Artykuł metodologiczny

Test immunohistochemiczny do wykrywania antygenu wirusa Lyssa z tkanek utrwalonych formaliną

DOI:

10.3791/60138

⸱

26 października 2021

 , 
1Poxvirus and Rabies Branch, Division of High-Consequence Pathogens and Pathology, National Center for Emerging and Zoonotic Infectious Diseases, Centers for Disease Control and Prevention

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół testu immunohistochemicznego do wykrywania antygenu wirusa wścieklizny jako alternatywny test diagnostyczny dla tkanek utrwalonych w formalinie.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jedną z głównych metod diagnostycznych wścieklizny jest wykrywanie kompleksu (antygenu) rybonukleoproteiny wirusa (RNP) w próbkach zakażonych tkanek. Podczas gdy test na przeciwciała fluorescencyjne (DFA) lub bezpośredni szybki test immunohistochemiczny (DRIT) są najczęściej stosowane do wykrywania antygenu, oba testy wymagają świeżych i/lub zamrożonych tkanek do wycisków na szkiełkach przed wykryciem antygenu przy użyciu przeciwciał. Jeśli próbki są pobierane i utrwalane w formalinie, żaden test nie jest optymalny do wykrywania antygenu, jednak badanie można przeprowadzić za pomocą konwencjonalnej immunohistochemii (IHC) po zatopieniu w blokach parafiny i pocięciu. W tej metodzie IHC tkanki są barwione przeciwciałami przeciwko wściekliźnie, skrawki są deparafinizowane, antygen jest pobierany przez częściową proteolizę lub innymi metodami oraz inkubowany z przeciwciałami pierwszorzędowymi i wtórnymi. Antygeny są barwione za pomocą peroksydazy chrzanowej / aminoetylokarbazolu i barwione przeciwwagowo hematoksyliną w celu wizualizacji za pomocą mikroskopu świetlnego. Oprócz specyficznego wykrywania antygenu, utrwalanie formaliny oferuje inne korzyści, takie jak oznaczanie zmian histologicznych, złagodzone warunki przechowywania i transportu próbek (w temperaturach otoczenia), możliwość testowania przypadków retrospektywnych oraz poprawa bezpieczeństwa biologicznego poprzez inaktywację czynników zakaźnych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wścieklizna to ostre, postępujące zapalenie mózgu wywołane przez wirusy RNA o negatywnym znaczeniu należące do rodzaju lyssavirus1. Prawie 99% wszystkich zgonów ludzi spowodowanych zakażeniem wirusem wścieklizny (RABV), typem należącym do rodzaju, jest przenoszonych przez psy2. Diagnostyka wścieklizny u zwierząt podejrzanych o wściekliznę opiera się na wykryciu antygenu (głównie nukleoproteiny kodowanej przez wirusa, białka N) w kompleksie z genomowym RNA (kompleks rybonukleoproteinowy, RNP) w tkance mózgowej3. Wykrywanie antygenu za pomocą testu na przeciwciała fluorescencyjne (DFA) jest uważane za złoty standard w diagnostyce wścieklizny4. Metoda wykorzystuje świeży lub świeżo zamrożony materiał mózgu, wycisk dotykowy na szkiełku, utrwalenie w acetonie, barwienie przy użyciu dostępnych na rynku fluorescencyjnych przeciwciał monoklonalnych lub poliklonalnych znakowanych izotiocyjanianem (FITC) i odczytane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej5. Test DFA jest szybki, czuły i specyficzny do wykrywania antygenu wścieklizny w świeżej tkance mózgowej. Niedawno wykazano, że bezpośredni szybki test immunohistochemiczny (DRIT), technika zmodyfikowanej immunohistochemii (IHC), wykazuje podobną czułość na DFA, ale oferuje przewagę mikroskopii świetlnej do wizualizacji6. Podczas gdy metoda wykrywania zastosowana w DRIT jest podobna do IHC, początkowy etap wykorzystuje świeże lub zamrożone tkanki do generowania wycisków dotykowych próbki, a następnie utrwalania w formalinie.

IHC jest powszechnie używaną techniką do określania zmian histologicznych i wykrywania białek za pomocą specyficznych przeciwciał w tkankach utrwalonych formaliną osadzonych w blokach parafinowych. IHC jest uznanym alternatywnym testem do wykrywania antygenu wścieklizny w sekcjach tkanek 7. IHC jest szczególnie wykorzystywany do diagnozowania retrospektywnych przypadków, które wykazywały choroby neurologiczne, w celu określenia obciążenia wścieklizną8. Tkanki utrwalone w formalinie zatopione w parafinie zachowują białka do wykrycia nawet po kilku latach, gdy są przechowywane w temperaturze otoczenia9. Leczenie formaliną modyfikuje białka poprzez sieciowanie i zmianę łańcuchów bocznych aminokwasów, co może spowodować, że epitopy przestaną reagować na przeciwciała10. Podczas gdy test IHC do wykrywania antygenu wścieklizny obejmuje mAb lub pAb, ten ostatni jest korzystny, ponieważ można wykryć wiele epitopów i rozbieżnych lyssawirusów11.

Standardowe etapy związane z IHC to utrwalanie tkanek w formalinie, osadzanie w blokach parafinowych, cięcie tkanek, deparafinizacja i hydratacja, odzyskiwanie epitopów, reaktywność przeciwko pierwotnym i wtórnym przeciwciałom oraz rozwój przy użyciu substratów chromogennych. Manuskrypt ten opisuje szczegółowy opis protokołu diagnozy wścieklizny. Do wykrywania antygenu wścieklizny wykorzystuje się surowicę myszy uodpornioną RABV (pAbs) wygenerowaną w amerykańskich Centrach Kontroli i Prewencji Chorób (CDC) w Atlancie w stanie Georgia w połączeniu z biotynylowanymi przeciwciałami wtórnymi przeciwko myszy. Biotynylowane Abs wykrywa się przez dodanie kompleksu streptawidyny i peroksydazy chrzanowej (HRP), a następnie rozwój koloru za pomocą substratu amino-etylokarbazolu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chociaż protokół IHC został przeprowadzony na tkankach utrwalonych w formalinie, które dezaktywują RABV, jeśli są obecne, odpowiednie protokoły bezpieczeństwa biologicznego powinny być odpowiednio przestrzegane. Wszystkie procedury bezpieczeństwa biologicznego są opisane w Bezpieczeństwie biologicznym w laboratoriach mikrobiologicznych i biomedycznych (BMBL) wydanie 5 (https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm), w tym noszenie odpowiednich środków ochrony osobistej (PPE) i wymóg szczepień zgodnie z opisem12. Ponadto należy przestrzegać właściwego hermetyzowania i obchodzenia się z niebezpiecznymi chemikaliami (takimi jak formalina, AEC i ksylen) (np. dygestoria).

1. Utrwalanie tkanek w formalinie

  1. Umieść 3-5 mm tkanki mózgowe pobrane po sekcji zwłok13 w 10% buforowanym fosforanem roztworze formaliny (stosunek tkanka do formaliny 1:20 do 1:50) przez 24-72 h.
    UWAGA: Formalina jest toksycznym utrwalaczem.
  2. Zapisz przybliżoną masę (rozmiar) tkanki, typ tkanki (obszary mózgu) i objętość formaliny. Ważne jest, aby laboratoria dokumentowały i prowadziły zapisy dotyczące czasów utrwalania.
  3. W celu dłuższego przechowywania tkanek po utrwaleniu formaliny i przed przetworzeniem należy umieścić tkankę w 70% etanolu.

2. Przetwarzanie tkanek

  1. Po utrwaleniu próbki należy przeciąć tkankę, aby uwzględnić ważne obszary mózgu, np. przekroje pnia mózgu, móżdżku (3 płaty) lub hipokampa (oba hipokampy), z których każdy ma grubość od 3 do 5 mm i umieszcza w kasetach do obróbki.
  2. Przetwarzać kasety tkankowe do infiltracji wosku parafinowego, osadzone w blokach parafinowych i podzielone (3 do 6 μm) na mikrotomie.

3. Przygotowanie materiałów / Barwienie naczyń

  1. Ustaw naczynie do barwienia14 (Tabela materiałów), jak pokazano w Rysunek 1. Napełnij każde naczynie 250 ml roztworu.
  2. Przygotowanie roztworu podstawowego substratu 3-amino-9-etylokarbiizolu (AEC)
    1. Rozpuścić jedną tabletkę 20 mg 3-amino9-etylokarbazolu (AEC) w 5 ml N,N, dimetyloformamidu za pomocą szklanej pipety.
      UWAGA: AEC jest czynnikiem rakotwórczym.
  3. Przygotowanie roztworu podstawowego proteazy (np. pronazy) do pobrania antygenu
    1. Rozpuścić 7 mg proteazy w 200 ml PBS.
  4. Przygotowanie buforu płuczącego PBS-T
    1. Dodaj 10 ml Tween 80 do 990 ml PBS. Dobrze wymieszaj, aby uzyskać jednorodny roztwór.

4. Deparafinizacja i ponowne uwodnienie tkanek

  1. Wykonać skrawek parafiny o wielkości 5 μm za pomocą mikrotomu, umieścić go na łaźni wodnej w temperaturze 38 °C i zebrać na szkiełkach podstawowych. Oznacz szkiełka długopisem/markerem odpornym na odczynniki.
  2. Umieść szkiełka na blasze i rozpuść w piekarniku o temperaturze 55-60 °C przez 1 godzinę. Nie należy podnosić temperatury powyżej 60 °C, ponieważ może to zniszczyć antygen wirusowy.
  3. Wyjmij szkiełka z piekarnika i natychmiast odparafinowaj w 3 kolejnych płukaniach ksylenu po 5 minut każde w naczyniach 1, 2 i 3.
  4. Ponownie uwodnić sekcje na szkiełku poprzez sekwencyjne zanurzenie w zmniejszającym się rozcieńczeniu etanolu do wody dejonizowanej: (4 do 11 to płukanie zanurzeniowe) danie 4: ksylen/100% etanol (1:1); danie 5: 100% etanolu; danie 6: 100% etanolu; danie 7: 95% etanolu; danie 8: 95% etanolu; danie 9: 80% etanolu; danie 10: 70% etanolu; danie 11: Woda dejonizowana (Rysunek 1. Ustawienie talerza).
    UWAGA: Ksylen jest niebezpieczną substancją chemiczną i praca powinna być wykonywana pod wyciągiem.

5. Pobieranie antygenu proteolitycznego

  1. Traktować szkiełka proteazą (2,5 μg/ml PBS) przez 30 minut w celu pobrania antygenu proteolitycznego w naczyniu 12.
  2. Następnie płucz w PBS-T przez 10 minut (danie 13).
  3. Traktuj 3% nadtlenkiem wodoru przez 10 minut (danie 14).
  4. Ponownie myj PBS-T przez 10 minut (danie 15).

6. Procedura barwienia

  1. Szkiełka należy obsługiwać pojedynczo, trzymając pozostałe prowadnice zanurzone w buforze (nie wyjmuj całego uchwytu prowadnicy - prowadnice powinny być mokre). Usuń jedno szkiełko podstawowe i zetrzyj nadmiar buforu (za pomocą ręcznika papierowego) z okolic sekcji tkanki, uważając, aby nie naruszyć fragmentu tkanki. Inkubuj szkiełka w komorze wilgotnościowej, wykonanej przez umieszczenie zwilżonych ręczników papierowych, na stole laboratoryjnym top14 w temperaturze pokojowej z normalną surowicą kozią (blokowanie) przez 15 minut.
  2. Inkubować z optymalnym, wstępnie ustalonym rozcieńczeniem, pierwszorzędowym przeciwciałem przeciwko wściekliźnie (rozcieńczenie 1:250 mysiej surowicy przeciwko wściekliźnie, nieopublikowane) (kontrola pozytywna) i ujemnymi przeciwciałami kontrolnymi w temperaturze pokojowej takiej samej jak powyżej (krok 6.1.) przez 60 minut, bez przemywania pomiędzy nimi.
  3. Po 60 minutach myć PBS-T przez 10 minut (danie 16).
  4. Inkubować z biotynylowanym przeciwciałem (specyficznym dla gatunku) w komorze wilgotnościowej w temperaturze pokojowej przez 15 minut (postępowanie takie samo jak w kroku 6.1.).
  5. Myć PBS-T przez 10 minut (danie 16).
  6. Inkubować z kompleksem Streptawidyna-HRP w komorze wilgotnościowej w temperaturze pokojowej przez 15 minut (obchodzenie się z nim jak w pkt 6.1.).
  7. Myć PBS-T przez 10 minut (danie 16).
  8. Inkubować z substratem peroksydazy, aminoetylokarbazolem (AEC), w komorze wilgotnościowej w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Wykonać AEC tuż przed użyciem. W tym celu dodaj 1 ml roztworu podstawowego AEC do 14 ml 0,1 M buforu octanowego o pH 5,2. Dodać 0,15 ml 3% H2O2. Przefiltrować mieszaninę tuż przed użyciem (filtr 0,45 μm).
    UWAGA: Roztwór roboczy AEC jest stabilny tylko przez 2-3 godziny. Roztwór podstawowy AEC może być przechowywany w lodówce przez dłuższy czas.
  9. Myć w wodzie dejonizowanej 10 min (danie 17)
  10. Barwione przeciwstawnie hematoksyliną Gilla rozcieńczone w stosunku 1:2 wodą dejonizowaną przez 2 minuty (danie 18).
  11. Nadmiar hematoksyliny spłukać wodą dejonizowaną, spłukać zanurzeniowo (naczynie 19 i 20).
  12. Opłucz w naczyniu Scott's Tap Water 30 s (roztwór do niebieszczenia) 21.
  13. Myć w wodzie dejonizowanej 10 min (danie 22)
  14. Zdejmuj szkiełka pojedynczo - zamontuj za pomocą rozpuszczalnego w wodzie medium montażowego.
  15. Czytaj slajdy pod mikroskopem świetlnym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 2 przedstawia reprezentatywne wyniki barwienia IHC pozytywnych i ujemnych próbek kontrolnych w różnych badanych tkankach mózgu. Rysunek 2A,D,G przedstawia próbki dodatnie przy 200x, podczas gdy Rysunek 2B,E,H odpowiada odpowiednio powiększeniu 400x. Rysunek 2A-C odpowiada pniu mózgu; Rysunek 2D-F odpowiada...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ze względu na wysoką śmiertelność wścieklizny po wystąpieniu objawów, diagnoza zwierząt podejrzanych o zakażenie RABV jest niezwykle ważna dla odpowiedniego leczenia profilaktycznego po ekspozycji. Diagnostyka wścieklizny zależy przede wszystkim od technik opartych na DFA, DRIT i PCR przy użyciu świeżych lub mrożonych tkanek. W przypadku badania tkanek utrwalonych w formalinie, test IHC stanowi alternatywną metodę czułego i swoistego wykrywania antygenu RABV. Podczas gdy tkanki utrwalone w formalinie mają białka ustabili...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy laborantom, epidemiologom i współpracownikom departamentów zdrowia publicznego za przesyłanie próbek do Centrów Kontroli i Prewencji Chorób. Ustalenia i wnioski zawarte w tym raporcie są ustaleniami i wnioskami autorów i niekoniecznie reprezentują oficjalne stanowisko Centrów Kontroli i Prewencji Chorób. Nazwy handlowe i źródła komercyjne służą wyłącznie do identyfikacji i nie oznaczają poparcia ze strony Centrów Kontroli i Prewencji Chorób.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
3% nadtlenek wodorufaramakiiOd ręki 3% H2O2
3-amino-9-etylokarbazol (AEC)Milipore SigmaA6926
Bufor octanowy pH 5,2Poly Scientific R& D Corp.s140
Buforowana formalina 10% buforowana fosforanemFisher ScientificSF100-4Certyfikowane
szkiełka nakrywkowe CorningFisher Scientific12-553-47124 X 50 mm
Etanol 190 ProofPharmco-AAPER111000190
Etanol 200 ProofPharmco-AAPER111000200
Preparat hematoksyliny Gilla #2Fisher ScientificCS401-1D
HistoMark Zestaw peroksydazy biotynowo-streptawidynowejseracare71-00-18Pierwotne przeciwciało myszy 
ImmunoHistoMountMillipore Sigmai1161Podłoże montażowe
N,N, dimetyloformamid GRFisher ScientificD119
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem HyCloneRR14440.0101M, pH 7.2 (pH 7.2-7.6)
Plan-APOCHROMAT 40X/0.95 ObiektywWielu dostawców
Plan-APOCHROMATYCZNY 20X/0.75 CelWielu dostawców
PronaseMillipore Sigma53702Proteaza, Streptomyces griseus
Scott's Tap Water Poly Scientific R& D Corp.s1887
Zestaw bejc Tissue-Tek SlideFisher Scientific50-294-72
TWEEN-80 Millipore SigmaP1754
XyleneFisher ScientificX3S-4Obrazowanie histologiczne
Zeiss Axioplan 2 - mikroskopWielu dostawców
Marki

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rupprecht, C., Kuzmin, I., Meslin, F. Lyssaviruses and rabies: current conundrums, concerns, contradictions and controversies. F1000Research. 6, 184(2017).
  2. Fooks, A. R., et al. Current status of rabies and prospects for elimination. Lancet. 384 (9951), 1389-1399 (2014).
  3. Finke, S., Brzozka, K., Conzelmann, K. K. Tracking fluorescence-labeled rabies virus: enhanced green fluorescent protein-tagged phosphoprotein P supports virus gene expression and formation of infectious particles. Journal of Virology. 78 (22), 12333-12343 (2004).
  4. WHO. WHO Expert Consulation on Rabies, Third Report. WHO Technical Report Series. 1012, 1(2018).
  5. Goldwasser, R. A., Kissling, R. E. Fluorescent antibody staining of street and fixed rabies virus antigens. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 98 (2), 219-223 (1958).
  6. Lembo, T., et al. Evaluation of a direct, rapid immunohistochemical test for rabies diagnosis. Emerging Infectious Diseases. 12 (2), 310-313 (2006).
  7. Fekadu, M., Greer, P. W., Chandler, F. W., Sanderlin, D. W. Use of the avidin-biotin peroxidase system to detect rabies antigen in formalin-fixed paraffin-embedded tissues. Journal of Virological Methods. 19 (2), 91-96 (1988).
  8. Hamir, A. N., Moser, G., Rupprecht, C. E. A five year (1985-1989) retrospective study of equine neurological diseases with special reference to rabies. Journal of Comparative Pathology. 106 (4), 411-421 (1992).
  9. Inoue, S., et al. Cross-reactive antigenicity of nucleoproteins of lyssaviruses recognized by a monospecific antirabies virus nucleoprotein antiserum on paraffin sections of formalin-fixed tissues. Pathology International. 53 (8), 525-533 (2003).
  10. Webster, J. D., Miller, M. A., Dusold, D., Ramos-Vara, J. Effects of prolonged formalin fixation on diagnostic immunohistochemistry in domestic animals. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (8), 753-761 (2009).
  11. Feiden, W., et al. Immunohistochemical staining of rabies virus antigen with monoclonal and polyclonal antibodies in paraffin tissue sections. Zentralblatt fur Veterinarmedizin Reihe B. 35 (4), 247-255 (1988).
  12. Manning, S. E., et al. Human rabies prevention--United States, 2008: recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices. Morbidity and Mortality Weekly Reports Recommendations and Reports. 57, 1-28 (2008).
  13. WHO. Laboratory techniques in rabies. 1, 5th ed, 67-72 (2018).
  14. Patrick, E. M., et al. Enhanced Rabies Surveillance Using a Direct Rapid Immunohistochemical Test. Journal of Visualized Experiments. (146), (2019).
  15. Whitfield, S. G., et al. A comparative study of the fluorescent antibody test for rabies diagnosis in fresh and formalin-fixed brain tissue specimens. Journal of Virology Methods. 95 (1-2), 145-151 (2001).
  16. WHO. Diagnostic procedures for antigen detection. , https://www.who.int/rabies/about/antigendetection/en (2016).
  17. Jarvis, J. A., Franke, M. A., Davis, A. D. Rabies direct fluorescent antibody test does not inactivate rabies or eastern equine encephalitis viruses. Journal of Virology Methods. 234, 52-53 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Antygen wirusa w ciekliznyzatapianie w parafinieodmaskowanie antygenusubstrat AECmikroskopia wietlnatraktowanie proteazprzeciwbarwienie hematoksylinbufor PBS T

Powiązane artykuły