Artykuł metodologiczny

Wysoce wydajna transfekcja pierwotnych makrofagów za pomocą mRNA transkrybowanego in vitro

DOI:

10.3791/60143

⸱

9 listopada 2019

 ,  ,  ,  , 
1Institute for Medical Microbiology, Immunology and Hygiene, Faculty of Medicine and University Hospital Cologne, University of Cologne, 2Center for Molecular Medicine Cologne, 3Cologne Cluster of Excellence on Cellular Stress Responses in Aging-associated Diseases (CECAD), 4German Center for Infection Research (DZIF)

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Makrofagi, zwłaszcza makrofagi pierwotne, są trudne do transfekcji, ponieważ specjalizują się w wykrywaniu cząsteczek pochodzenia niewłasnego. Opisujemy protokół, który umożliwia wysoce wydajną transfekcję pierwotnych makrofagów za pomocą mRNA generowanego z matryc DNA, takich jak plazmidy.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Makrofagi to komórki fagocytarne wyspecjalizowane w wykrywaniu cząsteczek pochodzenia niewłasnego. W tym celu są one wyposażone w szeroką gamę receptorów rozpoznawania wzorców (PRR). Niestety, sprawia to również, że makrofagi są szczególnie trudne do transfekcji, ponieważ odczynnik do transfekcji i transfekowane kwasy nukleinowe są często rozpoznawane przez PRR jako niewłasne. Dlatego transfekcja często powoduje aktywację makrofagów i degradację transfekowanych kwasów nukleinowych, a nawet samobójstwo makrofagów. W tym miejscu opisujemy protokół, który umożliwia wysoce wydajną transfekcję mysich pierwotnych makrofagów, takich jak makrofagi otrzewnowe (PM) i makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego (BMDM) za pomocą mRNA in vitro transkrybowanego z matryc DNA, takich jak plazmidy. Dzięki temu prostemu protokołowi wskaźniki transfekcji wynoszą około 50-65% dla PM i około 85% dla BMDM bez obserwowania cytotoksyczności lub immunogenności. Szczegółowo opisujemy wytwarzanie mRNA do transfekcji z konstruktów DNA, takich jak plazmidy i procedura transfekcji.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Makrofagi to komórki fagocytarne, które specjalizują się w wykrywaniu, spożywaniu i degradacji mikrobów, komórek apoptotycznych i resztek komórkowych. Ponadto pomagają koordynować odpowiedzi immunologiczne poprzez wydzielanie cytokin i chemokin oraz prezentowanie antygenów limfocytom T i limfocytom B. Makrofagi odgrywają również ważną rolę w wielu innych procesach, takich jak gojenie się ran, miażdżyca, nowotworzenie i otyłość.

Aby móc wykrywać cząsteczki niebędące własnymi, takie jak wzorce molekularne związane z patogenami (PAMP) i cząsteczki nie na miejscu, takie jak wzorce molekularne związane z uszkodzeniem (DAMP), makrofagi są wyposażone w duży zestaw receptorów rozpoznawania wzorców (PRR)1. Niestety, sprawia to również, że makrofagi są szczególnie trudne do transfekcji2 jako odczynnik transfekcji3 i transfekowane kwasy nukleinowe4,5,6,7 często są rozpoznawane przez PRR jako nie-self. Z tego powodu transfekcja makrofagów przy użyciu metod chemicznych lub fizycznych8 zwykle powoduje aktywację i degradację transfekowanych kwasów nukleinowych makrofagów, a nawet samobójstwo makrofagów poprzez piroptozę, formę programowanej śmierci litycznej komórki wywoływanej po rozpoznaniu cytozolowych PAMP/DAMPs, takich jak DNA lub obce RNA9. Biologiczna transfekcja makrofagów przy użyciu wirusów, takich jak adenowirusy lub lentiwirusy jako wektory, jest często bardziej wydajna, jednak budowa takich wektorów wirusowych jest czasochłonna i wymaga sprzętu o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 210,11.

Tak więc, mimo że makrofagi są przedmiotem intensywnych badań, analiza ich funkcji na poziomie molekularnym jest utrudniona, ponieważ jedno z najważniejszych narzędzi biologii molekularnej, transfekcja konstruktów kwasów nukleinowych do egzogennej ekspresji białek, jest prawie niemożliwa do zastosowania. To często zmusza badaczy do używania linii komórkowych podobnych do makrofagów, a nie makrofagów w dobrej wierze. Zastosowania transfekcji konstruktu kwasu nukleinowego obejmują ekspresję zmutowanych lub znakowanych wersji białek, nadekspresję określonego białka, reekspresję białka na odpowiednim tle nokautu oraz ekspresję białek z innych gatunków (np. Rekombinaza Cre lub przewodnik RNA i Cas9 do docelowego nokautu genu).

Tutaj opisujemy protokół, który pozwala na wysoce efektywną transfekcję (zwykle trudnych do transfekcji) pierwotnych makrofagów, czyli mysich makrofagów otrzewnowych (PM) i makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego (BMDM) z mRNA generowanym z matryc DNA, takich jak plazmidy. Co ważne, transkrybowane in vitro mRNA wygenerowane przy użyciu tego protokołu zawiera naturalnie występujące zmodyfikowane nukleozydy 5-metylo-CTP i pseudo-UTP, które zmniejszają immunogenność i zwiększają stabilność4,6,7,12,13. Co więcej, końce 5' mRNA transkrybowanego in vitro są defosforylowane przez fosfatazę antarktyczną, aby zapobiec rozpoznaniu przez kompleks RIG-I14,15. Minimalizuje to wrodzone rozpoznawanie immunologiczne mRNA transkrybowanego in vitro. Dzięki naszemu łatwemu do wykonania protokołowi osiągane są wskaźniki transfekcji między 50-65% (makrofagi otrzewnowe (PM)) i 85% (BMDM), przy czym, co ważne, nie obserwuje się cytotoksyczności ani immunogenności. Opisujemy szczegółowo (i) w jaki sposób immunologicznie wyciszone mRNA do transfekcji może być generowane z konstruktów DNA, takich jak plazmidy, oraz (ii) samą procedurę transfekcji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Izolacja makrofagów od myszy została przeprowadzona zgodnie z niemieckim prawem o ochronie zwierząt zgodnie z Komisją Etyki Uniwersytetu w Kolonii.

UWAGA: Wszystkie kroki wykonuj w rękawiczkach. Wszystkie etapy transfekcji należy wykonywać pod okapem z przepływem laminarnym, aby zapobiec zanieczyszczeniu komórek. Przed rozpoczęciem pracy z mRNA wyczyść wszystkie narzędzia, takie jak pipety i każdą powierzchnię, 70% etanolem i/lub środkiem powierzchniowo czynnym rozkładającym RNAse (Tabela materiałów). Upewnij się, że wszystkie probówki reakcyjne są wolne od RNAzy i sterylne. Do rozcieńczania należy używać wyłącznie sterylnej wody wolnej od RNAaz. Używaj wyłącznie końcówek do pipet z filtrami. Wymieniaj końcówki pipet po każdym etapie pipetowania.

1. Generowanie szablonu DNA

UWAGA: Matryca DNA do transkrypcji mRNA in vitro przy użyciu tego protokołu musi zawierać sekwencję promotora T7, aby umożliwić dokowanie polimerazy RNA. Jeśli plazmid zawierający sekwencję DNA białka będącego przedmiotem zainteresowania zawiera już prawidłowo zorientowaną sekwencję promotora T7 bezpośrednio przed sekwencją będącą przedmiotem zainteresowania, należy przeprowadzić linearyzację plazmidu (patrz krok 1.1.). W przeciwnym razie należy dołączyć promotor T7 do sekwencji będącej przedmiotem zainteresowania za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR, patrz krok 1.2.).

  1. Linearyzacja plazmidów zawierających promotory T7
    1. Linearyzuj plazmidy już zawierające prawidłowo zorientowaną sekwencję promotora T7 poprzez trawienie enzymem restrykcyjnym przecinającym dolny do kodonu stop interesującej sekwencji. W przeciwnym razie transkrypcja nie zakończy się poprawnie po interesującej sekwencji.
      nuta: Najlepiej jest stosować enzymy restrykcyjne pozostawiające końce lub 5' zwisające.
    2. Potwierdź całkowitą linearyzację plazmidu za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym niestrawionego w porównaniu z strawionym plazmidowym DNA.
    3. Oczyść zlinearyzowane plazmidowe DNA przed użyciem jako matryca DNA do transkrypcji mRNA in vitro za pomocą zestawu do oczyszczania DNA (tabela materiałów).
  2. Mocowanie promotora T7 za pomocą PCR
    1. Użyj startera do przodu zawierającego następujące składniki (we wskazanej kolejności od 5' do 3'): około 5 losowych pz przed promotorem (np. GAAAT); sekwencja promotora T7 (TAATACGACTCACTATAG); dwa dodatkowe G dla zwiększenia wydajności transkrypcji (GG); część specyficzna dla sekwencji docelowej, która jest homologiczna do sekwencji plazmidowej otaczającej kodon start.
      nuta: Powinien składać się z: 3-6 pz przed sekwencją KOZAK i kodonem start, sekwencji KOZAK i kodonu start (zwykle GCCACC ATG G), 12-18 pz poniżej kodonu start. Jeśli sekwencja będąca przedmiotem zainteresowania nie zawiera jeszcze sekwencji KOZAK lub kodonu start, można je dołączyć w tym kroku, po prostu dołączając je do sekwencji startera.
    2. Oblicza się tm przedniego startera tylko biorąc pod uwagę część homologiczną do sekwencji docelowej.
    3. Aby ocenić tworzenie dimerów/spinek do włosów, należy użyć całej sekwencji podkładu, która z łatwością może przekroczyć 50 pz.
    4. Użyj odwróconego startera znajdującego się gdzieś poniżej kodonu stop.
      nuta: Jeśli sekwencja będąca przedmiotem zainteresowania nie zawiera jeszcze kodonu stop, można ją dołączyć w tym kroku, po prostu dołączając ją do sekwencji startera.
    5. Użyj starterów do przodu i do tyłu, aby wykonać PCR przy użyciu polimerazy o wysokiej wierności z korektą (Tabela materiałów).
    6. Potwierdź wytwarzanie pojedynczego produktu i wielkość amplikonu za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym (np. użyj 1% żelu agarozowego i stałego prądu 100 V).
    7. Oczyść produkt PCR przed użyciem jako matryca DNA do transkrypcji mRNA in vitro za pomocą zestawu do oczyszczania DNA.

2. Generacja mRNA

  1. Rozmrozić wszystkie składniki zestawu do transkrypcji mRNA in vitro (patrz tabela materiałów). Wiruj przez 5 s i wiruj w dół przez 2 s przy 2,000 x g. Trzymaj na lodzie do czasu użycia.
  2. Przygotować mieszaninę reakcyjną do transkrypcji mRNA in vitro w probówce mikrowirówkowej o pojemności 0,5 ml w następującej kolejności (całkowita objętość 40 μL): 20 μL 10x mieszaniny ARCA/NTP (wchodzącej w skład zestawu do transkrypcji mRNA in vitro); 0,25 μl 5-metylo-CTP (końcowe stężenie (f.c.) wynosi 1,25 mM; 50% całkowitego CTP); 0,25 μL pseudo-UTP (f.c. wynosi 1,25 mM; 50% całkowitego UTP); X μL matrycy DNA; 2 μl mieszaniny polimerazy RNA T7 (wchodzącej w skład zestawu do transkrypcji mRNA in vitro); Y μL H2O.
    wolne od RNAzowego nuta: X oznacza objętość zawierającą co najmniej 1 μg DNA. Na przykład 1,6 μl z roztworu podstawowego 625 ng/μl. Y jest objętością zapasową do całkowitej objętości 40 μl.
  3. Wiruj przez 5 s i wiruj w dół przez 2 s przy 2,000 x g. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut przy 400 obr./min na mieszalniku termicznym do transkrypcji in vitro.
  4. Następnie dodać 2 μl DNazy I bezpośrednio do mieszaniny reakcyjnej w celu usunięcia matrycowego DNA. Wiruj przez 5 s i wiruj w dół przez 2 s przy 2,000 x g.
  5. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut przy 400 obr./min na mieszalniku termicznym. Pobrać porcję 2 μl na żel kontrolny (krok 3.3) i przechowywać w temperaturze -80 °C.
  6. W przypadku ogonowania poli(A) należy dodać następujące składniki bezpośrednio do poprzedniej mieszaniny reakcyjnej (do końcowej objętości 50 μl): 5 μl 10x buforu reakcyjnego polimerazy poli(A) i 5 μl polimerazy poli(A) (oba zawarte w zestawie do transkrypcji mRNA in vitro). Wiruj przez 5 s i wiruj w dół przez 2 s przy 2,000 x g.
  7. Inkubować mieszaninę w temperaturze 37 °C przez 30 minut przy 400 obr./min na termomikserze. Pobrać porcję 2 μl na żel kontrolny (krok 3.3) i przechowywać w temperaturze -80 °C.
  8. W celu defosforylacji końców 5' mRNA należy dodać następujące składniki bezpośrednio do poprzedniej mieszaniny reakcyjnej (do końcowej objętości 60 μL): 3 μL H2O wolne od RNAzy; 6 μL 10x buforu reakcyjnego fosfatazy antarktycznej; 3 μL fosfatazy antarktycznej (15 jednostek na 60 μl objętości reakcyjnej). Wiruj przez 5 s i wiruj w dół przez 2 s przy 2,000 x g.
  9. Inkubować mieszaninę w temperaturze 37 °C przez 30 minut przy 400 obr./min na mieszalniku termicznym.
  10. Fosfataza antarktyczna inaktywowana termicznie przez inkubację w temperaturze 80 °C przez 2 min.
    nuta: Najlepiej użyć oddzielnego miksera termicznego, nie czekaj, aż pierwszy mikser osiągnie żądaną temperaturę.

3. Oczyszczanie mRNA

  1. Oczyść transkrybowane mRNA in vitro za pomocą dedykowanego zestawu do oczyszczania RNA (tabela materiałów).
    1. Dodać X μl roztworu elucyjnego do mieszaniny reakcyjnej mRNA z kroku 2.10. Wymieszaj, odwracając 5 razy. Dodać 300 μl koncentratu roztworu wiążącego. Wymieszać 5 razy, delikatnie pipetując.
      nuta: X oznacza objętość zapasową do całkowitej objętości 100 μl. Na przykład dodaj 40 μl roztworu elucyjnego do 60 μl mieszaniny reakcyjnej mRNA.
    2. Dodać 100 μl etanolu wolnego od RNAaz. Wymieszać delikatnym pipetowaniem 5 razy.
    3. Umieść kolumnę filtrującą w jednej z dostarczonych probówek zbiorczych. Delikatnie przenieś mieszaninę reakcyjną mRNA na środek filtra, nie dotykając filtra. Wirować przy 15 000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej (RT).
    4. Ostrożnie podnieś kolumnę filtrującą i wyrzuć przepływ z rurki zbiorczej. Umieść kolumnę filtra z powrotem w tej samej probówce zbiorczej.
    5. Dodać 500 μl roztworu myjącego (nie zapomnij dodać 20 ml etanolu wolnego od RNAaz przed pierwszym użyciem roztworu myjącego).
    6. Wirować przy 15 000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej. Powtórzyć kroki 3.1.4-3.1.6, aby umyć jeszcze raz.
    7. Wirować z pełną prędkością (17 900 x g) przez 1 minutę w temperaturze pokojowej, aby usunąć resztki płynu z kolumny filtra. Ostrożnie wyjmij kolumnę filtracyjną z rurki zbiorczej. Umieść kolumnę filtracyjną w nowej probówce zbiorczej.
    8. Dodać 50 μl buforu elucyjnego na środek filtra, nie dotykając filtra. Inkubować w temperaturze 65 °C przez 10 minut na mieszalniku termicznym.
    9. Wirować przy 15 000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej. Wyjmij kolumnę filtracyjną i wyrzuć ją.
  2. Zmierzyć stężenie i czystość wymytego mRNA, na przykład za pomocą spektrofotometru mikroobjętościowego do pomiaru absorbancji przy 260 i 280 nm.
    nuta: Stosunek A260/A280 wynoszący 1,8-2,1 wskazuje na wysoce oczyszczone mRNA.
  3. Sprawdzić obecność pojedynczego produktu, prawidłową długość transkryptu i ogonowanie poli(A), analizując podwielokrotności z kroków 2.5 i 2.7 za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym w warunkach denaturacji (na przykład użyć 1,2% żelu agarozowego zawierającego 20 mM kwasu 3-(N-morfolino)propanosulfonowego [MOPS], 5 mM octanu sodu, 1 mM EDTA i 20% formaldehydu i uruchomić w 20 mM MOPS, 5 mM octanu sodu, 1 mM EDTA i 0,74 % formaldehydu przy stałym prądzie 100 V).
  4. Oczyszczone mRNA należy przechowywać w probówce elucyjnej w temperaturze -80 °C do czasu transfekcji. Jeśli używasz tylko niewielkich ilości mRNA do transfekcji, podziel mRNA na porcję, aby uniknąć powtarzających się cykli zamrażania i rozmrażania.
    UWAGA: mRNA może być przechowywane w temperaturze -80 °C przez około 1 rok.

4. Przygotowanie makrofagów

  1. Poddaj eutanazji myszy C57/BL6 (użyj myszy tej samej płci i w wieku 6-24 tygodni) przez zwichnięcie szyjki macicy.
    nuta: Te same myszy można wykorzystać do izolacji PM (krok 4.2) i generowania BMDM (kroki 4.3 i 4.4). Do izolacji PM użyj co najmniej dwóch myszy. Jeśli ma być wygenerowany tylko BMDM, zwykle wystarczy jedna myszka.
  2. Immunomagnetyczne wzbogacanie makrofagów otrzewnowych.
    1. Napełnij strzykawkę o pojemności 10 ml kaniulą 0,9 x 40 mm 8 ml lodowatego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i 2 ml powietrza. Przepłukać jamę otrzewnej PBS. Powietrze utworzy pęcherzyk, który zminimalizuje wyciek PBS.
    2. Za pomocą tej samej strzykawki należy szybko zebrać płukanie otrzewnowej i przenieść do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. W razie potrzeby połącz komórki otrzewnej wielu myszy. Utrzymuj zawiesinę komórkową na lodzie.
    3. Odwirować zawiesinę komórek w temperaturze 650 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 5 ml 0,2 % NaCl przez 30 s w celu lizy czerwonych krwinek.
    4. Dodaj 5 ml 1,6% NaCl do całkowitej objętości 10 ml, aby odtworzyć warunki izotoniczne. Wirować przy 650 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    5. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 97,5 μl buforu do magnetycznego sortowania komórek (MCS) (2 mM kwas etylenodiaminotetraoctowy [EDTA], 0,5% albuminy surowicy bydlęcej [BSA] w PBS) na 1 płukanie otrzewnowej (np. jeśli trzy myszy zostały wypłukane, ponownie zawiesić w 292,5 μl).
    6. Dodać 2,5 μl kulek paramagnetycznych sprzężonych z przeciwciałem specyficznym dla CD11b na 97,5 μl zawiesiny komórkowej (np. dodać 7,5 μl do 292,5 μl).
    7. Inkubować na lodzie przez 15 minut przy 150 obr./min na wytrząsarce orbitalnej.
    8. Odwirować zawiesinę komórek w temperaturze 650 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml buforu MCS.
    9. Dodać 4 ml buforu MCS do całkowitej objętości 5 ml i przemyć komórki, delikatnie pipetując trzykrotnie w górę i w dół.
    10. Powtórzyć kroki 4.2.8 i 4.2.9 jeszcze dwa razy, co daje w sumie trzy etapy mycia.
    11. Podczas etapów mycia umieść kolumnę LS w separatorze magnetycznym (patrz Tabela materiałów). Przepłukać kolumnę 3 ml buforu MCS.
      nuta: Unikaj pęcherzyków, ponieważ mogą one zatkać kolumnę.
    12. Zawiesić osad komórkowy w 1 ml buforu MCS. Dodać 3 ml buforu MCS do całkowitej objętości 4 ml, wymieszać, pipetując trzy razy w górę i w dół.
    13. Przenieść 4 ml zawiesiny komórek na przepłukaną kolumnę LS.
      nuta: Ponownie unikaj pęcherzyków, ponieważ mogą one zatkać kolumnę.
    14. Poczekaj, aż zbiornik kolumny będzie całkowicie pusty. Nie dodawaj dodatkowego płynu, dopóki kolumna nie przestanie kapać.
    15. Dodać 3 ml buforu MCS do kolumny. Następnie poczekaj, aż zbiornik kolumny będzie całkowicie pusty. Powtórz krok 4.2.15 jeszcze dwa razy.
    16. Umieść kolumnę LS w stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml. Nałożyć 5 ml buforu MCS na kolumnę. Poczekaj, aż 2 ml płynu przejdzie przez kolumnę, a następnie użyj tłoka, aby delikatnie wepchnąć pozostałą frakcję do probówki.
    17. Odwirować zawiesinę komórek o sile 650 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.
    18. Ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml DMEM uzupełnionym 10% inaktywowaną termicznie surowicą cielęcą płodu (FCS) (DMEM+FCS).
    19. Określić liczbę żywotnych komórek, licząc w roztworze błękitu trypanowego w komorze liczącej Neubauera i komórki nasienne w DMEM+FCS na płytki hodowlane.
      nuta: Wysiewać PM o gęstości 100 000 komórek/studzienkę na płaskiej płytce do mikromiareczkowania. Nie należy używać płytek poddanych hodowlom tkankowym, ponieważ nie można od nich oderwać cząstek stałych. Zamiast tego użyj nieobrobionych płytek.
  3. Generacja BMDM
    1. Usuń skórę i mięśnie z tylnych nóg za pomocą nożyczek. Umyj każdą nogę przez krótkie zanurzenie w 70% etanolu.
    2. Odłącz nogi i otwórz oba końce kości udowej i piszczelowej, przecinając nożyczkami.
    3. Napełnij strzykawkę o pojemności 5 ml wypełnioną kaniulą 0,6 mm x 30 mm 5 ml roztworu RPMI 1640 o bardzo niskiej zawartości endotoksyn (VLE) i wypłucz szpik kostny z otwartych kości do naczynia hodowlanego.
    4. W razie potrzeby połączyć szpik kostny wielu myszy, powtarzając kroki 4.3.1-4.3.3. Przenieść szpik kostny do stożkowej probówki wirowej o pojemności 50 ml.
    5. Odwirować zawiesinę szpiku kostnego o sile 650 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić sklarowany osad.
    6. Zawiesić osad komórkowy w 5 ml buforu do lizy krwinek czerwonych (8,3% NH4Cl, 0,1 M Tris) i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej w celu lizy czerwonych krwinek.
    7. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 650 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut i odrzucić supernatant.
    8. Zawiesić osad komórkowy w 1 ml pożywki VLE RPMI 1640 uzupełnionej 10% FCS, 1% penicyliny/streptomycyny, 1% HEPES, 1% pirogronianu sodu i 10 ng/ml rekombinowanego czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF) (RPMI+++++).
    9. Dodaj 4 ml RPMI+++++ do całkowitej objętości 5 ml.
    10. Przygotować 5 szalek Petriego o wymiarach 92 mm x 16 mm bez obróbki z krzywkami (patrz Tabela Materiałów) na mysz, pipetując 7 ml pożywki RPMI+++++ do każdej płytki
      11. .
    11. Przenieść 1 ml roztworu komórkowego na 5 przygotowanych szalek hodowlanych i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
    12. Po 4 dniach nakarm komórki, dodając 4 ml RPMI+++++. Po 6-7 dniach komórki szpiku kostnego są w pełni zróżnicowane do BMDM.
  4. Zbiór BMDM
    1. Całkowicie usuń pożywkę z naczyń hodowlanych. Dodaj 5 ml ciepłego 0,2 mM EDTA w PBS do każdego naczynia.
    2. Delikatnie zeskrob całą płytkę za pomocą skrobaka do komórek, aby odłączyć BMDM. Połączyć zawiesiny komórek w stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml.
    3. Ponownie przepłucz wszystkie 5 naczyń. Użyj tej samej objętości 5 ml ciepłego 0,2 mM EDTA w PBS dla wszystkich 5 potraw. Połącz tę zawiesinę komórek z tą z poprzedniego kroku.
    4. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 650 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.
    5. Zawiesić osad komórkowy w 1 ml pożywki VLE RPMI 1640 uzupełnionej 10% FCS, 1% HEPES, 1% pirogronianu sodu i 10 ng/ml rekombinowanego M-CSF, ale bez antybiotyków (RPMI++++).
    6. Określić liczbę żywotnych komórek, licząc w roztworze błękitu trypanowego w komorze liczącej Neubauera i komórki nasienne w RPMI++++ na płytki hodowlane.
      nuta: Wysiewać BMDM o gęstości maksymalnie 50 000 komórek/studzienkę na płaskiej płytce do mikromiareczkowania. Nie należy używać płytek poddanych hodowli tkankowej, ponieważ BMDM trudno od nich odłączyć. Zamiast tego użyj nieobrobionych płytek.

5. Transfekcja makrofagów za pomocą mRNA

  1. Oblicz wymaganą objętość bufora transfekcji mRNA.
    nuta: Wymagana objętość bufora do transfekcji mRNA zależy od wielkości studzienki: użyj 200 μl do transfekcji na płytce 6-dołkowej, 100 μl na płytce 12-dołkowej i tak dalej. Zawsze należy dodać trochę wolnej objętości ze względu na straty przy pipetowaniu (ale nie za dużo, aby zapobiec nadmiernemu rozcieńczeniu mRNA). Na przykład użyj 450 μL zamiast 4 x 100 μL = 400 μL do transfekcji w 4 dołkach 12-dołkowej płytki.
  2. Oblicz wymaganą objętość odczynnika do transfekcji mRNA. Odczynnik do transfekcji mRNA dodaje się w stosunku 1:50. Na przykład 9 μl odczynnika do transfekcji mRNA jest wymagane do uzyskania końcowej objętości 450 μl.
  3. Oblicz całkowitą wymaganą ilość mRNA. Do skutecznej transfekcji wymagane jest co najmniej 100 ng na 100 000 makrofagów, 200 ng działa jeszcze lepiej (np. 800 ng mRNA do transfekcji 400 000 makrofagów).
    1. Pomnóż obliczoną ilość wymaganego mRNA przez całkowitą liczbę dołków, które muszą zostać transfekowane (np. 4 dołki z 400 000 makrofagów każdy: 4 x 800 ng = 3 200 ng mRNA jest wymagane łącznie dla wszystkich studzienek). Na przykład, jeśli zapas mRNA wynosi 426,8 ng / μl, 7,49 μl jest potrzebne do optymalnej transfekcji 4 dołków z 400 000 makrofagów każdy.
  4. Dodać obliczoną objętość buforu do transfekcji mRNA (krok 5.1.) pomniejszoną o objętości odczynnika do transfekcji mRNA (krok 5.2) i mRNA (krok 5.3) do probówki reakcyjnej. Na przykład 450 μL - 9 μL - 7,49 μL = 433,51 μL.
  5. Rozmrozić zapas mRNA i wymieszać go, delikatnie obracając probówkę elucyjną. Dodać obliczoną objętość mRNA (krok 5.3) do probówki reakcyjnej z buforem reakcyjnym mRNA (w przykładzie przedstawionym powyżej: 7,49 μl w 433,51 μL).
  6. Wiruj przez 5 s i wiruj w dół przez 2 s przy 2,000 x g.
  7. Wirować odczynnik do transfekcji mRNA przez 5 s i wirować przez 2 s przy 2,000 x g.
  8. Dodać obliczoną objętość odczynnika do transfekcji mRNA (krok 5.2) do probówki reakcyjnej zawierającej bufor do transfekcji mRNA i mRNA (w przykładzie przedstawionym powyżej: 9 μl odczynnika do transfekcji mRNA).
  9. Wiruj mieszankę transfekcyjną przez 5 s i wiruj w dół przez 2 s przy 2,000 x g.
  10. Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
  11. W międzyczasie zastąp pożywkę makrofagów świeżą, ciepłą pożywką hodowlaną (patrz kroki 4.2.18. i 4.4.5).
  12. Po etapie inkubacji 5.10 dodać mieszaninę transfekcji do studzienek zawierających makrofagi w objętości odpowiedniej do wielkości studzienki (patrz krok 5.1). Dodaj mieszankę transfekcyjną kroplami w kółko od zewnątrz do środka studzienki.
  13. Delikatnie kołysz płytką, najpierw w pionie, a następnie w poziomie, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie mieszanki transfekcyjnej w studzience. Następnie inkubować w temperaturze 37 °C i 5 % CO2 . Synteza białka kodowanego przez transfekowane mRNA rozpocznie się wkrótce po transfekcji. Aby uzyskać najlepsze wyniki, inkubować przez co najmniej 6 godzin.
  14. Po inkubacji przeanalizuj wydajność transfekcji za pomocą mikroskopii (immuno)fluorescencyjnej, cytometrii przepływowej lub immunoblot16 lub użyj transfekowanych makrofagów do wybranego eksperymentu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Udało nam się wykorzystać ten protokół do generowania kodowania mRNA dla oznaczonych flagą wariantów NEMO i IKKβ do transfekcji pierwotnych makrofagów16. Plazmidy kodujące dla oznaczonego flagą typu dzikiego (NEMOWT) i zmutowanego C54/347A NEMO (NEMOC54/374A) (patrz Tabela Materiałów) zawierają już promotor T7 we właściwej orientacji (Rysunek 1A). W związku z tym musieliśmy tylko linearyzow...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym miejscu przedstawiamy protokół wysoce wydajnej transfekcji zwykle trudnych do transfekcji pierwotnych makrofagów za pomocą transkrybowanego mRNA in vitro. Co ważne, transfekcja makrofagów przy użyciu tego protokołu nie indukuje śmierci komórki ani nie aktywuje sygnalizacji prozapalnej, co wskazuje, że ani odczynnik do transfekcji, ani transfekowane mRNA nie są rozpoznawane jako niewłasne.

Jakość mRNA ma kluczowe znaczenie dla udanej transfekcji makrofagów przy użyciu tego protokołu. Dlat...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 670).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
5-metylo-CTP (100 mM)Jena BiosienceNU-1138Sprzechowywany w temperaturze -20 ° C
Fosfataza antarktycznaNew England BioLabsM0289przechowywana w temperaturze -20 & deg; C
Bufor reakcyjny fosfatazy antarktycznej (10x)New England BioLabsB0289przechowywany w temperaturze -20 & deg; C
przeciwciało anty-NEMO/IKK&gammaInvitrogenMA1-41046przechowywane w temperaturze -20 & stopni; Przeciwciało
anty-&beta-aktynoweC Sigma-AldrichA2228przechowywane w temperaturze -20 & deg; C
szalki Petriego 92,16 mm z krzywkamiSarstedt821,473przechowywane w RT
CD11b Mikrogranulki mysz i człowiekMiltenyi Biotec130-049-601przechowywane w temperaturze 4 stopni; C
Rekombinaza Cre + T7-Promotor starter do przoduSigma-Aldrich5′-GAAATTAATACGACTCACTATA
GGGGCAGCCGCCACCATGTCC
AATTTACTGACCGTAC-3´, przechowywany w temperaturze -20 ° C
Rekombinaza Cre + T7-Promotor odwrócony starterSigma-Aldrich5′-CTAATCGCCATCTTCCAGCAGG
C-3′, przechowywany w temperaturze -20 °
Zestaw do oczyszczania DNA C: Zestaw do oczyszczania QIAquick PCRQiagen28104przechowywany w RT
eGFP + T7-Promotor forward primerSigma-Aldrich5´-GAAATTAATACGACTACTATA
GGGATCCATCGCCACCATGGTG
AGCAAGG-3´, przechowywany w temperaturze -20 ° C
eGFP + T7-Promotor podkład odwróconySigma-Aldrich5´-TGGTATGGCTGATTA
TGATCTAGAGTCG-3´, przechowywany w temperaturze -20 ° C
Bufor Fast Digest (10x)Thermo ScientificB64przechowywany w temperaturze -20 ° C
FastDigest XbaIThermo ScientificFD0684przechowywany w temperaturze -20 stopni; C
Polimeraza o wysokiej wierności z korektą: Q5 Polimeraza DNA o wysokiej wiernościNew England Biolabs IncM0491Sprzechowywana w temperaturze -20 & stopni; C
IKKβ + T7-Promotor starter do przoduSigma-Aldrich5′-GAAATTAATACGACTCACTATA
GGGTTGATCTACCATGGACTACA
AAGACG-3′, przechowywany w temperaturze -20 ° C
IKKβ + T7-Promotor starter odwróconySigma-Aldrich5′-GAGGAAGCGAGAGCT-CCATCTG-3′, przechowywany w temperaturze -20 °
Zestaw do transkrypcji mRNA C in vitro: zestaw mRNA HiScribe T7 ARCA (z ogonem poliA)New England BioLabsE2060przechowywany w temperaturze -20 stopni; C
LS KolumnyMiltenyi Biotec130-042-401przechowywane w RT
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303przechowywane w RT
bufor transfekcji mRNA i odczynnik: jetMESSENGERPolyplus transfekcja409-0001DEprzechowywany w temperaturze 4 & st.; C
Mutant IKKβ Plazmid IKK-2S177/181EAddgene11105przechowywany w temperaturze -20 & stopni; C
Zmutowany plazmid NEMOC54/347AAddgene27268przechowywany w temperaturze -20 & deg; C
plazmid pEGFP-N3Addgene62043przechowywany w temperaturze -20 & deg; C
poly(I:C)Calbiochem528906przechowywany w temperaturze -20 stopni; Plazmid
pPGK-CreF.T. Wunderlich, H. Wildner, K. Rajewsky, F. Edenhofer, Nowe warianty indukowalnej rekombinazy Cre: nowy mutant białka fuzyjnego Cre-PR wykazuje zwiększoną czułość i rozszerzony zakres indukowalności. Kwasy nukleinowe Res. 29, 47e (2001). przechowywany w temperaturze -20 ° C
pseudo-UTP (100 mM)Jena BiosienceNU-1139Sprzechowywany w temperaturze -20 ° C
Separator QuadroMACSMiltenyi Biotec130-090-976przechowywany w RT
Przeciwciało anty-myszy CD11b, BioLegend sprzężony z APC101212przechowywany w temperaturze 4 &; C
Przeciwciało przeciw myszom F4/80, sprzężone z PEeBioscience12-4801-82przechowywane w temperaturze 4 & stopni; C
Rekombinowany M-CSFPeprotech315-02przechowywany w temperaturze -20 & deg;
Zestaw do oczyszczania C RNA: Zestaw do czyszczenia transkrypcji MEGAclearThermoFisher ScientificAM1908przechowywany w temperaturze 4 stopni; C
Środek powierzchniowo czynny rozkładający RNAzy: RnaseZAPSigma-AldrichR2020przechowywany w RT
Ultrapure LPS z E.coli O111:B4Invivogenprzechowywany w temperaturze -20 ° C
Dziki typ IKKβ plazmidAddgene11103przechowywany w temperaturze -20 & deg; C
Plazmid NEMO typu dzikiegoAddgene27268przechowywany w temperaturze -20 & deg; Z
C

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ley, K., Pramod, A. B., Croft, M., Ravichandran, K. S., Ting, J. P. How Mouse Macrophages Sense What Is Going On. Frontiers in Immunology. 7 (204), (2016).
  2. Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. The expression of exogenous genes in macrophages: obstacles and opportunities. Methods in Molecular Biolology. 531, 123-143 (2009).
  3. Guo, X., et al. Transfection reagent Lipofectamine triggers type I interferon signaling activation in macrophages. Immunology and cell biology. 97 (1), 92-96 (2019).
  4. Kariko, K., Weissman, D. Naturally occurring nucleoside modifications suppress the immunostimulatory activity of RNA: implication for therapeutic RNA development. Current Opinion in Drug Discovery and Development. 10 (5), 523-532 (2007).
  5. Van De Parre, T. J., Martinet, W., Schrijvers, D. M., Herman, A. G., De Meyer, G. R. mRNA but not plasmid DNA is efficiently transfected in murine J774A.1 macrophages. Biochemical and biophysical research communications. 327 (1), 356-360 (2005).
  6. Uchida, S., Kataoka, K., Itaka, K. Screening of mRNA Chemical Modification to Maximize Protein Expression with Reduced Immunogenicity. Pharmaceutics. 7 (3), 137-151 (2015).
  7. Kariko, K., et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability. Molecular Therapy. 16 (11), 1833-1840 (2008).
  8. Khantakova, J. N., et al. Transfection of bone marrow derived cells with immunoregulatory proteins. Cytokine. 108, 82-88 (2018).
  9. Franz, K. M., Kagan, J. C. Innate Immune Receptors as Competitive Determinants of Cell Fate. Molecular Cell. 66 (6), 750-760 (2017).
  10. Kaestner, L., Scholz, A., Lipp, P. Conceptual and technical aspects of transfection and gene delivery. Bioorganic & medicinal chemistry letters. 25 (6), 1171-1176 (2015).
  11. Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).
  12. Kormann, M. S., et al. Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice. Nature Biotechnology. 29 (2), 154-157 (2011).
  13. Kariko, K., Buckstein, M., Ni, H., Weissman, D. Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors: the impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA. Immunity. 23 (2), 165-175 (2005).
  14. Hornung, V., et al. 5'-Triphosphate RNA is the ligand for RIG-I. Science. 314 (5801), 994-997 (2006).
  15. Pichlmair, A., et al. RIG-I-mediated antiviral responses to single-stranded RNA bearing 5'-phosphates. Science. 314 (5801), 997-1001 (2006).
  16. Herb, M., et al. Mitochondrial reactive oxygen species enable proinflammatory signaling through disulfide linkage of NEMO. Science Signaling. 12 (568), (2019).
  17. Schmidt-Supprian, M., et al. NEMO/IKK gamma-deficient mice model incontinentia pigmenti. Molecular Cell. 5 (6), 981-992 (2000).
  18. Mandal, P. K., Rossi, D. J. Reprogramming human fibroblasts to pluripotency using modified mRNA. Nature Protocols. 8 (3), 568-582 (2013).
  19. Oh, S., Kessler, J. A. Design, Assembly, Production, and Transfection of Synthetic Modified mRNA. Methods. 133, San Diego, CA. 29-43 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Transfekcja makrofag w pierwotnychmakrofagi pochodz ce z szpiku kostnegomakrofagi otrzewnoweprotok transfekcji mRNAdodawanie ogona PolyAcytometria przep ywowamikroskopia fluorescencyjnaelektroforeza w elu agarozowymanaliza ekspresji bia ek

Powiązane artykuły