Artykuł metodologiczny

Elektroporacja siRNA w celu modulacji autofagii w komórkach dendrytycznych pochodzących z monocytów zakażonych wirusem opryszczki pospolitej typu 1

9.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60190

⸱

28 października 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Immune Modulation, Universitätsklinikum Erlangen

W tym artykule

Podsumowanie

W tym badaniu prezentujemy strategie oparte na inhibitorach i siRNA, które mają na celu zakłócenie przepływu autofagicznego w komórkach dendrytycznych pochodzących z monocytów zakażonych wirusem opryszczki pospolitej typu 1 (HSV-1).

Streszczenie

Wirus opryszczki pospolitej typu 1 (HSV-1) indukuje autofagię zarówno w niedojrzałych komórkach dendrytycznych (iDCs), jak i dojrzałych komórkach dendrytycznych (mDCs), podczas gdy strumień autofagiczny obserwuje się tylko w iDCs. Aby uzyskać wgląd w mechanizmy mechaniczne, opracowaliśmy skuteczne strategie zakłócania obrotu autofagicznego indukowanego przez HSV-1. Strategia oparta na inhibitorach, mająca na celu modulację autofagii indukowanej przez HSV-1, stanowi pierwszy wybór, ponieważ jest to łatwa i szybka metoda. Aby obejść potencjalne, niespecyficzne, niecelowe efekty takich związków, opracowaliśmy alternatywną strategię opartą na siRNA, aby modulować obrót autofagiczny w iDC po zakażeniu HSV-1. Rzeczywiście, elektroporacja iDC z siRNA specyficznym dla FIP200 przed zakażeniem HSV-1 jest bardzo specyficzną i skuteczną metodą ablacji ekspresji białka FIP200, a tym samym hamowania przepływu autofagicznego. Obie przedstawione metody skutkują skutecznym hamowaniem indukowanego przez HSV-1 obrotu autofagicznego w iDC, przy czym technika oparta na siRNA jest bardziej specyficzna dla celu. Opracowano dodatkowe podejście oparte na siRNA, aby selektywnie wyciszyć ekspresję białek KIF1B i KIF2A, ułatwiając obrót autofagiczny po zakażeniu HSV-1 w mDC. Podsumowując, technika elektroporacji siRNA stanowi obiecującą strategię, pozwalającą na selektywną ablację ekspresji odrębnych białek i analizę ich wpływu na zakażenie HSV-1.

Wprowadzenie

Generowanie ludzkich komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów (DC) stanowi odpowiedni model in vitro do badania funkcji i biologii tego ważnego typu komórek odpornościowych. Izolacja, jak również różnicowanie monocytów w DC jest dobrze znane w ostatnich latach1,2. Zakażenie DC wirusem opryszczki pospolitej typu 1 (HSV-1) α-herpesvirus służy jako system modelowy do badania modulacji biologii DC za pośrednictwem HSV-1 2,3,4,5,6. Jest to szczególnie ważne, aby wyjaśnić, w jaki sposób herpeswirusy tłumią lub hamują silne przeciwwirusowe odpowiedzi immunologiczne, aby ustalić latencję w niszach uprzywilejowanych immunologicznie wewnątrz hosta7,8. Pod tym względem herpeswirusy są bardzo skutecznymi patogenami, które są szeroko rozpowszechnione w całej populacji, osiągając częstość występowania serologicznego do 90% w zależności od regionu geograficznego9. Aby to zrozumieć i ewentualnie temu zapobiec, potrzebne są dalsze badania nad modulacjami układu odpornościowego gospodarza, a zwłaszcza komórek odpornościowych, takich jak DC, za pośrednictwem HSV-1.

Zupełnie nowe spostrzeżenie dotyczące interakcji DC z HSV-1 zostało niedawno opublikowane przez Turan et al.10. Autorzy wykazali, że osiągnięcie replikacji HSV-1 jest ściśle zależne od statusu dojrzewania DC. W iDC pełna replikacja HSV-1 jest ułatwiona przez mechanizmy zależne od autofagii. Podczas gdy HSV1 indukuje autofagię zarówno w iDC, jak i mDC, strumień autofagiczny obserwuje się tylko w iDC. To z kolei ułatwia wydostawanie się kapsydów wirusowych do komórek macierzystych poprzez autofagiczną degradację laminy jądrowej w iDC. Aby uzyskać mechanistyczny wgląd w ten indukowany przez HSV-1 szlak degradacji w iDC w porównaniu z mDC, kluczowe znaczenie mają nowe i skuteczne strategie badania strumienia autofagicznego.

Makroautofagia (autofagia) to dobrze zachowany, wieloetapowy proces ukierunkowany na wewnątrzkomórkowe białka lub całe organelle do trawienia lizosomalnego11. Upraszczając, autofagię można podzielić na (i) inicjację, (ii) zarodkowanie błony, (iii) ekspansję pęcherzyków i (iv) fazę fuzji autofagosomu i lizosomów12. Podczas inicjacji (i) składniki takie jak aktywowany kompleks kinazy ULK1/2, zawierający białko oddziałujące z rodziną ogniskowych kinaz adhezyjnych o stężeniu 200 kD (FIP200), mają kluczowe znaczenie dla aktywacji kompleksu beclin-1-Vps34-AMBRA1. Następnie zarodkowanie błony (ii) inicjuje tworzenie fagoforu13, który pochłania ładunki cytoplazmatyczne oznaczone cząsteczkami takimi jak p6214. Podczas ekspansji pęcherzyków i dojrzewania autofagoforu (iii) białkowy łańcuch lekki 3 (LC3)-I związany z mikrotubulami jest przekształcany w swoją lipidowaną formę LC3-II, która jest wprowadzana do błony autofagosomalnej. Tak więc współczynniki konwersji LC3-I do -II są wskaźnikiem indukcji autofagii poprzez odzwierciedlenie tworzenia dojrzałych autofagosomów15,16. Po fuzji autofagosomu z lizosomem (iv) nie tylko ładunek autofagiczny, ale także związane z nim białka p62 i LC3-II ulegają degradacji (np. Przez hydrolizę). Tak więc utrata p62 i LC3-II służy jako markery strumienia autofagicznego17. Fuzja autofagosomów z lizosomami, a tym samym podążanie za obrotem autofagicznym, jest w dużym stopniu zależne od wewnątrzkomórkowej lokalizacji lizosomalnej. Jest to regulowane między innymi przez członków rodziny kinezyny KIF1B i KIF2A, które, jak wykazano, negatywnie wpływają na fuzję autofagosomu z lizosomem18. Co ciekawe, ekspresja białek KIF1B i KIF2A jest indukowana podczas dojrzewania DC, a tym samym jest odpowiedzialna za nieefektywny przepływ autofagiczny w mDC zakażonych HSV-1, co utrudnia pełną replikację HSV-110.

Eksperymentalne próby modulacji autofagii obejmują użycie związków, o których wiadomo, że indukują lub hamują ten konkretny szlak19,20,21. W tym badaniu opisujemy dwie strategie oparte na inhibitorach w celu zablokowania obrotu autofagicznego w iDC zakażonych HSV-1. Pierwszym związkiem użytym w naszych eksperymentach jest specyficzny i silny inhibitor autofagii-1 (spautin-1), który został opisany jako promujący degradację kompleksu beclin-1-Vps34-AMBRA1 podczas fazy inicjacji autofagii22. Drugim związkiem zastosowanym w niniejszym badaniu jest bafilomycyna-A1 (BA1), inhibitor V-ATPazy, który blokuje późne zdarzenia autofagiczne (tj. fuzję autofagosomu z lizosomem oraz zakwaszenie autolizosomów)23,24. Stosowanie któregokolwiek z tych dwóch inhibitorów przed zakażeniem iDC HSV-1 silnie hamuje autofagię, ale nie zaburza efektywnej ekspresji genów wirusa. Tak więc ta strategia oparta na inhibitorach przed zakażeniem HSV-1 oferuje potężne narzędzie do hamowania indukowanego przez HSV-1 strumienia autofagicznego, który można łatwo rozszerzyć na mnóstwo różnych typów komórek i wirusów, które również potencjalnie indukują autofagię.

Aby przezwyciężyć główną wadę podejścia opartego na inhibitorach (tj. niespecyficzne efekty off-target), opracowaliśmy metodę opartą na siRNA do blokowania przepływu autofagicznego w (zakażonych HSV-1) iDC. Technika elektroporacji siRNA stanowi potężną alternatywną strategię, polegającą na selektywnej ablacji ekspresji odrębnych białek (tj. składników autofagicznych). W naszych eksperymentach iDC zostały elektroporowane siRNA specyficznym dla FIP200 przy użyciu aparatu do elektroporacji I (patrz tabela materiałów) i zmodyfikowanego protokołu opisanego przez Gerera i in. (2017) oraz Prechtel i in. (2007), w celu zahamowania autofagii podczas fazy inicjacji25,26. Ta technika pozwoliła nam na specyficzne obniżenie ekspresji FIP200 w iDC, bez ingerencji w żywotność komórek i ich niedojrzały fenotyp dwa dni po elektroporacji. Warto zauważyć, że zakażenie HSV-1 stwierdzono w tych elektroporowanych iDC, co znalazło odzwierciedlenie w wydajnej ekspresji białek wirusowych. Ta technika oparta na siRNA oferuje wyjątkową korzyść (tj. że wiele różnych składników autofagicznych, nawet w połączeniu) może być specjalnie ukierunkowanych na ablację ich ekspresji.

W tym badaniu opisujemy metodę opartą na siRNA do indukowania strumienia autofagicznego również w mDC zakażonych HSV-1. W tym przypadku iDC poddano elektroporacji siRNA ukierunkowanemu na KIF1B i KIF2A przed dojrzewaniem DC przy użyciu aparatu do elektroporacji II (patrz tabela materiałów). Ponieważ oba białka są regulowane w górę podczas dojrzewania DC i wiadomo, że negatywnie regulują fuzję autofagosomów z lizosomami10,18, ich knockdown silnie indukował autofagiczny strumień w mDC po zakażeniu HSV-1. W ten sposób technika oparta na siRNA umożliwiła nam specyficzne wywołanie obrotu autofagicznego poprzez ingerencję w ekspresję białka KIF w mDC, a tym samym mogła naśladować ich poziomy ekspresji w iDC.

Podsumowując, prezentujemy dwie różne metody hamowania przepływu autofagicznego w iDC zakażonych HSV-1. Podczas gdy pierwsze podejście oparte na inhibitorach stanowi łatwy, tani i szybki sposób na zakłócenie degradacji autofagicznej, druga technika oparta na siRNA jest bardziej specyficzna i jest bardzo odpowiednią metodą wspierania i weryfikacji wyników eksperymentów opartych na inhibitorach. Ponadto opisujemy metodę indukowania strumienia autofagicznego również w mDC zakażonych HSV-1, poprzez knockdown dwóch białek KIF za pośrednictwem siRNA.

Protokół

DC pochodzące z monocytów zostały wygenerowane z produktów leukaferezy od zdrowych dawców. W tym celu uzyskano pozytywny głos lokalnej komisji etycznej (numer referencyjny 4556). Eksperymenty w niniejszym badaniu zostały przeprowadzone zgodnie z zaleceniami komisji bioetycznej "Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg" (numer referencyjny 4556). Wszyscy darczyńcy wyrazili pisemną świadomą zgodę, w tym zgodnie z Deklaracją Helsińską.

1. Generowanie i obsługa niedojrzałych komórek dendrytycznych (iDCs) i dojrzałych komórek dendrytycznych (mDCs)

  1. Wyizoluj ludzkie komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) z komór systemu leukoredukcji (LRSC), jak opisano wcześniej27. Unikaj kriokonserwacji PBMC i używaj ich bezpośrednio po izolacji, aby uzyskać wyższą wydajność prądu stałego.
  2. Wygeneruj ludzkie DC z PBMC różnych zdrowych dawców w kolbach do hodowli komórkowych T175, jak opisano wcześniej10,27. Krótko mówiąc, użyj 350-400 milionów PBMC w 30 ml pożywki DC (RPMI 1640 bez L-glutaminy, 1% (v/v) AB-surowicy, 100 U/ml penicyliny, 100 mg/ml streptomycyny, 0,4 mM L-glutaminy, 10 mM HEPES) na kolbę do hodowli komórkowej w celu izolacji monocytów przez adherencję. Po 1 godzinie zmyć nieprzylegającą frakcję za pomocą RPMI 1640. Dodać świeżą pożywkę DC uzupełnioną 800 U/mL GM-CSF i 250 U/mL IL-4 i inkubować przez 3 dni.
    1. W 3 dniu po przyleganiu do zaleceń dodać 5 ml świeżej pożywki DC zawierającej GM-CSF i IL-4 o końcowym stężeniu odpowiednio 400 U/ml i 250 U/ml na kolbę do hodowli komórkowej w celu różnicowania DC.
    2. Aby zebrać iDC, delikatnie spłucz luźno przylegające iDC z dna kolby do hodowli komórkowej, w 4 dniu po przyklejeniu. Powtórz ten krok 2 razy. Do wytworzenia mDC dodać koktajl dojrzewający o następującym składzie: GM-CSF (stężenie końcowe: 40 U/ml), IL-4 (stężenie końcowe: 250 U/ml), IL-6 (stężenie końcowe: 1000 U/ml), IL-1β (stężenie końcowe: 200 U/ml), TNF-α (stężenie końcowe: 10 ng/ml), prostaglandyna E2 (PGE2; stężenie końcowe: 1 μg/ml).
    3. Sześć dni po adherencji (dwa dni po indukcji dojrzewania za pomocą koktajlu cytokin) wypłukać mDC z dna kolby do hodowli komórkowej. Powtórz ten krok dwa razy.
      UWAGA: Niedojrzałe i dojrzałe DC mogą być sekwencyjnie generowane od identycznych dawców w 1 kolbie do hodowli komórkowych. W tym celu należy (i) oddzielić odpowiednią liczbę iDC i (ii) wywołać dojrzewanie pozostałych komórek w kolbach za pomocą koktajlu cytokin wymienionego w kroku 1.2.2.
  3. Przenieść iDC lub mDC w odpowiednim pożywce do hodowli komórkowej do probówek o pojemności 50 ml. Zebrać komórki przez odwirowanie w stężeniu 300 x g przez 5 minut.
    1. Delikatnie zawiesić (=przepłukać) DC w 5-10 ml RPMI 1640 na kolbę do hodowli komórkowych. Połącz odpowiednie zawieszenia DC w jednej rurze.
    2. Zdefiniuj numer komórki za pomocą komory zliczającej lub metody alternatywnej. Unikaj zmian temperatury podczas obchodzenia się z iDC, aby zmniejszyć ryzyko zmian fenotypowych.

2. Analizy cytometryczne przepływu w celu monitorowania stanu dojrzewania fenotypowego

  1. Przenieś iDC lub mDC (0.5 x 106) z kroku 1.3.1 do probówki 1.5 mL. Zebrać komórki przez odwirowanie przy 3390 x g przez 1,5 min. Przemyć komórki raz buforem FACS (PBS uzupełniony 2% płodową surowicą cielęcą (FCS)).
  2. Ponownie zawiesić komórki w 100 μl roztworu barwiącego przeciwciała (bufor FACS) zawierającego specyficzne przeciwciała znakowane fluorochromem przeciwko określonym cząsteczkom powierzchniowym.
    1. Użyj następujących przeciwciał, aby zweryfikować czystość (CD3-FITC, CD14-PE), a także stan dojrzewania DC (CD80-PacBlue/-PE-Cy5, CD11c-PE-Cy5, CCR7-PE-Cy7, CD83-APC, CD86-PE, MHCII-APC-Cy7).
    2. Przygotować jedną niebarwioną próbkę w 100 μl buforu FACS jako kontrolę.
    3. Plamić komórki na lodzie w ciemności przez 30 minut.
  3. Następnie przemyć komórki dwa razy w 1 ml buforu FACS i odwirować przy 3390 x g przez 1,5 minuty.
  4. Na koniec ponownie zawieś komórki w 200 μl buforu FACS uzupełnionego 2% PFA i przeanalizuj komórki za pomocą cytometrii przepływowej. Stałe ogniwa można przechowywać w temperaturze 4°C w ciemności do 2 dni.

3. Procedura zakażenia DCs wirusem opryszczki pospolitej typu 1 (HSV-1) i interferencja strumienia autofagicznego wywołanego przez HSV-1 przez spautin-1 lub bafilomycynę-A1

UWAGA: Szczep HSV-1/17+/CMV-EGFP/UL43 (HSV-1 EGFP) użyty w tym badaniu został uzyskany z laboratoryjnego szczepu HSV-1 szczep 17+. Szczep HSV-1 EGFP wykazuje ekspresję wzmocnionego białka zielonej fluorescencji (EGFP), które zostało wprowadzone do locus genu UL43 pod kontrolą promotora CMV. EGFP służy jako marker zakażenia HSV-1. Ponadto szczep HSV1-RFPVP26 został wykorzystany do badań nad infekcją DC (wcześniej opisaną w Turan i wsp., 2019). Wirus ten ulega ekspresji białka powierzchniowego kapsydu VP26 połączonego z monomerem białka czerwonej fluorescencji (mRFP).

  1. Przenieś iDC lub mDC (2 x 106) z kroku 1.3 do probówki o pojemności 2 ml. Następnie odwirować komórki o sile 3390 x g przez 1,5 minuty i odrzucić supernatant.
  2. Delikatnie zawiesić komórki w pożywce infekcyjnej (RPMI 1640 uzupełniony 20 mM HEPES).
    1. Aby zahamować szlak degradacji autofagosomalno-lizosomalnej, należy wstępnie potraktować DC spautiną-1 lub bafilomycyną-A1 na 1 godzinę przed zakażeniem. Dodać 10 μM spautin-1 lub 1 μM BA1 lub DMSO jako nieleczoną kontrolę do pożywki infekcyjnej. Inkubować komórki w bloku grzewczym z prędkością 300 obr./min, wytrząsając w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
    2. W przypadku badań nad infekcjami należy zaszczepić komórki wirionami HSV-1 przy wielokrotności infekcji (MOI) wynoszącej 2. Dodać odpowiednią objętość buforu MNT (30 mM kwasu 2-(N-morfolino)etanosulfonowego (MES), 100 mM NaCl, 20 mM Tris) jako próbną kontrolę. Inkubować komórki w bloku grzewczym z prędkością 300 obr./min, wytrząsając w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
  3. 1 godzinę po zakażeniu (hpi) zebrać komórki w temperaturze 3390 x g przez 1,5 min. Odaspirować inokulum i delikatnie ponownie zawiesić komórki w pożywce DC zawierającej 40 U/ml GM-CSF, 250 U/ml IL-4 i 10 μM spautin-1, 1 μM BA1 lub DMSO jako kontrolę. Komórki zaprawione próbą nasion i zakażone HSV-1 w końcowym stężeniu 1 x 106/ml na płytkę 6-dołkową.
  4. W temperaturze 16-24 hpi zbierz komórki przez płukanie (mDC) lub za pomocą skrobaka do komórek (iDCs). Przenieś komórki do probówki safelock o pojemności 1,5 ml.
    1. Zebrać komórki przez odwirowanie przy 3390 x g przez 1,5 minuty i przemyć osad raz, dodając 1 ml PBS.
    2. Energicznie ponownie zawiesić komórki w mieszaninie do lizy zawierającej 29 μl 2x Roti-Load, 1 μL 100 mM MgCl2 i 12,5 U/ml benzonazy.
    3. W celu lizy komórek i trawienia DNA przy użyciu benzonazy próbki inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 minut. Następnie należy denaturować białka w temperaturze 95 °C przez 10 minut.
    4. Wykonaj analizy SDS-PAGE i Western blot w celu sprawdzenia poziomu białka LC3BI/II, p62, ICP0/5 i GAPDH.

4. Interferencja strumienia autofagicznego indukowanego przez HSV-1 poprzez elektroporację iDC przy użyciu FIP200-siRNA

UWAGA: Obecny protokół elektroporacji siRNA został zmodyfikowany z Prechtel et al. (2007) i Gerer et al. (2017).

  1. Przenieść iDC (12 x 106) w 3,5 dniu po przyklejeniu do probówki o pojemności 50 ml. Następnie odwirować komórki o stężeniu 300 x g przez 5 minut i odrzucić supernatant. Równolegle należy przeprowadzić analizę cytometrii przepływowej w celu monitorowania stanu dojrzewania zgodnie z opisem w kroku 2 (Użyj fioletu Life/Dead zamiast CD80-PacBlue).
  2. Delikatnie przemyć iDC w 5 ml OptiMEM bez czerwieni fenolowej i odwirować komórki przy 300 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant i delikatnie ponownie zawiesić iDC w 200 μl OptiMEM bez czerwieni fenolowej, dostosowując stężenie komórek 6 x 106/100 μL. Nie umieszczaj ogniw na lodzie i unikaj zmian temperatury. Działaj szybko i unikaj długich okresów inkubacji iDC w OptiMEM bez czerwieni fenolowej.
  3. Przenieść 75 pmol siRNA specyficznego dla FIP200 lub 75 pmol zaszyfrowanego siRNA, jako kontrolę, do elektrokuwet o średnicy 4 mm i dodać 100 μl (6x106 komórek) zawiesiny ogniwa. Bezpośrednio impulsować iDC za pomocą aparatu do elektroporacji I, stosując następujące ustawienia: 500 V przez 1 ms.
    1. Przed rozpoczęciem procedury doświadczalnej należy przygotować zawiesiny siRNA zgodnie z instrukcją producenta, podwielokrotność porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C. Rozmrozić i przechowywać na lodzie w przypadku używania tych siRNA do elektroporacji. Przed elektropoturą próbek należy wykonać impuls testowy.
  4. Po elektroporacji bezpośrednio przenieś iDC na płytki 6-dołkowe ze świeżym, wstępnie podgrzanym podłożem DC (uzupełnionym 40 U/ml GM-CSF i 250 U/ml IL-4). Wysiewać komórki w końcowym stężeniu 1 x 106/ml i umieszczać je w inkubatorze. Nie wypłukuj ogniw z kuwety elektrycznej.
  5. Po 48 godzinach najpierw zbadaj pod mikroskopem morfologię elektroporowanych iDC. Następnie zbierz komórki za pomocą skrobaka do komórek i przenieś je do probówek o pojemności 15 ml. Przepłukać studzienki 1 ml PBS uzupełnionego 0,01% EDTA i przenieść roztwór do odpowiednich probówek.
  6. Następnie podziel 6 x 106 iDC na warunek siRNA, jak opisano w następnych krokach.
    1. Użyj komórek 0,5 x 106, aby ocenić stan dojrzewania i żywotność komórek, jak opisano w kroku 2. Należy stosować następujące przeciwciała: CD11c-PE-Cy5, CCR7-PE-Cy7, CD83-APC, MHCII-APC-Cy7 i Life/Dead violet.
    2. Użyj 1 x 106 komórek do analiz Western blot, aby zweryfikować skuteczność knockdown specyficzną dla FIP200. Przenieś i zbierz komórki do probówki safelock o pojemności 1,5 ml przez odwirowanie przy 3390 x g przez 1,5 minuty. Przygotować lizaty komórkowe zgodnie z opisem w kroku 3.4 i przeprowadzić analizę Western blot.
    3. Użyj pozostałych komórek (4,5 x 106) do eksperymentów z infekcją HSV-1. Dla każdego warunku eksperymentalnego przenieś 2,25 x 106 iDC do probówek o pojemności 2 ml i albo zainfekuj je HSV1 przy MOI 2, albo dodaj bufor MNT jako pozorowaną kontrolę. Przeprowadź infekcję zgodnie z opisem w kroku 3.3.
    4. W temperaturze 20 hpi zebrać komórki za pomocą skrobaka do komórek i przygotować lizaty komórkowe do analizy Western blot zgodnie z opisem w kroku 3.4.

5. Modulacja szlaku autofagosomalno-lizosomalnego w mDC zakażonych HSV-1 za pomocą elektroporacji KIF1B/2A-siRNA

  1. Przenieś iDC (24 x 106) w 4 dniu po przyleganiu do probówki o pojemności 50 ml. Następnie odwirować komórki o stężeniu 300 x g przez 5 minut i odrzucić supernatant.
  2. Delikatnie zawiesić (= przepłukać) iDC w 8 ml PBS, aby dostosować końcowe stężenie komórek 3 x 106/ml. Przenieś 3 x 106 komórek do probówek o pojemności 1,5 ml i zbieraj komórki w temperaturze 3390 x g przez 1,5 minuty.
  3. Zawiesić iDC w 100 μl buforu P3 zawierającego mieszaninę suplementów (zgodnie z instrukcjami producenta; aparat II zestawu do elektroporacji) i albo (i) 75 pmol siRNA specyficznego dla KIF1B, (ii) 75 pmol siRNA specyficznego dla KIF2A, lub (iii) oba. Użyj (iv) odpowiedniej ilości zaszyfrowanego siRNA jako kontroli. Przygotuj dwie probówki dla każdego warunku siRNA (6 x 10,6 komórek) i przenieś zawiesiny do oddzielnych elektrokuwet. Bezpośrednio impulsować iDC, stosując impuls "EH-100" za pomocą aparatu do elektroporacji II.
    1. Przed rozpoczęciem procedury doświadczalnej należy przygotować zawiesiny siRNA zgodnie z instrukcją producenta, podwielokrotność porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C. Rozmrozić i przechowywać na lodzie w przypadku używania tych siRNA do elektroporacji. Nie umieszczaj iDC na lodzie i unikaj zmian temperatury. Poruszaj się szybko i unikaj długiej inkubacji iDC w PBS lub buforze P3.
  4. Bezpośrednio po elektroporacji dodaj 500 μl wstępnie podgrzanego RPMI 1640 do kuwet elektrycznych. Inkubować komórki w inkubatorze przez 5-10 minut. Przenieś iDC na płytki 6-dołkowe ze świeżą, wstępnie podgrzaną pożywką DC (uzupełnioną 40 U/ml GM-CSF i 250 U/ml IL-4). Połącz odpowiednie warunki w jednym dołku, wysiewaj komórki w końcowym stężeniu 1·106/ml i umieść je w inkubatorze.
  5. 4 godziny po inkubacji dodać koktajl dojrzewania zawierający cytokiny wymienione w kroku 1.2.2.
    UWAGA: Przygotować jedną próbkę z nieelektroporowanych prądów stałych (1 x 106) jako kontrolę do analiz cytometrii przepływowej 2 dni po elektroporacji. Z komórkami kontrolnymi należy postępować analogicznie do próbek poddanych elektropostacji.
  6. Dwa dni po elektroporacji zbierz komórki przez ponowne zawieszenie i przenieś do probówek o pojemności 15 ml. Przepłukać studzienki 1 ml PBS i przenieść zawiesiny do odpowiednich probówek. Podział 6·106 DC na warunek siRNA, zgodnie z opisem w następujących krokach:
    1. Użyj 0,25 x 106 DC (elektroporowanych i nieelektroporowanych), aby sprawdzić stan dojrzewania i żywotność ogniw, jak opisano w kroku 2. Użyj następujących przeciwciał: CD80-PE-Cy5, CD83-APC, CD86-PE, MHCII-APC-Cy7 i Life/Dead violet.
    2. Użyjkomórek 0,75 x 10 6 do analiz Western blot, aby ocenić skuteczność knockdown specyficzną dla KIF1B/2A. Zebrać komórki do probówki safelock o pojemności 1,5 ml przez odwirowanie przy 3390 x g przez 1,5 min. Przygotować lizaty komórkowe zgodnie z opisem w kroku 3.4 i przeprowadzić analizę Western blot.
    3. Użyj pozostałych komórek (5 x 10,6) z każdego stanu siRNA i przeprowadź eksperymenty z infekcją HSV-1. Dla każdego warunku eksperymentalnego przenieś 2,5 x 106 iDC do probówek o pojemności 2 ml i albo zainfekuj je HSV-1 przy MOI 2, albo dodaj bufor MNT jako pozorowaną kontrolę. Przeprowadź infekcję zgodnie z opisem w kroku 3.3.
    4. Po 20 godzinach od zakażenia należy pobrać komórki przez ponowne zawieszenie i przygotować lizaty komórkowe do analizy Western blot w celu sprawdzenia indukcji obrotu autofagicznego wywołanego przez HSV-1, jak opisano powyżej w kroku 3.4.

Wyniki

W niniejszej pracy opisujemy metody zakłócania autofagii indukowanej przez HSV-1 w komórkach dendrytycznych. Obejmuje to generowanie ludzkich iDC i mDC pochodzących z monocytów, które zostały poddane analizie fenotypowej za pomocą cytometrii przepływowej (Rysunek 1). W 4. dniu po adhezji komórki DC wykazują fenotyp niedojrzały, charakteryzujący się słabą ekspresją CD80, CCR7 i CD83, a także wysoką ekspresją CD11c i umiarkowaną ekspresją MHCII. Brak sygnałów CD3 i CD14 pozwala wykluczyć zanieczyszczenia limfocytami T oraz monocytami. W 6. dniu po adhezji (tj. w 2. dniu po indukcji dojrzewania) komórki DC wykazują fenotyp dojrzały, co odzwierciedla znaczący wzrost powierzchniowej ekspresji CD80, CCR7, CD83 i MHC-II. Zakażenie szczepem HSV-1 wykazującym ekspresję eGFP (Rysunek 2) prowadzi do niemal całkowitego zakażenia zarówno iDC (Rysunek 2A górny panel), jak i mDC (Rysunek 2A dolny panel, Rysunek 2B), co potwierdzają silne sygnały GFP analizowane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej oraz cytometrii przepływowej.

Jak wykazano w naszym ostatnim raporcie, HSV-1 indukuje autofagię zarówno w iDC, jak i mDC, jednak obrót autofagiczny zachodzi wyłącznie w iDC10. W pierwszym podejściu potraktowano iDC i mDC spautyną-1 (Rycyna 3A) – aby zablokować inicjację autofagii – lub bafilomycyną-A1 (BA1; Rycyna 3B) – aby zahamować końcową fuzję autofagosomu z lizosomem. Po infekcji iDC wirusem HSV-1 w obecności spautyny-1 i BA1, strumień autofagiczny odzwierciedla spadek ekspresji odpowiednio p62 i LC3B. W przeciwieństwie do tego, infekcja mDC wirusem HSV-1 w obecności spautyny-1 nie wpływa na ekspresję p62, podczas gdy traktowanie spautyną-1 i BA1 indukuje akumulację LC3B-II. Odzwierciedla to indukcję autofagii przy jednoczesnym braku obrotu autofagicznego w mDC. W iDC wstępne traktowanie spautyną-1 silnie przywraca autofagiczną degradację p62 po infekcji HSV-1, co wynika z zahamowania autofagii w fazie inicjacji. Po wstępnym traktowaniu BA1, iDC nieinfekowane oraz zainfekowane HSV-1 wykazują silną akumulację poziomów białka LC3B-II, co wskazuje na skuteczne zahamowanie obrotu autofagicznego poprzez blokowanie późnej fuzji autofagosomu z lizosomem. Zgodnie z tym, wstępne traktowanie mDC spautyną-1 i BA1 prowadzi również do odpowiednio stabilnych poziomów p62 i zwiększonych poziomów białka LC3B-II.

W drugiej metodzie upośledzenia przepływu autofagicznego zbadano zdolność elektroporacji siRNA skierowanego przeciwko FIP200 do blokowania przepływu autofagicznego w iDCs zakażonych HSV-1. Jak pokazano na Rysunku 4A, w iDCs 48 h po elektroporacji stwierdzono znaczny spadek poziomu białka FIP200 w porównaniu z kontrolnym siRNA. W tym punkcie czasowym iDCs nie wykazują żadnych oznak śmierci komórkowej (Rysunek 4B) i zachowują swój niedojrzały fenotyp (Rysunek 4C). Zakażenie iDCs z wyciszonym FIP200 wirusem HSV-1 ujawnia silny spadek przepływu autofagicznego w porównaniu z odpowiednikami traktowanymi kontrolnym siRNA (Rysunek 4D). Towarzyszy temu wzrost poziomu białek LC3B oraz p62 w przypadku wyciszenia FIP200 w iDCs zakażonych HSV-1.

W próbie odwrotnej zbadaliśmy, czy ablacja ekspresji białek KIF1B i KIF2A za pomocą siRNA umożliwia obrót autofagosomalno-lizosomalny również w zainfekowanych HSV-1 komórkach mDC. W związku z tym iDC poddano elektroporacji przy użyciu specyficznych siRNA celujących w jedno lub oba te białka, a następnie komórki dojrzewano (Rysunek 5). 2 dni po elektroporacji, w przypadku zastosowania specyficznych siRNA, mDC wykazują silną redukcję ekspresji białka KIF1B i/lub KIF2A (Rysunek 5A). Metoda ta nie prowadziła ani do znacznej śmierci komórek (Rysunek 5B), ani do zmian w ich fenotypowym statusie dojrzewania (Rysunek 5C). Potwierdzając znaczenie KIF1B i KIF2A podczas degradacji autofagosomalno-lizosomalnej, ich usunięcie przed infekcją HSV-1 ułatwia zwiększenie strumienia autofagicznego w mDC. Przejawia się to obniżonym poziomem resztkowego białka p62 w porównaniu z odpowiednim warunkiem kontrolnym (Rysunek 5D).

Histogramy cytometrii przepływowej; barwione/niebarwione markery immunologiczne: CD3, CD14, CD11c, CD80, CCR7, CD83, MHCII.
Rysunek 1: Charakterystyka fenotypowa ludzkich iDC i mDC pochodzących z monocytów za pomocą cytometrii przepływowej. DC wygenerowano i zabarwiono swoistymi przeciwciałami w celu weryfikacji ich czystości: (A) CD3 w celu wykluczenia zanieczyszczeń limfocytami T, (B) CD14 w celu wykluczenia zanieczyszczeń monocytami oraz (C) CD11c jako marker DC. W celu oceny statusu dojrzewania fenotypowego zastosowano następujące przeciwciała: (D) CD80, (E) CCR7, (F) CD83 oraz (G) MHCII. Cząsteczki te wykazują wysoką ekspresję na mDC, co pozwala na rozróżnienie fenotypu niedojrzałych i dojrzałych DC. Dane analizowano przy użyciu programu FCS express 5.0. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Analiza infekcji HSV-1; światło przechodzące vs. fluorescencja GFP w iDCs/mDCs; wykres cytometrii przepływowej.
Rycina 2: Analizy mikroskopowe oraz cytometryczne iDCs i mDCs zainfekowanych HSV-1.iDCs i mDCs zainfekowano szczepem HSV-1 wykazującym ekspresję EGFP (HSV-1 EGFP), aby umożliwić ilościowe określenie poziomu infekcji na podstawie sygnału GFP. (A) Analizy mikroskopowe GFP-dodatnich iDCs i mDCs zainfekowanych HSV-1 przy MOI równym 2, w porównaniu do ich niezinfekowanych odpowiedników, w 24 hpi. W celu wizualizacji zainfekowanych komórek monitorowano fluorescencję GFP. Pasek skali reprezentuje 400 µm. (B) Pomiar cytometryczny mDCs poddanych infekcji pozorowanej (mock) lub HSV-1 podczas kinetyki infekcji. Górne panele (histogramy z czarną linią) przedstawiają warunki mock, dolne panele (histogramy wypełnione na czarno) przedstawiają komórki zainfekowane HSV-1 po wskazanych punktach czasowych po infekcji. Dane analizowano przy użyciu oprogramowania FCS express 5.0. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza Western blot ekspresji białek, zakażenie HSV-1 w iDC/mDC, w obecności DMSO, Spautiny-1, BA1.
Rycina 3: Spautina-1 i bafilomycyna-A1 modulują strumień autofagii w zakażonych HSV-1 iDC.iDC i mDC traktowano (A) spautiną-1 lub (B) bafilomycyną-A1 (BA1) przez 1 h przed zakażeniem. Następnie komórki poddano zakażeniu pozorowanemu lub zakażeniu HSV-1 (HSV1-RFPVP26) przy MOI wynoszącym 2. Po 16-18 h zebrano DC, a lizaty białkowe poddano analizie Western blot w celu określenia ekspresji p62 lub LC3B-I/-II jako markerów autofagii, ICP0 jako kontroli zakażenia oraz GAPDH jako kontroli załadunku. Poziomy białek LC3B-I i LC3B-II skwantyfikowano i znormalizowano względem białka referencyjnego GAPDH przy użyciu oprogramowania Bio1D (gęstość optyczna). Przedstawiono stosunek znormalizowanych sygnałów LC3B-II do znormalizowanych sygnałów LC3B-I. Rycina ta została zmodyfikowana i zaadaptowana z ©2019 Turan et al., pierwotnie opublikowana w JCB. https://doi.org/10.1083/jcb.20180115110. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza Western blot wpływu siRNA na FIP200, dane z cytometrii przepływowej dotyczące markerów CD, badanie infekcji HSV-1.
Rysunek 4: Analiza strumienia autofagii w iDC zainfekowanych HSV-1 po elektroporacji siRNA przeciwko FIP200. iDC poddano elektroporacji kontrolnym siRNA lub siRNA specyficznym dla FIP200 przy użyciu aparatu do elektroporacji I. (A) 48 h po elektroporacji przeanalizowano efektywność wyciszenia FIP200 w komórkach DC za pomocą analizy Western blot. (B) Żywotność komórek, a także (C) stan dojrzewania przeanalizowano metodą cytometrii przepływowej przed elektroporacją (jasnoniebieskie histogramy) oraz 48 h po elektroporacji (ciemnoniebieskie i szare histogramy). Przedstawiono wartości median dla trzech różnych dawców. Po potwierdzeniu efektywnego wyciszenia FIP200 oraz niedojrzałego fenotypu, komórki zainfekowano HSV-1 (HSV-1 EGFP) przy użyciu MOI wynoszącego 2. Dane przeanalizowano za pomocą oprogramowania FCS express 5.0. (D) 20 h po infekcji komórki poddano analizie Western blot w celu określenia ekspresji LC3B-I/-II i p62 jako markerów autofagii. ICP5 wykryto jako kontrolę infekcji, a GAPDH jako kontrolę załadunku. Panele A i D zostały zmodyfikowane i zaadaptowane z ©2019 Turan et al., pierwotnie opublikowane w JCB. https://doi.org/10.1083/jcb.20180115110. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Analiza Western blot i cytometrii przepływowej efektów siRNA na białka KIF2A, KIF1B oraz markery CD.
Rycina 5: Ablacja KIF1B i/lub KIF2A za pośrednictwem siRNA moduluje obrót autofagiczny w mDC zainfekowanych HSV-1. iDC poddano elektroporacji specyficznymi dla KIF1B i/lub KIF2A siRNA, a także kontrolnym siRNA, przy użyciu aparatu do elektroporacji II. W 4 h po elektroporacji indukowano dojrzewanie poprzez dodanie koktajlu dojrzewania. W 48 h po elektroporacji przeanalizowano DC pod kątem (A) wydajności wyciszenia KIF za pomocą Western blottingu, (B) żywotności komórek, a także ich (C) fenotypowego stanu dojrzewania za pomocą analiz cytometrii przepływowej (pokazano dwóch różnych dawców). „w/o EP” oznacza bez elektroporacji, ale po indukcji dojrzewania; „post control EP” oznacza po elektroporacji z użyciem kontrolnego siRNA; „post KIF1B, KIF2A, KIF1B/2A EP” oznacza po elektroporacji z użyciem siRNA specyficznych dla KIF1B i/lub KIF2A. Po potwierdzeniu wydajnego wyciszenia KIF1B i/lub KIF2A oraz fenotypu dojrzałego, komórki zainfekowano HSV-1 (HSV-1 EGFP) przy MOI wynoszącym 2. Dane analizowano za pomocą oprogramowania FCS express 5.0. (D) Komórki poddano analizie Western blot 20 h po infekcji w celu oceny ekspresji p62 jako markera autofagii. ICP5 służyło jako kontrola infekcji, a GAPDH jako kontrola ładowania. Ryciny A i D zostały zmodyfikowane i zaadaptowane z ©2019 Turan et al., pierwotnie opublikowane w JCB. https://doi.org/10.1083/jcb.20180115110. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Zakres niniejszego protokołu obejmuje (i) postępowanie z ludzkimi iDC pochodzącymi z monocytów, jak również z mDC, (ii) ich zakażenie HSV-1, (iii) ich leczenie związkami znanymi z hamowania autofagii oraz (iv) ich elektroporację za pomocą siRNA przy użyciu dwóch różnych konfiguracji technicznych. Korzystając z obecnego protokołu, strumień autofagiczny może być albo zablokowany w iDC zakażonych HSV-1, albo indukowany w mDC zakażonych HSV-1.

Ponieważ DC, a zwłaszcza iDC, są bardzo wrażliwymi komórkami, praca z tymi komórkami obejmuje dość delikatne kroki. Do wytwarzania prądu stałego zalecamy stosowanie świeżo wyizolowanych PBMC i unikanie ich krioprezerwacji, aby uzyskać wyższą wydajność komórek. Ponadto, podczas obchodzenia się z iDC podczas eksperymentów, w tym ich późniejszej uprawy, należy unikać gwałtownych lub długotrwałych zmian temperatury. W przeciwnym razie iDC mogą ulegać zmianom fenotypowym, a zatem konieczna jest weryfikacja ich niedojrzałego fenotypu za pomocą cytometrii przepływowej. Należy zauważyć, że w przeciwieństwie do swoich dojrzałych odpowiedników, iDC nie mają wyraźnych markerów, takich jak CD80, CD83 i CD8628,29. Zakażenie iDC i mDC HSV-1 jest dobrze znaną metodą 2,3,4,5,6,10. My i inni wykazaliśmy, że DC są bardzo podatne na zakażenie HSV-1, gdy zastosowano MOI 1 lub 2 (Figura 2). W naszych rękach utrzymanie objętości pożywki infekcyjnej na niskim poziomie (1-3 x 106 komórek w 250-350 μL) doprowadzi do lepszej skuteczności infekcji.

Klasycznym podejściem do ingerencji w dany odrębny szlak komórkowy jest użycie określonych związków. Obecnie dostępnych jest wiele różnych modulatorów autofagii, tj. aktywatorów i inhibitorów,30. Jeśli chodzi o autofagię indukowaną przez HSV-1 w DC, Turan i in., (2019) wykazali ostatnio hamujący wpływ spautyny-1 i bafilomycyny-A1 (BA1) na obrót autofagiczny w iDC10. Ta technika hamowania autofagii jest odpowiednia do łączenia z późniejszym zakażeniem HSV-1, ponieważ ani wskaźnik infekcji, ani stan dojrzewania DC (zwłaszcza iDC) nie są zaburzone. W przyszłych zastosowaniach to podejście oparte na inhibitorach może być również stosowane w połączeniu z innymi czynnikami zakaźnymi, w warunkach stresowych, takich jak głód, a także w przypadku różnych typów komórek. Jednak w przypadku stosowania inhibitorów pojawiają się ograniczenia w określaniu odpowiedniego stężenia do skutecznego hamowania autofagii, bez poważnego wpływu na żywotność komórek. Głównym ograniczeniem przy stosowaniu inhibitorów jest jednak występowanie potencjalnych niepożądanych lub niepożądanych skutków, które mogą prowadzić do mylących wyników 31,32.

Drugim podejściem do interferencji z autofagią, omówionym w niniejszym protokole, jest specyficzne nokautowanie przy użyciu siRNA 33,34,35. Z jednej strony użyliśmy aparatu do elektroporacji I, aby specyficznie ablować ekspresję FIP200, hamując w ten sposób indukowany przez HSV-1 obrót autofagiczny w iDC. Z drugiej strony wyciszyliśmy dwa różne białka KIF (tj. KIF1B i KIF2A), używając aparatu do elektroporacji II, aby ułatwić przepływ autofagiczny w mDC zakażonych HSV-1. Oba protokoły elektroporacji doprowadziły do prawie całkowitej ablacji FIP200 w iDC i KIF1B/KIF2A w mDC, co zweryfikowano za pomocą analiz Western blot (Figura 4A, Figura 5A). W przeciwieństwie do aparatu do elektroporacji I, który nie wpływa na żywotność prądów stałych, elektroporacja mDC przy użyciu aparatu do elektroporacji II powoduje nieco wyższy odsetek martwych komórek (ryc. 4B, ryc. 5b). W związku z tym, w przyszłych zastosowaniach, aparat do elektroporacji I powinien być preferowany zarówno do iDC, jak i mDC. Co ciekawe, obie techniki oparte na siRNA, modulujące strumień autofagiczny, są kompatybilne z późniejszym zakażeniem HSV-1 iDC lub mDC. Co więcej, ani niedojrzały fenotyp iDC, ani dojrzały fenotyp mDC nie ulega zmianie po elektroporacji.

Elektroporacja iDC przy użyciu siRNA specyficznego dla FIP200 jest skuteczną i wysoce specyficzną metodą knockdownu genów, a także hamowania strumienia autofagicznego po zakażeniu HSV-1. Oprócz specyficznego wyciszania FIP200, protokół ten można dostosować do wyciszania innych składników autofagicznych, uczestniczących na różnych etapach kaskady autofagicznej. Jednak zidentyfikowanie odpowiedniego celu dla skutecznego hamowania autofagii za pośrednictwem siRNA obejmuje kilka aspektów budzących niepokój. Po pierwsze, skuteczność knockdown genów związanych z autofagią (ATG) niekoniecznie dodatnio koreluje ze skutecznym hamowaniem autofagii i jest wysoce zależna od specyficznego białka ATG, które jest wyciszone36. Po drugie, odrębne białka ATG są dodatkowo zaangażowane w szlaki inne niż autofagia, dlatego ich ablacja może również prowadzić do niepożądanych skutków ubocznych 37,38,39. Po trzecie, różne ATG mogą mieć nadmiarowe funkcje, więc knockdown jednego składnika może nie być wystarczający do zahamowania autofagii (np. beclin-1 i beclin-2)40.

Ponadto protokół elektroporacji oparty na aparacie do elektroporacji I DC jest również odpowiedni dla mRNA i może być stosowany do wielu dodatkowych typów komórek pierwotnych, takich jak PBMC25. System ten zapewnia zatem ogólną strategię dostarczania różnych gatunków RNA do różnych typów komórek pierwotnych. Podsumowując, przedstawiamy dwa protokoły hamowania strumienia autofagicznego, przy użyciu podejścia opartego na inhibitorze lub siRNA w połączeniu z późniejszym zakażeniem HSV-1 iDC. Ponadto opisujemy podejście do elektroporacji siRNA w celu indukowania strumienia autofagicznego w mDC po zakażeniu HSV-1.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Niemiecką Radę ds. Badań Naukowych (DFG) poprzez projekt STE 432/11-1 przyznany AS oraz przez program ELAN z Wydziału Lekarskiego (Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg) poprzez projekt 18-12-21-1, przyznany LG.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
4D-Nucleofector Core Unit (aparat do elektroporacji II)Lonza (Bazylea, Szwajcaria)AAF-1002B
AB-SerumSigma Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Niemcy)H4522Hodowla komórek dendrytycznych
ACD-ASigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Niemcy)9007281
Amaxa P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit L (aparat do elektroporacji II)Lonza (Bazylea, Szwajcaria)V4XP-3024
Amersham ECL Prime Western Blotting Detection ReagentGE Healthcare (Solingen, Niemcy)RPN2232Western Blot Detection
Nadsiarczan amonu (APS)Sigma Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Niemcy)A3678
anty-mysia IgG (mysza, poliklonalna, HRP)Sygnalizacja komórkowa (Leiden, Holandia)7076Western Blot detekcja
anty-królicza IgG (koza, poliklonalna, HRP)Sygnalizacja komórkowa (Leiden, Holandia)7074Wykrywanie Western Blot
Bafilomycyna A1Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Niemcy)tlrl-baf1hamowanie autofagii i degradacji lizosomalnej
Cytometr przepływowy BD FACS Canto IIBD Biosciences (Heidelberg, Niemcy)338962
BenzonazaSigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Niemcy)E1014
Komora bibułkowa Fastblot B44Biometra (Gö ttingen, Niemcy)846-015-100
CCR7 (mysz, Pe-Cy7)BioLegend (Fell, Niemcy)557648Cytometria przepływowa
Rozcieńczenie: 1:100
Klon: G043H7
CD11c (mysz, Pe-Cy5)BD Biosciences (Heidelberg, Niemcy)561692Cytometria przepływowa
Rozcieńczenie: 1:100
Klon: B-ly6
CD14 (mysz, PE)BD Biosciences (Heidelberg, Niemcy)555398Cytometria przepływowa
Rozcieńczenie: 1:100
Klon: M5E2
CD3 (mysz, FITC)BD Biosciences (Heidelberg, Niemcy)555332Cytometria przepływowa
Rozcieńczenie: 1:100
Klon: UCHT1
CD80 (mysz, V450)BD Biosciences (Heidelberg, Niemcy)560442Cytometria przepływowa
Rozcieńczenie: 1:100
Klon: L307.4
CD83 (mysz, APC)eBioscience Thermo Fisher Scientific (Langenselbold, Niemcy)17-0839-41Cytometria przepływowa
Rozcieńczenie: 1:200
Klon: HB15e
CD86 (mysz, PE)BD Biosciences (Heidelberg, Niemcy)553692Cytometria przepływowa
Rozcieńczenie: 1:100
obrazowania komórek EVOS FLAMG/Life Technologies (Karlowe Wary, USA)AMF4300
FIP200 (królik)Sygnalizacja komórkowa (Lejda), Holandia)12436Wykrywanie Western Blot
Rozcieńczenie: 1:1000
Klon: D10D11
GAPDH (mysz)Merck Millipore (Massachusetts, USA)AB2302Wykrywanie Western Blot
Rozcieńczenie: 1:5000
Klon: MAB374
Aparat Gene Pulser II (aparat do elektroporacji I)BioRad Laboratories GmbH (Mü nchen, Niemcy)165-2112
GM-CSF (4x104 U/mL)Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Niemcy)130-093-868
HLA? DR (mysz, APC-Cy7)BioLegend (Fell, Niemcy)307618Cytometria przepływowa
Rozcieńczenie: 1:200
Klon: L243
HSV-1/17+/CMV-EGFP/UL43Zakażenie BioVexDC
 
ICP0 (mysz)Santa Cruz Biotechnology (St. Cruz; Dallas, Teksas, USA)sc-53070Wykrywanie Western Blot
Rozcieńczenie: 1:1000
Klon: 11060
ICP5 (mysz)Santa Cruz Biotechnology (St. Cruz; Dallas, Teksas, USA)sc-56989Wykrywanie Western Blot
Rozcieńczenie: 1:1000
Klon: 3B6
IL-1 i beta; (0,1x106 U/ml)Cell Genix GmbH (Freiburg, Niemcy)1411-050
IL-4 (1x106 U/mL)Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Niemcy)130-093-924
IL-6 (1x106 U/mL)Cell Genix GmbH (Freiburg, Niemcy)1404-050
ImageQuant LAS 4000GE Healthcare (Solingen, Niemcy)28955810
KIF1B (mysz)Santa Cruz Biotechnology (St. Cruz; Dallas, Teksas, USA)sc-376246Wykrywanie Western Blot
Rozcieńczenie: 1:1000
Klon: E-12
KIF2A (mysz)Santa Cruz Biotechnology (St. Cruz; Dallas, Teksas, USA)sc-271471Wykrywanie Western Blot
Rozcieńczenie: 1: 1000 < br / > Klon: D-7
LC3B (królik)Sygnalizacja komórkowa (Leiden, Holandia)3868Wykrywanie Western Blot
Rozcieńczenie: 1:1000
Klon: D11
L-glutaminaLonza (Bazylea, Szwajcaria)17-605E
ŻYWY/MARTWY Naprawialny zestaw do barwienia martwych komórek FioletowyTechnologies (Carlsbad, Kalifornia, USA)L34964Barwienie L/D w cytometrii przepływowej
LymphoprepAlere Technologies AS (Oslo, Norwegia)04-03-9391/01
Chlorek magnezuCarl Roth GmbH (Karlsruhe, Niemcy)A537.1
Megafuge 2.0 RSHeraeus (Hanau, Niemcy)75015505
N, N, N', N'-tetrametyloetylendiamina (TEMED)Sigma-Aldrich Chemie GmbH ( Steinheim, Niemcy)Komora licząca T9281
NeubauerMarka (Wertheim, Niemcy)717805
Kolby do hodowli komórek Nunc (175,0 cm2)Thermo Scientific (Rockford, USA)159910
p62 (królik)Sygnalizacja komórkowa (Leiden, Holandia)88588Wykrywanie Western Blot
Rozcieńczenie: 1:1000
Klon: D5L7G
PageRuler wstępnie barwiona drabinka białkowaThermo Fisher Scientific (Langenselbold, Niemcy)26616
Paraformaldehyd, 16 %Alfa Aesar, Haverhill, Stany Zjednoczone43368.9M
PerfectSpin 24 PlusPeqlab (Erlangen, Niemcy)C2500-R-PL
PGE2 (1 mg/mL)Pfizer (Berlin, Niemcy)BE130681
Buforowany fosforanem sól fizjologiczna (PBS)Lonza (Bazylea, Szwajcaria)17-512F
System żelu białkowego MiniProtean IIBio-Rad Laboratories GmbH (Mü nchen, Niemcy)1652960
RestoreTM Western Blot Stripping BufferThermo Scientific, Rockford, USA21059
Platforma bujana wt 15Biometra (Gö ttingen, Niemcy)042-590
RotiBlockCarl Roth GmbH (Karlsruhe, Niemcy)A151.4
Roti-Load 1 (4x)Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Niemcy)K929.3
Rotiphorese Gel 30 (37.5:1)Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Niemcy)3029.1
RPMI 1640Lonza (Bazylea, Szwajcaria)12-167F
Dodecyl sodu Siarczan (SDS)Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Niemcy)2326.2
Thermomixer comfortEppendorf (Hamburg, Niemcy)5355 000.011
TNF-α (10 μ g/mL)Peprotech (Hamburg, Niemcy)300-01A
TrisCarl Roth GmbH (Karlsruhe, Niemcy)4855.3
Roztwór błękitu trypanowego (0,4%)Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Niemcy)T8154
Tween 20Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Niemcy)9127.1
Whatman 0,2 μ m Membrana nitrocelulozowaGE Healthcare (Solingen, Niemcy)10600001
WhatmanTM Bibuła chromatograficzna 3 mm ChrFisher Scientific GmbH (Schwerte, Niemcy)3030917
System Life

Bibliografia

  1. Chapuis, F., Rosenzwajg, M., Yagello, M., Ekman, M., Biberfeld, P., Gluckman, J. C. Differentiation of human dendritic cells from monocytes in vitro. European Journal of Immunology. 27 (2), 431-441 (1997).
  2. Kummer, M., et al. Herpes simplex virus type 1 induces CD83 degradation in mature dendritic cells with immediate-early kinetics via the cellular proteasome. Journal of Virology. 81 (12), 6326-6338 (2007).
  3. Kruse, M., et al. Mature dendritic cells infected with herpes simplex virus type 1 exhibit inhibited T-cell stimulatory capacity. Journal of Virology. 74 (15), 7127-7136 (2000).
  4. Salio, M., Cella, M., Suter, M., Lanzavecchia, A. Inhibition of dendritic cell maturation by herpes simplex virus. European Journal of Immunology. 29 (10), 3245-3253 (1999).
  5. Prechtel, A. T., et al. Infection of mature dendritic cells with herpes simplex virus type 1 dramatically reduces lymphoid chemokine-mediated migration. Journal of General Virology. 86, Pt 6 1645-1657 (2005).
  6. Theodoridis, A. A., Eich, C., Figdor, C. G., Steinkasserer, A. Infection of dendritic cells with herpes simplex virus type 1 induces rapid degradation of CYTIP, thereby modulating adhesion and migration. Blood. 118 (1), 107-115 (2011).
  7. Cohrs, R. J., Gilden, D. H. Human herpesvirus latency. Brain Pathology. 11 (4), 465-474 (2001).
  8. Grinde, B. Herpesviruses: latency and reactivation - viral strategies and host response. Journal of Oral Microbiology. 5, (2013).
  9. Whitley, R. J., Roizman, B. Herpes simplex virus infections. The Lancet. 357 (9267), 1513-1518 (2001).
  10. Turan, A., et al. Autophagic degradation of lamins facilitates the nuclear egress of herpes simplex virus type 1. The Journal of Cell Biology. 218 (2), 508-523 (2019).
  11. Takeshige, K., Baba, M., Tsuboi, S., Noda, T., Ohsumi, Y. Autophagy in yeast demonstrated with proteinase-deficient mutants and conditions for its induction. The Journal of Cell Biology. 119 (2), 301-311 (1992).
  12. Yin, Z., Pascual, C., Klionsky, D. J. Autophagy: machinery and regulation. Microbial Cell. 3 (12), 588-596 (2016).
  13. Bodemann, B. O., et al. RalB and the exocyst mediate the cellular starvation response by direct activation of autophagosome assembly. Cell. 144 (2), 253-267 (2011).
  14. Bjorkoy, G., et al. p62/SQSTM1 forms protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect on huntingtin-induced cell death. The Journal of Cell Biology. 171 (4), 603-614 (2005).
  15. Kabeya, Y., et al. LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing. The EMBO Journal. 19 (21), 5720-5728 (2000).
  16. Kabeya, Y., Mizushima, N., Yamamoto, A., Oshitani-Okamoto, S., Ohsumi, Y., Yoshimori, T. LC3, GABARAP and GATE16 localize to autophagosomal membrane depending on form-II formation. Journal of Cell Science. 117, Pt 13 2805-2812 (2004).
  17. Pankiv, S., et al. p62/SQSTM1 binds directly to Atg8/LC3 to facilitate degradation of ubiquitinated protein aggregates by autophagy. The Journal of Biological Chemistry. 282 (33), 24131-24145 (2007).
  18. Korolchuk, V. I., Rubinsztein, D. C. Regulation of autophagy by lysosomal positioning. Autophagy. 7 (8), 927-928 (2011).
  19. Li, Y., et al. A cell-based quantitative high-throughput image screening identified novel autophagy modulators. Pharmacological Research. 110, 35-49 (2016).
  20. Pampaloni, F., et al. A Novel Cellular Spheroid-Based Autophagy Screen Applying Live Fluorescence Microscopy Identifies Nonactin as a Strong Inducer of Autophagosomal Turnover. SLAS Discovery. 22 (5), 558-570 (2017).
  21. Deng, Y., Zhu, L., Cai, H., Wang, G., Liu, B. Autophagic compound database: A resource connecting autophagy-modulating compounds, their potential targets and relevant diseases. Cell Proliferation. 51 (3), 12403(2018).
  22. Liu, J., et al. Beclin1 controls the levels of p53 by regulating the deubiquitination activity of USP10 and USP13. Cell. 147 (1), 223-234 (2011).
  23. Mauvezin, C., Neufeld, T. P. Bafilomycin A1 disrupts autophagic flux by inhibiting both V-ATPase-dependent acidification and Ca-P60A/SERCA-dependent autophagosome-lysosome fusion. Autophagy. 11 (8), 1437-1438 (2015).
  24. Yoshimori, T., Yamamoto, A., Moriyama, Y., Futai, M., Tashiro, Y. Bafilomycin A1, a specific inhibitor of vacuolar-type H(+)-ATPase, inhibits acidification and protein degradation in lysosomes of cultured cells. Journal of Biological Chemistry. 266 (26), 17707-17712 (1991).
  25. Gerer, K. F., Hoyer, S., Dorrie, J., Schaft, N. Electroporation of mRNA as Universal Technology Platform to Transfect a Variety of Primary Cells with Antigens and Functional Proteins. Methods in Molecular Biology. 1499, 165-178 (2017).
  26. Prechtel, A. T., Turza, N. M., Theodoridis, A. A., Steinkasserer, A. CD83 knockdown in monocyte-derived dendritic cells by small interfering RNA leads to a diminished T cell stimulation. The Journal of Immunology. 178 (9), 5454-5464 (2007).
  27. Pfeiffer, I. A., et al. Leukoreduction system chambers are an efficient, valid, and economic source of functional monocyte-derived dendritic cells and lymphocytes. Immunobiology. 218 (11), 1392-1401 (2013).
  28. Villadangos, J. A., Heath, W. R. Life cycle, migration and antigen presenting functions of spleen and lymph node dendritic cells: limitations of the Langerhans cells paradigm. Seminars in Immunology. 17 (4), 262-272 (2005).
  29. Lechmann, M., Berchtold, S., Hauber, J., Steinkasserer, A. CD83 on dendritic cells: more than just a marker for maturation. Trends in Immunology. 23 (6), 273-275 (2002).
  30. Yang, Y. P., et al. Application and interpretation of current autophagy inhibitors and activators. Acta Pharmacologica Sinica. 34 (5), 625-635 (2013).
  31. Redmann, M., et al. Inhibition of autophagy with bafilomycin and chloroquine decreases mitochondrial quality and bioenergetic function in primary neurons. Redox Biology. 11, 73-81 (2017).
  32. Yan, Y., et al. Bafilomycin A1 induces caspase-independent cell death in hepatocellular carcinoma cells via targeting of autophagy and MAPK pathways. Scientific Reports. 6, 37052(2016).
  33. Hale, C. M., et al. Identification of modulators of autophagic flux in an image-based high content siRNA screen. Autophagy. 12 (4), 713-726 (2016).
  34. Lipinski, M. M., et al. A genome-wide siRNA screen reveals multiple mTORC1 independent signaling pathways regulating autophagy under normal nutritional conditions. Developmental Cell. 18 (6), 1041-1052 (2010).
  35. Orvedahl, A., et al. Image-based genome-wide siRNA screen identifies selective autophagy factors. Nature. 480 (7375), 113-117 (2011).
  36. Staskiewicz, L., Thorburn, J., Morgan, M. J., Thorburn, A. Inhibiting autophagy by shRNA knockdown: cautions and recommendations. Autophagy. 9 (10), 1449-1450 (2013).
  37. Lee, I. H., et al. Atg7 modulates p53 activity to regulate cell cycle and survival during metabolic stress. Science. 336 (6078), 225-228 (2012).
  38. Fremont, S., Gerard, A., Galloux, M., Janvier, K., Karess, R. E., Berlioz-Torrent, C. Beclin-1 is required for chromosome congression and proper outer kinetochore assembly. EMBO Reports. 14 (4), 364-372 (2013).
  39. Bestebroer, J., V'kovski, P., Mauthe, M., Reggiori, F. Hidden behind autophagy: the unconventional roles of ATG proteins. Traffic. 14 (10), 1029-1041 (2013).
  40. Galluzzi, L., Kroemer, G. Common and divergent functions of Beclin 1 and Beclin 2. Cell Research. 23 (12), 1341-1342 (2013).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Modulacja autofagiizaka enie HSV 1wyciszenie FIP200analiza Western blotcytometria przep ywowaywotno kom rekekspresja bia ekprotok elektroporacji
Elektroporacja siRNA w celu modulacji autofagii w komórkach dendrytycznych pochodzących z monocytów zakażonych wirusem opryszczki pospolitej typu 1
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.