Przedstawiono protokół tworzenia sztucznej diety bez krwi do karmienia komarów Anopheles w niewoli. Dieta ta ma podobną wydajność do krwi kręgowców i wyzwala oogenezę i dojrzewanie jaj oraz daje zdolne do życia dorosłe potomstwo.
Artykuł metodologiczny
Bezkrwawa dieta do hodowli komarów Anopheline
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Badania nad malarią wymagają warunków hodowli i produkcji komarów (Anopheles spp.) w niewoli na dużą skalę. Zrównoważona i niezawodna produkcja komarów jest obecnie hamowana przez dostarczanie świeżej krwi kręgowców. Alternatywy dla krwi są potrzebne do promowania skutecznych strategii zwalczania malarii i innych chorób przenoszonych przez wektory, które są przenoszone przez owady żywiące się krwią. Mając to na uwadze, opracowano sztuczne diety płynne jako substytuty świeżej krwi kręgowców. W niniejszym artykule przedstawiamy bezkrwawą, sztuczną, płynną dietę, która zapewnia tempo odżywiania podobne do krwi i naśladuje fizjologiczne efekty świeżej mączki z krwi kręgowców. Dieta indukuje dojrzewanie jajników i jaj komarów Anopheles, a także zapewnia dobrą przeżywalność larw i rozwój funkcjonalnych dorosłych osobników. Opracowana bezkrwawa dieta płynna stanowi ważny postęp w kierunku zrównoważonej hodowli komarów w niewoli i zmniejszy koszty utrzymania kolonii komarów oraz wyeliminuje potrzebę świeżej krwi kręgowców.
Wprowadzenie
Choroby przenoszone przez wektory dotykają kilka milionów ludzi na całym świecie i powodują miliony zgonów każdego roku. Przenoszone są przez owady zakażone mikroorganizmami chorobotwórczymi (pierwotniaki, wirusy) nabytymi, gdy żywią się krwią zakażonego żywiciela. Następnie zakażony wektor przekaże patogen nowemu gospodarzowi podczas następnego posiłku z krwi. Malaria jest najbardziej śmiertelną chorobą przenoszoną przez wektory, która jest przenoszona przez kilka różnych gatunków komarów Anopheles i dotyka 40% światowej populacji1. Pasożyt protista malarii jest odpowiedzialny za ponad 400 000 zgonów rocznie, z czego większość to dzieci poniżej 5 roku życia (Światowa Organizacja Zdrowia). Samica komara Anopheles przenosi pasożyta malarii z rodzaju Plasmodium między ludźmi a innymi zwierzętami, gdy żywi się krwią kręgowców, co jest niezbędnym krokiem do produkcji i rozwoju jaj2.
Obecne strategie zwalczania malarii i innych pojawiających się śmiertelnych chorób przenoszonych przez komary opierają się na rozwoju innowacyjnych strategii zwalczania komarów3,4,5, które obejmują wypuszczenie na wolność dużej liczby komarów hodowanych w owadach. Jednak kluczowym czynnikiem ograniczającym jest zależność od dopływu świeżej krwi w celu skutecznego wychowania i rozmnażania komarów. Zmienny skład krwi kręgowców może negatywnie wpływać na płodność komarów i przystosowanie potomstwa oraz może ograniczać niezawodność i trwałość kolonii hodowlanych w niewoli. Programy wypuszczania i zwalczania komarów wymagają systemów produkcji komarów na dużą skalę i regularnych dostaw dużych ilości krwi kręgowców. Jest to główna przeszkoda w produkcji komarów i rodzi szereg problemów etycznych związanych z wykorzystywaniem żywych zwierząt i ograniczeniami logistycznymi spowodowanymi związanymi z tym wymagającymi przepisami bezpieczeństwa. Sprawia to, że koszty utrzymania i bezpieczeństwa kolonii komarów są wysokie i stanowią wyzwanie dla zrównoważonego charakteru obecnych praktyk hodowli komarów, szczególnie w krajach o niskich dochodach, gdzie zagrożenie malarią jest znacznie większe.
Ostatnio badania koncentrowały się na rozwoju substytutów krwi, które naśladują mączkę z krwi kręgowców, ale jak dotąd osiągnięto tylko ograniczony sukces6,7,8,9. Skuteczna sztuczna dieta musi (1) wywołać pełny obrzęk samic komarów, (2) wyzwolić produkcję witellogeniny, (3) wyprodukować duże partie zdolnych do życia jaj i (4) wygenerować zdrowe potomstwo10. Ponadto sztuczne diety mają standardowy skład, a zatem są bardziej niezawodne w produkcji komarów do celów badawczych i kontrolnych. Skuteczne diety bezkrwiste zostały opracowane dla komarów Aedes (sprawdzone przez Gonzales i Hansen11), ale nie dla Anopheles spp. Istniejące sztuczne diety zawierają fagostymulant (np. ATP10), źródło białka do dojrzewania jaj6,12, węglowodany jako źródło energii i aminokwasy (aa)13, które mają fundamentalne znaczenie dla produkcji jaj i są głównym czynnikiem ograniczającym płodność komarów14. Sztuczna dieta bezkrwista musi również dostarczać cholesterolu15, co poprawia produkcję jaj. W tym miejscu opisujemy sztuczną dietę bezkrwistą dla samic komarów Anopheles i wykazujemy, że ma ona stałą i równoważną wydajność do wysokiej jakości mączki z krwi kręgowców.
Protokół
Myszy zostały pozyskane z domu dla zwierząt IHMT. Doświadczenia na zwierzętach prowadzono w ścisłej zgodności z portugalskim prawem i wytycznymi dotyczącymi wykorzystywania zwierząt laboratoryjnych. Direção-Geral de Veterinária, Ministério da Agricultura do Desenvolvimento Rural e das Pescas, Portugalia zatwierdziła wszystkie protokoły badań (zatwierdzenia id: 023351 i 023355).
UWAGA: Wykonaj wszystkie testy karmienia w temperaturze ~26 °C.
1. Komary
- Utrzymuj komary szczepu Anopheles coluzzii (dawniej Anopheles gambiae forma M) Yaoundé w temperaturze 26 °C, wilgotności 75% w cyklu 12 godzin: 12 godzin światło: ciemność. Komary domowe stosujące standardowe warunki owadobójcze, aby zagwarantować krycie.
- Zbierz poczwarki komarów do małego pojemnika na wodę. Umieść pojemnik w klatce na komary, aby dorosłe komary mogły się wyłonić i połączyć w pary. Zapewnij 10% roztwór do karmienia glukozą. Trzy dni po wzejściu zbierz potrzebną liczbę komarów z klatki za pomocą aspiratora.
- Na dzień przed próbami karmienia usuń 10% roztwór do karmienia glukozą.
UWAGA: W trakcie eksperymentów wykorzystano 3 jednodniowe komary.
2. Karmienie komarów
- Przygotowanie sztucznych diet płynnych
- Przygotuj sztuczne diety płynne w sterylnych warunkach w komorze z przepływem laminarnym. Przygotuj bogatą dietę płynną (r-liq_diet), dodając następujące składniki do początkowej diety płynnej (i-liq_diet; Zmodyfikowana pożywka Eagle'a firmy Dulbecco [wysoka zawartość glukozy z L-glutaminą], patrz tabela 1): 0,55 g/L ATP, 1 g/L cholesterolu i 200 g/l albuminy surowicy bydlęcej (BSA). Dokładnie wymieszaj wszystkie składniki i przefiltruj za pomocą mikrofiltra 0,45 μm.
UWAGA: Nie przechowuj diet; Do każdego eksperymentu należy przygotowywać diety świeżo z roztworów podstawowych, ponieważ tracą one jakość podczas przechowywania. Składniki diet opisano w tabeli 1.
- Przygotuj sztuczne diety płynne w sterylnych warunkach w komorze z przepływem laminarnym. Przygotuj bogatą dietę płynną (r-liq_diet), dodając następujące składniki do początkowej diety płynnej (i-liq_diet; Zmodyfikowana pożywka Eagle'a firmy Dulbecco [wysoka zawartość glukozy z L-glutaminą], patrz tabela 1): 0,55 g/L ATP, 1 g/L cholesterolu i 200 g/l albuminy surowicy bydlęcej (BSA). Dokładnie wymieszaj wszystkie składniki i przefiltruj za pomocą mikrofiltra 0,45 μm.
- Pobieranie krwi myszy
- Znieczulenie 6-8 tygodniowych samic myszy CD1 (Mus musculus) ketaminą (120 mg/kg) i ksylazyną (16 mg/kg) drogą dootrzewnową.
- Wykonaj nakłucie serca (Rysunek 1), gdy mysz nie wykazuje żadnej reakcji mięśniowej w odpowiedzi na różne bodźce fizyczne (np. szczypanie palców u nóg i ogona).
- Krew należy pobrać za pomocą sterylnej strzykawki o pojemności 1 ml z igłą o wymiarach 27 G x 1/2 (0,4 x 12 mm2), która zawiera 100 μl heparyny (soli sodowej) o stężeniu 1 mg/mL, aby zapobiec tworzeniu się skrzepów krwi. Utrzymywać temperaturę krwi w temperaturze 37 °C za pomocą łaźni wodnej.
- Sztuczne karmienie
- Zbierz około 30 samic komarów z klatki za pomocą aspiratora.
- Przenieś samice komarów do papierowych kubków o pojemności 500 ml i przykryj drobną siatką moskitiery, aby nie mogły uciec. Zastosuj szklany podajnik podłączony do plastikowych rurek, aby utrzymać stały przepływ wody do górnej części każdej filiżanki (Rysunek 2). Zapewnić stały przepływ wody do cylindrycznej rurki i podajnika, tak aby temperatura wewnątrz była utrzymywana na poziomie około 37.5 °C.
UWAGA: Standardowe urządzenie do sztucznego karmienia szklanym dzwonem16 zostało użyte do dostarczania opracowanych diet samicom komarów. - Rozciągnąć membranę z folii parafinowej w poprzek ujścia szklanego podajnika, aby pomieścić posiłek.
- Podgrzej i-liq_diet i r-liq_diet w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej. Nałóż 1 ml do podajnika szklanki. Karm komary przez 60 minut w ciemności i-liq_diet, r-liq_diet lub świeżą krwią myszy. Wykonać testy w temperaturze 26 °C.
- Ocena szybkości karmienia.
- Po sztucznym karmieniu komary należy znieczulić na zimno w temperaturze -20 °C przez 30 s. Umieść komary w schłodzonej szalce Petriego.
- Zapisz liczbę w pełni nabrzmiałych (Rysunek 3) samic komarów.
UWAGA: Procent karmionych komarów jest używany jako wskaźnik sukcesu karmienia.
3. Cechy historii życia
- Produkcja jaj i płodność
- Przenieś w pełni nabrzmiałe samice za pomocą pędzla do indywidualnych klatek (20 cm x 20 cm x 20 cm).
- Utrzymuj komary w temperaturze 26 ± 1 °C, wilgotności 75% i cyklu 12 h: 12 godzin światło: ciemność z 10% glukozy ad libitum.
- Czterdzieści osiem godzin po karmieniu dodaj na dnie nawilżoną bibułę filtracyjną do składania jaj (ryc. 4). Policz jaja po 48 i 72 godzinach od dodania bibuły do składania jaj za pomocą ręcznej lupy. Zalej bibułę filtracyjną wodą destylowaną, aby zebrać jaja.
- Śmiertelność larw
- Zbierz jajka do tacek (23 cm x 15 cm x 6 cm) wypełnionych wodą destylowaną (Rysunek 5). Podczas eksperymentów utrzymuj stały poziom wody w tacach.
- Codziennie karm larwy około 13 mg mielonego pokarmu dla ryb na tacę. Zastosuj podobny reżim karmienia do wszystkich tacek z replikami.
- Codziennie usuwaj martwe poczwarki i larwy. Zakończ eksperymenty, gdy wszystkie poczwarki rozwiną się w dorosłe osobniki i policz liczbę dorosłych samców i samic.
- Rejestruj daty wylęgu i śmierci oraz obliczaj wskaźniki śmiertelności.
- długowieczność
- Zbierz 15 dorosłych samców i 15 dorosłych samic z pokolenia F1 z każdej grupy dietetycznej. Trzymaj samce i samice w tej samej klatce.
- Podawaj dorosłym 10% roztwór glukozy ad libitum. Codziennie usuwaj martwe dorosłe osoby.
- Utrzymuj komary w tej samej temperaturze, wilgotności, warunkach cyklu świetlnego i reżimie podawania cukru, jak opisano powyżej.
- Zarejestruj daty śmierci i oblicz długowieczność.
- Pomiar długości skrzydła
- Znieczulenie na zimno pięciodniowych dorosłych komarów F1 (samca i samicy) z każdej grupy dietetycznej w temperaturze -20 °C przez 90 s.
- Pod stereoskopem delikatnie chwyć kleszczami klatkę piersiową każdego komara i umieść je brzuszną stroną do góry.
- Zebrać oba skrzydełka za pomocą skalpela i umieścić je na czystym szkiełku mikroskopowym zawierającym wysuszoną kroplę podłoża montażowego. Za pomocą igły 20 G dodaj dodatkowe podłoże mocujące do krawędzi szkiełka nakrywkowego i powoli opuść szkiełko nakrywkowe na skrzydełka.
- Zmierz długość skrzydła (Rysunek 6) za pomocą stereoskopu za pomocą mikrometru.
Wyniki
Wyniki opisane poniżej porównują wydajność samic komarów z rodzaju Anopheles karmionych sformułowanym, bogatym sztucznym pokarmem (r-liq_diet) oraz komarów karmionych początkową dietą płynną (i-liq_diet) lub świeżą krwią. Dietę przetestowano zgodnie ze schematem protokołu przedstawionym na Rysunku 7. Opisana tutaj dieta r-liq_diet jest częścią patentu (PCT/IB2019/052967).
Procent w pełni nasyconych samic
Liczba nasyconych samic komarów karmionych dietą r-liq_diet (89%) była istotnie wyższa niż liczba nasyconych samic karmionych krwią (56%) (Rysunek 8).
Płodność i rozrodczość
W celu oceny jakości żywieniowej diet i-liq_diet oraz r-liq_diet zastosowano wskaźniki płodności i rozrodczości samic w pierwszym cyklu gonotroficznym. Samice karmione świeżą krwią kręgowców złożyły średnio 24 ± 11 jaj, natomiast samice karmione dietą r-liq_diet złożyły średnio 25 ± 5 jaj (Tabela 2). U samic karmionych dietą i-liq_diet nie zaobserwowano składania jaj.
Śmiertelność pokolenia F1
Oceniono kondycję komórkomózgów F1 z kolonii karmionych krwią kręgowców lub dietą r-liq_diet. Odnotowano śmiertelność larw, poczwarek oraz osobników dorosłych. Zmienność (błąd standardowy średniej [SEM]) była wyższa u komarów karmionych krwią (Rysunek 9 i Tabela 2) w porównaniu do komarów karmionych dietą r-liq_diet. Pokolenie F1 komarów karmionych krwią lub dietą r-liq_diet wykazało porównywalne wskaźniki śmiertelności i przeżywalności.
Przewidywana długość życia F1
Według szacunków Center for Disease Control and Prevention dzikie dorosłe samice komarów żyją do miesiąca, lecz prawdopodobnie nie przeżywają więcej niż 1−2 tygodnie, natomiast samce żyją około tygodnia i żywią się wyłącznie nektarem oraz innymi źródłami cukrów. Zauważono, że różnice w spożyciu pokarmu przez rodziców mogą wpływać na przeżywalność potomstwa komarów17. W naszym doświadczeniu dorosłe samice i samce w grupach blood (samice 24,5 ± 6,8; samce 18,5 ± 6,9) oraz r-liq_diet (samice: 22,5 ± 8,1; samce: 11,9 ± 6,9) miały zbliżoną średnią przewidywaną długość życia (Tabela 3), a samice wykazały dłuższą żywotność w porównaniu do samców.
Wielkość ciała F1
Długość skrzydła posłużyła jako wskaźnik wielkości ciała osobników dorosłych. W porównaniu z innymi gatunkami, dorosłe osobniki Anopheles są komarami o małej lub średniej wielkości, z długością skrzydła od 2.8 do 4.4 mm18. Wielkość ciała dorosłych komarów Anopheles pokolenia F1 karmionych dietą r-liq_diet mieściła się w oczekiwanym zakresie i była zbliżona do wielkości komarów z insektarium karmionych krwią (Rysunek 10).
Analiza statystyczna
Przedstawione dane reprezentują średnią z co najmniej trzech niezależnych eksperymentów (chyba że zaznaczono inaczej). Słupki błędów reprezentują SEM. W przypadku danych o rozkładzie Gaussa grupy niezależne porównywano za pomocą testu t Studenta, w przeciwnym razie zastosowano test Mann-Whitneya. Różnice między grupami karmionymi sztuczną dietą analizowano za pomocą dokładnego testu Fishera i uznano za istotne przy P ≤ 0,05.
Rycina 1: Pobieranie krwi z myszy CD1 poprzez punkcję wewnątrzsercową. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 2: Standardowy aparat do sztucznego karmienia. Szklany karmnik zawiera r-liq_diet, którą podaje się samicom komarów z rodzaju Anopheles. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
Rysunek 3: Komary Anopheles po sztucznym karmieniu. Od lewej do prawej: w pełni nasycona samica karmiona r-liq_diet, nienasycona samica karmiona r-liq_diet, samiec oraz w pełni nasycona samica karmiona krwią myszy. Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.
Rycina 4: Jaja Anopheles złożone 48 h po karmieniu samic dietą r-liq_diet. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 5: Stadia larw L2, które wykluły się z jaj, zostały zebrane na papierze filtracyjnym i umieszczone w tackach z wodą destylowaną. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
Rycina 6: Prawe skrzydło samicy komara Anopheles coluzzii z generacji F1. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 7: Schemat protokołu testowania sztucznej diety. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 8: Tempo żerowania samic komarów karmionych dietami sztucznymi lub krwią. Gwiazdki oznaczają istotne różnice między komarami karmionymi dietami r-liquid i i-liquid a grupą kontrolną karmioną krwią. Dwustronny dokładny test Fishera: ****P ≤ 0.0001 (ryzyko względne: 0.4828, 95% przedział ufności [CL]: 0.3776 do 0.6194) dla diety r-liquid w porównaniu z krwią, *P = 0.0335 (ryzyko względne: 1.379, 95% CL: 1.044 do 1.836) dla krwi w porównaniu z dietą i-liquid. Niebieski: niekarmione; czerwony: karmione. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 9: Wpływ sformułowanej bezkrwistej paszy na śmiertelność oraz stosunek samców do samic komarów F1 Anopheles coluzzii. Przeprowadzono trzy niezależne eksperymenty, w każdym z nich wykorzystując po 30 komarów na dietę. Nieparzysty test t nie wykazał istotnych różnic między grupą karmioną krwią a grupą karmioną dietą r-liq_diet (wartości P wahały się od 0,5047 do 0,8491). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 10: Długość skrzydła. Do wyznaczenia długości skrzydła wykorzystano odległość od nacięcia osiowego do żyłki R4+5 z wyłączeniem szczecinek frędzlowatych. Wielkość oceniono dla 5 samic i 5 samców z każdej grupy dietetycznej (średnia ± SEM). Wartości przedstawiono jako średnia ± SEM. Kolor łososiowy: r-liq_diet; kolor czerwony: krew kręgowców. Nieparzysty test t; lewe skrzydło samicy: t = 1.300, df = 8, P = 0.2298; lewe skrzydło samca: t = 2.400, df = 8, P = 0.0432; prawe skrzydło samicy: t = 1.300, df = 8, P = 0.2298; prawe skrzydło samca: t = 2.277, df = 7, P = 0.0569. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
| Komponenty | g/L |
| Adenozynotrifosforan | 0.55 |
| Albumina surowicy bydlęcej | 200 |
| *Cholesterol | 1 |
| Chlorek wapnia bezwodny | 0.2 |
| Chlorek choliny | 0.004 |
| D-pantenotranian wapnia (witaminy B5) | 0.004 |
| D-glukoza bezwodna | 4.5 |
| Azotan żelaza(III) nonohydrat | 0.0001 |
| Kwas foliowy | 0.004 |
| Glicyna | 0.03 |
| I-inozytol | 0.007 |
| monochlorowodorek L-argininy | 0.084 |
| dwuwodowodorek L-cystyny | 0.063 |
| L-glutamina | 0.584 |
| monohydrat monochlorek L-histydyny | 0.042 |
| L-izoleucyna | 0.105 |
| L-leucyna | 0.105 |
| monochlorowodorek L-lizyny | 0.146 |
| L-metionina | 0.03 |
| L-fenyloalanina | 0.066 |
| L-seryna | 0.042 |
| L-treonina | 0.095 |
| L-tryptofan | 0.016 |
| Dwuwodny dwusodowy l-tyrozynian | 0.104 |
| L-walina | 0.094 |
| Siarczan magnezu bezwodny | 0.098 |
| Niacynamid (nikotynamid) | 0.004 |
| Czerwony fenol | 0.015 |
| Chlorek potasu | 0.4 |
| Monohydrochlorowodorek pyridoksyny | 0.004 |
| Sól sodowa kwasu pirogronowego | 0.011 |
| Ryboflawina (witaminy B2) | 0.0004 |
| Wodorowęglan sodu | 3.7 |
| Chlorek sodu | 6.4 |
| Wodorofosforan sodu bezwodny | 0.109 |
| Amonowodorek tiaminy (witaminy B1) | 0.004 |
| *Tylko w r-liq_diet | |
Tabela 1: Skład diety płynnej i-liquid oraz diety płynnej r-liquid.
| Całkowita liczba jaj (± SEM) | Liczba jaj/samica (± SEM) | |
| Krew | 733 ± 330 | 24 ± 11 |
| dieta-ciekła | 763 ± 164 | 25 ± 5 |
| dieta i-liq | 0 | 0 |
Tabela 2: Partie jaj produkowane przez Anopheles coluzzii samice. Dla każdej diety eksperymentalnej przeprowadzono trzy niezależne doświadczenia, wykorzystując w każdym z nich 30 samic komarów.
| Samice (dni ± SEM) | Samce (dni ± SEM) | |
| Krew | 24.5 ± 6.8 | 18.5 ± 6.9 |
| r-dieta_płynna | 22.5 ± 8.1 | 11.9 ± 6.9 |
Tabela 3: Przewidywana długość życia F1 Anopheles komary. Długość życia komarów pokolenia F1, pochodzących od sztucznie karmionych osobników F0, oceniano poprzez rejestrację dat wylęgu i śmierci każdego komara z tej samej grupy dietetycznej (monitorowano 15 samic i 15 samców). Wyniki przedstawiono jako średnią długość życia komarów w danej grupie dietetycznej.
Dyskusja
Sukces naszej opracowanej diety bezkrwistej jest prawdopodobnie wynikiem synergicznego fizjologicznego działania wszystkich składników dodanych do i-liq_diet (bogatego w cukier, aminokwasy, witaminy i mikroelementy): BSA (źródło białka), ATP (fagostymulant) i cholesterolu (źródło lipidów). Suplementacja r-liq_diet poszczególnymi składnikami sama w sobie nie była skuteczna w stymulowaniu produkcji jaj (dane nie pokazane). Jedną z wad protokołu może być koszt niektórych składników, takich jak cholesterol. Mimo to jego obecność jest fundamentalna, ponieważ owady nie są w stanie go syntetyzować19 , a cząsteczka ta jest prekursorem hormonów ekdysteroidowych, które regulują syntezę żółtka i dojrzewanie jaj u stawonogów20. Niższe ilości cholesterolu powinny być badane w celu optymalizacji potrzebnej ilości w celu obniżenia kosztów i zwiększenia korzyści płynących ze sztucznej diety.
Kolejnym ograniczeniem metody jest to, że sztuczna dieta musi być świeżo przygotowana z roztworów podstawowych, ponieważ raz przygotowana w końcowej postaci płynnej traci jakość po przechowywaniu. W przyszłości nasza dieta może być przygotowywana w postaci suszu elektrycznego, podobnie jak SkitoSnackt, sztuczny zamiennik mączki z krwi dla komarów Aedes aegypti 21.
Oprócz dostarczania niezbędnych składników odżywczych, sztuczny posiłek musi przyciągać i stymulować samice komarów do żerowania w taki sam sposób, jak wtedy, gdy żywią się świeżą krwią kręgowców. Opisana tu sztuczna dieta bezkrwawa spowodowała 20% wzrost liczby w pełni nabrzmiałych samic komarów w porównaniu z grupą kręgowców karmionych krwią. Ta pośrednia miara atrakcyjności może być dodatkowo wyjaśniona za pomocą olfaktometrów, aby potwierdzić, że sztuczna dieta jest bardziej atrakcyjna i bardziej atrakcyjna dla komarów niż świeża krew.
Największy wpływ diety na śmiertelność larw zaobserwowano w przypadku larw pochodzących od komarów żywiących się krwią, co sugeruje, że sztuczna dieta o stabilnym składzie może przyczynić się do zmniejszenia śmiertelności i poprawy sukcesu lęgowego komarów w porównaniu ze świeżą krwią. Mniej przewidywalny wynik posiłku z krwi może wynikać z różnic w składzie gospodarza17 i obecności we krwi cząsteczek, które mogą zakłócać fizjologię komarów22. Powyższe fakty podkreślają korzyści dla wysokiej jakości hodowli komarów w diecie bezkrwawej.
Ogólnie rzecz biorąc, średnia liczba jaj składanych w naszym badaniu była niska w stosunku do tych zgłaszanych u niektórych owadów, ale średnia liczba jaj składanych w jajach była porównywalna z hodowanym w laboratorium szczepem A. gambiae karmionym ludzką krwią (22,6 ± 5,5 jaj/samicę)23. Nie zaobserwowano istotnych różnic statystycznych między naszymi grupami eksperymentalnymi karmionymi zarówno świeżą krwią, jak i sztucznymi posiłkami (Tabela 2), co sugeruje, że wdrożenie sztucznych systemów żywienia membranowego w naszej opracowanej diecie jest wystarczające do utrzymania i rozmnażania kolonii komarów Anopheles w niewoli.
Sztuczne, bezkrwawe posiłki mogą utrzymać kolonie Aedes 22, ale w przypadku komarów Anopheles są ograniczone lub nie mają żadnego skutku11. Niedawno opisano sztuczny posiłek na bazie osocza dla komarów Anopheles 24 , ale wskaźniki żerowania i potencjał reprodukcyjny były niskie. Nasze wyniki stanowią znaczny postęp w dziedzinie wiedzy naukowej (sprawdzonej przez Gonzalesa i Hansena11), ponieważ nasz sformułowany r-liq_diet miał podobną lub lepszą wydajność niż standardowa mączka z krwi kręgowców. Dalsza poprawa stabilności i kosztów magazynowania powinna poszerzyć zakres jego zastosowania.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Chcielibyśmy podziękować Dinorze Lopes (IHMT-NOVA Animal Facility) za wsparcie techniczne, Joanie Gomes i Anie Catarinie Alves (IHMT-NOVA Insectary Facility) za utrzymanie kolonii komarów Anopheles. Finansowane przez Fundację Billa i Melindy Gatesów (OPP1138841), Fundação para a Ciência e Tecnologia (UID/Multi/04413/201, UID/Multi/04326/2013, SFRH/BPD/89811/2012, CEECIND/00450/2017).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Hydrat soli disodowej adenozyno5'-trifosforanu (ATP) | Sigma Aldrich | A2383 | |
| BSA-Albumina surowicy bydlęcej | Sigma Aldrich | A790G | |
| Cholesterol | MP Biomedicals | 199342 | |
| Zmodyfikowana pożywka Eagle's Dulbecco (wysoka glukoza z L-glutaminą) | Lonza Bioscience | BE12-604F | |
| Montaż Entellan średni | Merck | 1079610100 | |
| Glassfeeder | Lokalny szklarz | z projektu | |
| Heparyna Sól sodowa | Pan Reac AppliChem | A3004,0001 | |
| Imalgè ne 1000 | Merial, Portugalia | 01MER122 | |
| Igła 20 G x 1" Igła 0,9 x 25 mm | Terumo Europe | NN-2025R | |
| Parafilm | Sigma Aldrich | P6543-1EA | |
| Rompun | Bayer, Portugalia | 7427831 | |
| Strzykawka do sterylizacji Millex-HV 0,45 | Millipore | SLHVR25KS | |
| 1ml, 27 G x ½ " Igła 0,4 x 12 mm | Terumo Europe | BS-NIN2713 | |
| Teich Mix Astra Pond | Astra | 4030733100957 | |
| Tetra Płatki Złotej Rybki | Tetra | 4004218742642 |
Bibliografia
- WHO. World Malaria Report. , World Health Organization. (2016).
- Hansen, I. A., Attardo, G. M., Rodriguez, S. D., Drake, L. L. Four-way regulation of mosquito yolk protein precursor genes by juvenile hormone-, ecdysone-, nutrient-, and insulin-like peptide signaling pathways. Frontiers in Physiology. 5, 103(2014).
- Catteruccia, F., Crisanti, A., Wimmer, E. A. Transgenic technologies to induce sterility. Malaria Journal. 8, Suppl 2 7(2009).
- Dame, D. A., Curtis, C. F., Benedict, M. Q., Robinson, A. S., Knols, B. G. J. Historical applications of induced sterilisation in field populations of mosquitoes. Malaria Journal. 8, Suppl 2 2(2009).
- Lacroix, R., et al. Open Field Release of Genetically Engineered Sterile Male Aedes aegypti in Malaysia. PLoS One. 7, 42771(2012).
- Lea, A. O., Knierim, J. A., Dimond, J. B., Delong, D. M. A Preliminary Note on Egg Production from Milk-Fed Mosquitoes. The Ohio Journal of Science. 55, 1-21 (1955).
- Kogan, P. H. Substitute blood meal for investigating and maintaining Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 27, 709-712 (1990).
- Griffith, J. S., Turner, G. D. Culturing Culex quinquefasciatus mosquitoes with a blood substitute diet for the females. Medical and Veterinary Entomology. 10, 265-268 (1996).
- Jason Pitts, R. A blood-free protein meal supporting oogenesis in the Asian tiger mosquito, Aedes albopictus (Skuse). Journal of Insect Physiology. 64, 1-6 (2014).
- Gonzales, K. K., Tsujimoto, H., Hansen, I. A. Blood serum and BSA, but neither red blood cells nor hemoglobin can support vitellogenesis and egg production in the dengue vector Aedes aegypti. PeerJ. 3, 938(2015).
- Gonzales, K. K., Hansen, I. A. Artificial Diets for Mosquitoes. International Journal of Environmental Research and Public Health. 13 (12), 1267(2016).
- Cosgrove, J. B., Wood, R. J. Effects of variations in a formulated protein meal on the fecundity and fertility of female mosquitoes. Medical and Veterinary Entomology. 10, 260-264 (1996).
- Attardo, G. M., Hansen, I. A., Shiao, S. -H., Raikhel, A. S. Identification of two cationic amino acid transporters required for nutritional signalling during mosquito reproduction. Journal of Experimental Biology. 209, 3071-3078 (2006).
- Clements, A. N. The biology of mosquitoes: Development, nutrition, and reproduction. , Chapman & Hall. New York, NY. (1992).
- Talyuli, O. A., et al. The use of a chemically defined artificial diet as a tool to study Aedes aegypti physiology. Journal of Insect Physiology. 83, 1-7 (2015).
- Lopes, L. F., Abrantes, P., Silva, A. P., Dorosario, V. E., Silveira, H. Plasmodium yoelii: The effect of second blood meal and anti-sporozoite antibodies on development and gene expression in the mosquito vector, Anopheles stephensi. Experimental Parasitology. 115, 259-269 (2007).
- Phasomkusolsil, S., et al. Maintenance of mosquito vectors: effects of blood source on feeding, survival, fecundity, and egg hatching rates. Journal of Vector Ecology. 38, 38-45 (2013).
- Gillies, M. T., De Meillon, B. The Anophelinae of Africa South of the Sahara (Ethiopian zoogeographical region). Publications of the South African Institute for Medical Research. 54, 1(1968).
- Canavoso, L. E., Jouni, Z. E., Karnas, K. J., Pennington, J. E., Wells, M. A. Fat metabolism in insects. Annual Review of Nutrition. 21, 23-46 (2001).
- Clifton, M. E., Noriega, F. G. The fate of follicles after a blood meal is dependent on previtellogenic nutrition and juvenile hormone in Aedes aegypti. Journal of Insect Physiology. 58, 1007-1019 (2012).
- Gonzales, K. K., et al. The Effect of SkitoSnack, an Artificial Blood Meal Replacement on Aedes aegypti Life History Traits and Gut Microbiota. Scientific Reports. 8, 11023(2018).
- Vodovotz, Y., Zamora, R., Lieber, M. J., Luckhart, S. Cross-talk between nitric oxide and transforming growth factor-beta1 in malaria. Current Molecular Medicine. 4, 787-797 (2004).
- Sumba, L. A., et al. Daily oviposition patterns of the African malaria mosquito Anopheles gambiae Giles (Diptera: Culicidae) on different types of aqueous substrates. Journal of Circadian Rhythms. 2, 6(2004).
- Baughman, T., et al. A highly stable blood meal alternative for rearing Aedes and Anopheles mosquitoes. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11, 0006142(2017).
Przedruki i uprawnienia
