Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Różnicowanie komórek HC11 i EpH4 nabłonka piersi myszy

8.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60147

⸱

27 lutego 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical and Molecular Sciences and Department of Pathology and Molecular Medicine, Queen's University, Kingston, 2Department of Chemical and Physical Sciences, University of Toronto, Mississauga, 3Department of Laboratory Medicine, Brampton Civic Hospital Campus, William Osler Health System, 4Latner Thoracic Surgery Research Laboratories

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy techniki indukcji różnicowania dwóch linii nabłonka piersi, HC11 i EpH4. Podczas gdy obie wymagają płodowej surowicy cielęcej, insuliny i prolaktyny do produkcji białek mleka, komórki EpH4 mogą w pełni różnicować się w mammosfery w trójwymiarowej hodowli. Te uzupełniające się modele są przydatne do badań transdukcji sygnału różnicowania i nowotworu.

Streszczenie

Kadheryny odgrywają ważną rolę w regulacji różnicowania komórek, jak również nowotworów. W niniejszej pracy opisano pochodzenie i metody indukcji różnicowania dwóch linii komórkowych nabłonka piersi myszy, HC11 i EpH4, oraz ich zastosowanie do badania uzupełniających się etapów rozwoju gruczołu sutkowego i transformacji nowotworowej.

Linia komórkowa nabłonka piersi myszy HC11 wywodzi się z gruczołu sutkowego ciężarnej myszy Balb/c. Różnicuje się, gdy rośnie do zbiegu przyczepiony do plastikowej powierzchni szalki Petriego w pożywce zawierającej płodową surowicę cielęcą i Hydrokortyzon, Insulinę i Prolaktynę (pożywka HIP). W tych warunkach komórki HC11 wytwarzają białka mleka β-kazeinę i kwaśne białko serwatkowe (WAP), podobnie jak komórki nabłonka sutka w okresie laktacji, i tworzą szczątkowe struktury przypominające gruczoły sutkowe zwane "kopułami".

Linia komórkowa EpH4 pochodziła z spontanicznie unieśmiertelnionych komórek nabłonka gruczołu sutkowego myszy wyizolowanych od ciężarnej myszy Balb/c. W przeciwieństwie do HC11, komórki EpH4 mogą w pełni różnicować się w sferoidy (zwane również mammosferami) podczas hodowli w trójwymiarowych (3D) warunkach wzrostu w pożywce HIP. Komórki są trypsynizowane, zawieszone w 20% matrycy składającej się z mieszaniny białek macierzy zewnątrzkomórkowej wytwarzanych przez komórki mięsaka myszy Engelbreth-Holm-Swarm (EHS), powlekane na wierzchu warstwy skoncentrowanej matrycy pokrywającej plastikową szalkę Petriego lub płytkę wielodołkową i pokryte warstwą 10% pożywki HIP zawierającej matrycę. W tych warunkach komórki EpH4 tworzą puste sferoidy, które wykazują polaryzację wierzchołkowo-podstawową, puste światło i wytwarzają β-kazeinę i WAP.

Korzystając z tych technik, nasze wyniki pokazały, że intensywność sygnału kadheryny/Rac jest krytyczna dla różnicowania komórek HC11. Podczas gdy Rac1 jest niezbędny do różnicowania, a niskie poziomy aktywowanego RacV12 zwiększają różnicowanie, wysokie poziomy RacV12 blokują różnicowanie, indukując nowotwór. Natomiast komórki EpH4 reprezentują wcześniejszy etap różnicowania nabłonka sutka, który jest hamowany nawet przez niski poziom RacV12.

Wprowadzenie

W normalnych tkankach lub nowotworach, komórki mają szerokie możliwości przylegania do swoich sąsiadów w trójwymiarowej organizacji, co jest naśladowane w hodowli przez wzrost komórek o dużej gęstości. Adhezja międzykomórkowa odbywa się głównie za pośrednictwem receptorów kadheryny, które definiują architekturę komórek i tkanek. Co ciekawe, niedawno wykazano, że kadheryny również odgrywają potężną rolę w transdukcji sygnału, zwłaszcza w sygnalizacji przeżycia1. Paradoksalnie, niedawno odkryto, że niektóre z tych sygnałów adhezji między komórkami emanujących z kadheryny są wspólne zarówno dla różnicowania, jak i nowotworu2. W tym miejscu opisano metody indukcji i oceny różnicowania w dwóch reprezentatywnych typach linii komórkowych nabłonka piersi myszy, HC11 i EpH4.

Linia komórkowa nabłonka piersi myszy HC11 może stanowić użyteczny model do badania różnicowania komórek nabłonkowych. Komórki HC11 to linia komórkowa pochodząca z COMMA-1D, pochodząca z gruczołu sutkowego kobiety w połowie ciąży Balb/c mouse3. W przeciwieństwie do innych klonów pochodnych COMMA-1D, klon HC11 nie wymaga egzogennie dodanej macierzy zewnątrzkomórkowej lub kouprawy z innymi typami komórek w celu indukcji in vitro endogennego genu β-kazeiny przez hormony laktogenne3. Ta linia komórkowa była szeroko stosowana w badaniach różnicowania, ponieważ zachowała ważne cechy prawidłowego nabłonka sutka: komórki HC11 mogą częściowo odtworzyć nabłonek przewodowy w oczyszczonej poduszeczce tłuszczowej sutka4. Co więcej, mogą różnicować się w dwuwymiarowej (2D) kulturze, gdy rosną do zbiegu przyczepione do plastikowej powierzchni szalki Petriego w obecności steroidu, takiego jak Hydrokortyzon lub deksametazon, oprócz Insuliny i Prolaktyny (pożywka HIP) bez naskórkowego czynnika wzrostu (EGF), inhibitora różnicowania5,6,7. W tych warunkach komórki HC11 wytwarzają białka mleka, takie jak β-kazeina i WAP, które są wykrywalne przez Western blot w ciągu 4 dni po indukcji. W tym samym czasie część komórek HC11 tworzy szczątkowe struktury przypominające gruczoły sutkowe, zwane w sposób stochastyczny "kopułami". Kopuły są widoczne 4-5 dni po indukcji i stopniowo powiększają się aż do 10 dnia, czemu towarzyszy wzrost produkcji β-kazeiny8. Co ciekawe, komórki HC11 posiadają zmutowany p539, a zatem reprezentują stan przednowotworowy. Z tego powodu model HC11 idealnie nadaje się do badania sieci sygnalizacyjnych różnicowania w połączeniu z nowotworem w tym samym układzie komórkowym.

Komórki EpH4, pochodna komórek IM-2, to nienowotworowa linia komórkowa pierwotnie pochodząca z spontanicznie unieśmiertelnionych komórek nabłonka gruczołu sutkowego myszy wyizolowanych od myszy w połowie ciąży Balb/c mouse10. Komórki EpH4 tworzą ciągłe monowarstwy nabłonkowe w hodowli 2D, ale nie różnicują się w struktury podobne do gruczołów10,11. Jednak po wzroście 3D w materiale składającym się z mieszaniny białek macierzy zewnątrzkomórkowej wytwarzanych przez komórki mięsaka myszy EHS12 (matryca EHS, matryca lub Matrigel, patrz tabela materiałów), oprócz stymulacji HIP, komórki EpH4 mogą podsumować początkowe etapy różnicowania gruczołu sutkowego. W tych warunkach komórki EpH4 tworzą sferoidy (zwane również mammosferami), które wykazują polaryzację wierzchołkowo-podstawową i puste światło oraz są zdolne do wytwarzania białek mleka, β-kazeiny i WAP, podobnie jak komórki nabłonka sutka w okresie laktacji. W przeciwieństwie do komórek HC11, które są niezróżnicowane, a niektóre wyrażają markery mezenchymalne13, komórki EpH4 wykazują czysto luminalną morfologię14. Doniesiono również, że komórki EpH4 wytwarzają białka mleka w hodowli 2D poprzez stymulację deksametazonem, insuliną i prolaktyną15. Jednak takie podejście wyklucza badanie efektów regulacyjnych, które naśladują mikrośrodowisko gruczołu sutkowego w hodowli 3D.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Posiewanie komórek HC11

  1. W okapie z przepływem laminarnym przy użyciu sterylnych technik przygotuj butelkę z 50 ml pożywki komórkowej HC11: RPMI-1640 z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 5 μg/ml insuliny i 10 ng/ml EGF (patrz tabela materiałów).
  2. Płytka około 400 000 komórek na 3 cm szalka Petriego: Przełóż dwie 10-centymetrowe, 50% zlewające się płytki Petriego na dwadzieścia 3-centymetrowych szalek w pożywce HC11. Komórki muszą być dobrze rozłożone, ale należy unikać wysuszania.
    1. Zassać pożywkę do kolby za pomocą pompy próżniowej.
    2. Dodać 250 μl trypsyny (patrz tabela materiałów) na płytkę o średnicy 10 cm. Zakręć i uderz w płytkę z boków, trzymając ją poziomo, aby rozprowadzić trypsynę i usunąć przyczepione komórki
    3. Obserwuj mikroskopię z kontrastem fazowym z obiektywem 4x, aby upewnić się, że komórki zaczęły odczepiać się od krawędzi przed pipetowaniem.
    4. Odessać około 1,5 ml pożywki HC11 w sterylnej, 9-calowej pipecie Pasteura i spryskać nią pionowo na komórki. Obróć szalkę Petriego podczas tryskania, aby usunąć wszystkie komórki. Musisz pracować szybko, aby uniknąć wysuszenia komórek.
    5. Przenieś wszystkie komórki do butelki z pożywką HC11 i zawiruj.
    6. Odpipetować 2 ml zawiesiny komórek na każdą 3 cm szalkę Petriego. Obróć szalki Petriego w poprzek, aby równomiernie się rozłożyły. Umieścić komórki w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  3. Następnego dnia lub gdy komórki są ~90-100% zlewne, odessaj pożywkę i zastąp ją pożywką z FBS i insuliną, ale bez EGF.

2. Indukcja, monitorowanie i oznaczanie ilościowe komórek HC11

  1. Po hodowaniu komórek w pożywce pozbawionej EGF przez 24 godziny, dodaj pożywkę różnicującą (pożywkę HIP) do dziesięciu 3 cm płytek: RPMI-1640 uzupełniony 10% FBS, 1 μg/ml Hydrokortyzonu (patrz Tabela Materiałów), 5 μg/ml Insuliny i 5 μg/ml Prolaktyny (patrz Tabela Materiałów) przez okres do 10 dni.
  2. Pozostałe dziesięć płytek o średnicy 3 cm należy zachować jako kontrolę: Zmień na pożywkę z 10% FBS i 5 μg/ml insuliny bez EGF i HIP.
  3. Zmieniaj pożywkę co 2-3 dni zarówno na komórki traktowane HIP, jak i kontrolne. Ostrożnie odpipetować pożywkę, aby upewnić się, że komórki się nie oderwą.
  4. Aby monitorować różnicowanie (tj. tworzenie się "kopuł"), obserwuj komórki pod mikroskopią z kontrastem fazowym (Rysunek 1A, lewy panel). Jeśli komórki wykazują ekspresję białka zielonej fluorescencji (GFP), obserwuj pod mikroskopią fluorescencyjną (wzbudzenie = 485/20; emisja = 530/25; powiększenie 240x; obiektyw 20x) (Rysunek 1A, prawy panel).
  5. Aby określić ilościowo stopień zróżnicowania, ekstrahuj białka z jednej szalki Petriego z każdej z komórek traktowanych HIP i kontrolnych, raz dziennie przez łącznie 10 dni i sonduj Western blot pod kątem β-kazeiny (patrz Tabela materiałów) (Rysunek 1B).
    1. Zeskrob komórki na lodzie za pomocą 1,5 ml lodowatej soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do plastikowej probówki wirówkowej o pojemności 1,8 ml.
    2. Granulować komórki w temperaturze 350 x g, 1 min, 4 °C.
    3. Szybko umyj pellet 2x lodowatym PBS. Odcedź wszelkie pozostałości.
    4. Przygotuj bufor do lizy: 50 mM HEPES (pH = 7,4), 150 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mM Na4P2O7, 1% NP-40, 100 mM NaF, 2 mM Na3VO4, 0,5 mM fluorku fenylometylosulfonylu (PMSF), 10 μg/ml aprotyniny, 10 μg/ml leupeptin16. Dodać 100 μl na 3 cm szalkę Petriego.
    5. Klarować lizat przez odwirowanie przy 10 000 x g przez 10 minut na zimno.
    6. Oznaczyć stężenie białka (patrz tabela materiałów) i załadować 10–20 μg białka z każdej próbki na 10% żel poliakrylamid-SDS.
    7. Elektroforeza przez 15 h przy 45 V, lub przy 100 V przez ~2–2,5 h.
    8. Przenieść na membranę nitrocelulozową lub PVDF za pomocą aparatu do elektroblottingu (patrz Tabela materiałów).
    9. Blok z 5% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) w soli fizjologicznej buforowanej tris z 0,1% Tween-20 (TBST).
    10. Dodać przeciwciało pierwszorzędowe, kozią anty-β-kazeinę rozcieńczoną w stosunku 1:2,000 lub mysią anty-β-aktynę rozcieńczoną w stosunku 1:1,000 (patrz tabela materiałów).
    11. Umyj 3x łyżką łyżkową po 5 minut za każdym razem.
    12. Dodać przeciwciało drugorzędowe, przeciwciało przeciwko kozom sprzężonym z peroksydazą chrzanową (HRP) rozcieńczone w stosunku 1:2,500 lub przeciwciało przeciwko koniu połączone z HRP rozcieńczone w stosunku 1:10,000.
    13. Umyj 3x łyżką łyżkową po 5 minut za każdym razem.
    14. Dodać odczynniki ECL do membrany zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela materiałów).

3. Posiewanie i 3D wzrost komórek EpH4 w matrycy EHS

UWAGA: Matryca jest ciekła w temperaturach <10 °C i stała w temperaturach wyższych. Przechowywać w temperaturze -80 °C. Rozmrozić w temperaturze 4 °C na noc przed użyciem. Przed użyciem należy wstępnie schłodzić płytki do kultur tkankowych i końcówki pipet w temperaturze -20 °C, a następnie przechowywać matrycę, płytki i końcówki pipet na lodzie, aby zapobiec ich zestaleniu.

  1. Hoduj komórki EpH4 w 2D w pożywce RPMI-1640 z 10% FBS i 5 μg/ml insuliny (EGF nie jest wymagany).
  2. Przygotować pożywkę wzrostową EpH4 uzupełnioną 10% (v/v, 3,500 μL) lub 20% (v/v 2,000 μL) w dwóch stożkowych probówkach o pojemności 50 ml. Przechowywać na lodzie, aż będzie gotowy do użycia.
  3. Pokryj 10 dołków (po 1 cm2 każda) płytki 24-dołkowej 150 μl nierozcieńczonej matrycy. Rozprowadź matrycę za pomocą końcówki do pipet. Unikaj tworzenia bąbelków. Delikatnie postukaj w boki płytki, trzymając ją poziomo, aby upewnić się, że matryca jest równomiernie rozłożona na dnie studzienki.
  4. Inkubować płytkę 24-dołkową w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę, aby umożliwić zestalenie się matrycy.
  5. Trypsynizuj komórki EpH4 zgodnie z powyższym opisem dla komórek HC11 i policz je za pomocą hemocytometru. Przenieść 5 x 104 komórek na studzienkę do sterylnej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml i wirować z prędkością 250 x g przez 5 minut.
  6. Ostrożnie zassać pożywkę i umieścić rurkę na lodzie.
  7. Ponownie zawiesić komórki w 350 μl pożywki wzrostowej EpH4 uzupełnionej 20% matrycą za pomocą końcówki pipety o pojemności 1 ml, trzymając stożkową probówkę na lodzie. Unikaj bąbelków. Ważne jest, aby zapewnić zawieszenie pojedynczej komórki.
  8. Po zestaleniu się matrycy dolnej warstwy (matryca powinna wydawać się półprzezroczysta i jaśniejsza w porównaniu z początkową powłoką studzienek), dodać 350 μl zawiesiny komórek do każdej powlekanej studzienki i umieścić w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C na ~ 1 godzinę, aby umożliwić zestalenie się 20% warstwy matrycy.
    1. Obserwuj komórki pod mikroskopem pod kątem kontrastu fazowego za pomocą obiektywu 4x. Pojedyncze komórki powinny być widoczne.
  9. Dodaj 200 μl pożywki EpH4 zawierającej 10% matrycy na wierzch 350 μl komórek zawieszonych w 20% matrycy. Inkubować w temperaturze 37 °C.

4. Indukcja różnicowania komórek EpH4 hodowanych w 3D (Rysunek 2)

UWAGA: Oprócz różnicowania, komórki EpH4 mogą również ulegać tubuogenezie, gdy są stymulowane HGF (czynnikiem wzrostu hepatocytów) w hodowli 3D. Wyrostki rurkowe można zobaczyć po 10 dniach stymulacji HIP i HGF.

  1. Rozpocznij indukcję różnicowania komórek EpH4 1 dzień po posianiu w macierzy. Ostrożnie usunąć 150 μl górnej pożywki zawierającej 10% matrycy z dołków za pomocą plastikowej końcówki do pipety. Dodać 200 μl pożywki EpH4 zawierającej HIP i 10% matrycy.
  2. Wymieniaj 10% podłoże matrix-HIP co 2 dni przez okres do 10 dni. Hoduj komórki kontrolne w tym samym 10% pożywce matrycowej bez HIP.
  3. Monitoruj formowanie się mammosfery pod wpływem kontrastu fazowego (Rysunek 3A, dolny panel).

5. Indukcja tubulingenezy komórek EpH4 hodowanych w 3D (Rysunek 3A i 3C)

  1. Przygotuj 24-dołkowe płytki i komórki EpH4 do wzrostu w matrycy, jak opisano w krokach 3.1–3.9. Następnego dnia po posianiu komórek w matrycy usunąć 150 μl pożywki EpH4 zawierającej 10% matrycy z dołków za pomocą plastikowej końcówki do pipety. Dodać 200 μl pożywki EpH4 zawierającej 10% matrycy, HIP i 20 ng/ml HGF (patrz tabela materiałów).
  2. Wymieniaj 10% podłoże matrycowe/HIP/HGF co 2 dni przez okres do 12–14 dni.
  3. Monitoruj tworzenie się kanalików pod mikroskopem za pomocą obiektywu 20x lub 40x (Rysunek 3A, prawy panel).

6. Kwantyfikacja różnicowania: Western Blot dla β-kazeiny

  1. Ostrożnie odpipetować 10% pożywkę matrix-HIP z dołków. Przepłucz 20% warstwę matrycy 2x 350 μl lodowatego PBS. Sferoidy powinny być nadal obecne w warstwie matrycy.
  2. Dodać 700–1 000 μl lodowatego PBS z 1 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) bezpośrednio do studzienek. Delikatnie odłącz dolną warstwę matrycy 100% od studzienki za pomocą końcówki pipety, aby odzyskać sferoidy obecne w tej warstwie. Wstrząsać delikatnie przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
  3. Ostrożnie przenieść zawiesinę sferoidalną do stożkowej rurki. Przepłukać studzienki ~500 μl PBS-EDTA, aby odzyskać wszelkie pozostałe sferoidy w studzienkach i dodać do stożkowej probówki.
  4. Kołysz się na lodzie przez dodatkowe 30 minut. Upewnij się, że matryca całkowicie się rozpuściła. Jeśli widoczne są grudki macierzy, dodaj więcej PBS-EDTA lub potrząsaj dłużej.
  5. Odwirować roztwór, aby granulować sferoidy o stężeniu 350 x g przez 5 minut.
  6. Odessać supernatant, zdać lizę sferoid w lodowato zimnym buforze do lizy i sondować pod kątem β-kazeiny, cykliny D1 i p120RasGAP za pomocą Western blot, jak w kroku 2.5 powyżej16. Jako przeciwciała pierwszorzędowe należy użyć koziej anty-β-kazeiny rozcieńczonej 1:2,000, króliczej antycykliny D1 rozcieńczonej 1:2,000 i mysiego anty-p120 rozcieńczonego 1:2,000. W przypadku przeciwciał drugorzędowych należy użyć przeciwciał przeciwko kozom sprzężonym z HRP w stosunku 1:2,500, w stosunku do królików w stosunku 1:2,500 i w stosunku do koni połączonych z HRP w stosunku 1:10,000.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Od dawna wiadomo, że różnicowanie komórek nabłonkowych i adipocytów wymaga osiągnięcia konfluencji oraz zaangażowania kadheryn2. My i inni badacze wykazaliśmy, że adhezja międzykomórkowa i zaangażowanie E- lub N-kadheryny oraz kadheryny-1, do czego dochodzi podczas konfluencji hodowlanych komórek, wywołuje gwałtowny wzrost aktywności małych GTPaz Rac oraz białka kontroli podziału komórkowego 42 (Cdc42), a proces ten prowadzi do aktywacji cytokin z rodziny interleukiny 6 (IL6) oraz Stat3 (przekaźni...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Komórki HC11 idealnie nadają się do badania różnicowania w połączeniu z transformacją nowotworową. Dodatkową zaletą jest to, że komórki HC11 są łatwo infekowane wektorami retrowirusowymi opartymi na Mo-MLV w celu ekspresji różnych genów. W naszych rękach komórki EpH4 były trudniejsze do zakażenia tymi samymi wektorami retrowirusowymi niż HC112.

Kontakt międzykomórkowy i zatrzymanie wzrostu są kluczowymi warunkami wstępnymi różnicowania komórek HC11. Tak więc, aby osiągn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają żadnych konfliktów do ujawnienia.

Podziękowania

Linia komórkowa HC11 została uprzejmie dostarczona przez Dr. D. Medina (Houston, TX). Autorzy są wdzięczni dr Andrew Craigowi z Queen's University za wiele odczynników i cennych sugestii. Komórki EpH4 były prezentem od dr C. Roskelleya (UBC, Vancouver). Colleen Schick zapewniła doskonałą pomoc techniczną w zakresie badań nad kulturami 3D.

Z wdzięcznością dziękujemy za pomoc finansową Kanadyjskiej Rady ds. Badań nad Naukami Przyrodniczymi i Inżynierią (NSERC), Kanadyjskim Instytutom Badań nad Zdrowiem (CIHR), Kanadyjskiej Fundacji Raka Piersi (CBCF, Ontario Chapter), Kanadyjskiemu Sojuszowi Badań nad Rakiem Piersi, Ontario Centres of Excellence, Breast Cancer Action Kingston (BCAK) oraz funduszowi Clare Nelson Bequest poprzez dotacje dla LR. Projekt BE otrzymał wsparcie finansowe od CIHR, CBCF, BCAK i Cancer Research Society Inc. PTG jest wspierane przez Kanadyjską Katedrę Badań, Kanadyjską Fundację Innowacji, CIHR, NSERC i Kanadyjskie Towarzystwo Onkologiczne. MN był wspierany przez stypendium w ramach Terry Fox Training Program in Transdisciplinary Cancer Research z NCIC, nagrodę dla absolwentów (QGA) oraz nagrodę dziekana z Queen's University. MG było wspierane przez stypendia podoktorskie z US Army Breast Cancer Program, Ministerstwa Badań i Innowacji Prowincji Ontario oraz Doradczego Komitetu Badawczego Queen's University. VH był wspierany przez stypendium doktoranckie CBCF i stypendium podoktorskie w ramach programu szkoleniowego Fundacji Terry'ego Foxa w zakresie transdyscyplinarnych badań nad rakiem we współpracy z CIHR. Hanad Adan był stypendystą letniego stypendium NSERC. BS został wsparty nagrodą dla absolwentów Queen's University.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
30% Akrylamid/0,8% roztwór Bis BioRad1610154Western Blotting
Przeciwciało antycyklinowe D1królik,sc-717Western Blotting
anty-p120, Santa Cruzsc-373751Western Blotting
przeciwciałem anty-β aktyną, technologia sygnalizacji komórkowej3700Western Blotting
Anty-β Przeciwciało kazeinowekoza, Santa Cruz Biotechnologysc-17971Western Blotting
AprotininBio ShopAPR600Bufor do lizy
Roztwór kwasu bicynchoninowegoSigmaB9643-1L-KCOznaczanie białka
Albumina surowicy bydlęcejBio ShopALB007.500Czystość oznaczania białek
Western ECL SubstrateBio Rad170-5061Western Blotting
Siarczan miedzi(II)SigmaC2284-25MLOznaczanie białka
DAPIThermofisher ScientificD1306Barwienie
digitoninyCalbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd14952-500Barwienie
EDTABio ShopEDT001.500
Naskórkowy czynnik wzrostuSigmaE9644Pożywka dla komórek HC11
Surowica cielęca płoduPAAA15-751Pożywka do hodowli komórkowych
Koza-Anty Królik-HRPSanta CruzSC-2004Western Blotting
Hepatocyty Czynnik wzrostu rekombinowanyGibcoPHG0321
HepesSigma7365-45-9Hodowla komórkowa
Horse Anti-Mouse HRPCell Signalling Technology7076Western Blotting
HydrokortyzonSigmaH0888HIP Średnia
insulinaSigmaI6634HIP Średni
kaptur o przepływie laminarnymBioGard KapturHodowla komórek
LeupeptinBio ShopLEU001.10Macierz buforu do lizy
(matryca Engelbreth-Holm-Swarm, Matrigel)CorningCACB 354230
Mysz Anti-Goat HRPSanta Cruzsc-8360Western Blotting
Mowiol 4-88 OdczynnikCalbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd475904-100GMBarwienie
Wielofotonowy mikroskop konfokalnyLeica TCS SP2
Na3VO4Bio ShopSOV850Bufor do lizy
Na4P207Sigma125F-0262Bufor do lizy
NaClBio ShopSOD001.1Western Blotting
NaFFisher Scientific7681-49-4Bufor do lizy
Aparat cyfrowy NikonCoolpix 995
NitrocelulozaBio Rad1620112Western Blotting
NP-40Sigma9016-45-9
ParaformaldehydFisher Scientific30525-89-4Mikroskop
kontrastowy z faząOlympus IX70Hodowla komórkowa
Fluorek fenylometylosufoniluSigma329-98-6Bufor do lizy
pMX GFP Rac G12VAddgene14567
ProlaktynaSigmaL6520HIP Medium
RPMI-1640SigmaR8758Komórka Pożywka
Naczynie do hodowli tkankowych 35Sarstedt83.3900.Hodowla komórkowa
Płytka do hodowli tkankowych-24dołki Sarstedt83.1836.300Aparat
do przenoszeniaCBS Scientific CoEBU-302Western Blotting
Tris AcetateBio ShopTRA222.500Western Blotting
TrypsinSigma9002-07-7.Hodowla komórkowa
Tween-20Bio ShopTWN510.500Western Blotting
Weryfikalny system elektroforezy żelowejCBS Scientific CoMGV-202-33Western Blotting
mysz z przeciwciałem Santa Cruz Mysz z barwienia hodowlana kultur komórkowych

Bibliografia

  1. Geletu, M., Guy, S., Arulanandam, R., Feracci, H., Raptis, L. Engaged for survival; from cadherin ligation to Stat3 activation. Jaks-Stat. 2, 27363-27368 (2013).
  2. Niit, M., et al. Regulation of HC11 mouse breast epithelial cell differentiation by the E-cadherin/Rac axis. Experimental Cell Research. 361 (1), 112-125 (2017).
  3. Ball, R. K., Friis, R. R., Schoenenberger, C. A., Doppler, W., Groner, B. Prolactin regulation of beta-casein gene expression and of a cytosolic 120-kd protein in a cloned mouse mammary epithelial cell line. The EMBO Journal. 7 (7), 2089-2095 (1988).
  4. Humphreys, R. C., Rosen, J. M. Stably transfected HC11 cells provide an in vitro and in vivo model system for studying Wnt gene function. Cell growth & differentiation. 8 (8), 839-849 (1997).
  5. Merlo, G. R., et al. differentiation and survival of HC11 mammary epithelial cells: diverse effects of receptor tyrosine kinase-activating peptide growth factors. European Journal of Cell Biology. 70 (2), 97-105 (1996).
  6. Wirl, G., Hermann, M., Ekblom, P., Fassler, R. Mammary epithelial cell differentiation in vitro is regulated by an interplay of EGF action and tenascin-C downregulation. Journal of Cell Science. 108, Pt 6 2445-2456 (1995).
  7. Arbeithuber, B., et al. Aquaporin 5 expression in mouse mammary gland cells is not driven by promoter methylation. BioMed Research International. 2015, 460598(2015).
  8. Morrison, B., Cutler, M. L. Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation. Journal of Visualized Experiments. (32), e1265(2009).
  9. Merlo, G. R., et al. Growth suppression of normal mammary epithelial cells by wild-type p53. Oncogene. 9, 443-453 (1994).
  10. Reichmann, E., Ball, R., Groner, B., Friis, R. R. New mammary epithelial and fibroblastic cell clones in coculture form structures competent to differentiate functionally. Journal of Cell Biology. 108 (3), 1127-1138 (1989).
  11. Somasiri, A., Wu, C., Ellchuk, T., Turley, S., Roskelley, C. D. Phosphatidylinositol 3-kinase is required for adherens junction-dependent mammary epithelial cell spheroid formation. Differentiation. 66 (2-3), 116-125 (2000).
  12. Mroue, R., Bissell, M. J. Three-dimensional cultures of mouse mammary epithelial cells. Methods in Molecular Biology. 945, 221-250 (2013).
  13. Williams, C., Helguero, L., Edvardsson, K., Haldosen, L. A., Gustafsson, J. A. Gene expression in murine mammary epithelial stem cell-like cells shows similarities to human breast cancer gene expression. Breast Cancer Research. 11 (3), 26(2009).
  14. Montesano, R., Soriano, J. V., Fialka, I., Orci, L. Isolation of EpH4 mammary epithelial cell subpopulations which differ in their morphogenetic properties. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 34 (6), 468-477 (1998).
  15. Nagaoka, K., Zhang, H., Watanabe, G., Taya, K. Epithelial cell differentiation regulated by MicroRNA-200a in mammary glands. PLoS One. 8 (6), 65127(2013).
  16. Arulanandam, R., et al. Cadherin-cadherin engagement promotes survival via Rac/Cdc42 and Stat3. Molecular Cancer Research. 17, 1310-1327 (2009).
  17. Geletu, M., et al. Classical cadherins control survival through the gp130/Stat3 axis. BBA-Molecular Cell Research. 1833, 1947-1959 (2013).
  18. Raptis, L., Arulanandam, R., Geletu, M., Turkson, J. The R(h)oads to Stat3: Stat3 activation by the Rho GTPases. Experimental Cell Research. 317 (13), 1787-1795 (2011).
  19. Raptis, L., et al. Beyond structure, to survival: Stat3 activation by cadherin engagement. Biochemistry and Cell Biology. 87, 835-843 (2009).
  20. Niit, M., et al. Regulation of Differentiation of HC11 Mouse Breast Epithelial Cells by the Signal Transducer and Activator of Transcription-3. Anticancer Research. 39 (6), 2749-2756 (2019).
  21. Brinkmann, V., Foroutan, H., Sachs, M., Weidner, K. M., Birchmeier, W. Hepatocyte growth factor/scatter factor induces a variety of tissue-specific morphogenic programs in epithelial cells. Journal of Cell Biology. 131, 1573-1586 (1995).
  22. Starova, B. Role of cell adhesion microevironment and the Src/Stat3 axis in autocrine HGF signaling during breast tumourigenesis. , Queen's University. M.Sc. Thesis (2008).
  23. Raptis, L., et al. Rasleu61 blocks differentiation of transformable 3T3 L1 and C3HT1/2-derived preadipocytes in a dose- and time-dependent manner. Cell Growth & Differentiation. 8, 11-21 (1997).
  24. Greer, S., Honeywell, R., Geletu, M., Arulanandam, R., Raptis, L. Housekeeping gene products; levels may change with confluence of cultured cells. Journal of Immunological Methods. 355, 76-79 (2010).
  25. Vultur, A., et al. Cell to cell adhesion modulates Stat3 activity in normal and breast carcinoma cells. Oncogene. 23, 2600-2616 (2004).
  26. Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
  27. Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).
  28. Hoskin, V. C. A novel regulatory role of Ezrin in promoting breast cancer cell invasion and metastasis. , Queen's University. Ph.D. Thesis (2015).
  29. Su, H. W., et al. Cell confluence-induced activation of signal transducer and activator of transcription-3 (Stat3) triggers epithelial dome formation via augmentation of sodium hydrogen exchanger-3 (NHE3) expression. Journal of Biological Chemistry. 282 (13), 9883-9894 (2007).
  30. Ostrovidov, S., et al. Skeletal muscle tissue engineering: methods to form skeletal myotubes and their applications. Tissue Engineering Part B: Reviews. 20 (5), 403-436 (2014).
  31. Cass, J. Novel Stat3 and Stat5 pathways in epithelial cell differentiation. , Queen's University. Ph.D. thesis (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Mysie komórki nabłonka piersiróżnicowanie komórek HC11różnicowanie komórek EpH4traktowanie podłożem HIPhodowla w macierzy 3Danaliza Western Blotmikroskopia kontrastowamikroskopia konfokalnaregulacja sygnału Ractworzenie mammosfer
Różnicowanie komórek HC11 i EpH4 nabłonka piersi myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.