6J, 4−8 tygodni, 20−25 g) w standardowych 12-godzinnych cyklach światła/ciemności z pożywieniem podawanym ad libitum. Aby uniknąć stresu u zwierząt, przed użyciem należy zaaklimatyzować myszy w obiekcie przez co najmniej tydzień i unikać trzymania w jednym miejscu. Aby udowodnić, że rytmy katabolizmu białek są naprawdę okołodobowe (tj. napędzane przez wewnętrzny zegar biologiczny zwierzęcia), trzymaj myszy w ciągłych ciemnych warunkach, uważając, aby nie wystawiać myszy na działanie światła egzogennego.
   nuta: Szczegółowe informacje na temat pomieszczeń dla myszy do eksperymentów z rytmem okołodobowym można znaleźć pod następującym odniesieniem¹¹.
2. Dla każdego punktu czasowego przydziel trzy myszy jako pozorowane kontrole i co najmniej trzy myszy dla każdego rodzaju zastosowanego inhibitora proteazy (leupeptyna do strumienia autofagicznego i bortezomib do pomiarów strumienia proteasomalnego). Zaplanuj sześć punktów czasowych równomiernie rozmieszczonych w odstępach 4-godzinnych w cyklu dnia i nocy, aby uzyskać próbki tkanek.
   nuta: 24-godzinny eksperyment z 6 punktami czasowymi z solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), leupeptyną i bortezomibem będzie wymagał łącznie 54 myszy (3 na zabieg x 3 zabiegi x 6 punktów czasowych).

2. Przygotowanie roztworu homogenizacyjnego, roztworów podstawowych inhibitorów i fiolek do pobierania wątroby myszy

1. Przygotować świeży bufor homogenizacyjny (HB) i przechowywać na lodzie: 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 250 mM sacharozy, 5 mM EDTA pH 8,0 i 1 tabletkę inhibitora proteazy na 100 ml.
   nuta: Na jedną mysz potrzeba około 10 ml HB.
2. Do dalszego przetwarzania próbek biologicznych każda próbka wymaga stożkowej probówki o pojemności 15 ml do przechowywania surowego homogenatu, probówki o pojemności 15 ml do przechowywania supernatantu pojądrowego, dwóch probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml do przechowywania odpowiednio granulowanego materiału o wymiarach 3 000 x g i 20 000 x g oraz probówki mikrowirówki o pojemności 1,5 ml do przechowywania frakcji cytoplazmatycznej. Dodać 7 ml zimnego HB do każdej probówki przeznaczonej do surowego homogenatu i przechowywać na lodzie.
3. Przygotować roztwór podstawowy hemisiarczanu leupeptyny o stężeniu 2 mg/ml w sterylnym PBS. Należy również przygotować 50 mg/ml roztwór bortezomibu w dimetylosulfotlenku (DMSO). Podwielokrotność roztworów należy przechowywać w temperaturze -80 °C.

3. Podawanie inhibitorów proteazy

1. Rozmrozić roztwory podstawowe leupeptyny (2 mg/ml) i bortezomibu (50 mg/ml) do temperatury pokojowej 15 minut przed każdym punktem czasowym. Zapas leupeptyny jest gotowy do wstrzyknięcia. Rozcieńczyć bortezomib w sterylnym PBS, aby uzyskać roztwór roboczy o stężeniu 50 μg/ml.
   nuta: Bortezomib jest wrażliwy na światło, dlatego do czasu użycia należy chronić materiał roboczy przed światłem.
2. Zważ myszy i wykonaj wstrzyknięcia dootrzewnowe "pozorowanego" PBS (0,5 ml), leupeptyny (40 mg / kg) lub bortezomibu (1,6 μg / kg). Myszy należy umieścić w odpowiednio oznaczonych klatkach, pogrupowanych według rodzaju otrzymanego wstrzyknięcia. Zapisz czas, w którym myszy są leczone lub manipulowane w standardowej tabeli (patrz Plik uzupełniający "Przykładowe dane").
   nuta: Kalkulator dawki jest dołączony jako pomoc w pliku uzupełniającym "Dane próbki". Ważne jest, aby wykonywać wstrzyknięcia szybko i w tej samej kolejności od punktu czasowego do punktu czasowego, aby zminimalizować zmienność.

4. Pozyskiwanie i przechowywanie tkanek

1. Dwie godziny po wstrzyknięciu należy poddać eutanazji myszy pojedynczo zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonym protokołem IACUC. Na przykład znieczulenie myszy, a następnie eutanazja przez zwichnięcie szyjki macicy. Przejdź do etapu sekcji bezpośrednio po eutanazji.
   nuta: Zapewnij pełne znieczulenie przed zwichnięciem szyjki macicy, szczypiąc przednie łapy bez zauważalnego odruchu.
2. Usuń lewy płat wątroby, wykonując nacięcie nożyczkami Metzenbaum o długości od 1,5 do 2,0 cm na brzusznym brzuchu myszy. Uzewnętrznij lewy płat wątroby i wytnij go nożyczkami chirurgicznymi. Zanurz próbkę wątroby w 7 ml lodowatego HB w odpowiednio oznakowanej stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Próbkę należy przechowywać na lodzie przez cały czas przetwarzania.
   nuta: Próbki można przechowywać na lodzie lub w temperaturze 4 °C przez noc przed kontynuacją. Jeśli standardowe markery makroautofagii i aktywności proteasomalnej są jedynymi zamierzonymi odczytami, próbki wątroby można błyskawicznie zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C do późniejszego przetworzenia. Aby zbadać inne cele degradacji (np. za pomocą proteomiki), należy przetworzyć próbki bez zamrażania.
3. Przystąp do eutanazji i sekcji następnej myszy, aż wszystkie próbki zostaną pobrane. Przetwarzaj myszy w tej samej kolejności grup, w jakiej zostały wstrzyknięte, i zapisz czas trwania tego kroku (patrz Plik uzupełniający "Przykładowe dane"). Każda mysz powinna zostać przetworzona w czasie krótszym niż 5 minut, aby zminimalizować różnicę w czasie ekspozycji na wstrzyknięte inhibitory.

5. Biochemiczne frakcjonowanie próbek wątroby

UWAGA: Rysunek 1B pokazuje schemat frakcjonowania.

1. Przenieść każdą próbkę wątroby i 7 ml HB do homogenizatora Dounce o pojemności 15 ml. Homogenizować próbkę za pomocą 10 uderzeń luźnego tłoka i 15 uderzeń ciasnego tłoka. Otrzymany surowy homogenat należy umieścić z powrotem w stożkowej probówce o pojemności 15 ml, z której pochodzi. Powtarzać tę czynność, aż wszystkie próbki wątroby zostaną zhomogenizowane.
2. Wirować surowe próbki homogenatu o masie 700 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia jąder i szczątków. Przenieść górne 4 ml supernatantu pojądrowego (S1) do świeżej stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
3. Oznaczyć stężenie białka frakcji S1 za pomocą testów Bradforda lub kwasu bicinchoninowego (BCA) zgodnie z instrukcjami producenta. Następnie wyrównać stężenia wszystkich próbek do 2,1 mg/ml lub do pożądanego stężenia, dodając w razie potrzeby świeży HB do S1. Znormalizowane próbki to frakcja "białka całkowitego" (Tot). Do dalszych celów analitycznych i poprawy jakości, podwielokrotność 500 μl frakcji Tot i przechowywać w temperaturze -80 °C.
4. Przenieść 1,5 ml pozostałej frakcji Tot do probówki mikrowirówkowej i wirować w temperaturze 3 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść 1 ml otrzymanego supernatantu (S2) do świeżej probówki do mikrowirówki i umieścić na lodzie.
5. Odessać pozostały supernatant i przemyć 3 000 x g granulki (3KP) dwukrotnie 1,5 ml zimnego HB. Granulat 3KP może być przechowywany w stanie suchym w temperaturze -80 °C, jeśli przewiduje się dalszą proteomikę. Jeśli przewiduje się tylko western blot, ponownie zawiesić osad 3KP w 200 μl buforu do próbek do elektroforezy w żelu poliakrylamidowym dodecylosiarczanu sodu (SDS-PAGE) (tabela materiałów) i gotować w temperaturze 95 °C przez 5 minut.
6. Wirować frakcję S2 w temperaturze 20 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść otrzymany supernatant (S3) do świeżej probówki do mikrowirówki. S3 to frakcja cytoplazmatyczna (cyto). W przypadku SDS-PAGE połączyć 150 μl frakcji cyto z 50 μl 4x buforu próbki SDS-PAGE i gotować w temperaturze 95 °C przez 5 minut.
7. Odessać pozostały supernatant z 20 000 x g granulki (20KP) i przemyć dwukrotnie 1,5 ml zimnego HB. Granulat 20KP może być przechowywany w stanie suchym w temperaturze -80 °C, jeśli przewiduje się dalszą proteomikę. Jeśli przewiduje się tylko western blott, zawiesić osad 20KP w 100 μl buforu do próbek SDS-PAGE i gotować w temperaturze 95 °C przez 5 minut.

6. Odczyt Western Blotting

1. W celu ilościowego określenia strumienia makroautofagicznego i proteasomalnego za pomocą western blotting, należy skomponować roztwór podstawowy oczyszczonego GST-LC3b (2 μg/ml), p62-His₆ (2 μg/ml) i poliubikwityny połączonej z Lys⁴⁸ (K48-Ub, 50 μg/mL) w 1x buforze próbki SDS-PAGE. Po gotowaniu w temperaturze 95 °C przez 5 minut, porcjować i przechowywać w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości.
2. W czasie SDS-PAGE wygeneruj 6-punktową krzywą wzorcową wzorcowej mieszaniny białek, seryjnie rozcieńczając 1:3 w 1x buforze próbki SDS-PAGE. Załaduj 10 μl każdej próbki krzywej wzorcowej do 26-dołkowego żelu midi-PAGE 4−12%, a następnie wstępnie wybarwione wzorce białka (Tabela materiałów), komercyjny wzorzec masy cząsteczkowej.
3. Aby zmierzyć strumień autofagiczny, załaduj 12 μl próbki 3KP do każdej studzienki.
   nuta: Zakładając, że wykonano leczenie pozorowane, bortezomibem i leupeptyną i zakładając, że na leczenie przypadały 3 myszy, każdy punkt czasowy powinien składać się z 9 próbek. W związku z tym każdy midi-gel może pomieścić 2 punkty czasowe oraz standardową krzywą, a typowy eksperyment z szeregami czasowymi będzie wymagał 3 midi-geli do odczytu.
4. Aby zmierzyć strumień proteasomalny, załaduj 12 μl frakcji cyto do każdej studzienki.
5. Oddziel próbki białek za pomocą SDS-PAGE i przenieś do membran z polifluorku winylidenu (PVDF) przy użyciu standardowych protokołów. Jeśli przewiduje się western blot dla LC3b, należy przenieść żele przy użyciu 20% buforu transferowego zawierającego metanol. W przeciwnym razie należy użyć 10% buforu transferowego zawierającego metanol, ponieważ umożliwi to bardziej efektywny transfer gatunków białek o dużej masie cząsteczkowej.
6. Wykonaj western blotting przy użyciu standardowych protokołów. Do analizy strumienia makroautofagicznego należy osuszyć błony zawierające próbki 3KP z przeciwciałami anty-p62 lub anty-LC3b (1:1,000) przez noc w temperaturze 4 °C. Do analizy strumienia proteasomalnego, błony zawierające próbki Cyto z poliubikwityną specyficzną dla anty-Lys⁴⁸ (1:1000) przez noc w temperaturze 4 °C.
7. Obrazowanie western blot przy użyciu standardowych przeciwciał drugorzędowych i urządzeń do obrazowania. Zobrazuj razem wszystkie membrany, które składają się na dany eksperyment szeregów czasowych.

7. Analiza danych

UWAGA: Zobacz plik uzupełniający "Przykładowe dane".

1. Aby wykonać densytometrię na próbkach western blot, użyj standardowego oprogramowania graficznego, Image Studio lub alternatywnie ImageJ.
2. Wykonaj pomiary densytometryczne na pasmach będących przedmiotem zainteresowania zarówno dla krzywej wzorcowej, jak i próbek eksperymentalnych. W programie Image Studio, używając p62 jako przykładu, narysuj długi prostokąt obejmujący monomer białka na dole i rozciągający się do górnej części błony. Skopiuj, wklej i przenieś prostokąt do pozostałych próbek. Ważne jest, aby prostokąt używany do oznaczania ilościowego był spójny między próbkami.
3. Zapisz kwantyfikację w arkuszu kalkulacyjnym, naciskając przycisk Raport i uruchom arkusz kalkulacyjny w prawym dolnym rogu okna analizy.
4. Wygeneruj densytometryczną krzywą standardową za pomocą arkusza kalkulacyjnego, używając seryjnie rozcieńczonej próbki wzorcowej i użyj regresji liniowej lub wielomianowej, aby uzyskać równanie krzywej standardowej o najlepszym dopasowaniu. Korzystając z tego równania, ekstrapoluj ilość p62, LC3b-II lub Lys^48-poly Ub w próbkach eksperymentalnych.
5. Aby uzyskać pomiary strumienia, należy odjąć ekstrapolowaną ilość białka w każdej próbce poddanej działaniu inhibitora od średniej wartości próbek PBS z tego samego punktu czasowego (patrz plik uzupełniający "Dane próbki").
6. Oceń istotność statystyczną czasowej zmienności obrotu białek za pomocą 1-kierunkowej ANOVA. Można to zrobić za pomocą standardowego oprogramowania do arkuszy kalkulacyjnych.

Wyniki

Reprezentatywne dane przedstawiono na Rysunku 2A,B, a kwantyfikacja tych danych znajduje się na Rysunku 2C,D (patrz również Plik uzupełniający „Sample Data”). Dla uproszczenia nie przedstawiono kontroli ładowania na Rysunku 2, jednak powinny być one pozyskane równolegle. W tym celu zazwyczaj stosuje się western blot przeciwko β-actin, ale wystarczające będzie również barwienie białe...

Dyskusja

Nasz protokół opisuje technicznie prosty sposób pomiaru rytmów biologicznych w obrocie białek u myszy przy użyciu powszechnie dostępnego sprzętu do biologii molekularnej. Ze względu na długość eksperymentów z szeregami czasowymi i liczbę zaangażowanych próbek biologicznych, ważne jest, aby zachować spójność w całym eksperymencie pod względem sposobu wstrzykiwania myszom, czasu pozyskiwania tkanek i biochemicznego przetwarzania próbek. Etapy iniekcji, eutanazji i zwichnięcia szyjki macicy mogą wymagać praktyki operatora p...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
4x SDS PAGE Przykładowy bufor	Invitrogen	Cat# NP0008
Bortezomib	EMD Millipore	Cat# 5.04314.0001; CAS: 179324-69-7
Image Studio	LICOR	N/A
Immobilon-FL Membrana PVDF 0,45 mikrona	Merck Millipore Ltd	Cat# IPFL00010
K48-linkage Specyficzna poliubikwityna (D9D5) Technologia	sygnalizacji komórkowej	Cat#8081S; RRID:AB_10859893
LC3a	Boston Biochem	Cat # UL-430
LC3b przeciwciało	Novus	Cat # NB100-2220; RRID:AB_10003146
Technologia sygnalizacji komórkowej	przeciwciał LC3b	Cat#2775; RRID:AB_915950
Leupeptin	Sigma	Cat# L2884; CAS: 103476-89-7
NuPAGE 4-12% Bis-tris Midi Żele białkowe	Thermo Fisher Scientific	Cat# WG1403BOX
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)	Thermo Fisher Scientific	Cat# NP0007
P62-his	Novus	Cat# NBP1-44490
Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standards	Bio-Rad	Cat# 1610373
Królik anty-p62/SQSTM1	Milipore-Sigma	Kot#P0067; RRID:AB_1841064
rhPoly-Ub WT (2-7) (K48)	Boston Biochem	Cat# UC-230
SDS-PAGE Żele midi-size	Invitrogen	Cat# WG1403
SIGMAFAST Tabletki inhibitora proteazy	Millipore-Sigma	Cat# S8830

mAb królika