Artykuł metodologiczny

Izolacja wzbogaconych egzosomami pęcherzyków zewnątrzkomórkowych przenoszących czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów z embrionalnych komórek macierzystych

DOI:

10.3791/60170

⸱

11 listopada 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacology and Toxicology, University of Louisville, 2Experimental Therapeutics Program, Brown Cancer Center, University of Louisville, 3Department of Medicine, University of Louisville, 4Department of Surgery, University of Louisville, 5Immuno-Oncology Program, Brown Cancer Center, University of Louisville, 6Department of Microbiology and Immunology, University of Louisville

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie opisuje metodę izolowania z embrionalnych komórek macierzystych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych wzbogaconych egzosomami przenoszących czynniki stymulujące tworzenie kolonii granulocytów makrofagów granulocytów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Embrionalne komórki macierzyste (ESC) to pluripotencjalne komórki macierzyste zdolne do samoodnawiania się i różnicowania we wszystkie typy komórek embrionalnych. Podobnie jak wiele innych typów komórek, ESC uwalniają małe pęcherzyki błonowe, takie jak egzosomy, do środowiska zewnątrzkomórkowego. Egzosomy służą jako niezbędne mediatory komunikacji międzykomórkowej i odgrywają podstawową rolę w wielu procesach (pato)fizjologicznych. Czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów (GM-CSF) działa jako cytokina modulująca odpowiedź immunologiczną. Obecność GM-CSF w egzosomach może potencjalnie zwiększyć ich funkcję immunologiczno-regulacyjną. W tym przypadku GM-CSF ulegał stabilnej nadekspresji w mysiej linii komórkowej ESC ES-D3. Opracowano protokół izolowania wysokiej jakości pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) wzbogaconych egzosomami z komórek ES-D3 z nadekspresją GM-CSF. Wyizolowane EV wzbogacone egzosomami charakteryzowały się różnorodnymi podejściami eksperymentalnymi. Co ważne, stwierdzono, że znaczne ilości GM-CSF są obecne w EV wzbogaconych w egzosomy. Ogólnie rzecz biorąc, EV wzbogacone w egzosomy GM-CSF z ESC mogą funkcjonować jako pęcherzyki bezkomórkowe, aby wywierać swoje działania immunoregulacyjne.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ESC pochodzą ze stadium blastocysty zarodka preimplantacyjnego1. Jako pluripotencjalne komórki macierzyste, ESC mają zdolność do samoodnawiania się i różnicowania w dowolny typ komórki embrionalnej. Ze względu na swój niezwykły potencjał rozwojowy i długoterminową zdolność do proliferacji, ESC są niezwykle cenne dla badań biomedycznych1. Obecne wysiłki badawcze w dużej mierze koncentrują się na potencjale terapeutycznym ESC w przypadku różnych głównych zaburzeń patologicznych, w tym cukrzycy, chorób serca i chorób neurodegeneracyjnych2,3,4.

Komórki ssaków, w tym ESC, są znane z tego, że uwalniają pęcherzyki o różnych rozmiarach do środowiska zewnątrzkomórkowego, a te EV posiadają wiele fizjologicznych i patologicznych funkcji ze względu na ich rolę w komunikacji międzykomórkowej5. Wśród różnych podtypów EV, egzosomy to małe pęcherzyki błonowe uwalniane z różnych typów komórek do przestrzeni zewnątrzkomórkowej po fuzji pośrednich przedziałów endocytarnych, ciał wielopęcherzykowych (MVB), z błoną plazmatyczną6. Doniesiono, że egzosomy pośredniczą w komunikacji międzykomórkowej i są krytycznie zaangażowane w wiele procesów (pato)fizjologicznych7,8. Egzosomy dziedziczą niektóre funkcje biologiczne po własnych komórkach rodzicielskich, ponieważ egzosomy zawierają materiały biologiczne pozyskane z cytozolu, w tym białka i kwasy nukleinowe. W ten sposób powiązane antygeny lub czynniki stymulujące odpowiedź immunologiczną specyficzną dla danej choroby są zamknięte w egzosomach z określonych typów komórek9. Utorowało to drogę do badań klinicznych badających egzosomy pochodzące z nowotworów jako szczepionkę przeciwnowotworową10.

GM-CSF to cytokina wydzielana przez różne typy komórek odpornościowych11. Pojawiające się dowody wskazują, że GM-CSF aktywuje i reguluje układ odpornościowy oraz odgrywa istotną rolę w procesie prezentacji antygenu12. Na przykład raport kliniczny sugeruje, że GM-CSF stymuluje odpowiedź immunologiczną na nowotwory jako adiuwant szczepionki 13. W badaniach klinicznych zbadano kilka strategii immunoterapii nowotworów opartych na GM-CSF w celu wykorzystania silnej aktywności immunostymulującej GM-CSF14. Wśród nich szczepionka przeciwnowotworowa złożona z napromieniowanych komórek nowotworowych wydzielających GM-CSF okazała się obiecująca u pacjentów z zaawansowanym czerniakiem, indukując komórkowe i humoralne odpowiedzi przeciwnowotworowe, a następnie martwicę w guzach z przerzutami15.

Ponieważ egzosomy pochodzące z ESC mają podobną aktywność biologiczną jak oryginalne ESC, być może egzosomy z ESC przenoszące GM-CSF mogłyby funkcjonować jako bezkomórkowe pęcherzyki regulujące odpowiedź immunologiczną. W artykule opisano szczegółową metodę wytwarzania wysokiej jakości EV wzbogaconych w egzosomy z ESC eksprymujących GM-CSF. Te wzbogacone egzosomami EV mogą potencjalnie służyć jako pęcherzyki regulujące układ odpornościowy w celu modulowania odpowiedzi immunologicznej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hodowla komórek ES-D3

  1. Aby wytworzyć wolną od egzosomów płodową surowicę bydlęcą (FBS), należy załadować FBS do ultrawirówki i odwirować przy 100 000 x g przez 16 godzin w temperaturze 4 °C. Po odwirowaniu zbierz supernatant surowicy jako FBS wolny od egzosomów w celu hodowli mysiej linii komórkowej ESC ES-D3 i uzyskania EV wzbogaconych w egzosomy.
  2. Przed posiewem komórek ES-D3 pokryj 15 cm szalki do kultur tkankowych żelatyną (0,1%) w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
  3. Postępując zgodnie z wcześniej opisanym protokołem16, hoduj komórki ES-D3 bez warstwy zasilającej w pokrytych żelatyną 15 cm naczyniach do hodowli tkankowych. Pożywka do hodowli komórkowych ES-D3 składa się z DMEM, FBS wolnego od egzosomów (15%), aminokwasów endogennych (0,1 mM), L-glutaminy (2 mM), β-merkaptoetanolu (0,1 mM), penicyliny (50 jednostek/ml), streptomycyny (50 μg/ml) i czynnika hamującego białaczkę (LIF; 100 jednostek/ml). Hodowla komórek ES-D3 w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wilgotnością 5% CO2 .
  4. Gdy komórki ES-D3 osiągną około 90% zbieżności w 15-centymetrowych szalkach do hodowli tkankowej, należy usunąć pożywkę przez aspirację. Umyj komórki za pomocą trypsyny (5 ml; 0,05%). Dodać trypsynę (5 ml) do potraw i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Zbierz komórki z naczyń.
  5. Dodaj świeżą pożywkę hodowlaną (5 ml) do pobranych komórek, aby dezaktywować trypsynę. Odwirować komórki przy sile 390 x g przez 5 minut. Ponownie zawiesić komórki na świeżym podłożu i określić liczbę komórek za pomocą hemocytometru.
  6. W przypadku komórek pasażujących należy umieścić komórki ES-D3 (5 x 106) w pokrytym żelatyną (0,1%) naczyniu do hodowli tkankowej o średnicy 15 cm ze świeżą pożywką (15 ml) i hodować przez 3 dni przed subkulturacją komórek.
  7. Aby zebrać supernatant do hodowli komórkowej do izolacji EV wzbogaconych w egzosomy, połóż komórki ES-D3 (1 x 107) w pokrytym żelatyną (0,1%) 15 cm naczyniu do hodowli tkankowych ze świeżą pożywką (15 ml) przez 3 dni przed pobraniem supernatantu do hodowli komórkowych.

2. Generowanie plazmidu ekspresji GM-CSF

UWAGA: Wygeneruj plazmid transfekcyjny pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP do nadekspresji GM-CSF w komórkach ES-D3. W tym plazmidzie ekspresja mysiego cDNA GM-CSF wraz z białkiem markerowym humanizowanym Renilla reniformis GFP (hrGFP) jest napędzana przez promotor ludzkiego czynnika wydłużenia łańcucha polipeptydowego 1α (EF1α) 17,18.

  1. Wygeneruj szkielet wektora.
    1. Trawić plazmid pEF1α-FD3ER-IRES-hrGFP (20 μg DNA) za pomocą enzymu restrykcyjnego EcoRI (100 jednostek) w temperaturze 37 °C przez 2 godziny w celu wytworzenia dwóch fragmentów DNA: szkieletu wektora (6,0 kb) i insertu FD3ER (2,5 kb).
    2. Przenieść 50% strawionego plazmidowego DNA (10 μg) do jednej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i traktować fosfatazą alkaliczną (20 jednostek) w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę. Rozpuścić zarówno nieleczone, jak i odfosforylowane DNA za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym (2%).
    3. Oczyść fragmenty DNA szkieletu wektora (6,0 kb) za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu DNA. Podczas gdy nieleczony szkielet wektora będzie służył jako pusty wektor (pEF1α-IRES-hrGFP), zdefosforylowany szkielet wektora zostanie wykorzystany do wytworzenia plazmidu eksprymującego GM-CSF (pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP).
  2. Wygeneruj wstawkę cDNA GM-CSF.
    1. Trawić plazmid pMSCV-mGM-CSF-IRES-EGFP19 (20 μg) za pomocą enzymu restrykcyjnego EcoRI (100 jednostek) w temperaturze 37 °C przez 2 godziny w celu wytworzenia dwóch fragmentów DNA: szkieletu wektora (6,5 kb) i mysiej insercji cDNA GM-CSF (474 pz).
    2. Rozpuścić strawione DNA za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym (2%). Oczyść mysi fragment cDNA GM-CSF (474 pz) za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu DNA.
  3. Wygeneruj plazmidy ekspresji.
    1. Przygotuj 2 reakcje ligacji (całkowita objętość 10 μl) za pomocą zestawu do ligacji DNA.
      1. Aby wygenerować pusty wektor pEF1α-IRES-hrGFP, należy podwiązać nieleczony szkielet wektora z kroku 2.1.3 (6.0 kb; 500 ng).
      2. Aby wygenerować pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP, należy podwiązać następujące fragmenty DNA: (1) zdefosforylowany szkielet wektorowy z kroku 2.1.3 (6,0 kb; 500 ng) i (2) fragment cDNA mGM-CSF wygenerowany w kroku 2.2.2 (474 pz; 200 ng).
    2. Związać w temperaturze 25 °C przez 5 minut. Przekształć zligowane DNA w komórki E. coli kompetentne DH5α. Przekształcone komórki E. coli należy umieścić na płytkach LB-agar zawierających karbenicylinę (50 μg/ml).
    3. Oczyść plazmidy z pojedynczych kolonii E. coli za pomocą zestawu do izolacji DNA. Zweryfikuj tożsamość plazmidów za pomocą sekwencjonowania DNA.

3. Generowanie komórek ES-D3 z nadekspresją GM-CSF

UWAGA: Transfekcja komórek ES-D3 plazmidem pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP w celu nadekspresji GM-CS. Kotransfekcja plazmidu pBabe-Neo do komórek ES-D3, aby ułatwić wybór stabilnie transfekowanych komórek18,20.

  1. Transfekcja plazmidów do komórek ES-D3.
    1. Umieść komórki ES-D3 (1,4 x 106) w pokrytym żelatyną (0,1%) 10 cm naczyniu do hodowli tkankowej z pożywką (10 ml) do transfekcji. Hodowla komórek ES-D3 posiana w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.
    2. Przygotować dwie mieszaniny plazmidów w probówkach mikrowirówkowych o pojemności 1,5 ml: (1) pEF1α-IRES-hrGFP (28 μg, kontrola wektorowa) z pBabe-Neo (4 μg) i (2) pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP (28 μg, z ekspresją GM-CSF) z pBabe-Neo (4 μg). Przeprowadzić transfekcję za pomocą zestawu do transfekcji zgodnie z protokołem producenta.
    3. Dodać pożywkę do transfekcji (1 ml) i odczynnik do transfekcji (64 μl) do każdej probówki zawierającej mieszaniny plazmidów i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
    4. Dodać mieszaniny transfekcji do odpowiednich 10 cm szalek komórek ES-D3. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 godzin.
    5. Zastąp pożywkę w 10 cm naczyniach świeżą pożywką hodowlaną (10 ml). Inkubować w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.
  2. Generuj masowe populacje stabilnie transfekowanych komórek ES-D3.
    1. Usunąć pożywkę z transfekowanych komórek ES-D3. Umyj komórki trypsyną (2 ml; 0,05%). Dodać trypsynę (2 ml) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Przenieś komórki do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i dodaj 2 ml świeżej pożywki hodowlanej, aby zneutralizować trypsynę. Wirować przy 390 x g przez 5 min.
    2. Zawiesić transfekowane komórki w świeżej pożywce hodowlanej (10 ml). Oceń intensywność fluorescencji GFP w transfekowanych komórkach ES-D3 za pomocą sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS), zgodnie z protokołem producenta.
    3. Przenieść transfekowane komórki do dwóch 10 cm szalek zawierających świeżą pożywkę hodowlaną (10 ml). Dodaj neomycynę (0,5 mg/ml), aby wyeliminować nietransfekowane komórki.
    4. Kontynuować hodowlę transfekowanych komórek w pożywce hodowlanej zawierającej neomycynę (0,5 mg/ml). Gdy transfekowany ES-D3 osiągnie 90% konfluencji, ponownie przenieś komórki do 15-centymetrowych szalek do hodowli tkankowej. Powtarzaj procedurę przez 2 tygodnie.
  3. Generuj klony stabilnie transfekowanych komórek ES-D3.
    1. Po wygenerowaniu dużych populacji stabilnie transfekowanych komórek ES-D3, zbierz komórki jak poprzednio. Określ liczbę komórek za pomocą hemocytometru. Odwirować komórki przy sile 390 x g przez 5 minut. Zawiesić komórki (1 x 10 7 komórek/ml) w świeżej pożywce hodowlanej.
    2. Przefiltruj komórki przez sterylne sitko o wielkości 40 μm. Oczyść ogniwa ES-D3 z dodatnim GFP za pomocą FACS, zgodnie z protokołem producenta.
    3. Umieścić pojedynczą posortowaną komórkę ES-D3 w jednym dołku pokrytej żelatyną (0,1%) 96-dołkowej płytki do hodowli tkankowej zawierającej rodzicielskie komórki ES-D3 (1 x 103) w pożywce wolnej od neomycyny (200 μL). Współhodowla transfekowanych komórek ES-D3 z ich nietransfekowanymi odpowiednikami rodzicielskimi zapewnia, że stabilnie transfekowane pojedyncze komórki ES-D3 przetrwają i namnażają się jako pojedynczy klon.
    4. Hoduj komórki przez 48 godzin, a następnie dodaj neomycynę (0,5 mg / ml) do 96-dołkowych płytek w celu wyeliminowania nietransfekowanych rodzicielskich komórek ES-D3.
    5. Kontynuuj hodowlę komórek ES-D3 GFP-dodatnich na 96-dołkowych płytkach do hodowli tkankowej z pożywką zawierającą neomycynę (0,5 mg / ml) przez 1 tydzień. Przenieś klonalne linie komórkowe ES-D3 do pokrytych żelatyną (0,1%) 6 cm naczyń do hodowli tkankowej z pożywką (5 ml) zawierającą neomycynę (0,5 mg / ml) przez 1 tydzień.
    6. Określ intensywność fluorescencji GFP w każdym z transfekowanych klonów komórek ES-D3 za pomocą FACS, zgodnie z protokołem producenta. Wybierz klony ES-D3 wykazujące ekspresję GM-CSF lub pusty wektor o wysokim poziomie zielonej fluorescencji.
    7. Określ ilości GM-CSF wydzielane przez komórki ES-D3 za pomocą mysiego zestawu ELISA GM-CSF, zgodnie z protokołem producenta.

4. Izolacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych wzbogaconych egzosomami

  1. Hodować komórki ES-D3 (1 x 107) w 15 cm szalkach do hodowli tkankowej przez 72 godziny w temperaturze 37 °C. Zebrać supernatant hodowli komórkowej. Zebrany supernatant przechowywać w temperaturze 4 °C do 1 tygodnia w celu zachowania integralności egzosomalnej.
  2. Odwirować supernatant kultur komórkowych przy 5 000 x g przez 60 minut w temperaturze 4 °C za pomocą wirówki w celu osadzenia dużych fragmentów komórek.
  3. Zebrać supernatant i odwirować przy 100 000 x g przez 90 minut w temperaturze 4 °C za pomocą ultrawirówki.
  4. Usunąć supernatant. Delikatnie przepłukać każdą osadkę dwukrotnie solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS; 1 ml) w celu usunięcia pozostałości supernatantu hodowli.
  5. Ponownie zawieś każdą granulkę w PBS. Określ ilościowo EV wzbogacone w egzosomy na podstawie ich zawartości białka5.
    1. Zmierz stężenie białka EV wzbogaconych w egzosomy za pomocą testu kwasu bicinchoninowego (BCA). Oczekiwana wydajność EV wzbogaconych egzosomami z komórek ES-D3 wynosi około 4 μg białka/ml supernatantu do hodowli komórkowych. Zawiesić EV wzbogacone w egzosomy w PBS (stężenie białka: ~6 μg/μL). Przechowuj EV wzbogacone w egzosomy w temperaturze -80 °C.

5. Charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych wzbogaconych egzosomami za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej

UWAGA: Zbadaj skład i strukturę EV wzbogaconych egzosomami wyizolowanych z ESC za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM)5.

  1. Utrwal EV wzbogacone w egzosomy (3-5 μg/μL) końcowym stężeniem 2% paraformaldehydu klasy EM w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.
  2. Załadować utrwalone próbki (10 μl) na miedziane siatki z węglową folią nośną. Próbki należy inkubować z kratkami miedzianymi przez 1 minutę, a następnie osuszyć siatki bibułą filtracyjną.
  3. Zabarwić kratki roztworem barwiącym zgodnie z protokołem producenta.
  4. Przenieś siatki na kawałek bibuły filtracyjnej za pomocą pęsety. Pozostaw kratki do wyschnięcia przez noc w temperaturze pokojowej.
  5. Rejestruj obrazy z mikroskopii elektronowej za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego (powiększenie 50 000x), zgodnie z protokołem producenta.

6. Ocena pęcherzyków zewnątrzkomórkowych wzbogaconych egzosomami za pomocą analizy western blot

  1. Przygotuj ekstrakty z całych komórek.
    1. Usunąć pożywkę z komórek ES-D3 hodowanych w 15 cm szalkach. Umyj komórki trypsyną (5 ml; 0,05%). Dodaj trypsynę (5 ml) do komórek. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Zbierz komórki i dodaj świeżą pożywkę hodowlaną (5 ml), aby zneutralizować trypsynę. Odwirować komórki przy sile 390 x g przez 5 minut. Ponownie zawieś komórki w PBS.
    2. Określ liczbę komórek za pomocą hemocytometru. Ponownie odwirować komórki przy 390 x g przez 5 minut. Ponownie zawieś komórki w buforze ładującym SDS-PAGE zawierającym 0,5% SDS (5 000 komórek/μL).
    3. Sonikować próbki przez 10 s za pomocą sonikatora o amplitudzie 10% (moc: 500 W; częstotliwość ultradźwiękowa: 20 kHz). Podgrzewać próbki w temperaturze 100 °C przez 5 minut.
  2. Przygotuj lizaty EV wzbogaconych egzosomami.
    1. Zawiesić EV wzbogacone w egzosomy w buforze ładującym SDS-PAGE zawierającym 0,5% SDS w stężeniu 1,2 μg/μL.
    2. Sonikować próbki przez 10 s za pomocą sonikatora o amplitudzie 10% (moc: 500 W; częstotliwość ultradźwiękowa: 20 kHz). Podgrzewać próbki w temperaturze 100 °C przez 5 minut.
  3. Wykrywanie białek za pomocą Western blot.
    1. Załaduj ekstrakty z całych komórek (10 μl; 5 000 komórek/μl) i lizaty EV wzbogacone egzosomami (10 μl; 1,2 μg/μL) do każdej studzienki żelu Bis-Tris PAGE (4-20%). Przenieś białka na membrany z polifluorku winylidenu (PVDF).
    2. Inkubować błony z odpowiednimi przeciwciałami pierwszorzędowymi i drugorzędowymi. Rozcieńczyć przeciwciała (w stężeniach wskazanych poniżej) w buforze bibułkowym zawierającym PBS, Tween-20 (0,2%) i odtłuszczone mleko w proszku (10% w/v).
      1. Należy stosować następujące przeciwciała pierwszorzędowe: anty-aneksyna V (200 ng / ml), anty-CD81 (50 ng / ml), anty-flotylina-1 (200 ng / ml), anty-cytochrom c (100 ng / ml), izomeraza dwusiarczku przeciwbiałkowego (200 ng / ml), anty-GAPDH (33 ng / ml) i anty-Oxphos COX IV-podjednostka IV (600 ng / ml).
      2. Należy stosować następujące przeciwciała drugorzędowe: anty-królicze IgG sprzężone z peroksydazą (20 ng / ml) i kozie przeciwciała anty-mysie sprzężone z peroksydazą (20 ng / ml).
    3. Wykrywaj białka za pomocą ulepszonego zestawu do wykrywania chemiluminescencji.

7. Określanie stężeń GM-CSF w pęcherzykach zewnątrzkomórkowych wzbogaconych egzosomami za pomocą testu ELISA

UWAGA: Oceń ilości GM-CSF w EV wzbogaconych egzosomami za pomocą testu ELISA za pomocą zestawu do mysiego GM-CSF, zgodnie z protokołem producenta z pewnymi modyfikacjami.

  1. Pokryj płytkę ELISA przeciwciałem wychwytującym. Traktuj EV wzbogacone egzosomami (0,6 μg) w samym PBS lub PBS + 0,05% Tween-20 (100 μL) w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Dodać próbki poddane działaniu substancji do powlekanej płytki ELISA i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Umyj płytkę samym PBS lub PBS + 0,05% Tween-20.
  2. Dodaj przeciwciało wykrywające do próbek. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Umyj płytkę samym PBS lub PBS + 0,05% Tween-20. Dodać Avidin-HRP do próbek. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Umyj płytkę samym PBS lub PBS + 0,05% Tween-20.
  3. Określić stężenia GM-CSF w EV wzbogaconych egzosomami, mierząc absorbancję przy 450 nm na czytniku mikropłytek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

GM-CSF występuje nadekspresja w mysich ESC.
Aby stabilnie nadekspresja GM-CSF w komórkach ES-D3, mysie cDNA GM-CSF sklonowano do wektora transfekcji w celu wygenerowania wektora ekspresyjnego pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP (Rysunek 1A). GM-CSF ulegał nadekspresji w komórkach ES-D3 przez transfekcję, a około 20% przejściowo transfekowanych komórek ES-D3 było GFP-dodatnich. Klony komórek stabilnie z nadekspresją GM-CSF lub pustą kontrolą w...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie to pokazuje wysoce wydajną metodę wytwarzania EV wzbogaconych w egzosomy przenoszących białko immunostymulujące GM-CSF, które można wykorzystać do badania immunomodulacyjnego działania EV wzbogaconych w egzosomy. Kilka badań sugeruje, że egzosomy wykazują funkcje immunoregulacyjne i przeciwnowotworowe22. Tak więc egzosomy z ESC wyrażające GM-CSF mogą również posiadać aktywność biologiczną, która reguluje odpowiedź immunologiczną. W tym protokole egzogenny mysi GM-CSF ulegał stabilnej nadek...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kavitha Yaddanapudi, Chi Li i John W. Eaton złożyli w USA wniosek patentowy "Kompozycje zawierające zmodyfikowane egzosomy pochodzące z embrionalnych komórek macierzystych i metody ich wykorzystania".

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jesteśmy wdzięczni Panu Arkadiuszowi Ślusarczykowi i Kentucky Biomedical Research Infrastructure Network (KBRIN, P20GM103436) za pozyskanie obrazów z transmisyjnego mikroskopu elektronowego. Praca ta była częściowo wspierana przez granty z NIH AA018016-01 (J.W.E.), Commonwealth of Kentucky Research Challenge Trust Fund (J.W.E.), NIH CA106599 and CA175003 (C.L.), NIH CA198249 (K.Y.) oraz Free to Breathe Research Grant (KWA).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Fosforan alkaliczny, Jelito cielęciaNew England BiolabsM0290SDefosforylujący plazmid DNA
anty-aneksyna V mAbSanta Cruz Biotechnologyklon H-3, sc-74438Western blot, RRID:AB_1118989
anty-CD81 mAbSanta Cruz Biotechnologyklon B-11, sc-166029Western blot, RRID:AB_2275892
antycytochrom c mAbSanta Cruz Biotechnologicznyklon A-8, sc-13156Western blot, RRID:AB_627385
anty-Flotillin-1 mAbSanta Cruz Biotechnologyklon C-2; sc-74566Western blot, RRID:AB_2106563
anty-GAPDH pAbRockland600-401-A33SWestern blot, RRID:AB_11182910
anty-mysia IgG, koza, sprzężona z peroksydaząThermo Fisher31430Western blot, RRID:AB_228307
anty-Oxphos COX IV-subunit IV mAbThermo Fisherklon 20E8C12 A21348Western blot, RRID:AB_221509
izomeraza dwusiarczkowa przeciwbiałkowa (PDI) pAbEnzoADI-SPA-890Western blot, RRID:AB_10616242
anty-królicza IgG, koza, sprzężona z peroksydaząThermo Fisher31460Western blot, RRID:AB_228341
Test BCA (kwas bicinchoninowy)Thermo Fisher23223Oznaczanie stężeń białek
Bis-Tris PAGE Gel, ExpressPlus, 4-20%GenscriptM42015Western blot
Karbenicylina, sól disodowaThermo Fisher10177012Wybór kolonii E. coli
Wirówka, Avanti J-26 XPIBeckman CoulterWirowanie wolnoobrotowe
Wirnik wirówki, JA-10Beckman Redlica09U1597do wirowania z niską
prędkością, Nalgene PPCOThermo Fisher3120-0500PKWirowanie o niskiej prędkości
Siatki Cu z folią węglowąMikroskopia elektronowa NaukiFF200-CuAkwizycja obrazów z mikroskopii elektronowej
EcoRINew England BiolabsR0101Trawienie plazmidu DNA
Zwiększona chemiluminescencja system detekcjiThermo Fisher32106Western blot
Cytometr przepływowy FACScaliburBecton DickinsonBadanie poziomów GFP komórek ES-D3
Surowica bydlęcapłodu ATCCSCRR-30-2020Pożywka dla komórek ES-D3
Sterylne sitka komórkowe Fisherbrand; Rozmiar oczek: 40 i mu; mThermo Fisher22-363-547Komory filtrujące ES-D3 do sortowania FACS
Żelatyna (0,1%)Thermo FisherES006BZestaw do hodowli komórek ES-D3
GM-CSF Zestaw ELISAThermo Fisher88733422Oznaczanie stężeń GM-CSF
KnockOut Dulbecco' s Zmodyfikowany Orzeł" s MediumThermo Fisher10-829-018Pożywka dla komórek ES-D3
Czynnik hamujący białaczkęThermo FisherESG1106Pożywka dla komórek ES-D3
L-glutaminaVWRVWRL0131-0100Pożywka dla komórek ES-D3
Odczynnik do transfekcji Lipofectamine 2000Thermo Fisher11668019Transfekcja komórek ES-D3
Czytnik mikropłytek, PowerWave XSBioTekOznaczanie stężeń GM-CSF
Szybki sortownik komórek MoFlo XDPBeckman CoulterIzolowanie pojedynczych klonów komórek ES-D3
NEB 5-alfa Kompetentny E. coliNew England BiolabsC2988JGenerowanie plazmidu ekspresji GM-CSF
NeomycynaThermo Fisher10-131-035Wybór klonów ES-D3
Aminokwasy endogenneThermo FisherSH3023801Podłoże do komórek ES-D3
Beztłuszczowe mleko w proszkuThermo FisherNC9022655Western blot
Opti-MEM I Zredukowane podłoże surowicyThermo Fisher31985062Transfekcja komórek ES-D3
ParaformaldehydMikroskopia elektronowa Nauki15710Pozyskiwanie obrazów z mikroskopii elektronowej
Penicylina/streptomycynaVWRsc45000-652Pożywka dla komórek ES-D3
Plazmid pEF1a-FD3ER-IRES-hrGFPAddgene37270Generowanie ekspresji GM-CSF
plazmidowe błony PVDFMilliporeEMD IPVH00010Western blot
QIAprep Spin Miniprep Kit (250)QIAGEN27106Generowanie plazmidu ekspresji GM-CSF
Zestaw do ekstrakcji żelu QIAquick (50)QIAGEN28704Generowanie plazmidu ekspresji GM-CSF
Zestaw do szybkiej ligacjiNew England BiolabsM2200SGenerowanie plazmidu ekspresyjnego GM-CSF
Transmisyjny mikroskop elektronowyHitachiHT7700Akwizycja obrazów z mikroskopii elektronowej
TrypsynaVWR45000-660Hodowla komórek ES-D3
Ultrawirówka, OptimaTM L-100 XPBeckman CoulterHigh wirowanie z prędkością
Wirnik ultrawirówki, 45TiBeckman Coulter09U4454Wirowanie z dużą prędkością
Butelka z poliwęglanu do ultrawirówkiBeckman Coulter355622Wirowanie z dużą prędkością
Roztwór barwiący UranyLessNauki o mikroskopii elektronowej22409Pozyskiwanie obrazów z mikroskopii elektronowej
Butelka wirówki

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  2. Sakthiswary, R., Raymond, A. A. Stem cell therapy in neurodegenerative diseases: From principles to practice. Neural Regeneration Research. 7 (23), 1822-1831 (2012).
  3. Liu, Y. W., et al. Human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes restore function in infarcted hearts of non-human primates. Nature Biotechnology. 36 (7), 597-605 (2018).
  4. Aguayo-Mazzucato, C., Bonner-Weir, S. Stem cell therapy for type 1 diabetes mellitus. Nature Reviews: Endocrinology. 6 (3), 139-148 (2010).
  5. Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  6. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
  7. Meldolesi, J. Exosomes and Ectosomes in Intercellular Communication. Current Biology. 28 (8), R435-R444 (2018).
  8. Stremersch, S., De Smedt, S. C., Raemdonck, K. Therapeutic and diagnostic applications of extracellular vesicles. Journal of Control Release. 244 (Pt B), 167-183 (2016).
  9. Lindenbergh, M. F. S., Stoorvogel, W. Antigen Presentation by Extracellular Vesicles from Professional Antigen-Presenting Cells. Annual Review of Immunology. 36, 435-459 (2018).
  10. Kunigelis, K. E., Graner, M. W. The Dichotomy of Tumor Exosomes (TEX) in Cancer Immunity: Is It All in the ConTEXt? Vaccines (Basel). 3 (4), 1019-1051 (2015).
  11. Becher, B., Tugues, S., Greter, M. GM-CSF: From Growth Factor to Central Mediator of Tissue Inflammation. Immunity. 45 (5), 963-973 (2016).
  12. Conti, L., Gessani, S. GM-CSF in the generation of dendritic cells from human blood monocyte precursors: recent advances. Immunobiology. 213 (9-10), 859-870 (2008).
  13. Higano, C. S., et al. Integrated data from 2 randomized, double-blind, placebo-controlled, phase 3 trials of active cellular immunotherapy with sipuleucel-T in advanced prostate cancer. Cancer. 115 (16), 3670-3679 (2009).
  14. Yan, W. L., Shen, K. Y., Tien, C. Y., Chen, Y. A., Liu, S. J. Recent progress in GM-CSF-based cancer immunotherapy. Immunotherapy. 9 (4), 347-360 (2017).
  15. Dranoff, G., et al. Vaccination with irradiated tumor cells engineered to secrete murine granulocyte-macrophage colony-stimulating factor stimulates potent, specific, and long-lasting anti-tumor immunity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (8), 3539-3543 (1993).
  16. Tremml, G., Singer, M., Malavarca, R. Chapter 1, Unit 1C 4, Culture of mouse embryonic stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. , (2008).
  17. Kirsch, P., Hafner, M., Zentgraf, H., Schilling, L. Time course of fluorescence intensity and protein expression in HeLa cells stably transfected with hrGFP. Molecules and Cells. 15 (3), 341-348 (2003).
  18. Zeng, X., et al. Stable expression of hrGFP by mouse embryonic stem cells: promoter activity in the undifferentiated state and during dopaminergic neural differentiation. Stem Cells. 21 (6), 647-653 (2003).
  19. Yaddanapudi, K., et al. Vaccination with embryonic stem cells protects against lung cancer: is a broad-spectrum prophylactic vaccine against cancer possible? PLoS One. 7 (7), e42289(2012).
  20. Dalby, B., et al. Advanced transfection with Lipofectamine 2000 reagent: primary neurons, siRNA, and high-throughput applications. Methods. 33 (2), 95-103 (2004).
  21. Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Chapter 3, Unit 3 22, Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cell Biology. , (2006).
  22. Zhang, X., et al. Exosomes for Immunoregulation and Therapeutic Intervention in Cancer. Journal of Cancer. 7 (9), 1081-1087 (2016).
  23. Bunggulawa, E. J., et al. Recent advancements in the use of exosomes as drug delivery systems. Journal of Nanobiotechnology. 16 (1), 81(2018).
  24. Schlesinger, S., Lee, A. H., Wang, G. Z., Green, L., Goff, S. P. Proviral silencing in embryonic cells is regulated by Yin Yang 1. Cell Reports. 4 (1), 50-58 (2013).
  25. Dranoff, G. GM-CSF-based cancer vaccines. Immunological Reviews. 188, 147-154 (2002).
  26. Park, Y. G., et al. Effects of Feeder Cell Types on Culture of Mouse Embryonic Stem Cell In Vitro. Development and Reproduction. 19 (3), 119-126 (2015).
  27. Lin, S., Talbot, P. Methods for culturing mouse and human embryonic stem cells. Methods in Molecular Biology. 690, 31-56 (2011).
  28. Yaddanapudi, K., et al. Exosomes from GM-CSF expressing embryonic stem cells are an effective prophylactic vaccine for cancer prevention. OncoImmunology. 8 (3), 1561119(2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Nadekspresja GM CSFprotok ultrawirowaniatransmisyjna mikroskopia elektronowaanaliza Western blotzestaw do detekcji ELISAmetoda izolacji egzosom wnads cz z hodowli kom rkowejmarkery egzosomalne

Powiązane artykuły