Artykuł metodologiczny

Pokolenie chimerycznych aksolotli ze zmutowanymi haploidalnymi kończynami poprzez szczepienie embrionalne

DOI:

10.3791/60156

⸱

29 stycznia 2020

 ,  , 
1Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology, Yale University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tym celem tego protokołu jest produkcja chimerycznych aksolotli z haploidalnymi kończynami przednimi pochodzącymi z tkanki dawcy zmutowanej, Cas9, przy użyciu technik przeszczepu tkanek embrionalnych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rosnący zestaw technik genetycznych i zasobów umożliwia badaczom badanie molekularnego pochodzenia zdolności niektórych gatunków salamander, takich jak aksolotle, do regeneracji całych kończyn w wieku dorosłym. W tym miejscu przedstawiamy techniki stosowane do generowania chimerycznych aksolotli z haploidalnymi kończynami przednimi zmutagowanymi Cas9, które można wykorzystać do badania funkcji genów i wierności regeneracji kończyn. Łączymy kilka technik embriologicznych i genetycznych, w tym wytwarzanie haploidalne poprzez aktywację in vitro, mutagenezę CRISPR/Cas9 i przeszczepianie tkanek w jednym protokole, aby stworzyć unikalny system haploidalnych badań genetycznych w modelowym organizmie regeneracyjnym. Strategia ta zmniejsza liczbę zwierząt, przestrzeń i czas potrzebny do funkcjonalnej analizy genów w regeneracji kończyn. Pozwala to również na badanie specyficznych dla regeneracji funkcji genów, które mogą być wymagane do innych istotnych procesów, takich jak organogeneza, morfogeneza tkanek i inne niezbędne procesy embrionalne. Opisana tu metoda jest unikalną platformą do przeprowadzania haploidalnych badań genetycznych w systemie modelowym kręgowców.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Historycznie rzecz biorąc, szczepienie tkanek embrionalnych u było ważną techniką do badania podstawowych mechanizmów biologii rozwoju i regeneracji. Aksolotl, gatunek salamandry, posiada imponującą zdolność do regeneracji tkanek i złożonych struktur, takich jak kończyny i narządy, po urazie lub amputacji. Równie imponujące jest to, że mogą one otrzymywać, bez odrzucenia, przeszczepy tkanek od innych osobników w stadium embrionalnym, młodocianym i dorosłym1,2,3. Regiony zarodków, które wytwarzają całe struktury, takie jak kończyny, ogony, oczy i głowy, oraz bardziej specyficzne tkanki, takie jak neuroektoderma i somit, mogą być szczepione między zarodkami w celu wytworzenia chimerycznych zwierząt1,2,4,5,6. Przez prawie sto lat badania takich chimerycznych zwierząt dostarczały kluczowych informacji na temat regeneracji, różnicowania tkanek, kontroli wielkości i tworzenia wzorów1,7,8.

W ciągu ostatniej dekady, liczne badania transkrypcyjne regenerujących się tkanek dostarczyły wglądu w programy genetyczne leżące u podstaw regeneracji salamandry9,10,11,12,13. Badania te uzupełniły rozszerzającą się listę genów kandydujących, które do tej pory w dużej mierze nie zostały scharakteryzowane w kontekście regeneracji. Ukierunkowane techniki mutagenezy, takie jak CRISPR/Cas, pozwalają obecnie na badanie takich genów, a takie podejścia genetyczne są znacznie ułatwione dzięki niedawnemu sekwencjonowaniu i składaniu dużego genomu aksolotla 14,15,16.

Staraliśmy się opracować techniki, które łączyłyby klasyczną biologię rozwojową z nową technologią genetyczną w celu zbadania mechanizmów regeneracji. Metody generowania haploidalnych zarodków aksolotli i innych salamander są znane od dziesięcioleci17. Chociaż techniki te od dawna są uważane za zalety salamander jako organizmów modelowych genetycznie18, niewiele późniejszych badań genetycznych obejmowało haploidalne zwierzęta. Używamy aktywacji in vitro w aksolotlu do produkcji haploidalnych zarodków, które służą jako dawcy tkanek do szczepienia19. Wykorzystując embriony zawierające fluorescencyjne markery genetyczne, opracowaliśmy niezawodne metody generowania kończyn pochodzących prawie w całości z tkanek dawcy (Rysunek 1A). Łącząc te dwie techniki, ominęliśmy późną śmiertelność embrionalną związaną z haploidią, co pozwoliło na produkcję w pełni rozwiniętych, przeszczepionych haploidalnych kończyn (Rysunek 1B, Figura 1B' i Rysunek 2).

Przeprowadzając mutagenezę za pośrednictwem CRISPR/Cas w haploidalnych zarodkach przed szczepieniem w celu stworzenia chimerycznych aksolotli ze zmutowanymi haploidalnymi kończynami, możemy badać funkcję genów szczególnie w kontekście rozwoju i regeneracji kończyn. Pozwala to na uratowanie kończyn przed potencjalnie śmiertelnymi dla zarodka zmutowanymi fenotypami. Podczas gdy mikroiniekcja CRISPR/Cas może generować zwierzęta, które są wysoce zmutowane, takie zwierzęta są zazwyczaj wysoce mozaikowe, z pewnym stopniem zatrzymywania alleli typu dzikiego i różnymi odrębnymi mutacjami w docelowych miejscach14,20. Mutageneza oparta na CRISPR w komórkach haploidalnych zwiększa penetrację mutacji powodujących utratę funkcji pojedynczego allelu, ponieważ nie można ich zamaskować przez zatrzymane allele typu dzikiego. Z tego powodu badania przesiewowe oparte na CRISPR w haploidalnych liniach komórkowych są coraz częściej wykorzystywane do badania genetycznych podstaw wielu procesów komórkowych21,22,23. Łącząc śledzenie linii oparte na CRISPR z naszymi protokołami szczepienia haploidalnych pąków kończyn, opisane tutaj podejście może służyć jako platforma dla haploidalnych badań genetycznych u żywych zwierząt20.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Procedury eksperymentalne użyte w tym protokole zostały zatwierdzone przez Yale University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC, 2017–10557) i były zgodne ze wszystkimi federalnymi politykami i wytycznymi regulującymi wykorzystanie kręgowców. Wszystkie eksperymenty na zwierzętach przeprowadzono na Ambystoma mexicanum (aksolotle) w obiektach Uniwersytetu Yale.

1. Generacja diploidalnych zarodków

  1. Uzyskaj diploidalne zarodki GFP+, które będą służyć jako gospodarze przeszczepu poprzez naturalne krycie przy użyciu jednego lub dwóch rodziców gfp24.
  2. Zbierz świeżo złożone jaja diploidalne i umieść je na metalowym sicie.
  3. Dokładnie opłucz jaja 40% roztworem Holtfretera (20 mM NaCl, 0,2 mM KCl, 0,8 mM NaHCO3, 0,2 mM CaCl2, 4 mMMgSO4, pH do 7,4).
  4. Umieść jajka w świeżym 40% roztworze Holtfretera i przechowuj w temperaturze 12 °C.
    UWAGA: Zarodki diploidalne należy zawsze uzyskiwać przed przejściem do pokolenia zarodków haploidalnych.

2. Pokolenie zarodków haploidalnych

  1. Przygotowanie dawcy gamet żeńskich
    1. Na 48 godzin przed przeprowadzeniem aktywacji in vitro znieczulić dojrzałą płciowo samicę aksolotla białego lub białego/RFP przez zanurzenie w 1 g/l buforowanym przez HEPES MS-222 w 40% roztworze Holtfretera25.
    2. Upewnij się, że zwierzę jest w pełni znieczulone po około 30 minutach zanurzenia, mocno ściskając jego ogon między kciukiem a palcem wskazującym. W pełni znieczulone zwierzęta nie będą fizycznie reagować na żadne szczypanie.
    3. Przygotować roztwór ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej (HCG) zawierający 10 000 U/ml w sterylnym roztworze soli fizjologicznej.
    4. Za pomocą strzykawki insulinowej 30 G wstrzyknij 0,15 CC HCG (1500 jednostek) w mięśnie grzbietowe do tylnej kończyny znieczulonej kobiety pod kątem 45° do linii środkowej, aby uniknąć kontaktu z rdzeniem kręgowym.
    5. Umieść samicę w świeżym 40% roztworze Holtfretera i umieść w lodówce o temperaturze 8−12 °C.
    6. Po 48 godzinach przywróć samicę do temperatury pokojowej. Umieść kilka kamieni lub plastikowych roślin w jej pojemniku jako powierzchnie do składania jaj.
      UWAGA: Samice, którym wstrzyknięto HCG, często zdeponują puste pudełka po galaretkach na kilka godzin przed złożeniem jaj.
    7. Usuń kamienie lub plastikowe rośliny po tym, jak samica zacznie konsekwentnie składać jaja.
    8. Pozwól samicy siedzieć w pustym zbiorniku przez 30 minut do 1 godz.
      UWAGA: Wstrzymanie materiałów, na których zwierzę może składać jaja, pozwoli na ściślejszą kontrolę pobierania oocytów.
  2. Kolekcja męskich gamet
    1. Podczas gdy składanie jaj przez samicę jest wstrzymane, należy znieczulić dojrzałego płciowo samca aksolotla GFP+, aby służył jako dawca nasienia, jak w kroku 2.1.1.
    2. Połóż w pełni znieczulonego samca na plecach na wilgotnych ręcznikach papierowych pod mikroskopem preparacyjnym
      3. .
    3. Jeśli eksperymentator jest praworęczny, prawą ręką umieść końcówkę pipety P1000 u podstawy kloaki.
    4. Umieść lewy palec wskazujący i kciuk lewej ręki w odległości 2−3 cm rostral od miednicy. Delikatnie ściśnij zwierzę, przesuwając palce w kierunku tylnych nóg, aby wypłukać próbki moczu nasienia.
    5. Zebrać każdą z nich, która została wypłukana z kloaki, do osobnej probówki do mikrowirówki. Powtórz ten proces, aby zebrać od 6 do 10 próbek.
    6. Odpipetować 5,0 μl z każdej próbki na szalkę Petriego, aby sprawdzić jakość nasienia za pomocą mikroskopu odwróconego.
      UWAGA: Skoncentrowane próbki nasienia mają mlecznobiały kolor, zwykle wahają się od 5 do 20 μl i są zwykle pobierane po ekstrakcji kilku, większych objętości próbek moczu plemników. Plemniki gromadzą się na dnie probówek w próbkach o większej objętości, jeśli nie zostaną zakłócone. Skoncentrowane próbki zdrowych plemników są bardzo ruchliwe i tracą aktywność wraz ze spadkiem ich stężenia. Zdrowi mężczyźni mogą wyprodukować do 50 μl skoncentrowanych plemników.
  3. Kolekcja gamet żeńskich
    1. Po uzyskaniu i potwierdzeniu zdrowej próbki nasienia znieczulij samicę aksolotla wstrzykniętą HCG, jak w kroku 2.1.1.
    2. Połóż w pełni znieczuloną samicę na wilgotnych ręcznikach papierowych na jej plecach.
    3. Usuń niezapłodnione jaja od samicy, wykonując ruch ręki podobny do tego w kroku 2.2.4.
    4. Zbierz jaja za pomocą mokrych kleszczy i przenieś je na 10-centymetrową szalkę Petriego. Potraktuj jaja napromieniowanym plemnikiem w ciągu 15 minut od pobrania.
  4. Przygotowanie gamet męskich i aktywacja in vitro
    1. Użyj pipety P10 lub P20, aby pipetować plemniki w górę i w dół, rozbijając grudki w celu utworzenia jednorodnej zawiesiny.
    2. Przybliż procent ruchliwych plemników, umieszczając kroplę 0,5 μl nierozcieńczonej zawiesiny nasienia na pokrywie szalki Petriego lub szkiełku podstawowym i badając pod mikroskopem odwróconym.
    3. Dodać 9,5 μl 0,1x zmodyfikowanego roztworu Ringera Marca (MMR; Tabela materiałów) do tej próbki, aby uzyskać 20-krotne rozcieńczenie plemników. Delikatnie pipetować w górę i w dół, aby wymieszać.
    4. Za pomocą mikroskopu odwróconego policz plemniki w trzech kroplach 1,0 μl 20x rozcieńczonej podwielokrotności na pokrywie płytki Petriego lub hemocytometrze, aby oszacować stężenie plemników w nierozcieńczonej zawiesinie.
    5. Przygotuj plemniki do napromieniania, rozcieńczając podwielokrotność oryginalnej próbki nasienia do około 80 000 ruchliwych komórek/ml w sterylnym 0,1x MMR.
    6. Policz liczbę komórek jajowych uzyskanych w ciągu ostatnich 15 minut. Dodać 0,5 μl świeżo rozcieńczonego nasienia z kroku 2.4.5 na jajo na szalkę Petriego. Za pomocą końcówki pipety rozprowadzić zawiesinę na warstwę o grubości 1 mm.
    7. Za pomocą plastikowego podnośnika umieścić próbkę w odległości 4 cm od bańek urządzenia sieciującego o długości fali 254 nm. Genetycznie dezaktywuj plemniki poprzez napromieniowanie próbki 800 000 uJ/mm2.
    8. Za pomocą pipety P10 odpipetuj zawiesinę na niezapłodnione komórki jajowe, pokrywając każdą komórkę jajową 0,25-0,5 μl napromienionego plemnika. Pozostaw jajka w temperaturze pokojowej na 30 minut.
    9. Po 30 minutach zalej jaja 0,1x MMR. Jaja należy natychmiast umieścić w inkubatorze o temperaturze 8−10 °C do wstrzykiwań następnego dnia lub w temperaturze 18 °C w przypadku wstrzyknięć w ciągu 7 godzin po aktywacji (hpa).
    10. Odjęte haploidy za pomocą ostrych kleszczy 30 minut po nawodnieniu. Jaja należy natychmiast umieścić w inkubatorze o temperaturze 8−10 °C do wstrzykiwań następnego dnia lub w temperaturze 18 °C do wstrzyknięć tego samego dnia.

3. Mutageneza haploidalna i jej utrzymanie

  1. Mikroiniekcje CRISPR/Cas9
    1. Projektuj sgRNA za pomocą skanowania CRISPRscan i syntetyzuj26,27.
    2. W przypadku mutagenezy multipleksowej należy przygotować zapas 5 sgRNA (10 ng/μL dla każdego sgRNA) i białka Cas9 (1 μg/μL). Przygotować 100-krotne rozcieńczenie tego zapasu (0,1 ng/μL na sgRNA, 10 ng/μL Cas9) do wstrzykiwań. W przypadku mutagenezy pojedynczego genu o wysokiej częstotliwości mutacji postępuj zgodnie z protokołem opisanym wcześniej28.
    3. Zarodki haploidalne należy wstrzykiwać w stadium jednokomórkowym 7 hpa, jeśli są przechowywane w temperaturze 18 °C, lub wstrzykiwać zarodki następnego dnia w stadium 2−8 komórek, jeśli są przechowywane w temperaturze 8−10 °C.
    4. Przenieś zarodki do 1,0x MMR z 20% polisarozą 400.
    5. Jeśli jest to pojedyncza komórka, wstrzyknąć każdemu zarodkowi kroplę o pojemności 5 nl roztworu do wstrzykiwań (około 1/4 promienia komórki jajowej) zawierającego całkowitą masę 0,5 pg/sgRNA i 50 pg białka Cas9. Jeśli jest wielokomórkowy, rozprowadź tę masę, wstrzykując mniejsze objętości do wielu komórek.
    6. Pozostawić zarodki do zagojenia się w polisacharozie 400 przez minimum 4 godziny, a maksymalnie 18 godzin w temperaturze 18 °C.
  2. Pomieszczenia dla zarodków haploidalnych
    1. Przenieś zarodki do 0,1x MMR z antybiotykiem-antybiotykiem.
    2. Umieść każdy zarodek w osobnym dołku na 24-dołkowej płytce, ponieważ niektóre z nich umrą lub rozwiną się nieprawidłowo. Utrzymuj w temperaturze 16−18 °C. W razie potrzeby można zastosować niższe temperatury w celu przedłużenia rozwoju.
    3. Zastąp pożywkę świeżą 0,1x MMR antybiotyko-antybiotykiem co drugi dzień.

4. Przygotowanie zarodków diploidalnego gospodarza

  1. Utrzymywać zarodki w otoczce galaretki w temperaturze od 12 do 16 °C aż do osiągnięcia stadium 22–26.
  2. Zebrać zarodki gotowe do szczepienia, umieścić je na sicie (rozmiar oczek 4 mm) i delikatnie spłukać 40% roztworem Holtfretera.
  3. Przenieś zarodki do wysterylizowanego filtrem 0,1x MMR zawierającego 1,5% wybielacza na okres do 2 minut. Całkowicie zanurz zarodki w roztworze wybielacza i delikatnie je obracaj, aby upewnić się, że powłoka galaretki ma pełny kontakt z roztworem wybielacza, aby zabić drobnoustroje obecne na zarodkach.
  4. Po 2 minutach rozcieńczyć roztwór wybielacza zawierający zarodki równą objętością wysterylizowanego przez filtr 0,1x MMR.
  5. Delikatnie przelej zarodki na odkażone wybielaczem sito (rozmiar oczek 4 mm) i przepłucz zarodki pięciokrotnie wysterylizowanym filtrem 0,1x MMR.
  6. Umieść zarodki na sterylnych 10 cm szalkach Petriego z 0,1x MMR z antybiotykami do dejelizji (penicylina 100 jednostek/ml, streptomycyna 100 μg/μL, 0,25 μg/ml, gentamycyna 25 μg/ml).
  7. Pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym usunąć galaretki i błony witelinowe z zarodków GFP+ za pomocą ostrych kleszczyków (wymiary końcówki 0,05 x 0,01 mm2).
  8. Przenieś zarodki GFP+ na nową szalkę Petriego. Zminimalizuj ilość płynu przenoszonego z szalki Petriego, na której zostały one poddane deżelacji.
  9. Przepłukać zarodki gospodarza GFP+ sterylnym 0,1x MMR antybiotykami cztery do sześciu razy w celu usunięcia zanieczyszczeń.
  10. Umieść czyste zarodki w temperaturze 4 °C na noc przed szczepieniem.
    UWAGA: Chłodzenie zarodków sprawia, że są one bardziej sztywne i czyste, możliwe jest oddzielenie mezodermy od endodermy.

5. Pokolenie chimery haploidalno-diploidalnej

  1. Przygotowanie naczynia chirurgicznego i podłoża
    1. Przygotuj sterylne chirurgiczne naczynia operacyjne, wlewając autoklawowaną 2% agarozę w 0,1x MMR do sterylnych, łatwych do uchwycenia 35 mm szalek Petriego. Napełnij szalki Petriego do połowy agarozą.
    2. Po ostygnięciu agarozy użyj sterylnego skalpela, aby wyciąć w agarozie pochyłe koryto o długości 25 mm, aby utrzymać zarodki na miejscu.
    3. Napełnij naczynie sterylnym środkiem chirurgicznym (0,1x MMR z antymykoplazmą 2,5 μg/ml, amfoterycyną B 0,25 μg/ml i cyprofloksacyną 10,0 μg/ml) i wstaw do lodówki w temperaturze 4 °C.
  2. Zabieg szczepienia zarodków
    1. Umieść jednego zdrowego haploidalnego dawcę z jednym lub dwoma dopasowanymi do etapu diploidalnymi zarodkami gospodarza GFP+ w korycie wstępnie schłodzonego naczynia operacyjnego zawierającego pożywkę chirurgiczną (Ryc. 3).
      UWAGA: Jeśli to możliwe, wykonaj procedurę na etapie chłodzenia (10 °C lub mniej).
    2. Użyj dwóch ultracienkich, autoklawizowanych kleszczyków (prosta końcówka, wymiary końcówki 0,05 x 0,02 mm2), aby usunąć warstwy ektodermy i mezodermy z gospodarza z pączkiem kończyny w pobliżu środka (Rysunek 4).
      UWAGA: Prostokątny obszar przeszczepu tkanki obejmuje pączek kończyny i rozciąga się od dziewiątego somitu do tylnej połowy wybrzuszenia skrzelowego, około 2 mm, wzdłuż przedniej tylnej osi. Wzdłuż osi grzbietowo-brzusznej szczepiony obszar rozciąga się na około 1,5 mm, w tym somity tuż poza brzuszną krawędź wybrzuszenia skrzelowego. Przeszczepiony obszar obejmuje całą mezodermę płytki bocznej i boczne połówki somitów, bez naruszania leżącej pod spodem endodermy. Zobacz Rysunek 4 i towarzyszący mu film, aby uzyskać szczegółowe informacje.
    3. Odłóż na bok tkankę gospodarza i usuń arkusz tkanki o równoważnej wielkości od haploidalnego dawcy przy użyciu tych samych metod.
    4. Umieścić arkusz tkanki haploidalnego dawcy na odpowiednim obszarze zarodka dawcy.
    5. Zabezpiecz tkankę, przykrywając ją autoklawowanym, prostokątnym odłamkiem szkła ze zmiażdżonego szkła mikroskopowego i delikatnie wciskając go w ciało zarodka gospodarza.
    6. Odwróć haploidalny zarodek dawcy na drugą stronę, aby pobrać zarodek kończyny dla drugiego zarodka gospodarza. Powtórz kroki od 5.2.2 do 5.2.5.
    7. Ostrożnie usuń pozostały nadmiar tkanek gospodarza i zarodek dawcy z naczynia.
    8. Pozostaw przeszczepy z kotwami do odłamków szkła na miejscu przez 60-75 minut, sprawdzając co 20 minut, aby upewnić się, że szkło się nie zsunęło.
    9. Po całkowitym przyleganiu przeszczepów tkanek użyj kleszczy, aby powoli odkleić kotwy odłamków szkła.
  3. Konserwacja Chimery
    1. Przenieś wszczepione zarodki na świeże podłoże chirurgiczne i utrzymuj je w temperaturze 8−12 °C przez noc do zagojenia. Indywidualnie umieszczaj wszczepione zarodki na płytkach 12- lub 24-dołkowych.
    2. Po 36−48 h przenieść wszczepione zarodki do sterylnego 0,1x antybiotyk-antybiotyk-antybiotyk MMR. Silne antybiotyki zawarte w pożywce chirurgicznej powodują toksyczność w przeszczepionych zarodkach po 3 dniach.
    3. Zastąp pożywkę świeżym 0,1x MMR i antybiotykami co 2-3 dni.
    4. Utrzymuj wszczepione zarodki w temperaturze 18 °C, aż będą w stanie się odżywiać28.
    5. Po 1 do 2 miesiącach rozwoju i pielęgnacji, haploidalne kończyny można ocenić pod kątem czystości przeszczepu za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu preparacyjnego.
      UWAGA: Obecność w kończynach tkanki GFP pochodzącej od gospodarza lub niepochodzącej od krwi jest wskaźnikiem nieczystego przeszczepu i często wiąże się z nieprawidłowym rozwojem kończyn. Zwierzęta te powinny zostać wyłączone z dalszej analizy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rozwijające się zarodki haploidalne można odróżnić od zarodków diploidalnych na podstawie fenotypu 'zespołu haploidalnego'29. W stadium przeszczepu haploidalne zarodki wykazują zmniejszoną krzywiznę wzdłuż osi przednio-tylnej i niepełne zamknięcie czopu żółtkowego (Ryc. 3A). Mikroskop fluorescencyjny może być użyty do zapewnienia, że haploidalne zarodki są wolne od ojcowskiej ekspresji GFP (Rysunek 3B...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W naszym protokole jest kilka krytycznych kroków do generowania chimer haploidalno-diploidalnych, które technik operacyjny powinien wziąć pod uwagę, aby uzyskać spójne wyniki szczepienia.

Najbardziej prawdopodobną przyczyną niepowodzenia wytwarzania haploidalnych są złe warunki aktywacji in vitro. Do aktywacji komórek jajowych należy użyć odpowiednich ilości ruchliwych plemników. Aby przedłużyć ruchliwość, próbki nasienia należy zawsze utrzymywać w temperaturze 4 °C. Przed nałożeniem jakiejkol...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować Katherine Roberts za jej opiekę nad kolonią aksolotlów. Finansowanie tej pracy zostało zapewnione przez Connecticut Innovations Regenerative Medicine Research Fund (15RMA-YALE-09 i 15-RMB-YALE-01) oraz Narodowy Instytut Zdrowia Dziecka i Rozwoju Człowieka Eunice Kennedy Shriver (Indywidualne Stypendium Podoktorskie F32HD086942).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
#55 Dumont KleszczeNarzędzia do nauki11295-1Używaj wyłącznie materiału Dumostar (można sterylizować w autoklawie)
Amfoterycyna BSigma AldrichA2942-20ML20 ml
Antybiotyk-Antybiotyk 100xThermo Fisher15240062
CiprofloksacynaSigma Aldrich17850-5G-F
Ficoll 400 (polisaroza 400)bioworld40600032-3Ficoll 400
GentamynaSigma AldrichG1914-250MG
Inkubator grzewczo-chłodzącyRevSciRS-IF-233
Ludzka gonadotropina kosmówkowaMerkChorulon
Megascript T7 Zestaw do transkrypcjiThermo FisherAM133440 reakcji
Etap chłodzenia MiroscopeBrook IndustriesNiestandardowe
niestandardowe białko NLS Cas9PNAbioCP01-2004 fiolki po 50 i mikro; g białko każdy
PlasmocinInvivogenant-mpt-1Poziom zabiegu
Receptury
1.0x Zmodyfikowany roztwór Ringera Marca (MMR)0,1 M NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 0,1 mM EDTA, 5 mM HEPES (pH 7,8), ph 7,4
40% roztwór20 mM NaCl, 0,2 mM KCl, 0,8 mM NaHCO3, 0,2 mM CaCl2, 4 mM MgSO4, pH do 7,4
Holtfretera

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kragl, M., et al. Cells keep a memory of their tissue origin during axolotl limb regeneration. Nature. 460 (7251), 60-65 (2009).
  2. Maden, M., Goodwin, B. C. Experiments on developing limb buds of the axolotl Ambystoma mexicanum. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 57, 177-187 (1980).
  3. McCusker, C. D., Diaz-Castillo, C., Sosnik, J., Phan, A. Q., Gardiner, D. M. Cartilage and bone cells do not participate in skeletal regeneration in Ambystoma mexicanum limbs. Developmental Biology. 416 (1), 26-33 (2016).
  4. Brun, R. B. Experimental analysis of the eyeless mutant in the mexican axolotl (Ambystoma mexicanum). Integrative and Comparative Biology. 18 (2), 273-279 (1978).
  5. Lopez, D., et al. Mapping hematopoiesis in a fully regenerative vertebrate: the axolotl. Blood. 124 (8), 1232-1242 (2014).
  6. de Both, N. J. Transplantation of Axolotl Heads. Science. 162 (3852), 460-461 (1968).
  7. Harrison, R. G. Some Unexpected Results of the Heteroplastic Transplantation of Limbs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 10 (2), 69-74 (2006).
  8. Fields, E., French, V., Bryant, P. J., Bryant, S. V Pattern regulation in epimorphic fields. Science. 193 (4257), 969-981 (2013).
  9. Gerber, T., et al. Single-cell analysis uncovers convergence of cell identities during axolotl limb regeneration. Science. 362 (6413), (2018).
  10. Knapp, D., et al. Comparative transcriptional profiling of the axolotl limb identifies a tripartite regeneration-specific gene program. PloS One. 8 (5), e61352(2013).
  11. Campbell, L. J., et al. Gene expression profile of the regeneration epithelium during axolotl limb regeneration. Developmental Dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 240 (7), 1826-1840 (2011).
  12. Bryant, D. M., et al. A Tissue-Mapped Axolotl De Novo Transcriptome Enables Identification of Limb Regeneration Factors. Cell Reports. 18 (3), 762-776 (2017).
  13. Gardiner, D. M., et al. Gene expression during the first 28 days of axolotl limb regeneration I: Experimental design and global analysis of gene expression. Regeneration. 2 (3), 120-136 (2015).
  14. Flowers, G. P., Timberlake, A. T., McLean, K. C., Monaghan, J. R., Crews, C. M. Highly efficient targeted mutagenesis in axolotl using Cas9 RNA-guided nuclease. Development. 141 (10), Cambridge, England. 2165-2171 (2014).
  15. Smith, J. J., et al. A Chromosome-Scale Assembly of the Enormous (32 Gb) Axolotl Genome. bioRxiv. , 373548(2018).
  16. Nowoshilow, S., et al. The axolotl genome and the evolution of key tissue formation regulators. Nature. 559 (7712), 50-55 (2018).
  17. Fankhauser, B. Y. G. The Effects of Changes in Chromosome Number on Amphibian Development. The Quarterly Review of Biology. 20 (1), 20-78 (1945).
  18. Malacinski, G. M., Brothers, A. J. Mutant Genes in the Mexican Axolotl. Science. 184 (4142), 1142-1147 (1974).
  19. Armstrong, B. Gynogenesis in the mexican axolotl. Genetics. 83 (4), 783-792 (1976).
  20. Flowers, G. P., Sanor, L. D., Crews, C. M. Lineage tracing of genome-edited alleles reveals high fidelity axolotl limb regeneration. eLife. 6, 1-15 (2017).
  21. Shalem, O., et al. Genome - scale CRISPR - Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
  22. Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. Genetic Screens in Human Cells Using the CRISPR-Cas9 System. Science. 343 (6166), 80-84 (2014).
  23. Yin, Z., Chen, L. Simple Meets Single: The Application of. CRISPR/Cas9 in Haploid Embryonic Stem Cells. Stem Cells International. 2017, 1-6 (2017).
  24. Khattak, S., et al. Optimized axolotl (Ambystoma mexicanum) husbandry, breeding, metamorphosis, transgenesis and tamoxifen-mediated recombination. Nature Protocols. 9 (3), 529-540 (2014).
  25. Vachon, P., Zullian, C., Dodelet-Devillers, A., Roy, S. Evaluation of the anesthetic effects of MS222 in the adult Mexican axolotl (Ambystoma mexicanum). Veterinary Medicine: Research and Reports. 7, 1-7 (2016).
  26. Montague, T. G., et al. Efficient Mutagenesis by Cas9 Protein-Mediated Oligonucleotide Insertion and Large-Scale Assessment of Single-Guide RNAs. PLoS One. 9 (5), (2014).
  27. Moreno-Mateos, M. A., et al. CRISPRscan: designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo. Nature Methods. 12 (10), 982-988 (2015).
  28. Kumar, A., Simon, A. Salamanders in Regeneration Research: Methods and Protocols. , Humana Press. New York, NY. (2015).
  29. Hronowski, L., Gillespie, L. L., Armstrong, J. B. Development and Survival of Haploids of the Mexican Axolotl, Ambystoma mexicanum. Journal of Experimental Zoology. 209, 41-47 (1979).
  30. Schreckenberg, G. M., Jacobson, A. G. Normal stages of development of the axolotl, Ambystoma mexicanum. Developmental Biology. 42 (2), 391-399 (1975).
  31. Hertwig, G. Beitrage Zum Determinations- Und Regenerationsproblem Mittels Der Transplantation Haploidkerniger Zellen. Archiv f. Entwicklungsmechanik. 111, 292-316 (1927).
  32. Fei, J. -F., et al. Efficient gene knockin in axolotl and its use to test the role of satellite cells in limb regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (47), 12501-12506 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Regeneracja ko czyny aksolotlagenerowanie zarodk w haploidalnychmutageneza CRISPR Cas9przeszczepianie tkanek zarodkowychchimera haploidalno diploidalnazap odnienie in vitroanaliza ekspresji GFPprzeszczepianie p czka ko czynyplatforma przesiewania genetycznegomodelowy system kr gowca

Powiązane artykuły