Technologia komórek kapsułkowanych do dostarczania leków biologicznych do oka myszy

Podsumowanie

Prezentowany tutaj jest protokół użycia alginianu jako polimeru w mikrokapsułkowaniu unieśmiertelnionych komórek w celu długoterminowego dostarczania leków biologicznych do oczu gryzoni

.

Streszczenie

Wiele obecnie opracowywanych metod leczenia chorób tylnego bieguna oka to leki biologiczne. Leki te muszą być często podawane, zazwyczaj w postaci zastrzyków do ciała szklistego. Kapsułkowane komórki wykazujące ekspresję wybranego leku biologicznego stają się narzędziem do lokalnej produkcji i uwalniania białek (np. poprzez długoterminowe dostarczanie leków). Ponadto systemy enkapsulacji wykorzystują przepuszczalne materiały, które umożliwiają dyfuzję składników odżywczych, odpadów i czynników terapeutycznych do i z komórek. Dzieje się tak podczas maskowania komórek przed odpowiedzią immunologiczną gospodarza, unikając konieczności tłumienia układu odpornościowego gospodarza. Protokół ten opisuje zastosowanie alginianu jako polimeru w mikrokapsułkowaniu w połączeniu z metodą elektronatryskiwania jako techniką mikrokapsułkowania. Komórki ARPE-19, spontanicznie powstająca ludzka linia komórkowa RPE, była wykorzystywana w długoterminowych eksperymentach terapii komórkowej ze względu na swoją funkcjonalność w ciągu całego życia i jest tutaj używana do kapsułkowania i dostarczania kapsułek do oczu myszy. Manuskrypt podsumowuje etapy mikrokapsułkowania komórek, kontroli jakości i dostarczania do oka.

Wprowadzenie

Terapie oparte na komórkach reprezentują rewolucyjne techniki biologiczne, które są szeroko stosowane w medycynie. Od niedawna z powodzeniem stosuje się je w leczeniu chorób neurodegeneracyjnych, chorób oczu i nowotworów. Terapie komórkowe obejmują szeroki zakres dziedzin, od wymiany komórek po dostarczanie leków, a ten protokół koncentruje się na tych ostatnich. Biodegradowalne mikrokapsułki alginianowe (MC) wykazały skuteczność jako system dostarczania i stają się szeroko stosowane w dziedzinie biomedycyny. Alginian został zastosowany w mikrokapsułkowaniu ze względu na prosty proces żelowania, biodegradowalność, doskonałą biokompatybilność i stabilność w warunkach in vivo^1,2,3,4.

Metoda elektronatryskowa, jako technika mikrokapsułkowania, została z powodzeniem wykorzystana do enkapsulacji peptydów i białek za pomocą alginianu (polimeru bazowego) i poli-l-ornityny (polimeru powlekającego wtórnie). Oba polimery są naturalnie występujące i używane ze względu na ich biokompatybilność^5,6,7. Jednak głównym wyzwaniem w terapiach komórkowych jest supresja układu odpornościowego gospodarza w celu uniknięcia skutków ubocznych spowodowanych lekami immunosupresyjnymi. Przepuszczalność mikrokapsułek alginianowych jest uważana za odpowiednią właściwość do enkapsulacji komórek, która umożliwia dyfuzję składników odżywczych, odpadów i czynników terapeutycznych do i z komórek, jednocześnie maskując je przed odpowiedzią immunologiczną gospodarza^8,9,10.

W oku, zamknięte komórki były używane w badaniach klinicznych do ciągłego dostarczania leków biologicznych (tj. czynników wzrostu^11,12 i antagonistów czynnika wzrostu¹³) do leczenia barwnikowego zwyrodnienia siatkówki lub zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem. Inne cele, takie jak inhibitory dopełniacza¹⁴, są obecnie badane w warunkach przedklinicznych.

Protokół

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z Oświadczeniem ARVO dotyczącym wykorzystania zwierząt w badaniach okulistycznych i wzrokowych i zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Medycznego Południowej Karoliny pod numerem protokołu ID 00399.

1. Hodowla komórkowa

1. Wygeneruj linię komórkową ludzkich komórek nabłonka barwnikowego siatkówki (ARPE-19) stabilnie wyrażającą wybrany gen zgodnie z opublikowanymi protokołami^14,15.
2. Utrzymuj komórki w zmodyfikowanym pożywce Dulbecco Eagle Medium (DMEM) uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS).
3. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .
4. Wymieniaj podłoże co 2-3 dni.
5. Pasaż komórek po osiągnięciu 70%–80% konfluencji przy użyciu standardowych procedur hodowli tkankowej.

2. Hermetyzacja komórek

1. Wymieszaj alginian sodu z wodą dejonizowaną (DI), aby uzyskać końcowe stężenie 2% w/v i oczyść przez filtrację za pomocą sterylnego filtra strzykawkowego 0,2 μm.
2. Przygotować komórki do zmieszania z roztworem alginianu poprzez trypsynizację, odwirowanie i przemycie ich 10 mM buforowanym roztworem soli HEPES (pH = 7,4). Za pomocą hemocytometru policz komórki i dostosuj końcowe stężenie komórek do 1 x 10⁶ w roztworze alginianu.
   nuta: Proces hermetyzacji powinien odbywać się wewnątrz wysterylizowanego kaptura.
3. Załaduj ~300 μl porcji mieszaniny alginianów i komórek do strzykawki o pojemności 3 ml i podłącz ją do pompy strzykawkowej. Roztwór zostanie przepompowany przez igłę o sile 30 g z końcówką do sterylnej kąpieli żelującej umieszczonej w sterylnej zlewce o pojemności 50 ml poniżej końcówki strzykawki na głębokości 7 mm, aby uzyskać odległość natryskiwania igły do kąpieli.
4. Kąpiel żelująca zawiera objętość 40 ml 10 mM buforowanego roztworu soli fizjologicznej HEPES zawierającego 100 mM chlorku wapnia (CaCl₂) i 0,5% w/v poli-L-ornityny (PLO). PLO jest wtórną powłoką polimerową, którą można pominąć lub zmienić w zależności od potrzeb badacza.
5. Dostosuj napięcie i natężenie przepływu i utrzymuj je na stałym poziomie podczas procesu enkapsulacji przy natężeniu przepływu 60 mm/h i napięciu początkowym 6,0 kV, aby uzyskać mikrokapsułki o wielkości ~150 μm.
6. Podłącz zacisk drutu anodowego (czerwony) końcówki igły generatora wysokiego napięcia do igły i podłącz zacisk uziemiający () do drutu miedzianego, który jest do połowy zanurzony w kąpieli żelującej. Jedna partia mieszaniny alginian + komórki (1 ml) zajmuje około 30 minut do przygotowania zamkniętych komórek (około 25 000 mikrokapsułek).
7. Uformowane mikrokapsułki zawierające komórki przemyć roztworem płuczącym (10 mM buforowanej soli fizjologicznej HEPES zawierającej 1,5 mM CaCl₂, pH = 7,4) dwukrotnie. Nie używaj PBS do prania.
8. Inkubować zamknięte komórki z 10% pożywką DMEM uzupełnioną FBS w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO₂,
   nuta: Instrumenty do procesu enkapsulacji są przedstawione na Rysunek 1.

3. Potwierdzenie, że enkapsulacja nie wpływa na żywotność komórek

1. Po inkubacji zamkniętych komórek przez 24 godziny w pożywce, należy przygotować małą próbkę 500 μL (~30 mikrokapsułek) do barwienia.
2. Przemyć mikrokapsułki 2x roztworem płuczącym (10 mM buforowanej soli fizjologicznej HEPES zawierającej 1,5 mM CaCl₂) i zabarwić je w celu zapewnienia żywotności żywej śmierci za pomocą zestawu do oznaczania żywych/martwych.
3. Przygotować mieszaninę barwiącą kalceiny AM (acetoksymetylu) i homodimeru etydyny-1 w końcowych stężeniach odpowiednio 2 μM i 4 μM.
4. Dodać 2 ml mieszaniny barwiącej do zamkniętych komórek i inkubować przez 30–45 minut w ciemności w temperaturze pokojowej (RT).
5. Przy ostrożnym zasysaniu odessać roztwór barwiący i przemyć mikrokapsułki 2x roztworem myjącym. Użyj systemu mikroskopu fluorescencyjnego, aby obserwować i obrazować zamknięte komórki.
   nuta: Dokumentacja enkapsulacji jest przedstawiona w Rysunek 2.

4. Potwierdzenie, że kapsułki mają odpowiedni rozmiar do dostarczania i dostarczania leku biologicznego.

1. Iniekcje doszklistkowe do oka myszy są zwykle wykonywane za pomocą igły o końcówce o wadze 27 g (średnica wewnętrzna 210 μm) przymocowanej do strzykawki Hamiltona o pojemności 2,5 μl.
2. Wytwarzaj kapsułki o wielkości od 100 do 200 μm, rozcieńczaj je w podłożu bez surowicy i ostrożnie wciągaj do strzykawki Hamiltona. PBS nie jest odpowiednim nośnikiem, ponieważ kapsułki alginianowe rozpuszczają się w PBS.
3. Powoli wysunąć krople zawierające kapsułki o wielkości 1 μl na szkiełko mikroskopowe i określić ich integralność za pomocą pionowego mikroskopu jasnego pola.
4. Dostosuj rozmiar kapsułki (patrz krok 2.3), dostosowując odpowiednio voltage i natężenie przepływu. Mniejsze mikrokapsułki są produkowane w sposób nieliniowy poprzez zwiększanie napięcia i nieznaczne zmniejszanie natężenia przepływu⁸. W naszych rękach najbardziej odpowiednie okazały się kapsułki o średnicy 150 μm. Regulacja wielkości kapsułki jest również uzależniona od utrzymania stałego stężenia alginianów przy jednoczesnej zmianie pozostałych parametrów.
5. Utrzymuj oddzielny zestaw komórek w kapsułkach o odpowiedniej wielkości w podłożu bez surowicy, aby określić ilość wydzieliny pożądanego leku biologicznego. Użyć czułych testów ELISA lub western blot, aby określić stężenie leków biologicznych w supernatancie.
6. Określić wymaganą ilość kapsułek, które należy wstrzyknąć, w oparciu o znaną farmakokinetykę/farmakodynamikę (PK/PD) środka terapeutycznego. W naszych rękach 10 kapsułek na oko myszy okazało się najbardziej skuteczne.

5. Podawanie kapsułek do ciała szklistego myszy

1. Wykonaj iniekcje doszklistkowe za pomocą mikroskopu preparacyjnego. Zobacz Rysunek 3 przedstawia przygotowanie chirurgiczne i materiały użyte podczas zabiegu. Szczegółowy protokół dotyczący iniekcji doszklistkowych można znaleźć gdzie indziej¹⁶.
2. Znieczulenie myszy poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie ksylazyny i ketaminy (20 mg/kg i 80 mg/kg) lub innych preferowanych środków znieczulających zatwierdzonych przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania danej instytucji. Upewnij się, że znieczulenie jest na odpowiedniej głębokości za pomocą szczypania palców u stóp¹⁷.
3. Rozszerz źrenice myszy za pomocą fenylefryny HCL (2,5%) i siarczanu atropiny (1%), aby zapewnić dobrą widoczność komory ciała szklistego i nałóż nawilżający żel pod oczy na oczy, aby utrzymać ich nawilżenie podczas zabiegu.
4. Nakłuć twardówkę na rąbku igłą 26 G jako otworem prowadzącym, upewniając się, że 1) igła jest ustawiona pod kątem 45° z okiem i stołem oraz 2) ścięta końcówka jest skierowana do góry, aby uniknąć przebicia soczewki.
5. Ostrożnie wstrzyknąć kapsułki za pomocą igły o sile 27 G z końcówką przymocowanej do strzykawki Hamiltona pod kątem 45° pod kontrolą wzrokową, upewniając się, że nie dotyka się igły soczewki. Uszkodzenie soczewki doprowadzi do powstania zaćmy. Kapsułki powinny być widoczne w ciele szklistym za pomocą mikroskopu preparacyjnego (Ryc. 4A).
6. Po wycofaniu igły należy leczyć miejsce wstrzyknięcia maściami z antybiotykiem, neomycyną i siarczanami polimyksyny B oraz maścią z antybiotykiem okulistycznym deksametazonu.
7. Nałóż goniotaire hypromeloza demulujący roztwór okulistyczny (2,5%) na oba oczy, aby zapobiec wysuszeniu rogówki w okresie rekonwalescencji.
8. Umieść mysz na poduszce grzewczej utrzymywanej w temperaturze 37°C i monitoruj, aż do całkowitego wybudzenia.
9. Udane wstrzyknięcie zamkniętych w kapsułkach komórek ARPE-19 powinno ujawnić obecność nienaruszonych kapsułek w komorze ciała szklistego myszy z niewielkimi ilościami zanieczyszczeń podczas obrazowania oka za pomocą optycznej tomografii koherentnej lub innych metod (Figura 4B).
10. Oko myszy, w które wstrzyknięto implant, po kilku dniach rekonwalescencji po operacji, jest teraz gotowe do wdrożenia paradygmatu eksperymentalnego.
    nuta: Konfiguracja chirurgiczna i dokumentacja kapsułek w oku są przedstawione odpowiednio na Rysunek 3 i Rysunek 4.

Wyniki

Komórki ARPE-19 to spontanicznie unieśmiertelniona ludzka linia komórkowa nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE), w przypadku której wykazano podatność na enkapsulację oraz długoterminowe przeżycie po implantacji kapsułek do oka. Narzędzia do enkapsulacji w alginianie przedstawiono na Rysunku 1. W niniejszym badaniu wykazano, że po enkapsulacji w alginianie obecność komórek w kapsułkach alginianowych została potwierdzona za pomocą obrazowania w polu jasnym (Rysunek 2A

Dyskusja

Ta technika enkapsulacji komórek jest stosunkowo szybka i łatwa do wykonania; Należy jednak pamiętać o pewnych kwestiach, aby uzyskać dokładne wyniki końcowe. Komórki powinny być utrzymywane w hodowli na szalce Petriego przed enkapsulacją i utrzymywane w odpowiednim zbiegu. Enkapsulacja powinna być wykonywana w odpowiednim okapie wentylacyjnym z regulowanym przepływem powietrza, jeśli to możliwe. Zbyt silny prąd powietrza może wpływać na tworzenie się kapsułek, zwłaszcza w długotrwałych eksperymentach. Sterylne naczynia ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
3 ml Strzykawka	BD	309656
30 G 1" igła	SAI Technologia infuzji	B30-100
Sól sodowa kwasu alginowego, z brązowych alg	Sigma	A0682
Siarczan atropiny Roztwór oftalmoliczny (1%)	Akorn	NDC 17478-215-15	do rozszerzania źrenicy
BD 1 mL Strzykawka 26 G x 3/8 (0,45 mm x 10 mm)	Becton, Dickinson i Firma	DG518105 500029609 REF 309625	do generowania otworu prowadzącego
Chlorek wapnia, bezwodny, granulowany	Sigma	C1016
GenTeal Tears	Alcon	NDC 0078-0429-47	do smarowania oczu podczas znieczulenia
Goniotaire: Hypromeloza (2,5%) Oftalmoliczny roztwór łagodzący (sterylny)	Altaire Pharmaceuticals Inc.	NDC 59390-182-13	do smarowania oczu podczas znieczulenia
Hamilton Końcówka igły/strzykawki: 27 G, mała piasta RN NDL, długość tulei (12 mm), końcówka 3, 6/PK	Hamilton	7803-01	do podawania kapsułek do ciała szklistego
Strzykawka Hamilton: 2,5 i mikro; L, Model 62 RN SYR, NDL sprzedawany oddzielnie	Hamilton	7632-01	do doszklistkowego dostarczania kapsułek
Bufor HEPES, 1 M	Bioodczynniki Fisher	BP299100
Generator wysokiego napięcia	ESD Technologia EMC	ES813-D20
ŻYWY/MARTWY Zestaw żywotności/cytotoksyczności	Thermofisher Scientific	L3224
Chlorowodorek L-ornityny, 99%	Alfa Aesar	A12111
Siarczany neomycyny i polimyksyny B oraz deksametazon Maść oftalmolowa	SANDOZ	NDC 61314-631-36	Antybiotyk zapobiegający infekcji po wstrzyknięciu do ciała szklistego
Chlorowodorek fenolefryny Roztwór oftalmolowy (2,5%)	Akorn	NDC 17478-201-15	do rozszerzania źrenic
Chlorek sodu	Sigma	S-5886
Sterylna strzykawka filtry, 0,2 μ m	VWR	28143-312
Pompa strzykawkowa	GRASEBY	MS16A