Analiza funkcji komórek satelitarnych podczas regeneracji mięśni szkieletowych przez uszkodzenie kardiotoksyny i wstrzyknięcie samodostarczającego siRNA in vivo

Podsumowanie

Opisujemy metodę in vivo do badania funkcjonalnej utraty określonego genu w komórkach satelitarnych za pomocą kombinacji uszkodzenia mięśni szkieletowych za pośrednictwem kardiotoksyny i wstrzyknięcia samodostarczającego siRNA.

Streszczenie

Mięśnie szkieletowe posiadają ogromną zdolność do regeneracji po urazach. Proces ten jest napędzany głównie przez komórki macierzyste mięśni, zwane również komórkami satelitarnymi. Komórki satelitarne charakteryzują się ekspresją czynnika transkrypcyjnego Pax7 i ich lokalizacją pod blaszką podstawną w spoczynkowych mięśniach szkieletowych. Po uszkodzeniu komórki satelitarne ulegają aktywacji, ulegają samoodnowie lub różnicowaniu, tworząc nowe włókna mięśniowe lub łącząc się z uszkodzonymi. Funkcjonalność komórek satelitarnych in vivo można badać za pomocą opartego na kardiotoksynach modelu uszkodzenia mięśni szkieletowych. Do badania funkcji jednego genu podczas regeneracji mięśni szkieletowych najczęściej wykorzystuje się transgeniczne modele myszy. W tym miejscu przedstawiamy alternatywną dla myszy transgenicznych metodę, aby zbadać funkcję genów w komórkach satelitarnych podczas regeneracji, np. w przypadkach, gdy myszy transgeniczne nie są dostępne. Łączymy uszkodzenie określonego mięśnia szkieletowego za pośrednictwem kardiotoksyny z wstrzyknięciem samodostarczającego się siRNA do regenerującego się mięśnia, który jest następnie pobierany przez komórki satelitarne między innymi przez komórki. W ten sposób udostępniamy metodę analizy funkcji genów w komórkach satelitarnych podczas regeneracji w warunkach fizjologicznych bez konieczności stosowania myszy transgenicznych.

Wprowadzenie

Mięśnie szkieletowe to największa tkanka ciała stanowiąca około 40% całkowitej masy ciała, umożliwiająca dobrowolne poruszanie się. Architektura tkankowa mięśni szkieletowych składa się głównie z postmitotycznych, terminalnie zróżnicowanych, wielojądrowych włókien mięśniowych, a także różnych innych komórek obwodowego układu nerwowego, układu naczyniowego i komórek śródmiąższowych¹. Co ważne, mięśnie szkieletowe mają ogromną zdolność do regeneracji i przywracania funkcji po urazie lub uszkodzeniu². Proces ten zależy od komórek macierzystych mięśni rezydujących w tkance, zwanych również komórkami satelitarnymi^3,4. Komórki satelitarne znajdują się między włóknem mięśniowym a blaszką podstawy i charakteryzują się ekspresją czynnika transkrypcyjnego Pax7^5,6,7. W warunkach homeostatycznych komórki satelitarne są w stanie spoczynku, ale aktywują się z powodu urazu, np. poprzez ekscentryczne ćwiczenia lub eksperymentalnie poprzez wstrzyknięcie kardiotoksyny jadu węża^6,8. Po aktywacji, dodatnie komórki satelitarne Pax7 wykazują koekspresję MyoD i Myf5, co angażuje komórki macierzyste w różnicowanie miogenne. Komórki satelitarne, które są odporne na regulację w górę czynników zaangażowania, zachowają swój potencjał macierzysty i powrócą do stanu spoczynku, aby uzupełnić pulę komórek macierzystych na przyszłe potrzeby. Po rozszerzeniu puli miogennych progenitorów, sieci transkrypcyjne są aktywowane przez czynniki różnicujące, takie jak miogenina, aby zainicjować wyjście z cyklu komórkowego i końcowe różnicowanie. Te mioprogenitory następnie łączą się ze sobą lub z istniejącymi włóknami mięśniowymi, przyczyniając się do utrzymania wielkości domeny mięśniowo-jądrowej. Włókna mięśniowe wyrażają końcowe geny różnicowania mięśni, takie jak ciężki łańcuch miozyny. Wreszcie, nowo powstałe włókna mięśniowe rosną i dojrzewają, aby zbudować jednostki funkcjonalne mięśni szkieletowych^9,10.

Na regenerację mięśni szkieletowych mogą wpływać różne warunki, w tym choroby mięśni lub starzenie się^11,12, począwszy od łagodnych upośledzeń do stanów zagrażających życiu, np. w dystrofii mięśniowej Duchenne'a^13,14. Dlatego medycyna regeneracyjna ma na celu odbudowę uszkodzonej lub nieprawidłowo działającej tkanki mięśni szkieletowych przy użyciu jej wrodzonej mocy regeneracyjnej poprzez ukierunkowanie na funkcję komórki satelitarnej^15,16. Aby w pełni wykorzystać jego potencjał, konieczne jest kompleksowe poznanie komórek satelitarnych w ich endogennej niszy podczas regeneracji mięśni szkieletowych. Chociaż istnieją eksperymentalne podejścia do izolowania komórek satelitarnych sąsiadujących z ich włóknami mięśniowymi¹⁷, pełna złożoność komórkowych i systemowych interakcji komórek satelitarnych z ich otoczeniem może być podsumowana tylko in vivo. W związku z tym ogromna wiedza na temat regeneracji mięśni szkieletowych została zdobyta za pomocą modeli urazów myszy^2,18.

Tutaj przedstawiamy specyficzny eksperymentalny model uszkodzeń myszy do badania regeneracji za pośrednictwem komórek macierzystych wywołanych przez kardiotoksynę uszkodzeń mięśnia piszczelowego przedniego in vivo. Kardiotoksyna, cytolityczna toksyna pochodząca z węża, która powoduje depolaryzację i martwicę włókien mięśniowych, jest wstrzykiwana do mięśnia piszczelowego przedniego, co z kolei wywoła degenerację tkanek, a następnie regenerację. Aby przeanalizować funkcję genów podczas ostrej regeneracji, samodostarczające się siRNA są wstrzykiwane w 3 dniu po urazie, w szczycie ekspansji komórki satelitarnej. Zwierzęta doświadczalne są uśmiercane w różnych punktach czasowych i pobierane są mięśnie piszczelowe przednie. Wypreparowane mięśnie są zamrażane i przetwarzane do dalszej kriosekcji. Mikroskopia immunofluorescencyjna jest następnie wykorzystywana do analizy markerów regeneracji. Metoda ta pozwala na badanie funkcji pojedynczego genu podczas sterowanej komórkami satelitarnymi regeneracji mięśni szkieletowych przy użyciu myszy typu dzikiego.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Departament Opieki nad Zwierzętami Thüringer Landesamt für Lebensmittelsicherheit und Verbraucherschutz (03-048/16; TLV; Bad Langensalza, Niemcy).

1. Uraz mięśni wywołany kardiotoksyną

UWAGA: Wykonuj wszystkie eksperymenty z udziałem żywych myszy zgodnie z krajową ustawą o ochronie zwierząt i w odpowiednich warunkach aseptycznych. Również składanie ofiar ze zwierząt musi odbywać się zgodnie z krajową ustawą o dobrostanie zwierząt.

1. Zdezynfekować pojemnik inhalacyjny używany do znieczulenia wziewnego oraz obszar operacyjny 70% etanolem. Umieść sterylną ściereczkę chirurgiczną na poduszce grzewczej, w której odbędzie się operacja.
2. Włącz poduszkę grzewczą w temperaturze 37 °C.
3. Leki przeciwbólowe (np. meloksykam w dawce 1 mg/kg masy ciała należy podać podskórnie) 15 minut przed rozpoczęciem zabiegu.
   nuta: Do typowego eksperymentu użyj myszy, które mają co najmniej 6 tygodni, są dopasowane płciowo i mają dobrą ogólną kondycję fizyczną.
4. Przygotować roztwór kardiotoksyny (20 μM w 0,9 % NaCl), przechowywać roztwór w temperaturze -20 °C.
5. Pozwól, aby roztwór kardiotoksyny osiągnął temperaturę pokojową (RT).
6. Przenieść mysz do komory inhalacyjnej i wywołać znieczulenie izofluranem (inicjacja 3,5 – 5 % w czystym tlenie). Sprawdź głębokość znieczulenia przy braku reakcji na uszczypnięcie palca u nogi.
7. Umieść mysz na czystym ręczniku papierowym i utrzymuj znieczulenie za pomocą maski na nos (1,5 – 3 % izofluranu w czystym tlenie). Ogolić obszar wstrzyknięcia w dolnej części nogi czaszki (od kolana do łapy, Rysunek 1A). Usuń nadmiar luźnych włosów.
   nuta: Fizyczne oddzielenie obszaru golenia i iniekcji w pomieszczeniu zapewni bardziej sterylne warunki do wstrzykiwań.
8. Umieść mysz w bocznej pozycji leżącej na poduszce grzewczej pokrytej sterylną ściereczką chirurgiczną i utrzymuj znieczulenie za pomocą maski na nos (1,5 – 3% izofluranu w czystym tlenie).
9. Zdezynfekować obszar wstrzyknięcia podudzia czaszki (od kolana do łapy) 70% etanolem.
10. Przed rozpoczęciem wstrzyknięcia domięśniowego należy uszczypnąć palec u nogi, aby zapewnić odpowiednią głębokość znieczulenia.
11. Wstrzyknąć 50 μl kardiotoksyny (20 μM w 0,9% NaCl) do mięśnia piszczelowego przedniego za pomocą strzykawki insulinowej z igłą o rozmiarze 29G. Najpierw przebij skórę tuż po dystalnej stronie kolana.
12. Wbij igłę całkowicie w mięsień (w orientacji włókien mięśniowych/równolegle do kości piszczelowej) i powoli wstrzyknij kardiotoksynę (10-20 s) wzdłuż całej długości mięśnia, przesuwając igłę do przodu iz powrotem, aby umożliwić równomierne rozprowadzenie kardiotoksyny, uszkadzając w ten sposób cały mięsień piszczelowy przedni (Rysunek 1B,C).
    nuta: Uszkadzając mięsień piszczelowy przedni tylko z jednej nogi, przeciwległy mięsień piszczelowy przedni może służyć jako kontrola wewnętrzna w celu ustalenia, czy mięśnie szkieletowe nie były patologicznie dotknięte przed uszkodzeniem kardiotoksyny.
13. Przenieś mysz z powrotem do klatki umieszczonej na poduszce grzewczej i monitoruj proces rekonwalescencji, aż zwierzę odzyska przytomność i zacznie chodzić.
    nuta: Myszy będą wykazywać tylko lekkie utykanie. Jeśli myszy mocno kuleją i w ogóle nie obciążają nogi, poświęć mysz.
14. Leki przeciwbólowe należy podawać przez kolejne 2 dni (np. meloksykam w dawce 1 mg/kg masy ciała podskórnie, co 24 godziny) i monitorować je co tydzień.

2. Wstrzyknięcie samodostarczającego siRNA do regenerującego się mięśnia piszczelowego przedniego (w 3 dniu po urazie kardiotoksyny)

1. Przygotuj roztwór siRNA, ponownie zawieszając siRNA (np. siRNA smart pool) w 0,9% NaCl (końcowe stężenie 2 μg/μL) zgodnie z instrukcją producenta.
   nuta: SiRNA jest chemicznie modyfikowany, aby ułatwić bierne pobieranie przez komórki i chronić je przed degradacją nukleazy. Nie są potrzebne żadne odczynniki do transfekcji, co zmniejsza toksyczność. Wykorzystanie inteligentnej puli czterech niezależnych sekwencji siRNA ukierunkowanych na ten sam gen zwiększa skuteczność knockdownu.
2. Przechowywać siRNA w temperaturze -20 °C i przenieść je na lodzie do sali operacyjnej.
3. Zdezynfekować pojemnik inhalacyjny używany do znieczulenia wziewnego oraz obszar operacyjny 70% etanolem. Umieść sterylną ściereczkę chirurgiczną na poduszce grzewczej, w której odbędzie się operacja.
4. Włącz poduszkę grzewczą w temperaturze 37 °C.
5. Przenieść mysz do pojemnika inhalacyjnego i wywołać znieczulenie izofluranem (inicjacja 3,5 – 5% w czystym tlenie). Sprawdź głębokość znieczulenia przy braku reakcji na uszczypnięcie palca u nogi.
6. Umieść mysz w bocznej pozycji leżącej na poduszce grzewczej pokrytej sterylną ściereczką chirurgiczną i utrzymuj znieczulenie za pomocą maski na nos (1,5 – 3% izofluranu w czystym tlenie).
7. Zdezynfekować miejsce wstrzyknięcia w dolnej części nogi czaszki (od kolana do łapy).
8. Przed rozpoczęciem wstrzyknięcia domięśniowego należy uszczypnąć palec u nogi, aby zapewnić odpowiednią głębokość znieczulenia.
9. Wstrzyknąć do 50 μl roztworu siRNA (łącznie do 100 μg w 0,9% NaCl; skierowane przeciwko genowi docelowemu; użyć zaszyfrowanego siRNA jako kontroli) do uszkodzonego mięśnia piszczelowego przedniego za pomocą strzykawki insulinowej z igłą 29 G. Najpierw przebij skórę tuż po dystalnej stronie kolana, a następnie wbij igłę w mięsień piszczelowy przedni.
10. Wbij igłę całkowicie w mięsień (w orientacji włókien mięśniowych/równolegle do kości piszczelowej) i powoli wstrzyknij roztwór siRNA (10 – 20 s) wzdłuż całej długości mięśnia, przesuwając igłę do przodu iz powrotem, aby umożliwić równomierne rozprowadzenie siRNA wzdłuż całego mięśnia piszczelowego przedniego.
11. Przenieś mysz z powrotem do klatki umieszczonej na poduszce grzewczej i monitoruj proces rekonwalescencji, aż zwierzę odzyska przytomność i zacznie chodzić.
    nuta: Analgezja niekoniecznie występuje po wstrzyknięciu siRNA.

3. Rozwarstwienie mięśnia piszczelowego przedniego

1. Przygotuj roztwór do zamrażania (2 części związku OCT i 1 część 30% sacharozy w wodzie dejonizowanej) co najmniej 12 godzin przed użyciem, aby uniknąć pęcherzyków powietrza.
2. Przygotuj foremki do zamrażania, owijając folię aluminiową wokół ołówka i uszczelniając ją taśmą. Ważne jest, aby spód formy zapewniał równą, zamkniętą powierzchnię.
   nuta: Mniejsze formy zamrażające pozwalają na szybsze zamrożenie mięśnia, unikając artefaktów zamrażania.
3. Poświęcić mysz, np. przez wdychanie CO₂ , w odpowiednim punkcie regeneracji i spryskać całą mysz i narzędzia preparacyjne 70% etanolem.
   nuta: Zwichnięcie szyjki macicy można zastosować ponadto, aby uniknąć nadmiernego krwawienia z nogi podczas izolowania mięśnia piszczelowego przedniego.
4. Usuń sierść i skórę z uszkodzonej kończyny tylnej, przecinając skórę w kostce bardzo cienkimi ostrymi nożyczkami (krawędź tnąca: 13 mm) i ciągnąc skórę w kierunku kolana za pomocą kleszczy.
5. Aby odsłonić ścięgno piszczelowe przednie w kostce, pociągnij pozostałą skórę w kierunku stopy lub przetnij ostrymi nożyczkami.
   nuta: Mysz można przypiąć do płyty nośnej, aby umożliwić lepsze mocowanie.
6. Przed pobraniem mięśnia piszczelowego przedniego usuń powięź za pomocą cienkich kleszczy (Dumont 5 lub 7, prostych lub zakrzywionych). Ściśnij zamknięte kleszcze przez powięź obok kości piszczelowej przy kostce kontuzjowanej nogi (Rysunek 2A). Przesuń kleszcze w kierunku kolana, rozrywając w ten sposób powięź i odsłaniając mięsień piszczelowy przedni (Ryc. 2B).
7. Aby wyizolować mięsień piszczelowy przedni, odsłoń dystalne ścięgno i chwyć je cienkimi kleszczami (Dumont 7, zakrzywiony). Przeciąć ścięgno za pomocą nożyczek sprężynowych (krawędź tnąca: 5 mm, średnica końcówki: 0,35 mm) i pociągnąć mięsień (trzymając go przy ścięgnie) w kierunku kolana.
8. Aby zebrać mięsień piszczelowy przedni, przetnij go jak najbliżej kolana za pomocą ostrych nożyczek.
9. Przed zamrożeniem przetnij mięsień piszczelowy przedni w środkowej części brzucha mięśnia prostymi nożyczkami na dwie połówki o równej wielkości, aby umożliwić analizę obszaru środkowej części brzucha (Rysunek 2C,D).
10. Napełnij formę do zamrażania do połowy roztworem do zamrażania.
11. Włóż dwie połówki mięśnia piszczelowego przedniego do formy zamrażającej tak, aby środkowy obszar brzucha był skierowany do dolnej części formy (Rysunek 2E). Upewnij się, że przednia połowa kości piszczelowej jest włożona w pozycję pionową, opierając się o ścianę formy zamrażającej, aby uniknąć przechylenia mięśnia.
    nuta: Im więcej roztworu zamarzającego znajduje się w formie, tym dłużej potrwa zamrażanie, zwiększając w ten sposób ryzyko wystąpienia krioartefaktów.
12. Przytrzymaj formę do zamrażania za pomocą kleszczy i przenieś ją do połowy do ciekłego azotu (Rysunek 2F). Upewnij się, że podczas procesu zamrażania do formy zamrażającej nie dostaje się ciekły azot.
13. Obserwuj proces zamrażania, medium zamrażające zmienia kolor z przezroczystego na biały i staje się stałe. Zanurz formę zamrażającą w ciekłym azocie na kilka sekund i przenieś formę zamrażającą do zamrażarki o temperaturze -80 °C lub do suchego lodu w celu przyszłego przetwarzania.
14. Zamrożone mięśnie należy przechowywać w foremkach do zamrażania w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia.
    nuta: Formy do zamrażania dobrze mieszczą się w 24-dołkowych płytkach lub probówkach reakcyjnych o pojemności 1,5 ml, co pozwala na etykietowanie i uporządkowane przechowywanie.
15. Z mięśniami w foremkach do zamrażania do dalszego użytku należy obchodzić się zawsze na suchym lodzie.

4. Kriosekcja regenerującego mięśnia piszczelowego przedniego

1. Przed rozpoczęciem cięcia należy ustawić temperaturę komory kriostatu na -21 °C, temperaturę obiektu na -20 °C, a grubość cięcia na 10, 12 lub 14 μm (w zależności od przyszłych zastosowań) (Rysunek 3A).
2. Przenieś próbkę mięśni w formie zamrażającej do kriostatu i pozwól jej dostosować się do temperatury przez kilka minut. W tym czasie oznacz szkiełka mikroskopowe.
3. Usuń folię wokół osadzonego mięśnia za pomocą wstępnie schłodzonych kleszczyków wewnątrz kriostatu. Unikaj dotykania próbki, ponieważ kriomedium zaczyna się łatwo rozmrażać.
4. Zamontuj próbkę w obszarze środkowego brzucha mięśnia piszczelowego przedniego skierowanego do góry na metalowym uchwycie próbki kriostatu za pomocą kriopożywki. Gwarantuje to, że miejsce cięcia mięśnia (spód formy) jest skierowane w stronę eksperymentatora.
5. Włóż uchwyt na próbkę z zamontowaną próbką do mechanizmu tnącego.
   nuta: Aby zapewnić prawidłowe podział próbki, przed rozpoczęciem należy użyć nowego ostrza.
6. Najpierw przyciąć blok próbki (30 μm), aby uzyskać równą płaszczyznę przekroju i dotrzeć do odpowiedniego obszaru mięśnia (Rysunek 3B).
7. Po przycięciu należy wyciąć kolejne odcinki o odpowiedniej grubości (np. 14 μm).
8. Zbierz skrawki na szkiełkach mikroskopowych, przytrzymując szkiełko stroną zadrukowaną w dół nad przekrojem. Sekcja jest dołączana do slajdu (Rysunek 3C).
9. Przechowywać skrawki w temperaturze -80 °C lub -20 °C do czasu dalszego użycia lub bezpośredniego użycia do immunofluorescencji lub immunohistochemii.

5. Barwienie immunologiczne dla markerów regeneracji

1. Wszystkie dalsze kroki należy wykonać w nawilżonej komorze.
2. Krótko zrównoważyć sekcje w temperaturze pokojowej.
3. Utrwal skrawki z 1 ml 2% PFA (w PBS, pH 7,4) na szkiełko przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
4. Usuń 2% roztwór PFA, wlewając go do odpowiedniego pojemnika na odpady.
5. Płukać 3 razy 1 ml PBS (pH 7,4) przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
6. Wyjmij PBS, wlewając go do pojemnika na odpady.
7. Na szkiełko dodać 1 ml roztworu do permeabilizacji (0,1% Triton X-100, 0,1 M glicyny o pH PBS 7,4) przez 10 minut.
8. Usunąć roztwór przepuszczalny, wlewając go do pojemnika na odpady.
9. Dodać 150 μl roztworu blokującego (M.O.M. 1:40 w PBS pH 7,4) na szkiełko podstawowe i przykryć szkiełkiem nakrywkowym. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
10. Usunąć szkiełko nakrywkowe i roztwór blokujący, nałożyć 100 μl roztworu przeciwciała pierwszorzędowego [PAX7, DSHB, mysie IgG1, nierozcieńczone lub devMHC, DSHB, nierozcieńczone, mysie IgG1 i laminina (królik, 1:1,000)] na szkiełko. Przykryj szkiełkiem podstawowym. Inkubować O/N (przez noc) w temperaturze 4 °C.
    nuta: Wykonaj barwienie kontrolne, pomijając przeciwciała pierwszorzędowe, zamiast tego inkubuj sekcję z roztworem blokującym.
11. Płukać 3 razy 1 ml PBS (pH 7,4) przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
12. Usuń PBS, wlewając go do pojemnika na odpady.
13. Dodać 100 μl roztworu przeciwciał drugorzędowych (Alexa Fluor 546 kozia anty-mysia IgG1 i Alexa Fluor 488 osła anty-królicza IgG w roztworze blokującym, 1: 1,000) na szkiełko podstawowe i przykryć szkiełkiem nakrywkowym. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
14. Inkubuj szkiełka w ciemności, np. użyj folii aluminiowej do przykrycia lub użyj czarnej nawilżonej komory.
    nuta: Od tej pory wszystkie kroki powinny być wykonywane w warunkach zmniejszonego oświetlenia, ponieważ niektóre przeciwciała drugorzędowe są wrażliwe na światło.
15. Usunąć szkiełko nakrywkowe i roztwór przeciwciał drugorzędowych.
16. Płukać 3 razy 1 ml PBS (pH 7,4) przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
17. Wyjmij PBS, wlewając go do pojemnika na odpady.
18. Barwienie DAPI należy przeprowadzić, dodając 1 ml roztworu na szkiełko do końcowego stężenia 10 μg/ml przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
19. Usuń roztwór barwiący DAPI, wlewając go do pojemnika na odpady.
20. Umyć 3 razy 1 ml PBS (pH 7,4) przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
21. Całkowicie usuń PBS używany do mycia.
22. Nałożyć 2 – 3 krople wodnego podłoża mocującego i bezpośrednio przykryć szkiełko nową szkiełkiem nakrywkowym.
23. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na 1 godzinę w temperaturze RT w ciemności.
24. Zabarwione skrawki przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności do czasu dalszej analizy przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego.

6. Barwienie hematoksyliny i eozyny

1. Wszystkie dalsze kroki należy wykonać w nawilżonej komorze.
2. Utrwal skrawki z 1 ml 2% PFA (w PBS, pH 7,4) na szkiełko przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
3. Usuń 2% roztwór PFA, wlewając go do odpowiedniego pojemnika na odpady.
4. Przenieś szkiełka do słoika Coplin.
5. Delikatnie spłucz szkiełka wodą z kranu.
   nuta: Nie odkręcaj kranu zbyt wysoko, ponieważ może to spowodować uszkodzenie sekcji.
6. Przenieś szkiełka do nawilżonej komory. Usuń płyn.
7. Stosować 1 ml roztworu barwiącego Hematoksylinę (Gill No 3) przez 2 minuty.
8. Przenieś szkiełka do słoika Coplin.
9. Delikatnie spłucz szkiełka wodą z kranu, aż jądra zmienią kolor na niebieski.
   nuta: Nie odkręcaj kranu zbyt wysoko, ponieważ może to uszkodzić twoje sekcje.
10. Przenieś szkiełka do nawilżonej komory. Usuń płyn.
11. Nałożyć 1 ml roztworu Eozyny Y i inkubować przez 2 minuty.
12. Przenieś szkiełka do słoika Coplin.
13. Delikatnie opłucz szkiełka wodą z kranu, aż woda z kranu spływająca ze szkiełków będzie czysta.
14. Usuń cały płyn i pozostaw szkiełka do wyschnięcia na 2 minuty.
15. Zamocuj w podłożu montażowym odpowiednim do immunohistochemii.

Wyniki

Typowy wynik barwienia mięśnia piszczelowego przedniego za pomocą hematoksyliny i eozyny (H&E) przed i po urazie za pośrednictwem kardiotoksyny jest przedstawiony w Rysunek 4A,B. W mięśniach kontrolnych architektura mięśnia jest nienaruszona, o czym świadczy lokalizacja jąder na obrzeżach włókien mięśniowych i brak akumulacji komórek jednojądrzastych w przestrzeni śródmiąższowej (Figura 4A). 7 dni po urazie za pośrednictwem kardiotoksyny powstają nowe włókna mięśniowe, oznaczone centralnie położonymi jądrami (Ryc. 4B). Ponadto można zaobserwować nagromadzenie komórek jednojądrowych, składających się głównie z komórek satelitarnych, ale także komórek niemiogennych, takich jak komórki odpornościowe. Cały mięsień powinien być uszkodzony charakteryzujący się centralnym położeniem wszystkich mięśni i nagromadzeniem komórek jednojądrzastych na całym odcinku mięśniowym.

Aby scharakteryzować postęp i powodzenie procesu regeneracji, można przeprowadzić kilka barwień immunofluorescencyjnych za pomocą markerów regeneracji. Liczbę komórek satelitarnych można oszacować przez barwienie dla Pax7, kanonicznego markera dla komórek satelitarnych (Rysunek 4C,D). Trzy dni po urazie liczba komórek satelitarnych wzrasta (Rysunek 4D), komórki satelitarne nie znajdują się już pod blaszką podstawną. Aby dokładniej przeanalizować proces regeneracji, nowo powstałe włókna mięśniowe można wybarwić przeciwciałami skierowanymi na rozwojową miozynę (Figura 4E). Nowo powstałe włókna mięśniowe wykazują centralnie położone jądra i silną ekspresję rozwojowej miozyny. W miarę dojrzewania włókien mięśniowych zmniejsza się ekspresja rozwojowej miozyny, średnica włókna mięśniowego wzrasta, podczas gdy jądra migrują na obrzeża włókien mięśniowych.

Wpływ pojedynczego genu na proces regeneracji można badać za pomocą myszy transgenicznych lub, jak pokazano tutaj, poprzez wstrzyknięcie samodostarczającego siRNA. Znakowane fluorescencyjnie, samodostarczające się zaszyfrowane siRNA kontrolne wstrzyknięto do regenerującego się mięśnia piszczelowego przedniego w 3 dniu po urazie, w momencie, w którym proliferacja komórek satelitarnych osiąga szczyt. Dwa dni po wstrzyknięciu siRNA komórki satelitarne analizowano pod kątem obecności znakowanego fluorescencyjnie siRNA (Figura 4F). Przeanalizowaliśmy, ile komórek satelitarnych wchłonęło znakowane fluorescencyjnie siRNA dwa dni po wstrzyknięciu do regenerującego się mięśnia (Ryc. 5). Około 75% wszystkich komórek satelitarnych w regenerującym się mięśniu było dodatnich dla znakowanego fluorescencyjnie siRNA. Ponadto ustaliliśmy, że około 74% wszystkich regenerujących się włókien miologicznych było dodatnich dla znakowanego fluorescencyjnie siRNA, co sugeruje, że albo 74% regenerujących się włókien mięśniowych wchłonęło siRNA, albo że komórki satelitarne siRNA-dodatnie albo połączyły się ze sobą, tworząc nowe włókna mięśniowe, albo że nastąpiła fuzja z już istniejącymi regenerującymi się włóknami mięśniowymi (Rysunek 5). Sugeruje to, że komórki satelitarne pobierają samodostarczające się siRNA i że siRNA utrzymuje się w komórkach satelitarnych przez co najmniej dwa dni.

Rycina 1: Wstrzyknięcie kardiotoksyny do mięśnia piszczelowego przedniego. (A) Myszy są znieczulane przez wdychanie izofluranu, a kończyna dolna jest golona. (B) Igła o sile 29 G jest wstrzykiwana w mięsień piszczelowy przedni (C) i przesuwana wzdłuż kości piszczelowej podczas wstrzykiwania roztworu kardiotoksyny. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 2: Etapy związane z rozwarstwieniem i zamrożeniem uszkodzonego mięśnia piszczelowego przedniego. (A) Mięśnie kończyn tylnych są odsłonięte (B), a powięź otaczająca mięsień piszczelowy przedni jest rozrywana w celu odsłonięcia mięśnia. (C) Po usunięciu mięśnia, przecina się go w środkowej części brzucha na dwie podobne do siebie połówki za pomocą ostrych prostych nożyczek (D). (E) Połówki wyciętego mięśnia są osadzone w formie z folii aluminiowej wypełnionej roztworem zamrażającym i zamrożone w ciekłym azocie (F). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ryc. 3: Sprzęt i etapy związane z kriosekcją mięśni piszczelowych przednich. (A) Temperaturę komory kriostatu ustawia się na -21 °C. (B) Mięsień piszczelowy przedni w roztworze do zamrażania jest zamontowany na uchwycie próbki. (C) Odcinki o grubości 14 μm są przymocowane do szklanych szkiełek mikroskopowych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 4: Reprezentatywne obrazy regenerujących się mięśni piszczelowych przednich. Barwienie H&E mięśni piszczelowych przednich przed (A) i 7 dni po urazie kardiotoksyny (B). (C) W nieuszkodzonych mięśniach komórki satelitarne Pax7 dodatnie (na czerwono) znajdują się pod blaszką podstawy oznaczoną lamininą (na zielono). Jądra są barwione przeciwstawnie DAPI (na niebiesko). Dodatnie komórki Pax7 są oznaczone strzałką. (D) Po 10 dniach regeneracji włókna mięśniowe charakteryzują się centralnie położonymi jądrami (na niebiesko), Pax7 jest pokazany na czerwono, laminina na zielono. Dodatnie komórki Pax7 są oznaczone strzałką. (E) Nowo powstałe włókna mięśniowe wyrażają rozwojową miozynę (na czerwono), lamininę na zielono, jądra są barwione przeciwstawnie DAPI (na niebiesko). (F) Znakowane fluorescencyjnie samodostarczające siRNA (siRED, przedstawione na czerwono) nadal znajduje się w komórkach satelitarnych (Pax7 dodatni, na zielono, oznaczone strzałką we wstawce) 2 dni po wstrzyknięciu samodostarczającego siRNA do regenerującego się mięśnia piszczelowego przedniego (wstrzyknięcie w 3 dniu po urazie za pośrednictwem kardiotoksyny). Laminina jest pokazana w kolorze białym, jądra są wybarwione przeciwstawnie DAPI (w kolorze niebieskim). Podziałka = 100 μm (A i B), 50 μm (C-E), 25 μm (F). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 5: Kwantyfikacja wychwytu znakowanego fluorescencyjnie siRNA. (A) Kwantyfikacja wychwytu siRNA przez komórki satelitarne (komórki Pax7+) i regenerujące się włókna mięśniowe 2 dni po wstrzyknięciu do regenerujących się mięśni szkieletowych. Wstrzyknięcie wykonano w 3 dniu po urazie spowodowanym przez kardiotoksynę. n = 3, słupki błędów pokazują SEM. (B) Kwantyfikacja leżąca u podstaw wykresu przedstawionego w (A). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

W tym miejscu przedstawiamy metodę badania funkcji określonego genu podczas regeneracji mięśni szkieletowych bez konieczności stosowania zwierząt transgenicznych. Osiąga się to poprzez połączenie uszkodzenia mięśni wywołanego kardiotoksyną z wstrzyknięciem samodostarczającego się siRNA do regenerujących się mięśni szkieletowych w 3 dniu po urazie. Szczegółowo opisaliśmy procedury uszkodzenia mięśni przez kardiotoksynę, wstrzyknięcie samodostarczającego się siRNA i przetwarzanie pobranych mięśni w celu analizy postępu regeneracji. Wykazaliśmy, że wstrzyknięcie kardiotoksyny jadu węża do mięśni szkieletowych skutecznie uszkadza cały mięsień i że samodostarczające się siRNA znajdują się w około 75% wszystkich komórek satelitarnych wśród innych typów komórek dwa dni po ich wstrzyknięciu do regenerującego się mięśnia szkieletowego (ryc. 4, ryc. 5).

Szczególną uwagę należy zwrócić na jednorodne uszkodzenie mięśnia piszczelowego przedniego, ponieważ różne stopnie uszkodzenia wpływają na wynik regeneracji, a tym samym może mieć wpływ na działanie siRNA. Ponadto niezwykle ważne jest, aby cały obszar regenerujący się został wstrzyknięty w samodostarczające się siRNA. W celu analizy procesu regeneracji zaleca się, aby zawsze porównywać podobne obszary regenerującego się mięśnia szkieletowego, dlatego mięsień piszczelowy przedni należy przeciąć na pół, aby zawsze porównywać obszar środkowej brzucha mięśnia. Analizując mięsień, należy przeanalizować całą kriosekcję, ponieważ skład włókien mięśniowych różni się w mięśniu piszczelowym przednim i dlatego może się inaczej regenerować.

Funkcję komórek satelitarnych można badać za pomocą różnych procedur eksperymentalnych, w tym ich hodowli na sąsiednich izolowanych pojedynczych włóknach mięśniowych¹⁷, przeszczepu i analizy regeneracji mięśni szkieletowych po indukowanym urazie ^18,19. Badanie funkcji komórek satelitarnych za pomocą modelu uszkodzeń indukowanych in vivo, np. wstrzyknięcie kardiotoksyny, daje możliwość analizy funkcji komórek satelitarnych również pod kątem ich interakcji z innymi typami komórek, takimi jak makrofagi oraz badania wpływu czynników ogólnoustrojowych². Uszkodzenie mięśni szkieletowych można osiągnąć na różne sposoby, np. ćwiczenia ekscentryczne, zamrożenie, wstrzyknięcie BaCl₂ lub wstrzyknięcie jadów węży, takich jak kardiotoksyna lub noteksyna¹⁸. Podczas gdy ćwiczenia ekscentryczne są prawdopodobnie najbardziej fizjologiczną metodą urazu, uraz jednego konkretnego mięśnia jest ograniczony tylko^{do 20}. Urazy mrozowe mogą być stosowane, gdy celem badania jest migracja komórek satelitarnych w kierunku miejsca urazu lub powinna zostać uszkodzona tylko określona część mięśnia. Eksperymentalnie rzecz biorąc, wadą urazów spowodowanych zamarzaniem jest otwarta operacja, którą należy wykonać, aby zastosować wstępnie schłodzoną metalową sondę. Wstrzyknięcie BaCl₂ lub jadów węży jest najbardziej dramatyczną metodą uszkodzenia, a tym samym stanowi największe wyzwanie dla funkcji komórek satelitarnych. Ponadto wstrzyknięcie jest minimalnie inwazyjne, czas operacji na ogół wynosi mniej niż pięć minut i nie obejmuje szycia itp., co minimalizuje ryzyko infekcji.

Uraz mięśni jest najczęściej wykorzystywany do badania funkcjonalnych konsekwencji utraty funkcji genów, np. utraty Pax7 ^7,21. Zwłaszcza, jeśli przedmiotem pytania naukowego są myszy w podeszłym wieku, stworzenie lub wykorzystanie myszy transgenicznych jest często niewykonalne. Wstrzyknięcie samodostarczających się siRNA ukierunkowanych na określony gen jest realną alternatywą w tych przypadkach i jest z powodzeniem stosowane²². Krótko mówiąc, mięsień piszczelowy przedni myszy został uszkodzony przez wstrzyknięcie kardiotoksyny, a samodostarczające się siRNA skierowane przeciwko fibronektynie (FN) zostały wstrzyknięte w 3 dniu po urazie. Mięśnie analizowano 10 dni po urazie i zaobserwowano znaczny spadek liczby komórek satelitarnych w warunkach kontroli siFN w porównaniu z zakodowanym siRNA. Skuteczność knockdown określono w lizatach całych mięśni za pomocą ilościowego Real Time PCR 2 dni po wstrzyknięciu siRNA, osiągnięto zmniejszenie poziomów ekspresji o 58%, co sugeruje, że skuteczność dostarczania i knockdown jest wystarczająca do analiz funkcjonalnych²². Alternatywą dla badania skuteczności knockdown są analizy immunoblot lub immunofluorescencji z przeciwciałami skierowanymi przeciwko genowi docelowemu. Skuteczność i swoistość siRNA stosowanego do iniekcji in vivo należy określić przed wstrzyknięciem myszom, np. poprzez badanie skuteczności w izolowanych komórkach satelitarnych lub pierwotnych mioblastach. Zastosowanie inteligentnej puli składającej się z 4 różnych siRNA w porównaniu z pojedynczym siRNA zwiększa skuteczność knockdownu, ale także zwiększa ryzyko niespecyficznego celowania. Specyficzność wszystkich użytych sekwencji siRNA powinna być badana w hodowli komórkowej, aby uniknąć efektów niedocelowych. Jako kontrolę, należy użyć nieukierunkowanego zakodowanego siRNA, ponieważ wstrzyknięcie siRNA samo w sobie może wpłynąć na proces regeneracji z powodu wstrzyknięcia, a tym samym na dodatkowe uszkodzenie mięśnia. Punkt czasowy wstrzykiwania siRNA zależy od pytania naukowego i profilu ekspresji docelowego genu. Ogólnie rzecz biorąc, wstrzyknięcie samodostarczającego siRNA w 3 dniu po uszkodzeniu kardiotoksyny celuje w większość genów ważnych dla proliferacji komórek satelitarnych, ponieważ proliferacja komórek satelitarnych osiąga szczyt około 3 dnia po urazie. Czas na pierwsze wstrzyknięcie siRNA nie powinien być krótszy niż 48 godzin po urazie kardiotoksyny, ponieważ objętość wstrzyknięcia kardiotoksyny jest dość duża, a reabsorpcja płynu powinna nastąpić przed wstrzyknięciem dodatkowych roztworów do mięśnia. Ogólnie rzecz biorąc, możliwe jest wielokrotne wstrzyknięcie siRNA lub kombinacja różnych siRNA, chociaż należy wziąć pod uwagę, że każde wstrzyknięcie do regenerującego się mięśnia powoduje dodatkowe uszkodzenia.

Jednym z ograniczeń opisanej metody jest fakt, że obserwowany efekt niekoniecznie zależy tylko od knockdown genu docelowego w komórkach satelitarnych, ale może być przypisany innym typom komórek, takim jak komórki odpornościowe lub fibro-adipogenne komórki progenitorowe. W związku z tym konieczne jest połączenie tych eksperymentów z eksperymentami badającymi czystą populację komórek satelitarnych. Można przeprowadzić eksperymenty z użyciem pływających kultur włókien miowodnych, w których komórki satelitarne są hodowane na sąsiednich włóknach mięśniowych lub przeprowadzić eksperymenty transplantacyjne przy użyciu izolowanych komórek satelitarnych¹⁷.

Alternatywą dla wstrzykiwania samodostarczających się siRNA jest wstrzykiwanie inhibitorów drobnocząsteczkowych lub białek rekombinowanych, które można przeprowadzić, w zależności od pytania naukowego. Na przykład wstrzyknięcie białka macierzy zewnątrzkomórkowej fibronektyny lub małocząsteczkowych inhibitorów sygnalizacji JAK / STAT zostało z powodzeniem przeprowadzone u starszych myszy^15,16. Analiza określonej funkcji genu w jednym konkretnym typie komórki podczas regeneracji mięśni szkieletowych, np. w komórkach satelitarnych, jest możliwa tylko dzięki zastosowaniu indukowalnego genetycznego modelu myszy. Wstrzyknięcia samodostarczających się siRNA, rekombinowanych białek lub inhibitorów małocząsteczkowych mogą wpływać na wiele typów komórek w regenerujących się mięśniach szkieletowych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Isoflurane	Henry Schein	Isothesia	inhalacja narkotyki
Gorąca płyta 062	Labotect	13854
System anestezjologiczny (Tec 7) z pudłem inhalacyjnym + maski na nos	Tem	Sega Minihub
Golarka dla gryzoni	isis	GT420
Cardiotoxin	Latoxan	L8102	jad węża potrzebny do kontuzji mięśni
Accell siRNA inteligentna pula	Dharmacon	w zależności od docelowego genu	samodostarczającego siRNA
Alexa Fluor 488 osioł anty-królik IgG	Thermo Fisher	A-21206	wtórne
Alexa Fluor 546 kozie przeciwciało przeciw myszom IgG1	Thermo Fisher	A-21123	przeciwciało wtórne
Szkiełka nakrywkowe	VWR	631-1574
CV Mount	Leica	14046430011	podłoże montażowe do immunohistochemii
DAPI	Sigma Aldrich	D9542	marker jądrowy
devMHC przeciwciało	DHSB	F.1652
Eosin Y	Thermo Fisher	73104
Hematoksylina Gill No3	Sigma-Aldrich	GHS316-500ML
Strzykawka insulinowa (29 g)	Terumo	3SS05M2813	strzykawka używana do iniekcji mięśniowych
Przeciwciało lamininowe	Sigma Aldrich	L9393
Odczynnik blokujący M.O.M	Vector labs	MKB-2213	blokujący barwienie immunofluorescencyjne
Meloksykam	Boehringer Ingelheim	Metacam	leki przeciwbólowe
OCT	Thermo Fisher	6502	osadzanie w tkankach
przeciwciało Pax7	DSHB	Przeciwciało	swoiste dla komórek satelitarnych
ProLong Gold Antifade Mountant	Thermo Fisher	P36934	podłoże montażowe aequos
Sacharoza	Carl Roth	4621.1	zatapiania tkanek
Szkiełka mikroskopowe	Superfrost plus	Thermo	J1830AMNZ
TritonX-100	Odczynnik
Narzędzia do preparacji
Dumont 5, proste	Fine Science Tools	11295-10
Dumont 7, zakrzywione	Fine Science Tools	11272-40
Bardzo cienkie nożyczki Bonn (krawędź tnąca: 13  mm)	Fine Science Tools	14084-08
Kleszcze o wąskim wzorze	Fine Science Tools	11002-16
Nożyczki sprężynowe (krawędź tnąca: 5  mm, średnica końcówki: 0,35  mm)	Narzędzia do nauki pięknej	91500-09