Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Układ mikrofizjologiczny jelita/wątroby do oceny farmakokinetyki i toksykologicznej leku

7.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60184

⸱

3 grudnia 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Brazilian Biosciences National Laboratory (LNBio), Brazilian Center for Research in Energy and Materials (CNPEM), 2Brazilian Synchrotron Light Laboratory (LNLS), Brazilian Center for Research in Energy and Materials (CNPEM), 3Grupo Boticário, 4Institute of Biology, University of Campinas

W tym artykule

Podsumowanie

Wystawiliśmy system mikrofizjologiczny (MPS) z organoidami jelitowymi i wątrobowymi na działanie paracetamolu (APAP). W artykule opisano metody produkcji organoidów oraz oceny właściwości farmakokinetycznych i toksykologicznych APAP w MPS. Opisano w nim również analizy funkcjonalności tkanek niezbędne do walidacji wyników.

Streszczenie

Oczekuje się, że niedawno wprowadzone systemy mikrofizjologiczne (MPS) hodujące ludzkie organoidy będą działać lepiej niż zwierzęta w fazie testów przedklinicznych procesu opracowywania leków, ponieważ są one genetycznie ludzkie i podsumowują wzajemne oddziaływanie między tkankami. W tym badaniu ludzka bariera jelitowa (emulowana przez kokulturę komórek Caco-2 i HT-29) oraz odpowiednik wątroby (emulowany przez sferoidy zbudowane ze zróżnicowanych komórek HepaRG i ludzkich komórek gwiaździstych wątroby) zintegrowano z dwunarządowym urządzeniem mikroprzepływowym z chipem (2-OC) w celu oceny niektórych właściwości farmakokinetycznych (PK) i toksykologicznych paracetamolu (APAP) (APAP). MPS miał trzy zestawy: Jelito tylko 2-OC, Wątroba tylko 2-OC i Jelito/Wątroba 2-OC z tym samym podłożem perfundującym oba organoidy. W przypadku oceny farmakokinetyki dozowaliśmy APAP w pożywce w ustalonych punktach czasowych po podaniu go przez barierę jelitową (emulując drogę doustną) lub w pożywce (emulując drogę dożylną), odpowiednio w dawce 12 μM i 2 μM. Próbki pożywek analizowano metodą wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej (HPLC) z odwróconymi fazami. Organoidy analizowano pod kątem ekspresji genów, wartości TEER, ekspresji i aktywności białek, a następnie zebrano, utrwalono i poddano zestawowi ocen morfologicznych. Technika MTT sprawdziła się dobrze w ocenie żywotności organoidów, ale analizy o wysokiej zawartości (HCA) były w stanie wykryć bardzo wczesne zdarzenia toksyczne w odpowiedzi na leczenie APAP. Sprawdziliśmy, że przepływ pożywki nie wpływa znacząco na wchłanianie APAP, natomiast znacznie poprawia równoważną funkcjonalność wątroby. Wchłanianie jelitowe i metabolizm wątrobowy APAP mogą być emulowane w MPS. Powiązanie danych MPS z modelowaniem in silico ma ogromny potencjał w zakresie poprawy przewidywalności metod in vitro i zapewnienia większej dokładności niż modele zwierzęce w badaniach farmakokinetycznych i toksykologicznych.

Wprowadzenie

Ze względu na różnice genomiczne i proteomiczne, modele zwierzęce mają ograniczoną wartość predykcyjną dla kilku wyników u ludzi. Co więcej, są czasochłonne, drogie i wątpliwe etycznie1. MPS to stosunkowo nowa technologia, która ma na celu poprawę mocy predykcyjnej oraz zmniejszenie kosztów i czasu poświęcanego na badania przedkliniczne. Są to urządzenia mikroprzepływowe hodujące organoidy (sztuczne mimetyki, jednostki funkcjonalne narządów) pod przepływem mediów, które promują komunikację organoid-organoid. Organoidy zbudowane z komórek ludzkich zwiększają znaczenie translacyjne2,3,4. Oczekuje się, że MPS będzie działał lepiej niż testy na zwierzętach, ponieważ są one genetycznie ludzkie i podsumowują wzajemne oddziaływanie między tkankami. Gdy jest w pełni funkcjonalny, MPS zapewni bardziej miarodajne wyniki, przy większej prędkości oraz niższych kosztach i ryzyku4. Wiele grup opracowuje MPS do różnych celów, zwłaszcza modeli chorobowych do testowania skuteczności leków.

Poziom ekspozycji jest jednym z najbardziej krytycznych parametrów oceny skuteczności i toksyczności leku5,6,7,8,9,10,11,12. MPS umożliwia integrację organoidów, które emulują ekspozycję ogólnoustrojową i oczekuje się, że będą działać lepiej niż tradycyjna hodowla tkanek ludzkich 2D. Technologia ta może znacznie poprawić przewidywanie wchłaniania złożonego w jelitach i metabolizmu wątrobowego4.

Dobrym punktem wyjścia jest MPS integrujący ludzki odpowiednik jelita i wątroby, biorąc pod uwagę centralną rolę tych dwóch narządów w biodostępności leków i ekspozycji ogólnoustrojowej13,14,15. APAP jest atrakcyjnym lekiem do badania MPS bez odpowiednika w nerkach, ponieważ jego metabolizacja odbywa się głównie przez wątrobę16,17.

2-OC to dwukomorowe urządzenie mikroprzepływowe odpowiednie do hodowli dwóch różnych ludzkich odpowiedników tkanek/organoidów połączonych mikrokanałami16. W celu naśladowania in vitro doustnego/dożylnego podawania leku przez ludzi i oceny wpływu wzajemnego oddziaływania między odpowiednikami w jelicie i wątrobie na farmakokinetykę APAP, oprócz funkcjonalności i żywotności organoidów, przeprowadzono trzy różne zespoły MPS: (1) "MPS w jelicie 2-OC" składającym się z odpowiednika jelitowego opartego na wkładce hodowlanej zawierającej kokulturę komórek Caco-2 + HT-29, zintegrowany z urządzeniem 2-OC; (2) "Wątrobowy 2-OC MPS" składający się ze sferoid wątroby wykonanych z HepaRG + HHSteC (ludzkie komórki gwiaździste wątroby) zintegrowanych z urządzeniem 2-OC; oraz (3) "MPS 2-OC jelita/wątroby" składający się z odpowiednika jelita w jednym przedziale urządzenia, komunikującego się z równoważnikiem wątroby w drugim poprzez przepływ pożywki przez kanały mikroprzepływowe.

Wszystkie testy zostały przeprowadzone w warunkach statycznych (brak przepływu) i dynamicznych (z przepływem) ze względu na wpływ bodźców mechanicznych (kompresja, rozciąganie i ścinanie) na żywotność i funkcjonalność komórki18,19,20. W niniejszym artykule opisano protokół emulacji podawania doustnego/dożylnego APAP oraz odpowiednie analizy wchłaniania/metabolizmu i toksykologiczne w 2-OC MPS zawierającym równoważne modele ludzkiego jelita i wątroby.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Produkcja ekwiwalentów tkankowych do uprawy w 2-OC

  1. Ekwiwalent bariery jelita cienkiego produkcja
    1. Utrzymuj komórki Caco-2 i HT-29 za pomocą równoważnej pożywki jelitowej: DMEM uzupełniony 10% FBS, 1% penicyliny i streptomycyny oraz 1% aminokwasów endogennych, który jest nazwany jako "DMEM S" w tym manuskrypcie.
    2. Usuń pożywkę, przemyj dwukrotnie 1x DPBS i dodaj 8 ml 0,25% trypsyny/EDTA, aby zdysocjować komórki Caco-2 wyhodowane w kolbach do hodowli komórkowych (175 cm2). Inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C i zatrzymać reakcję poprzez dodanie co najmniej podwójnej objętości inhibitora trypsyny. Wykonaj tę samą procedurę dla komórek HT-29, dostosowując objętość odczynników, ponieważ potrzebna jest mniejsza ilość tych komórek i są one przechowywane w mniejszych kolbach (75 cm2).
    3. Wirować przy 250 x g przez 5 minut, usunąć supernatant z obu probówek i ponownie zawiesić granulki komórek w 10 ml DMEM S. Policz komórki, zapewniając żywotność komórek wyższą niż 80%. Aseptyczną integrację wkładek do hodowli komórkowych w 24-dołkowej płytce uprzednio wypełnionej 400 μl DMEM S na studzienkę po stronie podstawno-bocznej (która reprezentuje ludzki krwioobieg).
    4. Współhoduj komórki Caco-2 i HT-29 w stosunku 9:121. Użyj 2,25 x 105 Caco-2 i 2,5 x 104 komórek HT-29 do każdego równoważnika jelita w końcowej objętości 200 μL DMEM S. Dostosuj liczbę komórek i objętość zgodnie z pożądaną liczbą organoidów. Dokładnie wymieszaj.
    5. Odpipetować 200 μl roztworu komórkowego do wierzchołkowej strony każdej wkładki (która reprezentuje stronę światła ludzkiego jelita), wysiewając 250 000 komórek na wkładkę. Współhoduj komórki we wkładkach przez trzy tygodnie22. Zmieniaj pożywkę co najmniej trzy razy w tygodniu, odsysając ją zarówno od strony wierzchołkowej, jak i podstawno-bocznej sterylną pipetą Pasteura, uważając, aby nie uszkodzić nienaruszonej bariery komórkowej.
      UWAGA: Kontynuuj aspirację po stronie wierzchołkowej, tak aby nie dotykać bariery komórkowej (zassać, opierając pipetę Pasteura o plastikową krawędź wkładki do komórek).
    6. Sprawdź szczelne formowanie monowarstwy, mierząc TEER (transepiteliczny opór elektryczny) co trzy dni za pomocą woltomierza23, zgodnie z instrukcjami producenta.
      1. Wykonać ślepą próbę, mierząc opór we wstawce do hodowli komórkowej bez komórek, ale z tym samym podłożem komórkowym i na tej samej płytce komórkowej.
      2. Obliczyć opór tkankowy, odejmując opór ślepej próby od oporu równoważnego tkankowo i pomnożyć przez efektywną powierzchnię membrany filtracyjnej (0,6cm2). Dobra odporność bariery jelitowej mieści się w zakresie od 150 do 400 Ω∙cm2,
        UWAGA: Po 21 dniach komórki muszą być w pełni zróżnicowane i utworzona bariera jelitowa, aby odpowiedniki jelitowe były gotowe do integracji z MPS.
  2. Produkcja ekwiwalentów wątroby
    1. Utrzymuj komórki HepaRG za pomocą równoważnego podłoża wątrobowego, którym jest William's Medium E uzupełnione 10% płodową surowicą bydlęcą, 2 mM L-glutaminy, 100 jednostek / ml penicyliny, 100 μg / ml streptomycyny, 5 μg / ml insuliny ludzkiej i 5 x 10-5 M hydrokortyzonu i jest nazwane "Williams ES" w tym rękopisie. Odnawiaj pożywkę HepaRG co 2-3 dni i utrzymuj hodowlę komórkową przez dwa tygodnie, aby zainicjować różnicowanie w hepatocytach i cholangiocytach.
    2. Po pierwszych dwóch tygodniach dodaj 2% DMSO do pożywki HepaRG przez dodatkowe dwa tygodnie, aby zakończyć różnicowanie komórek24,25. Hoduj HHSTeC w pożywce z komórek gwiaździstych (SteC CM), używając kolb do hodowli komórkowych pokrytych poli-L-lizyną, zmieniając pożywkę co dwa lub trzy dni.
    3. Usunąć pożywkę, przemyć dwukrotnie 1x DPBS i dodać 8 ml 0,05% trypsyny/EDTA, aby dysocjować komórki HepaRG wyhodowane w kolbach do hodowli komórkowych (175 cm2). Inkubować przez 5-10 minut w temperaturze 37 °C i zatrzymać reakcję poprzez dodanie co najmniej podwójnej objętości inhibitora trypsyny. To samo należy zrobić dla HHSTeC, dostosowując objętość odczynnika, ponieważ potrzebna jest mniejsza ilość tych komórek i można je przechowywać w mniejszych kolbach (75 cm2).
    4. Odwirować oba przy 250 x g przez 5 minut, usunąć supernatant i ponownie zawiesić granulki komórek w pożywce Williams E S. Policz komórki, zapewniając żywotność komórek wyższą niż 80%.
    5. Wygeneruj sferoidy wątroby łączące komórki HepaRG i HHSTeC w stosunku odpowiednio 24:1 w Williams E S medium16. Dodaj 4,8 x 104 zróżnicowany HepaRG i 0,2 x 104 HHSTeC, aby skomponować każdą sferoidę wątroby z 50 000 komórek w objętości 80 μl. Dostosuj liczbę komórek i objętość zgodnie z pożądaną liczbą sferoid. Dokładnie wymieszaj.
    6. Za pomocą pipety wielokanałowej dozować 80 μl połączonej puli komórek do każdej studzienki składającej się z 384 sferoidalnych mikropłytek o okrągłej geometrii dna.
      UWAGA: Po czterech dniach powstają sferoidy o wielkości około 300 μm.
    7. Używając końcówek o szerokim otworze, przenieś sferoidy wątroby na 6-dołkowe płytki o bardzo niskim mocowaniu, co pozwala na wymagane liczenie "jeden po drugim".

2. Integracja odpowiedników jelitowych i wątrobowych w 2-OC MPS

  1. Zespół 2-OC MPS w jelicie do oznaczania wchłaniania
    1. Odpipetować 500 μl DMEM S do większej komory 2-OC i 300 μL do mniejszej. Odessać podłoże podstawno-boczne i wierzchołkowe każdego równoważnego bariery jelitowej w 24-dołkowych płytkach. Za pomocą sterylnych kleszczyków zintegruj jedną wkładkę na obwód 2-OC, szczególnie w większej komorze. Nałożyć 200 μl pożywki jelitowej po stronie wierzchołkowej.
      UWAGA: Należy unikać tworzenia się pęcherzyków podczas integracji organoidów z MPS.
    2. Podłącz MPS do jednostki sterującej, która musi być podłączona do źródła sprężonego powietrza. Ustawić parametry: ciśnienie około ±300 bar i częstotliwość pompowania 0,3 Hz. Rozpocząć przepływ 24 godziny przed podaniem substancji badanej. Następnego dnia należy wykonać zabieg APAP.
  2. Zespół 2-OC MPS wątroby do oznaczania metabolizmu
    1. Odpipetować 650 μl Williams E S do dużej komory i 350 μl do mniejszej komory, która przyjmie sferoidy. W 6-dołkowych płytkach o bardzo niskim mocowaniu policz sferoidy za pomocą końcówek o szerokim otworze. Każdy odpowiednik wątroby składa się z dwudziestu sferoidów26. Zintegruj dwadzieścia odpowiedników wątroby na obwód, używając końcówek o szerokim otworze, co pozwala na przenoszenie tylko organoidów, do mniejszej komory 2-OC.
    2. Podłącz MPS do jednostki sterującej, która musi być podłączona do źródła sprężonego powietrza. Ustawić parametry: ciśnienie około ±300 bar i częstotliwość pompowania 0,3 Hz. Rozpocząć przepływ 24 godziny przed podaniem substancji badanej. Następnego dnia należy wykonać zabieg APAP.
  3. Zespół 2-OC MPS jelita/wątroby do oznaczania wchłaniania i metabolizmu
    1. Połącz oba podłoża (jelito i wątrobę) w proporcji 1:4, co oznacza 200 μl DMEM S po stronie wierzchołkowej jelita i 800 μl Williams ES po stronie podstawno-bocznej. Zintegruj odpowiedniki jelitowe i wątrobowe, jednocześnie, w 2-OC.
    2. Podłącz MPS do jednostki sterującej, która musi być podłączona do źródła sprężonego powietrza. Ustawić parametry: ciśnienie około ±300 bar i częstotliwość pompowania 0,3 Hz. Rozpocząć przepływ 24 godziny przed podaniem substancji badanej. Następnego dnia wykonaj zabieg APAP.
      UWAGA: W przypadku wszystkich eksperymentów każdy punkt czasowy należy wykonać w trzech egzemplarzach, co oznacza trzy oddzielone obwody 2-OC (tj. urządzenia 1 i 1/2 2-OC). Całkowita objętość każdego obwodu 2-OC wynosi 1 ml.

3. Preparat paracetamolu (APAP)

  1. Przygotować roztwór podstawowy APAP, rozpuszczając APAP w absolutnym etanolu. W dniu doświadczenia rozcieńczyć APAP w odpowiednim podłożu (roztwór APAP) do stężenia 12 μM dla "podania doustnego" i 2 μM dla "podania dożylnego".
  2. Upewnić się, że końcowe stężenie etanolu w roztworze do kontroli i uzdatniania nośnika wynosi 0,5% dla obu podań. W przypadku kontroli pozytywnej (100 mM APAP) stężenie etanolu wynosi 2%.

4. Podawanie substancji testowej i pobieranie próbek z pożywki

  1. APAP "doustne" podawanie próbek i pobieranie próbek pożywki
    1. Odessać podłoże podstawno-boczne i wierzchołkowe każdego równoważnego bariery jelitowej w 2-OC. Odpipetować 500 μl odpowiedniej pożywki hodowlanej do dużej komory po stronie organoidu podstawno-bocznego i 300 μl do małej komory.
    2. Sprawdzić, czy nie ma pęcherzyków i przystąpić do leczenia równoważnego barierze jelitowej z substancją badaną po stronie wierzchołkowej, naśladując podawanie doustne. Naśladuj "doustne" podawanie APAP, dodając 200 μL roztworu 12 μM APAP po wierzchołkowej stronie wkładek do hodowli jelitowych, która reprezentuje "stronę światła" jelita (Rysunek 1B). Podłącz MPS do jednostki sterującej.
    3. Zbierz całkowitą objętość od strony wierzchołkowej i podstawno-bocznej w następujących punktach czasowych: 0 h, 5 min, 15 min, 30 min, 1 h, 3 h, 6 h, 12 h i 24 h15,27. Przeprowadzić wszystkie doświadczenia w trzech egzemplarzach, w warunkach statycznych i dynamicznych, a następnie zebrać każdą próbkę z każdej potrójnej próbki w oddzielnej mikroprobówce. Analizować próbki za pomocą HPLC/UV.
      UWAGA: Oddzielne próbki wierzchołkowe i podstawno-boczne.
  2. APAP "dożylne" podawanie i pobieranie próbek pożywki
    1. Emuluj drogę "dożylną", podając 2 μM roztwór APAP bezpośrednio do przedziału wątrobowego. Zassać całą zawartość podłoża 2-OC. Odpipetować 650 μl Williams ES zawierającego substancję badaną do dużej komory i 350 μl tej samej pożywki do mniejszej komory, która zawiera 20 sferoid. Zbierz wszystkie woluminy w następujących punktach czasowych: 0 h, 30 min, 1 h, 2 h, 3 h, 6 h, 12 h i 24 h27,28.
    2. Wszystkie eksperymenty należy wykonywać w trzech egzemplarzach, w warunkach statycznych i dynamicznych. Zebrać każdą próbkę z każdej potrójnej próbki do oddzielnej mikroprobówki. Analizować próbki za pomocą HPLC/UV.

5. Oprzyrządowanie i warunki chromatograficzne

  1. Analiza HPLC
    1. Ustawić wszystkie istotne parametry analizy HPLC zgodnie z tabelą 1.
    2. Przefiltruj fazę ruchomą przez filtr membranowy 0,45 μm pod próżnią. Przefiltrować próbki przez filtr strzykawkowy PVDF o porach 0,22 μm (średnica 13 mm) i przechowywać je w fiolce. Rozpocznij pomiar.
  2. Roztwory podstawowe, wzorce kalibracyjne i próbki do kontroli jakości (QC)
    1. Przygotować 10 mM roztworów podstawowych APAP w buforze octanu amonu (100 mM, pH 6,8) i dalej rozcieńczyć pożywką do hodowli komórkowych DMEM S i Williams E S rozcieńczoną buforem octanu amonu (1:1, v/v) w celu uzyskania roztworów roboczych w zakresie od 0,25 do 100,00 μM.
    2. Dołączyć zestaw próbek kalibracyjnych w trzech egzemplarzach oraz próbki do kontroli jakości na czterech poziomach w trzech egzemplarzach. Przygotować te wzorce przez seryjne rozcieńczanie.
    3. Utwórz krzywe kalibracyjne obszarów pików APAP w porównaniu z nominalnymi stężeniami wzorcowymi APAP. Określ dopasowanie regresji liniowej dla każdej krzywej kalibracyjnej. Oceń stopień dopasowania różnych modeli kalibracyjnych za pomocą kontroli wizualnej, współczynnika korelacji, dokładności i precyzji w trakcie i między cyklami.
    4. Wstrzyknąć ślepe próbki pożywki DMEM S i Williams ES rozcieńczone w buforze octanu amonu (1:1, v/v) w sekstuplikacie. Przygotować trzy egzemplarze próbek kontroli jakości w pożywkach DMEM S i Williams ES rozcieńczonych buforem octanu amonu (1:1, v/v) dla stężeń APAP 0,50 (LOQ), 4,50, 45,00 i 90,00 μM.
    5. Upewnij się, że próbki do kontroli jakości są przygotowane z nowego roztworu podstawowego, innego niż ten, który został użyty do wygenerowania krzywej wzorcowej. Wykorzystanie próbek kontroli jakości do zbadania zmian w obrębie i między seriami.
  3. Procedury walidacji
    1. Przeprowadź walidację metody bioanalitycznej zgodnie z wcześniej opisanymi procedurami29,30. Przeprowadzić serie chromatograficzne przy pięciu lub sześciu oddzielnych okazjach, biorąc pod uwagę odpowiednio pożywki do hodowli komórkowych Williams ES i DMEM S.
    2. Upewnić się, że punkty kalibracji w zakresie od 0,25 do 100,00 μM APAP w pożywkach do hodowli komórkowych DMEM S lub Williams E S rozcieńczonych w buforze octanu amonu (1:1, v/v) są wykreślone w oparciu o powierzchnie pików APAP (oś y) w stosunku do odpowiednich stężeń nominalnych (oś x). Porównać nachylenia tych standardowych krzywych kalibracyjnych z nachyleniami krzywej kalibracyjnej przygotowanymi w buforze octanu amonu. Upewnij się, że wszystkie krzywe kalibracyjne mają wartość korelacji co najmniej 0,998.
    3. Określ precyzję i dokładność (w trakcie i między seriami) analitu w macierzy zastępczej za pomocą powtórzeń na czterech różnych poziomach LLOQ, kontroli niskiej, średniej i wysokiej jakości przez pięć lub sześć różnych dni. Wykonać pomiary precyzji i dokładności w trakcie serii tego samego dnia w pożywce do hodowli komórkowych DMEM S lub Williams E S rozcieńczonej w buforze octanu amonu (1:1, v/v) zawierającym stężenia APAP 0,50, 4,50, 45,00 i 90,00 μM (n = 3).
    4. Oceń każdy zestaw próbek kontroli jakości zawierający stężenia APAP z ostatnio uzyskanych krzywych kalibracyjnych. Zbadać selektywność testów poprzez stopień oddzielenia związku będącego przedmiotem zainteresowania i możliwych innych pików chromatograficznych spowodowanych przez składniki zakłócające.
  4. Dolna granica oznaczalności (LLOQ) i granica wykrywalności (LOD)
    1. Określić dolną granicę oznaczalności (LLOQ) na podstawie odchylenia standardowego odpowiedzi i podejścia opartego na nachyleniu. Obliczenia należy wykonać za pomocą wzoru 10α/S, gdzie α jest odchyleniem standardowym punktu przecięcia z osią y, a S jest nachyleniem linii prostej uzyskanym przez wykreślenie krzywych kalibracyjnych29,30. Oszacuj granicę wykrywalności (LOD), biorąc pod uwagę 3,3-krotność odchylenia standardowego ślepej próby, podzielonego przez nachylenie krzywej kalibracyjnej29,30.

6. Żywotność/funkcjonalność ekwiwalentów tkanek

  1. Turnieje wielostolikowe (MT
    1. Wykonaj test MTT, aby ocenić żywotność organoidów we wszystkich punktach czasowych testu MPS. Jako kontrolę negatywną użyj nośnika komórkowego plus pojazdu. Jako kontrolę pozytywną potraktuj organoidy 100 mM APAP i 1% NaOH rozcieńczonym w pożywce komórkowej.
    2. Przenieść 20 sferoid każdej kontrpróby dla poszczególnych studzienek na płytkę 96-dołkową, a wkładki do hodowli komórkowych, zawierające odpowiedniki jelitowe, do 24 dołków komórkowych, umieszczając po jednym ekwiwalencie jelita na studzienkę. Umyj odpowiedniki tkanek trzykrotnie 1x DPBS.
    3. Dodać 300 μl roztworu MTT o stężeniu 1 mg/ml, rozcieńczonego w odpowiednim pożywce komórkowej, do dołka. Inkubować płytki przez 3 godziny w standardowych warunkach hodowli komórkowych.
    4. Ostrożnie usunąć roztwór MTT z każdej studzienki za pomocą pipetowania. Ekstrahować formazan MTT z jelit i wątroby przy użyciu 200 μl izopropanolu na dołek przez noc w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Uszczelnij pokrywkę, aby zapobiec parowaniu.
    5. Przenieść 200 μl każdego supernatantu do odpowiedniego, wstępnie zidentyfikowanego dołka na 96-dołkowej mikropłytce testowej. Użyj izopropanolu jako ślepej próby.
    6. Odczytać absorbancję formazanu w czytniku płytkowym przy długości fali 570 nm. Obliczyć względną zdolność komórek do redukcji MTT (%), wykorzystując średnią gęstość optyczną każdego punktu czasowego, w porównaniu z kontrolą ujemną, uważaną za 100% żywotność komórek.
  2. Cytochemia/Histologia
    1. Utrwalić odpowiedniki jelita i wątroby przez 25 minut w temperaturze pokojowej, używając 4% (w/v) paraformaldehydu w 0,1 M buforze fosforanowo-solnym, pH 7,4. Umyć organoidy 5 razy w buforze PBS przez 10 minut za każdym razem. Zabarwić jelita i wątrobowe odpowiedniki za pomocą izotiocyjanianu tetrametylorodaminy-falloidyny lub falloidyny Alexa Fluor 647, 1:50 w PBS31.
    2. Przenieś je do pożywki zamrażającej OCT na kilka minut, aby zaaklimatyzować się w temperaturze pokojowej przed przeniesieniem do ciekłego azotu aż do całkowitego zamrożenia. Wykonać kriosekcje sferoid wątroby o grubości około 10-12 μm za pomocą kriostatu.
    3. Zamontuj skrawki tkanek w podłożu montażowym za pomocą DAPI. Zbadaj je za pomocą konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej.
    4. Zamrozić organoidy po utrwaleniu, aby przeprowadzić barwienie hematoksyliną i eozyną zgodnie z ustalonymi protokołami. Zamontuj szkiełka z podłożem montażowym po przekrojeniu tkanki zgodnie z powyższym opisem i wykonaj obrazy histologiczne za pomocą mikroskopu optycznego.
  3. Wysoka analiza treści
    1. Barwienie mitochondrialne i jądrowe komórek
      1. Rozpuść liofilizowany proszek w DMSO, aby uzyskać 1 mM roztwór podstawowy do barwienia mitochondriów (np. MitoTracker Deep Red FM). Porcjowany roztwór podstawowy należy przechowywać w temperaturze -20 °C z dala od światła. Rozcieńczyć 1 mM roztworu podstawowego do barwienia mitochondriów do końcowego stężenia (200 nM) we wstępnie podgrzanym (37 °C) pożywce do hodowli tkankowej bez surowicy.
      2. Usuń pożywkę do hodowli komórkowych. Dodać mitochondrialny roztwór barwiący, aby całkowicie pokryć próbkę i inkubować komórki przez 15-45 minut w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze z 5% CO2 .
      3. Ostrożnie usuń roztwór roboczy do barwienia mitochondriów i zastąp go 2-4% utrwalaczem paraformaldehydu w PBS przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
      4. Delikatnie płucz utrwalone komórki PBS przez 5 minut. Powtórz proces prania dwukrotnie.
      5. Przygotować podstawowy roztwór do barwienia kwasów nukleinowych o stężeniu 10 mg/ml (16,23 M), rozpuszczając 100 mg barwnika Hoechst 33342 w 10 ml ultraczystej wody.
        UWAGA: Roztwór podstawowy należy podzielić na porcje i przechowywać w temperaturze -20 °C w bezpiecznym miejscu.
      6. Przygotować roztwór roboczy do barwienia kwasami nukleinowymi o stężeniu 0,2-2,0 μg/ml w PBS i inkubować utrwalone komórki z roztworem roboczym barwiącym kwasy nukleinowe przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
      7. Usuń roztwór roboczy barwiący kwasy nukleinowe i delikatnie przepłucz komórki PBS przez 5 minut trzy razy. Komórki należy przechowywać w PBS w temperaturze 4 °C, chroniąc przed światłem.
    2. Analiza barwienia mitochondrialnego i jądrowego
      1. Analizuj komórki za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego z zestawami filtrów odpowiednimi dla barwienia kwasem nukleinowym (λEx/ λEm: 361/497 nm) i barwienia mitochondrialnego (λEx/ λEm: 644/665 nm). Znajdź komórki według barwienia dodatniego kwasu nukleinowego i określ ilościowo liczbę komórek. Określ ilościowo intensywność fluorescencji barwników mitochondrialnych w mitochondriach.
  4. Pomiary morfometryczne (obliczenia sferoid) w ImageJ
    1. Eksportuj obrazy High Content Analysis (HCA) jako pliki *.flex z oprogramowania Columbus. Importuj pliki .flex jako skalę szarości w ImageJ za pomocą wtyczki Bio-Formats32: Plik > Importuj > Bio-Formats.
    2. W oknie Opcje importu wybierz opcję Wyświetlanie Hyperstack i włącz opcję Podziel kanały w obszarze Podziel na osobne okna. Ta opcja pozwoli na dostęp do wszystkich plików w określonym kanale (np. DAPI, mitotracker itp.). Nie wybieraj opcji Użyj stosu wirtualnego w obszarze Zarządzanie pamięcią.
      UWAGA: Zaleca się używanie kanału DAPI jako "pyłu" na obrazach, ponieważ pożywka hodowlana jest zmniejszona pod względem długości fali UV (np. 405 nm).
    3. Dostosuj rozmiar piksela (Analizuj > Ustaw skalę), jeśli nie został załadowany zgodnie z wartościami osadzonymi w pliku .flex. Zastosuj filtr Rozmycie gaussowskie, aby usunąć nadmiar szumów i uniknąć nieregularności konturu kształtu. Filtry > procesowej > rozmycie gaussowskie. Wysoka wartość Sigma (promień) między 2,0 a 3,0 jest idealna dla większości przypadków. Jeśli stos zawiera kilka obrazów, zastosuj do wszystkich z nich (wybierz opcję Tak w oknie Stos procesów).
    4. Wygeneruj obraz binarny, aby oddzielić tło od organoidów (obiektów) za pomocą progu. Kliknij opcję Obraz > Dostosuj > próg. Użyj czerwonej maski, aby dostosować wartości w zależności od intensywności obrazu, aby dopasować je do kształtu organoidu, zachowując nienaruszoną morfologię. Wyłącz ciemne tło, jeśli obraz ma białe tło. Kliknij przycisk Zastosuj.
    5. W oknie Konwertuj stos na binarny wybierz metodę Próg. Zazwyczaj w tego rodzaju przetwarzaniu obrazu preferowane są ustawienia domyślne lub trójkątne. Tło powinno być ciemne. Wybierz opcję Oblicz próg dla każdego obrazu, jeśli w stosie znajduje się kilka obrazów.
    6. Wybierz opcję Process > Binary > Fill holes (Przetwarzaj) binary (Binarne Wypełnij otwory). Opcjonalnie usuń z tła. W Process > Binary > Options wybierz opcję Czarne tło i ponownie wykonaj polecenie Wypełnij otwory. Wyłącz opcję Czarne tło przed przejściem do następnego kroku.
    7. Oddzielne obiekty. W przypadku organoidów dobrym wyborem jest metoda zlewni. Kliknij pozycję Process (Przetwarzaj> binarny > zlewnia. Wykonaj analizę kształtu.
      1. Wybierz opcję Analizuj > ustaw pomiary. Dostępnych jest kilka opcji (szczegóły w https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-30.html). W przypadku organoidów wybierz Obszar, Średnia wartość szarości, Min i maksymalna wartość szarości oraz Deskryptory kształtu. Opcjonalnie wybierz opcję Wyświetl etykietę, aby zidentyfikować obiekty na obrazie i notację naukową. Kliknij przycisk OK.
      2. Wybierz opcję Analysis (Analiza> Analizuj cząstki. Wybierz limity rozmiaru i cyrkularności. Zachowaj odpowiednio wartości 0-nieskończoność i 0,00-1,00, aby zmierzyć wszystkie obiekty na obrazie. W polu Pokaż wybierz opcję Kontury, aby obiekty były identyfikowane. Włącz opcję Wyświetl wyniki, aby wyświetlić wyniki; Wyklucz na krawędziach, aby wykluczyć obiekty stykające się z krawędziami; Uwzględnij otwory, aby ewentualne otwory wewnętrzne w obiektach były traktowane jako część głównego kształtu.
    8. Powtórz analizę kształtu dla każdego stosu obrazów, a wyniki zostaną dołączone do jednej tabeli. Eksportuj tabelę wyników w pliku > Zapisz jako... jako plik z wartościami oddzielonymi przecinkami (.csv).
  5. PCR w czasie rzeczywistym
    1. Ekstrahować RNA z równoważników tkankowych przy użyciu jednofazowego roztworu fenolu i izotiocyjanianu guanidyny, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.
    2. Przeprowadź syntezę cDNA przez odwrotną transkrypcję 1 – 2 μg całkowitego RNA.
    3. Amplifikuj wszystkie cele za pomocą starterów specyficznych dla genu (Tabela 5), aby przeprowadzić ilościową reakcję PCR w czasie rzeczywistym. Każdy qRT-PCR zawiera 30 ng RNA z odwrotną transkrypcją i 100 nM każdego startera.
    4. Postępuj zgodnie z warunkami PCR: 50 °C przez 3 minuty (1 cykl); 95 °C przez 5 minut (1 cykl); 95 °C przez 30 sekund, 59 °C przez 45 sekund i 72 °C przez 45 sekund (35 - 40 cykli).
  6. Test CYP
    1. Postępuj zgodnie z sekcją 2.2 dla zespołu 2-OC wątroby. Grupy eksperymentalne to kontrola bez komórek, zabiegi APAP 2 μM przez 12 godzin, 24 godziny i kontrola nośnika. Postępuj zgodnie z sekcjami 3.3 i 4.2 dla przygotowania i leczenia APAP 2 μM.
      UWAGA: Aby upewnić się, że wszystkie próbki będą gotowe w tym samym czasie do testu CYP, należy rozpocząć 12-godzinny zabieg 12 godzin po rozpoczęciu 24-godzinnego leczenia. Kontrolę aktywności CYP bez komórek należy poddać działaniu 0,5% roztworu etanolu, a także kontrolę nośnika.
    2. Rozmrozić 3 mM roztwór podstawowy podłoża luminogenicznego w temperaturze pokojowej i rozcieńczyć w stosunku 1:1000 w William's ES. Chronić przed światłem.
    3. Zbierz sferoidy i przenieś każdą grupę eksperymentalną do studzienki z 96-dołkową płytką. Usunąć pożywkę, przemyć dwukrotnie 100 μl 1x DPBS i dodać 80 μl 3 μM roztworu substratu do dołka. Utrzymuj kontrolę bez komórek w pożywce William's ES. Zachowaj studnię bez sferoid lub roztworu substratu do kontroli w tle. Inkubować przez 30-60 minut w temperaturze 37 °C z 5% CO2 , chronić przed światłem.
    4. Zrównoważyć liofilizowany odczynnik do wykrywania lucyferyny (LDR) za pomocą buforu do rozpuszczania z esterazy. Mieszaj przez wirowanie lub odwracanie. Przechowuj odpowiednią objętość w temperaturze pokojowej do następnego kroku.
      UWAGA: Rozpuszczony LDR może być przechowywany w temperaturze pokojowej przez 24 godziny lub w temperaturze 4 °C przez 1 tydzień bez utraty aktywności. W przypadku długotrwałego przechowywania przechowywać w temperaturze –20 °C.
    5. Po inkubacji przenieść 25 μl nienaruszonego supernatantu sferoid do trzech różnych dołków białej, nieprzezroczystej, 96-dołkowej mikropłytki. Dodać 25 μl LDR do dołka i homogenizować.
    6. Inkubuj białą płytkę w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Odczytaj luminescencję na luminometrze. Nie używaj fluorometru.
    7. Obliczyć sygnały netto, odejmując wartości luminescencji tła (kontrola bez komórek) od wartości badanego związku poddanego działaniu i niepoddanego działaniu (kontrola nośnika). Obliczyć procentową zmianę aktywności CYP3A4, dzieląc wartości netto poddane działaniu substancji przez wartości netto niepoddane działaniu substancji i mnożąc przez 100.
  7. Western blotting (zachodnia plama)
    1. Przenieś sferoidy wątroby do zidentyfikowanej mikroprobówki o pojemności 1,5 ml. Usuń podłoże i przemyj dwukrotnie 100 μl 1x DPBS.
    2. Lizować sferoidy wątroby w 100 μl buforu RIPA do lizy komórkowej w temperaturze 4 °C przez 20 min. Wirować przez 15 minut, 4 °C i 11000 obr./min. Przenieść supernatant do innej zidentyfikowanej mikroprobówki o pojemności 1,5 ml.
    3. Określ ilościowo ilość białka uzyskanego metodą Bradforda. Załadować od 10 do 50 μg białka z ilościowo oznaczonego lizatu komórkowego na studzienkę gradientowego żelu poliakrylamidowego 3-15% i wykonać SDS-PAGE.
    4. Przenieś załadowane białko z żelu do membrany PVDF o grubości 0,22 μm przez półsuche wyposażenie systemu. Użyj roztworu przenoszącego 50 mM Tris-HCl i 192 mM glicyny. Ustaw parametry sprzętu w zależności od liczby żeli do przeniesienia (od 1 do 2 na raz).
    5. Zablokuj niespecyficzne interakcje na membranie PVDF z 3-5% roztworem mleka odtłuszczonego w buforze TBS-T: sól fizjologiczna buforowana Tris (50 mM Tris pH 7,6, 150 mM chlorek sodu) uzupełniona 0,1% Tween 20. Utrzymuj membranę pod delikatnym, ciągłym wstrząsaniem przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    6. Prać TBS-T pod delikatnym, ciągłym wstrząsaniem przez 3-5 minut w temperaturze pokojowej. Powtórz ten krok prania dwa razy.
    7. Rozcieńczyć pierwszorzędowe przeciwciała albuminowe i winkuliny odpowiednio do 1:1000 i 1:2000 na TBS-T. Inkubować błonę z pierwszorzędowymi przeciwciałami przez noc w temperaturze 4 °C, delikatnie i stale wstrząsając.
      UWAGA: Zawsze postępuj zgodnie z instrukcjami producenta, aby rozcieńczyć przeciwciała.
    8. Usuń przeciwciało pierwszorzędowe i umyj membranę 3 razy (krok 6.7.6). Rozcieńczyć przeciwciało wtórne ECL przeciwko mysim IgG do 1:5000 na TBS-T. Inkubować błonę z przeciwciałem drugorzędowym pod delikatnie ciągłym wstrząsaniem przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
    9. Usunąć przeciwciało wtórne i umyć membranę (krok 6.7.6). Wykonaj detekcję białka za pomocą ECL Western Blotting Substrate. Naświetlić filmy autoradiograficzne przez 30 s do 30 min. Przeprowadzić detekcję immunoblottingu w trzech egzemplarzach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby przeprowadzić testy PK APAP w 2-OC MPS, pierwszym krokiem jest wyprodukowanie odpowiedników (organoidów) ludzkiego jelita i wątroby. Są one zintegrowane z urządzeniem mikroprzepływowym 2-OC (Rysunek 1A) 24 godziny przed rozpoczęciem testu PK APAP. Następnego dnia podłoże jest zmieniane, a model jest poddawany działaniu APAP. Rysunek 1 ilustruje odpowiedniki jelit i wątroby umieszczone wewnątrz urządzenia 2-OC (Rysunek 1B) oraz przebieg czasowy eksperymentu A...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Dokładna i wiarygodna ocena właściwości farmakologicznych nowych leków badawczych ma kluczowe znaczenie dla zmniejszenia ryzyka na kolejnych etapach rozwoju. MPS to stosunkowo nowa technologia, która ma na celu poprawę mocy predykcyjnej oraz zmniejszenie kosztów i czasu poświęcanego na badania przedkliniczne. Nasza grupa czyni postępy w ocenie właściwości farmakokinetycznych i toksykologicznych, które są najczęściej potrzebne do optymalizacji ołowiu. Pracowaliśmy z urządzeniem mikroprzepływowym 2-OC, które posiada dwie k...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy dr Christie Guguen-Guillouzo, dr Philippe'owi Griponowi z Jednostki 522 INSERM oraz dr Christianowi Trepo z Jednostki 271 INSERM za wykorzystanie materiału biologicznego (komórki Hepa RG) i za udostępnienie go nam w celu przeprowadzenia badań naukowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1x DPBSThermo Fisher Scientific14190235Bez wapnia, bez magnezu
2-OCTissUse GmbHDwunarządowy chip
384-dołkowa mikropłytka sferoidalnaCorning3830/Przezroczysty, Okrągłe dno, Ultra-Niska nasadka
4% ParaformaldehydSłuży do utrwalania komórek
ParacetamolSigma AldrichA7085Zastosowanie do testów MPS
AcetonitrylTediaUżywany do wykonywania HPLC
Alexa Fluor 647 falloidynaThermo Fisher Naukowyeksperyment konfokalny
Octan amonuSigma AldrichUżywany do wykonywania HPLC
Komórki Caco-2Sigma Aldrich86010202
Bufor
Kolbydo hodowli komórkowychSarstedt
Konfokalny mikroskop fluorescencyjnyLeicaDMI6000
KriostatLeicaCM1950
DMEM o wysokiej zawartości glukozyThermo Fisher Scientific12800017Dodaj suplementy: 10% płodowej surowicy bydlęcej, 100 jednostek na ml penicyliny, 100 i mikro; g / ml streptomycyny i 1% aminokwasów endogennych
DMSOSigma AldrichD4540Dodaj 2% do podłoża HepaRG
Syntezator etanoluPłodowa
surowica bydlęcaThermo Fisher Scientific 12657029
Zamrażarka OCTTissue-TekTissue-Tek® O.C.T.™ Związek jest preparatem rozpuszczalnych w wodzie glikoli i żywic, zapewniającym wygodną matrycę próbki do cięcia kriostatu w temperaturach -10° C i poniżej.
Hematoksylina & Eozyna
Komórki HepaRGBiopredic InternationalHPR101Komórki niezróżnicowane
HHSTeCScienCell Research Laboratories5300komórek i wszystkie suplementy hodowlane
Hoechst 33342Eksperymenty HCA
Komórki HT-29Sigma Aldrich85061109
Insulina ludzkaInvitrogen - Thermo Fisher Scientific12585014
HydrokortyzonSigma AldrichH0888
IzopropanolMerck278475
Karnovsky' s utrwalacz
Thermo Fisher ScientificA2916801
Luna C18 kolumna ochronna SSPhenomenexSłuży do wykonywania HPLC
MikroskopLeicaDMi4000
MikrotomLeicaRM2245
Milicell 0,4 i mikro; m Wkładki o wielkości porówMerckPIHP01250
Miernik Millicell ERS-2MerckMERS00002Służy do pomiaru TEER
MitoTracker Deep RedEksperymenty HCA System
MX3000P MTTThermo Fisher ScientificM6494
Komora
Liczenie komórek
System obrazowania o wysokiej zawartości OperetkiPerkin ElmerSłuży do wykonywania testu HCA
P450-Glo CYP3A4 z lucyferyną-IPAPromegaCat.# V9001
Penicylina/StreptomycynaThermo Fisher Scientific15070063Hodowla komórkowa
PermountThermo Fisher Scientific
Histology PrimersMembrana RT-qPCR
PVDFBioRad
PVDF Filtr0,22 μ m wielkość porów
Kolumna Luna C18 z odwróconymi fazamiPhenomenexSłuży do wykonywania
wytrząsarki HPLC (IKA VXR Basic Vibrax)IKA Works GmbH & Co2819000Używany do sferoidów w celu poprawy testu MTT
Pożywka gwiaździsta (STeC CM)ScienCell5301Dodaj suplementy STeC CM
SuperScriptIITM Odwrotna transkryptazaThermo Fisher Scientific
SYBR Green PCR Master MixThermo Fisher Scientific Odczynnik
TRizol TMThermo Fisher ScientificTrizol jest jednofazowym roztworem fenolu i izotiocyjanianu guanidyny.
Roztwór trypsyny/EDTAThermo Fisher ScientificR001100
Płyty o bardzo niskim mocowaniuCorningCLS3471-24EA6 dołków
Vectashield plus DAPI nośniki
Biały nieprzezroczysty 96-dołkowy mikroplatePerkinHelmer
Końcówki
Williams EPan BiotechP04-29510Dodaj suplementy: 10% płodowej surowicy bydlęcej, 2 mM L-glutaminy, 100 jednostek na ml penicyliny, 100 i mikro; g/ml streptomycyny i 5 &mikro; g/ml insuliny ludzkiej
kakodylowy L-glutamina Neubauera Agilent Technologies strzykawkowy montażoweo szerokim otworze

Bibliografia

  1. Zhang, D., Luo, G., Ding, X., Lu, C. Preclinical experimental models of drug metabolism and disposition in drug discovery and development. Acta Pharmaceutica Sinica B. 2 (6), 549-561 (2012).
  2. Hynds, R. E., Giangreco, A. The relevance of human stem cell-derived organoid models for epithelial translational medicine. Stem Cells. 31 (3), 417-422 (2013).
  3. Sivaraman, A., et al. A Microscale In vitro Physiological Model of the Liver: Predictive Screens for Drug Metabolism and Enzyme Induction. Current Drug Metabolism. 6 (6), 569-591 (2005).
  4. Dehne, E. M., Hasenberg, T., Marx, U. The ascendance of microphysiological systems to solve the drug testing dilemma. Future Science OA. 3 (2), 185(2017).
  5. Oleaga, C., et al. Multi-Organ toxicity demonstration in a functional human in vitro system composed of four organs. Scientific Reports. 6, 20030(2016).
  6. Maschmeyer, I., et al. A four-organ-chip for interconnected long-term co-culture of human intestine, liver, skin and kidney equivalents. Lab Chip. 15 (12), 2688-2699 (2015).
  7. Esch, M. B., Mahler, G. J., Stokol, T., Shuler, M. L. Body-on-a-chip simulation with gastrointestinal tract and liver tissues suggests that ingested nanoparticles have the potential to cause liver injury. Lab Chip. 14 (16), 3081-3092 (2014).
  8. Materne, E. M., et al. The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture. Journal of Visualized Experiments. , e52526(2015).
  9. Esch, M. B., Ueno, H., Applegate, D. R., Shuler, M. L. Modular, pumpless body-on-a-chip platform for the co-culture of GI tract epithelium and 3D primary liver tissue. Lab Chip. 16 (14), 2719-2729 (2016).
  10. Sung, J. H., Kam, C., Shuler, M. L. A microfluidic device for a pharmacokinetic–pharmacodynamic (PK-PD) model on a chip. Lab on a Chip. 10 (4), 446-455 (2010).
  11. Viravaidya, K., Sin, A., Shuler, M. L. Development of a Microscale Cell Culture Analog to Probe Naphthalene Toxicity. Biotechnology Progress. 20 (1), 316-323 (2004).
  12. Sin, A., Chin, K. C., Jamil, M. F., Kostov, Y., Rao, G., Shuler, M. L. The Design and Fabrication of Three-Chamber Microscale Cell Culture Analog Devices with Integrated Dissolved Oxygen Sensors. Biotechnology Progress. 20 (1), 338-345 (2004).
  13. Tsamandouras, N., et al. Integrated Gut and Liver Microphysiological Systems for Quantitative In vitro Pharmacokinetic Studies. The AAPS Journal. 19 (5), 1499-1512 (2017).
  14. Graham, G. G., Davies, M. J., Day, R. O., Mohamudally, A., Scott, K. F. The modern pharmacology of paracetamol: Therapeutic actions, mechanism of action, metabolism, toxicity and recent pharmacological findings. Inflammopharmacology. 21 (3), 201-232 (2013).
  15. Hodgman, M. J., Garrard, A. R. A Review of Acetaminophen Poisoning. Critical Care Clinics. 28 (4), 499-516 (2012).
  16. Maschmeyer, I., et al. Chip-based human liver-intestine and liver-skin co-cultures - A first step toward systemic repeated dose substance testing in vitro. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 95, 77-87 (2015).
  17. Bessems, J. G. M., Vermeulen, N. P. E. Paracetamol (acetaminophen)-induced toxicity: Molecular and biochemical mechanisms, analogues and protective approaches. Critical Reviews in Toxicology. 31 (1), 55-138 (2001).
  18. Hirt, M. N., et al. Increased afterload induces pathological cardiac hypertrophy: A new in vitro model. Basic Research in Cardiology. 107 (6), 307(2012).
  19. Fink, C., et al. Chronic stretch of engineered heart tissue induces hypertrophy and functional improvement. The FASEB journal official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 14 (5), 669-679 (2000).
  20. Zhang, B., Peticone, C., Murthy, S. K., Radisic, M. A standalone perfusion platform for drug testing and target validation in micro-vessel networks. Biomicrofluidics. 7 (4), 044125(2013).
  21. Araújo, F., Sarmento, B. Towards the characterization of an in vitro triple co-culture intestine cell model for permeability studies. International Journal of Pharmaceutics. 458 (1), 128-134 (2013).
  22. Cadena-Herrera, D., et al. Validation of three viable-cell counting methods: Manual, semi-automated, and automated. Biotechnology Reports. 7, 9-16 (2015).
  23. User Guide Millicell® ERS-2 Electrical Resistance System. Millipore. , Available from: http://www.merckmillipore.com/BR/pt/life-sciencee-research/cell-culture-systems/cell-analysis/millicell-ers-2-voltohmmeter/FiSb.qB.LDgAAAFBdMhb3.r5 6-10 (2016).
  24. Gripon, P., et al. Infection of a human hepatoma cell line by hepatitis B virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (24), 15655-15660 (2002).
  25. Guillouzo, A., et al. The human hepatoma HepaRG cells: A highly differentiated model for studies of liver metabolism and toxicity of xenobiotics. Chemico-Biological Interactions. 168 (1), 66-73 (2007).
  26. Wagner, I., et al. A dynamic multi-organ-chip for long-term cultivation and substance testing proven by 3D human liver and skin tissue co-culture. Lab on a Chip. 13 (18), 3538-3547 (2013).
  27. Forrest, J. A. H., Clements, J. A., Prescott, L. F. Clinical Pharmacokinetics of Paracetamol. Clinical Pharmacokinetics. 7 (2), 93-107 (1982).
  28. Dollery, C. Therapeutic Drugs. , Churchill Livingstone. London. (1999).
  29. Food and Drug Administration Guidance for Industry: Bioanalytical method validation. U.S. Department of Health and Human Services. , Available from: http://www.labcompliance.de/documents/FDA/FDA-Others/Laboratory/f-507-bioanalytical-4252fnl.pdf (2013).
  30. Shah, V. P., et al. Bioanalytical method validation-a revisit with a decade of progress. Pharmaceutical research. 17 (12), 1551-1557 (2000).
  31. Marin, T. M., et al. Shp2 negatively regulates growth in cardiomyocytes by controlling focal adhesion kinase/src and mTOR pathways. Circulation Research. 103 (8), 813-824 (2008).
  32. Linkert, M., et al. Metadata matters: Access to image data in the real world. Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
  33. OECD. OECD TG 491 - Short Time Exposure In vitro Test Method for Identifying i) Chemicals Inducing Serious Eye Damage and ii) Chemicals Not Requiring Classification for Eye Irritation or Serious Eye Damage. OECD. 14, OECD guidelines for the testing of chemicals (2018).
  34. Fernandes, M. B., Gonçalves, J. E., Tavares, L. C., Storpirtis, S. Caco-2 cells permeability evaluation of nifuroxazide derivatives with potential activity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA). Drug Development and Industrial Pharmacy. 41 (7), 1066-1072 (2015).
  35. OECD. OECD TG 492 - Reconstructed human Cornea-like Epithelium (RhCE) test method for identifying chemicals not requiring classification and labelling for eye irritation or serious eye damage. OECD. 35, OECD guidelines for the testing of chemicals (2018).
  36. OECD, O. E. C. D. OECD. OECD TG 431 - In vitro skin corrosion: reconstructed human epidermis (RHE) test method. OECD. 8, OECD guidelines for the testing of chemicals (2016).
  37. OECD. OECD TG 439 - In vitro Skin Irritation: Reconstructed Human Epidermis Test Method. OECD. 21, OECD guidelines for the testing of chemicals (2015).
  38. Marin, T. M., et al. Acetaminophen absorption and metabolism in an intestine/liver microphysiological system. Chemico-Biological Interactions. 299, 59-76 (2019).
  39. Maass, C., Stokes, C. L., Griffith, L. G., Cirit, M. Multi-functional scaling methodology for translational pharmacokinetic and pharmacodynamic applications using integrated microphysiological systems (MPS). Integrative Biology (United Kingdom). 9 (4), 290-302 (2017).
  40. Sung, J. H., Wang, Y., Shuler, M. L. Strategies for using mathematical modeling approaches to design and interpret multi-organ microphysiological systems (MPS). APL Bioengineering. 3 (2), 021501(2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Uk ad jelito w troba na chipiefarmakokinetyka paracetamoluanaliza HPLCtest ywotno ci MTTmikroskopia konfokalnaekspresja gen w w organoidachpomiar TEERkom rki gwia dziste w trobykokultura Caco 2 i HT 29
Układ mikrofizjologiczny jelita/wątroby do oceny farmakokinetyki i toksykologicznej leku
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.