Prezentujemy metodologię izolacji mysich miocytów oraz sposób uzyskiwania śladów napięcia lub wapnia jednocześnie ze śladami skracania sarkomeru za pomocą fotometrii fluorescencyjnej z jednoczesnymi cyfrowymi pomiarami geometrii komórek.
Artykuł metodologiczny
Obrazowanie optyczne izolowanych mysich miocytów komorowych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Zdolność do izolowania dorosłych miocytów serca pozwoliła naukowcom na badanie różnych patologii serca na poziomie pojedynczej komórki. Podczas gdy postęp w dziedzinie barwników wrażliwych na wapń pozwolił na solidny zapis optyczny dynamiki wapnia w pojedynczej komórce, rejestracja solidnych transbłonowych sygnałów napięcia optycznego pozostała trudna. Prawdopodobnie wynika to z niskiego stosunku pojedynczego do szumu, fototoksyczności i fotowybielania tradycyjnych barwników potencjometrycznych. W związku z tym pomiary napięcia w pojedynczych ogniwach od dawna ograniczają się do techniki zacisku krosowego, która, choć jest złotym standardem, jest technicznie wymagająca i ma niską przepustowość. Jednak dzięki opracowaniu nowych barwników potencjometrycznych można uzyskać duże, szybkie reakcje optyczne na zmiany napięcia przy niewielkiej lub zerowej fototoksyczności i fotowybielaniu. Protokół ten szczegółowo opisuje, jak wyizolować dorosłe mysie miocyty, które można wykorzystać do skracania komórek, pomiaru wapnia i napięcia optycznego. W szczególności protokół opisuje, jak używać ratiometrycznego barwnika wapniowego, barwnika wapniowego z pojedynczym wzbudzeniem i barwnika z pojedynczym napięciem wzbudzenia. Podejście to można wykorzystać do oceny kardiotoksyczności i arytmogenności różnych czynników chemicznych. Chociaż fototoksyczność jest nadal problemem na poziomie pojedynczej komórki, omówiono metodologię jej ograniczania.
Wprowadzenie
Aby badać serce w stanach zdrowych i patologicznych, często przydatne jest badanie fenotypu na poziomie pojedynczej komórki. Podczas gdy postęp naukowy pozwolił na solidny pomiar dynamiki wapnia w pojedynczej komórce, pomiary napięcia optycznego w pojedynczej komórce pozostały rzadkie1. Prawdopodobnie jest to spowodowane niskim stosunkiem sygnału do szumu (SNR), fototoksycznością i fotowybielaniem tradycyjnych barwników potencjometrycznych2,3. Niemniej jednak uzyskano izolowane potencjały czynnościowe optyczne miocytów2,3,4. Ponadto, dzięki postępom w chemii i fizyce barwników wrażliwych na napięcie, SNR poprawił się5. Nowsze sondy potencjału błonowego (tabela materiałów) reagują na zmiany potencjału błonowego w ciągu submilisekund i mają zakres odpowiedzi fluorogenicznej wynoszący około 25% na 100 mV. Ponadto wzbudzenie/emisja zestawu potencjału błonowego (np. FluoVolt; Tabela materiałów) używany w tym protokole działa ze standardowymi ustawieniami izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC) lub białka zielonej fluorescencji (GFP)6.
Widma wzbudzenia/emisji FITC i GFP pokrywają się z widmami fluo-4 związanymi z wapniem7. Jednoczesna akwizycja fotometrii fluorescencyjnej z cyfrowymi pomiarami geometrii komórki była tradycyjnie stosowana do jednoczesnego pozyskiwania pomiarów wapnia i skracania komórek8. Protokół ten szczegółowo opisuje, jak izolować mysie miocyty i jak rejestrować sygnały wapnia lub napięcia przy użyciu standardowych ustawień FITC. Dodatkowo opisano, w jaki sposób prosty przełącznik w filtrach wzbudzenia/emisji na stacji roboczej do obrazowania może być wykorzystany do uzyskania pomiarów wapnia i skracania przy użyciu wskaźnika metrycznego barwnika wapnia fura-2. W porównaniu do fluo-4, fura-2 ma większe powinowactwo do wapnia i jest stosunkowo odporna na fotowybielanie9. W związku z tym, przy użyciu jednej stacji roboczej, protokół ten pozwala na dokładne zbadanie sprzężenia pobudzenia i skurczu miocytów pojedynczo.
Protokół
Wszystkie metody i procedury opisane w tym protokole zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) Uniwersytetu Case Western Reserve.
1. Przygotowanie roztworów, instrumentów i szkiełek nakrywkowych
UWAGA: 1x roztwory mogą być używane przez okres do miesiąca.
- Przygotować 10x bufor Krebs-Henseleit bufor HEPES bez wapnia (KHB-HB) dodając 68,96 g NaCl, 3,57 g KCl, 59,58 g HEPES, 2,18 g K2HPO4, 3,08 gMgSO4 i 19,82 g glukozy do 800 ml podwójnie destylowanej wody w kolbie o pojemności 1 000 ml. Po całkowitym rozpuszczeniu zawartości uzupełnić objętość w kolbie miarowej o pojemności 1 000 ml.
UWAGA: Tradycyjny roztwór Krebs Henseleit wykorzystuje wodorowęglan sodu jako bufor, a roztwór w tym protokole wykorzystuje roztwór Krebs Henseleit z buforem HEPES. Roztwór jest stabilny przez 6 miesięcy, jeśli jest sterylnie przefiltrowany. - Przygotować 10x roztwór Tyrode'a, dodając 86,51 g NaCl, 0,552 g NaH2PO4, 2,03 g MgCl2, 9,91 g glukozy, 4,03 g KCl, 2,65 g CaCl 2 i 35,76 g HEPES do 800 ml podwójnie destylowanej wody w kolbie o pojemności 1000 ml. Po całkowitym rozpuszczeniu zawartości uzupełnić objętość w kolbie miarowej o pojemności 1000 ml.
UWAGA: Roztwór jest stabilny przez 6 miesięcy, jeśli jest sterylnie przefiltrowany. - Przygotuj 1x KHB-HB, odmierzając 100 ml 10x bulionu i dodając do 875 ml podwójnie destylowanej wody w kolbie o pojemności 1,000 ml. Umieścić kolbę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Gdy roztwór osiągnie 37 °C, użyj NaOH, aby zwiększyć pH do 7,39. Po dostosowaniu pH doprowadzić roztwór do objętości w kolbie miarowej o pojemności 1000 ml. Sterylnie przefiltrować roztwór za pomocą systemu filtracji próżniowej.
- Przygotuj 1x roztwór Tyrode'a, odmierzając 100 ml 10x bulionu i dodając do 875 ml podwójnie destylowanej wody w kolbie o pojemności 1,000 ml. Umieścić kolbę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Gdy roztwór osiągnie 37 °C, użyj NaOH, aby zwiększyć pH do 7,39. Po dostosowaniu pH doprowadzić roztwór do objętości w kolbie miarowej o pojemności 1 000 ml. Sterylny filtr wykorzystujący system filtracji próżniowej.
- Przygotuj 1x zmodyfikowany roztwór Tyrode'a, odmierzając 100 ml 10x bulionu i dodając do 875 ml podwójnie destylowanej wody w kolbie o pojemności 1,000 ml. Rozpuścić 3,07 g zredukowanego L-glutationu w kolbie. Umieścić kolbę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Gdy roztwór osiągnie 37 °C, użyj NaOH, aby zwiększyć pH do 7,39. Po dostosowaniu pH doprowadzić roztwór do objętości w kolbie miarowej o pojemności 1 000 ml. Sterylnie przefiltrować roztwór za pomocą systemu filtracji próżniowej.
- Przygotować 100 mM roztworu podstawowego blibstatyny, dodając 855 μl dimetylosulfotlenku (DMSO) do 25 mg proszku. Porcjować w odstępach co 20 μl i przechowywać w zamrażarce w temperaturze -80 °C przez okres do sześciu miesięcy.
- Sporządzić bufor zatrzymujący, dodając 2 g albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i 1 fiolkę podzielonego bulionu z blibstatyną do 100 ml 1x KHB-HB i sterylnie przefiltrować roztwór za pomocą systemu filtracji próżniowej.
- Sporządzić bufor do posiewu, dodając 5 ml płodowej surowicy bydlęcej i 1 fiolkę podzielonego bulionu z blibstatyną do 95 ml M199 HEPES. Sterylnie przefiltrować roztwór za pomocą systemu filtracji próżniowej.
- Sporządzić bufor do hodowli miocytów, dodając jedną 1 fiolkę z podzielonego bulionu blebbistatyny i 4 ml penicyliny-streptomycyny do 396 ml M199 (25 mM HEPES). Sterylnie przefiltrować roztwór za pomocą systemu filtracji próżniowej.
- Autoklaw 2 pary pęset Dumont, 2 pary zakrzywionych nożyczek Iris, 2 hemostatyki, jedną parę kleszczy chirurgii plastycznej, 6 czarnych plecionych jedwabnych szwów 4-0 ułożonych do użycia jako chirurgiczny węzeł dwurzutowy i cztery zlewki o pojemności 100 ml.
- Wysterylizuj 22 x 22 mm2 szklane szkiełka nakrywkowe. Najpierw umieść pojedyncze szkiełko nakrywkowe w każdym dołku płytki sześciodołkowej. Następnie, po zdjęciu pokrywy, włącz lampę UV w szafie bezpieczeństwa biologicznego i wystaw szkiełka nakrywkowe na działanie światła UV przez 1 godzinę.
- Przygotuj roboczy roztwór podstawowy laminy, najpierw rozmrażając butelkę na lodzie. Dodać zawartość jednej butelki do wystarczającej ilości zimnego, sterylnego, buforowanego fosforanem soli fizjologicznej (PBS), aby osiągnąć końcowe stężenie 0,04 mg/ml. Porcjować 1,3 μl do autoklawowanych probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml. Przechowywać w temperaturze -80 °C.
UWAGA: Każda probówka zawiera wystarczającą ilość lamininy na pojedynczą płytkę sześciodołkową. Unikaj wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania. - Pokryj wysterylizowane szkiełko nakrywkowe, najpierw rozmrażając roboczy roztwór lamininy na lodzie. Za pomocą pipety P1000 odessać 200 μl lamininy. Delikatnie przeciągnij końcówkę pipety wzdłuż jednej krawędzi szkiełka nakrywkowego, aby umożliwić działanie kapilarne w celu wyciągnięcia niewielkiej ilości lamininy, aby ułatwić przymocowanie szkiełka nakrywkowego do płytki sześciodołkowej.
- Następnie wyrzuć pozostałą lamininę ze środka szkiełka nakrywkowego. Okrężnymi ruchami rozprowadź kroplę lamininy na szkiełku nakrywkowym. Umieścić w inkubatorze o temperaturze 37 °C co najmniej 1 godzinę i do 24 godzin przed izolacją.
2. Przygotowanie aparatu Langendorffa
UWAGA: Poszczególne elementy aparatu Langendorffa używane w tym protokole są wymienione w Tabeli Materiałów.
- Włączyć łaźnię z wodą obiegową. Ustaw temperaturę tak, aby perfuzat miał temperaturę 37 °C.
UWAGA: Przy zbiornikach roztworu ustawionych na wysokość 60 cm, krążący poród wody musi być ustawiony na 41 °C, aby perfuzat wynosił 37 °C. W przeciwieństwie do wcześniej zgłaszanych protokołów, wysokość zbiornika nie musi być zmieniana. - Przepłukać aparat Langendorffa 70% etanolem, a następnie dwukrotnie przepłukać autoklawowaną wodą podwójnie destylowaną. Po spłukaniu napełnij zbiornik KHB-HB i natlenić 100% tlenem.
- Zalać system, pozwalając natlenionemu KHB-HB najpierw spłynąć do zlewki o pojemności 100 ml. Gdy 50 ml roztworu spłynie do zlewki, zmień pozycję 3-drogowego kurka odcinającego, aby zatrzymać przepływ ze zbiornika KHB-HB. Wlać 50 ml natlenionego KHB-HB ze zlewki do zbiornika kolagenazy.
- Pozwól KHB-HB spłynąć ze zbiornika do wytrawiania, aż 5 ml pozostanie w zbiorniku kolagenazy. Podczas zalewania zbiornika kolagenazy kilkakrotnie przełączaj 3-kierunkowy kurek odcinający między zbiornikami, aby umożliwić odgazowanie przewodów. Po zalaniu instalacji należy pamiętać o użyciu syfonu odgazowującego umieszczonego na górze wężownicy grzewczej, aby umożliwić wydostanie się pozostałego powietrza z systemu.
- Przygotuj roztwór kolagenazy. W przypadku szczurów połącz 100 mg kolagenazy typu II, 100 ml natlenionego KHB-HB i 2 fiolki bulionu blebbistain. W przypadku myszy połącz 100 mg kolagenazy typu II, 40 ml natlenionego KHB-HB i 2 fiolki bulionu blebbistain. Po wymieszaniu roztwór powinien być stabilny przez 1 godz.
UWAGA: Żywotność miocytów może się różnić w zależności od partii kolagenazy typu II. Skorzystaj z programu pobierania próbek kolagenazy, aby przetestować wiele przed zamówieniem hurtowym.
3. Izolacja miocytów
- Wstrzyknąć zwierzęciu 1,000 j. heparyny. Czekamy 5 min.
UWAGA: Można używać myszy i szczurów w każdym wieku. Jednak ogólnie rzecz biorąc, im starsze lub bardziej chore zwierzę, tym niższy plon miocytów. - Zwierzę należy uśmiercić, najpierw znieczulając je izofluranem metodą otwartej kropli (1 cm³ izofluranu na 500 cm³ objętości), a następnie poddać zwierzę eutanazji mieszaniną pentobarbitalu (150 mg/kg dootrzewnowo).
- Szybko wytnij serce, chwytając najpierw futro powyżej wyrostka mieczykowatego. Za pomocą nożyczek do tęczówki wykonaj małe nacięcie bezpośrednio pod wyrostkiem mieczykowatym i pociągnij futro w górę w kierunku głowy, odsłaniając skórę.
- Chwyć wyrostek mieczykowaty i przetnij przeponę, odsłaniając jamę piersiową. Wykonaj nacięcie klapy, odciągnij mostek do tyłu za pomocą hemostatu i użyj zakrzywionych kleszczy, aby wyciąć serce powyżej aorty wstępującej i umieścić w zimnym KHB-HB.
- Kankaniulizuj serce za pomocą mikroskopu stereoskopowego i kleszczy numer 5. Upewnij się, że serce jest zanurzone, a kaniula została zagruntowana przed wycięciem serca, aby zapobiec zatorowi. Potwierdź prawidłowe ułożenie kaniuli, wizualizując końcówkę kaniuli około 1 mm powyżej wprowadzenia aorty do komory.
UWAGA: Im szybszy czas kaniulacji, tym lepsza wydajność miocytów. - Rozpocznij przepływ KHB-HB, obracając kran na Langendorffie. Podłącz kaniulę do Langendorffa. Perfuzja serca przez 5 min.
UWAGA: Ponieważ perfuzja jest dostarczana przez system oparty na grawitacji, przepływ przez serce będzie funkcją zgodności tętnic wieńcowych. - Przełącz perfuzję ze zbiornika KHB-HB na zbiornik buforowy do wytrawiania. Gdy bufor trawienny dotrze do serca, ustaw minutnik (5 minut dla myszy lub 15 minut dla szczura). Upewnij się, że perfuzat został zebrany w sterylnej zlewce o pojemności 100 ml. W razie potrzeby napełnić zbiornik buforowy mineralizacji perfugatem aż do upływu czasu mineralizacji.
- Po strawieniu oddziel komory serca kleszczami i nożyczkami do tęczówki w sterylnej zlewce o pojemności 100 ml. Umieść każdą komorę w osobnej studzience na sześciodołkowej płytce. Wlej 5 ml roztworu kolagenazy do każdej studzienki.
- Natychmiast zacznij mielić tkankę serca za pomocą nożyczek. Kawałki tkanki powinny mieć około 1 mm3. Za pomocą sterylnych pipet transferowych delikatnie rozdrobnić zmieloną tkankę serca. Roztwór powinien stać się mętny.
- Gdy kawałki tkanki staną się białe i pierzaste, zbadaj komórki za pomocą odwróconego mikroskopu. Jeśli liczba żywotnych komórek jest większa niż 80%, przystąp do przecedzania komórek do stożkowej probówki o pojemności 50 ml za pomocą sitka do komórek 100 μm. Użyj innej rurki i sitka do każdej komory serca.
- Jeśli liczba żywotnych komórek jest mniejsza niż 80%, sprawdź czas potrzebny na kaniulację. Jeśli czas kaniulacji przekracza 5 minut, wypróbuj inne serce. Jeśli nie, oznacz nowe partie kolagenazy za pomocą programu pobierania próbek kolagenazy.
- Granulować komórki, odwirowując przy 215 x g przez 2 minuty. Pellet powinien być zwarty i nie luźny. Jeśli osad jest luźny, preparat zawiera wiele martwych komórek. W kapturze do hodowli tkankowej ponownie zawiesić osad w 10 ml buforu zatrzymującego.
- Granulować komórki, odwirowując przy 215 x g przez 2 minuty. Pellet powinien być zwarty i nie luźny. Jeśli osad jest luźny, preparat zawiera wiele martwych komórek.
- Ponownie zawiesić komórki w 5 ml buforu do powlekania. Wykonaj zliczanie komórek. Dostosuj mililitry buforu do posiewu, aby osiągnąć końcowe stężenie miocytów 2 x 104 komórek na ml.
- Usunąć szkiełka nakrywkowe pokryte lamininą z inkubatora. Odessać kroplę lamininy.
- Na każde szkiełko nakrywkowe należy podać 200 μl zawiesiny miocytów. Umieścić w inkubatorze o temperaturze 37 °C (21%O2, 5% CO2) na 2 godziny, aby umożliwić załączenie. Po 2 godzinach odessać nieprzyłączone komórki, dodać 2 ml pożywki hodowlanej i hodować przez okres do 4 dni.
4. Ładowanie barwnika Fura-2
- Przygotować 2 mM ester fura-2 acetoksymetylowy (fura-2 AM) roztwór podstawowy, dodając 25 μl DMSO do 50 μg proszku fura-2 AM (1 fiolka). Podzielić na 6 μl podwielokrotności. Weź 1 porcję fury-2 rano i dodaj do 6 ml pożywki galwanicznej. Wirować do mieszania.
- Wyjąć 1 sześciodołkową płytkę miocytów z inkubatora. Odsysanie podłoża. Dodaj 1 ml mieszaniny pożywki fura-2 do każdej studzienki. Przykryj płytkę folią, pozostaw płytkę w temperaturze pokojowej i odczekaj 15 minut.
- Odessać mieszaninę pożywki fura-2 i dodać 1 ml roztworu Tyrode'a do każdej studzienki. Przykryj folią. Odczekaj 20 minut w temperaturze pokojowej, aby umożliwić wypłukanie barwnika przed obrazowaniem.
5. Ładowanie barwnika Fluo-4
- Przygotować 1,82 mM roztwór podstawowy estru acetoksymetylowego fluo-4 (fluo-4 AM), dodając 25 μl DMSO do 50 μg proszku fluo-4 AM (1 fiolka). Podzielić na 8,333 μl podwielokrotności. Weź 1 porcję bulionu fluo-4 AM i dodaj do 6 ml pożywki galwanicznej. Wirować do mieszania.
- Wyjąć 1 sześciodołkową płytkę miocytów z inkubatora. Odsysanie podłoża. Dodać 1 ml mieszaniny pożywki fluo-4 AM do każdej studzienki. Przykryj płytkę folią, pozostaw płytkę w temperaturze pokojowej i odczekaj 15 minut.
- Odessać mieszaninę pożywki fluo-4 AM i dodać 1 ml roztworu Tyrode'a do każdej studzienki. Przykryj folią. Odczekaj 20 minut w temperaturze pokojowej, aby umożliwić wypłukanie barwnika przed obrazowaniem.
6. Potencjał membrany Obciążenie barwnikiem
- Usuń składnik A i składnik B z zestawu potencjału membranowego. W stożkowej probówce o pojemności 15 ml wymieszaj 50 μl składnika B i 5 μl składnika A. Vortex wymieszać. Dodać 10 ml pożywki galwanicznej do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej mieszaninę barwników napięciowych. Wirować do mieszania.
- Wyjąć 1 sześciodołkową płytkę miocytów z inkubatora. Zassać media. Do każdej studzienki dodać 800 μl mieszaniny barwników o potencjale membranowym. Przykryj płytkę folią, pozostaw płytkę w temperaturze pokojowej i odczekaj 15 minut.
- Odessać mieszaninę pożywki barwiącej i dodać 1 ml roztworu modyfikowanego Tyrode'a do każdej studzienki. Przykryj folią.
7. Fotometria i zapisy urządzeń sprzężonych z ładunkiem
- Włącz sprzęt w następującej kolejności: mikroskop, lampa łukowa, hyperswitch, system interfejsu fluorescencji, zasilacz Myocam, stymulator pola i komputer.
- Upewnij się, że zestawy filtrów wzbudzenia/emisji są odpowiednie dla barwnika obrazowego.
UWAGA: Fura-2 wzbudza się przy 340 nm i 380 nm światła. Emituje światło o długości fali 510 nm. Fluo-4 i barwnik membranowy napięcia są wzbudzane przy 485 nm światła i emitują przy 520 nm światła. - Zalać system, włączając podciśnienie, całkowicie otwierając zacisk węża i delikatnie zanurzając każdą strzykawkę o pojemności 60 ml używaną w kolektorze. Do zapisów wapnia użyj roztworu Tyrode'a. Do zapisów napięcia należy użyć zmodyfikowanego roztworu Tyrode'a.
- Włącz grzałkę i ustaw przepływ, regulując rolkę clamp na rurce perfuzyjnej. Nagrywać w temperaturze 36 ± 1 °C.
- Otwórz oprogramowanie do akwizycji. Upewnij się, że parametry są ustawione dla właściwego barwnika obrazowego.
- W ciemności usuń folię z płytki sześciodołkowej i umieść szkiełko nakrywkowe w komorze stymulacji. Upewnij się, że stymulator jest wyłączony na tym etapie. Skoncentruj się na miocytach za pomocą obiektywu 10x.
- Po ustawieniu ostrości rozpocznij stymulację od stymulacji polem przy 1 Hz, 0,2 V. Stopniowo zwiększaj napięcie, aż do uzyskania stymulacji 1:1. Następnie zwiększaj napięcie, aż zostanie osiągnięty 1,5-krotność progu.
UWAGA: Ponieważ sprzężenie wzbudzenia-skurczu jest zależne od temperatury, upewnij się, że ogniwa były perfundowane przez 15 minut przed nagraniem. Pozwala to miocytom na regenerację po szoku spowodowanym powrotem do temperatury pokojowej do 37 °C, a luźno połączone komórki mogą odpłynąć. - Przełącz się z obiektywu 10x na obiektyw 40x. Skoncentruj się na komórce, która jest zgodna z tempem 1:1. Dostosuj plastikowe rolety tak, aby tylko jedna komórka znajdowała się w polu view.
- Korzystając z oprogramowania, umieść pole obszaru zainteresowania na dobrze zdefiniowanych sarkomerach. Uruchom oprogramowanie akwizycyjne, aby zainicjować światło wzbudzenia. Korzystając z filtrów o neutralnej gęstości, odpowiednio dostosuj ustawienie intensywności, aby uzyskać odpowiedni SNR.
Wyniki
Rysunek 1A przedstawia aparat Langendorffa. Natleniacz znajduje się w zbiorniku z KHB-HB. Roztwór kolagenazy znajduje się w środkowym zbiorniku w postaci strzykawki o pojemności 60 mL. Linia odgazowywania jest podłączona do pustego zbiornika w postaci strzykawki o pojemności 60 mL. Po udanej izolacji większość komórek powinna mieć kształt pręcika i być prążkowana. Pod obiektywem 40x w większości miocytów powinny być widoczne wyraźne prążkowania. Rysunek 1B,C przedstawia przykłady zdrowych miocytów szczura. Po izolacji komórki mogą być hodowane do 4 dni, zachowując swoją morfologię i właściwości elektryczne.
Aby zmierzyć sprzężenie pobudzenia ze skurczem, komórki umieszcza się w podgrzewanej komorze stymulującej. Ponieważ miocyty są wrażliwe na zmiany temperatury, ważne jest, aby pozostawić szkiełko podstawowe w komorze na 15 min w celu wyrównania temperatury przed rozpoczęciem pomiaru. W przypadku pomiarów fluorescencji długość fali wzbudzenia jest generowana przez żarówkę ksenonową 75 W. Żarówki ksenonowe wytwarzają widmo światła naśladujące naturalne światło słoneczne. Natężenie światła oraz długość fali są kontrolowane za pomocą filtrów neutralnych/emisyjnych. Światło wzbudzenia przechodzi następnie przez obiektyw do miocytu. Długość fali emisji jest następnie zbierana przez fotopowielacz. W systemie opisanym w niniejszej procedurze zarówno filtry wzbudzenia, jak i emisji muszą być zmieniane ręcznie.
Skrócenie natomiast jest rejestrowane za pomocą czujnika CCD (charge coupled device). Oprogramowanie akwizycyjne, dokonując pomiarów w czasie rzeczywistym z częstotliwością do 1 000 razy na sekundę, wyznacza średnią z linii w obrębie obszaru zainteresowania, aby utworzyć wyraźny wzór prążkowania. Następnie obliczana jest szybka transformata Fouriera (FFT). Piki w widmie mocy reprezentują średni rozstaw sarkomerów. Zmiany w rozstawie sarkomerów podczas stymulacji są następnie nanoszone na wykres i poddawane kwantyfikacji.
Rysunek 2 przedstawia zapisy stężenia wapnia i skrócenia zarejestrowane z miocytu myszy C57/B6 obciążonego barwnikiem wapniowym fura-2. Protokół stymulacji jest modyfikacją protokołów stymulacji opisanych wcześniej10,11. Zdrowe miocyty mysie powinny być zdolne do stymulacji z częstotliwością spoczynkową 10 Hz. Rysunek 3 przedstawia ilościową analizę uśrednionych danych z całego zespołu uzyskanych od myszy C57/B6 oraz ich rodzeństwa transgenicznego (TG), u których wprowadzono mutację punktową w kanale potasowym. Zauważalna jest brak różnic między grupami, z wyjątkiem czasu relaksacji przy stymulacji 10 Hz.
W przeciwieństwie do fura-2, który jest barwnikiem o podwójnym wzbudzeniu, barwnik napięciowy oraz fluo-4 są barwnikami o pojedynczej długości fali wzbudzenia, których widma wzbudzenia/emisji są zgodne ze standardowym widmem wzbudzenia i emisji FITC (494/506 nm). W związku z tym, przy użyciu tego zestawu filtrów można rejestrować stężenie wapnia i skracanie sarkomerów lub napięcie i skracanie sarkomerów.
Rycina 4A przedstawia zapis napięcia zarejestrowany z miocytu myszy C57/B6 stymulowanego z częstotliwością 10 Hz. W porównaniu do sygnałów wapniowych, zapisy napięcia z pojedynczej komórki mają mniejszą amplitudę i wymagają obróbki wstępnej w celu uzyskania sygnału nadającego się do analizy. Rycina 4B przedstawia uśredniony potencjał czynnościowy (AP) utworzony z potencjałów AP z Ryciny 4A. Rycina 4C,D przedstawia uśredniony potencjał AP po zastosowaniu filtru cyfrowego dolnoprzepustowego Butterwortha lub filtru Savitzky’ego-Golaya. Podczas filtrowania sygnału należy zachować ostrożność, aby nie zniekształcić rzeczywistych danych. Zwróć uwagę na subtelne różnice w kształcie potencjałów AP na Rycini 4B-D.
Rysunek 5 przedstawia zapisy zarejestrowane z miocytów szczura stymulowanych z częstotliwością 1 Hz. Oprócz tego, że sygnał napięciowy jest niższy niż sygnał wapniowy, różni się również kinetyka skurczu. Wynika to z faktu, że barwniki wapniowe buforują wapń, podczas gdy barwniki napięciowe tego nie robią.
Podobnie jak w przypadku przejściowego wzrostu stężenia wapnia (Rysunek 3), miocyty wykazały również zmiany czasu trwania potencjału czynnościowego (APD) zależne od częstotliwości stymulacji (Rysunek 6). Podczas gdy zapisy fura-2 poddano uśrednianiu zbiorczemu przed kwantyfikacją, zapisy napięcia przefiltrowano za pomocą filtru wygładzającego wielomianowego Savitzky'ego-Golaya (szerokość 5, rząd 2) przed uśrednianiem zbiorczym i kwantyfikacją.
Jak ilościowo określono na Rysunku 6 i Rysunku 7, poza wykazaniem zmian APD wywołanych stymulacją, wykazano również indukowane lekiem wydłużenie AP. Przy częstotliwości stymulacji 4 Hz, zależna od stężenia blokada przejściowego prądu wychodzącego (Ito) za pomocą 4-aminopirydyny doprowadziła do wydłużenia APD.
Na koniec należy zachować ostrożność, aby uniknąć cytotoksyczności. Rysunek 8 przedstawia ostatnie 11 s z 20 s zapisu. Jak wskazują czerwone strzałki na Rysunku 8, przedłużona ekspozycja miocytów na niebieskie światło prowadzi do aktywności wyzwalanej.
Rycina 1: Aparatura Langendorffa ze stałym ciśnieniem. (A) Aparatura Langendorffa z opisem poszczególnych komponentów białym drukiem. (B) Izolowane miocyty szczura Sprague-Dawley obserwowane przez obiektyw 10x. (C) Izolowane miocyty szczura obserwowane przez obiektyw 40x. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
Rycina 2: Reprezentatywne zapisy stężeń wapnia i skracania sarkomerów zarejestrowane z miocytów C57/B6 przy użyciu fura-2. Zapisy stężeń wapnia i skracania sarkomerów zarejestrowane przy 1, 2, 4, 10, 0,5 i 0,75 Hz. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 3: Ilościowe oznaczenie skrócenia sarkomerów, szczytowego stężenia wapnia, czasu relaksacji oraz czasu wychwytu zwrotnego zarejestrowanych u myszy typu dzikiego (WT) i transgenicznych (TG) szczepu C57/B6. (A) Skrócenie sarkomerów. (B) Szczytowe stężenie wapnia. (C) Czas relaksacji zdefiniowany jako powrót do 90% wartości bazowej na zapisie skrócenia. (D) Czas wychwytu zwrotnego zdefiniowany jako powrót do 90% wartości bazowej na zapisie wapnia. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 4: Optyczny potencjał czynnościowy zarejestrowany z miocytu myszy C57/B6 stymulowanego z częstotliwością 10 Hz. (A) 1-sekundowy ślad niefiltrowany. (B) Uśredniony zespołowo optyczny potencjał czynnościowy. (C) Uśredniony zespołowo optyczny potencjał czynnościowy po zastosowaniu filtru dolnoprzepustowego Butterwortha. (D) Uśredniony zespołowo optyczny potencjał czynnościowy po zastosowaniu wielomianowego filtru wygładzającego Savitzky-Golaya. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 5: Reprezentatywne przebiegi wapnia, napięcia i skracania sarkomerów zarejestrowane z miocytów szczura Sprague-Dawley stymulowanych z częstotliwością 1 Hz. (A) Przebiegi wapnia i skracania sarkomerów zarejestrowane przy stymulacji 1 Hz z użyciem fluo-4. (B) Przebiegi napięcia i skracania sarkomerów zarejestrowane przy stymulacji 1 Hz z użyciem barwnika napięciowego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
Rycina 6: Optyczne potencjały czynnościowe zarejestrowane z miocytów szczura Sprague-Dawley stymulowanych z częstotliwością 1, 2 i 4 Hz. (A) Przefiltrowany zapis zarejestrowany przy stymulacji 1 Hz. (B) Przefiltrowany zapis zarejestrowany przy stymulacji 2 Hz. (C) Przefiltrowany zapis zarejestrowany przy stymulacji 4 Hz. (D) Czas trwania potencjału czynnościowego 10, mierzony jako 10% powrotu do linii bazowej. (E) Czas trwania potencjału czynnościowego 50, mierzony jako 50% powrotu do linii bazowej. (F) Czas trwania potencjału czynnościowego 90, mierzony jako 90% powrotu do linii bazowej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 7: Wpływ 4-aminopirydyny na optyczne potencjały czynnościowe szczura Sprague-Dawley rejestrowane przy stymulacji 4 Hz. (A) Uśredniony przebieg sygnału zarejestrowany przy stymulacji 4 Hz bez dodatku 4-aminopirydyny do roztworu. (B) Uśredniony przebieg sygnału zarejestrowany przy stymulacji 4 Hz z dodatkiem 1 µM 4-aminopirydyny do roztworu. (C) Uśredniony przebieg sygnału zarejestrowany przy stymulacji 4 Hz z dodatkiem 10 µM 4-aminopirydyny do roztworu. (D) Czas trwania potencjału czynnościowego 10, mierzony jako powrót do linii bazowej na poziomie 10%. (E) Czas trwania potencjału czynnościowego 50, mierzony jako powrót do linii bazowej na poziomie 50%. (F) Czas trwania potencjału czynnościowego 90, mierzony jako powrót do linii bazowej na poziomie 90%. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 8: Fototoksyczność indukowana barwnikiem napięciowym w miocytach szczura Sprague-Dawley po 20 s ciągłej ekspozycji na światło. Czerwone strzałki wskazują zdarzenia cytotoksyczne. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Dyskusja
Możliwość wyizolowania miocytów serca jest potężną metodą, którą można wykorzystać do zrozumienia fizjologii, patologii i toksykologii serca. W powyższym protokole opisaliśmy metodę, która wykorzystuje aparat Langendorffa o stałym ciśnieniu grawitacyjnym w celu uzyskania pojedynczych miocytów serca. Następnie, za pomocą systemu fotometrii fluorescencyjnej, opisujemy, jak jednocześnie pozyskać albo wapń i skracanie, albo napięcie i skracanie śladów.
Ze względu na różną kinetykę między barwnikami wapniowymi należy zachować ostrożność przy wyborze barwnika. W tym protokole zarówno fura-2, jak i fluo-4 zostały zaprojektowane z estrami AM, co wymagało etapu mycia, aby dać czas, aby esterazy wewnątrzkomórkowe miały czas na rozszczepienie grupy AM i uwięzienie barwnika w komórce. Podczas gdy zarówno fura-2, jak i fluo-4 są uważane za barwniki wapniowe o wysokim powinowactwie, Kd dla fury-2 wynosi 145 nM w porównaniu do 345 nM dla fluo-49. Co więcej, fura-2 jest ratiometryczna. Z tego powodu może być stosowany do ilościowego określania wewnątrzkomórkowego poziomu wapnia 9,12. Z drugiej strony Fluo-4 jest jednofalową sondą wapniową. Zaletą stosowania fluo-4 jest to, że wytwarza jaśniejszy sygnał fluorescencyjny. Niezależnie od tego, jaki barwnik wapniowy jest używany, w porównaniu z barwnikiem wapniowym, membranowe sondy napięciowe mają niższy SNR.
Jak pokazano na rys. 4 i rys. 5, ślady napięcia w porównaniu ze śladami wapnia mają mniejszą amplitudę. Korzystając z zawartego w oprogramowaniu cyfrowego filtrowania śladów, możliwe jest zwiększenie wskaźnika SNR i ilościowe określenie danych (Rysunek 4 i Rysunek 7). Po ilościowym określeniu zarówno stany przejściowe wapnia, jak i optyczne APD wykazują restytucję, skracając czas ich trwania przy szybszych częstotliwościach stymulacji (Rysunek 2, Rysunek 3, Rysunek 6 i Rysunek 7). Krótsze APD podczas szybszych cykli stymulacji są konieczne, aby zapewnić wystarczająco dużo czasu na wypełnienie komór podczas rozkurczu. Uważa się, że zmiany w tym zjawisku wskazują na wzrost ryzyka arytmii 13,14,15,16. Chociaż zmiany w APD mogą być spowodowane chorobą, mogą być również spowodowane przez chemikalia. Jak pokazano na rysunku 7, gdy dominujący mysi repolaryzujący prąd potasowy, Ito, jest zablokowany, optyczny APD staje się dłuższy.
Mimo to, jak donoszono wcześniej w przypadku barwników wrażliwych na napięcie, natężenie i czas trwania światła mogą zmienić APD 2,5,17. Uważa się, że jest to wynik wytwarzania reaktywnych form utleniających (ROS)5. Wcześniej wykazano, że dodanie przeciwutleniaczy do roztworu rejestrującego może zapobiec cytotoksyczności barwnika wrażliwego na napięcie5. W rezultacie dodaliśmy przeciwutleniacz L-glutation (10 mM) do roztworu Tyrode'a. Na rysunku 8 pokazano ostatnie 11 s z 20-sekundowego nagrania uzyskanego w tempie 1 Hz. Jak wskazują czerwone strzałki, zmiany w APD nastąpiły dopiero po 15 sekundach nagrania; w związku z tym, chociaż zmodyfikowany roztwór Tyrode'a nie zapobiegł fototoksyczności, znacznie ją opóźnił. Stosując zmodyfikowane rozwiązanie Tyrode'a, stosując ustawienie niskiego natężenia światła i utrzymując czas nagrywania poniżej 5 s, możliwe jest uniknięcie jakichkolwiek zmian w APD wywołanych barwnikiem. Jest to ważne, ponieważ bez zachowania ostrożności w celu uniknięcia fototoksyczności, dane mogą zostać błędnie zinterpretowane jako powodujące wczesne lub opóźnione depolaryzacje. Oprócz ograniczenia ekspozycji na niebieskie światło istnieją dodatkowe środki ostrożności, które można podjąć, aby zapobiec błędnej interpretacji danych.
Pierwszym z nich jest nagrywanie tylko z komórek, które podążają za tempem jeden do jednego i mają spoczynkową długość sarkomeru większą lub równą 1,75 μm. Punkt odcięcia 1,75 μm pochodzi z obserwacji Gordona i wsp.18 , że napięcie gwałtownie spada, gdy długość sarkomeru jest poniżej tej wartości. Niemniej jednak niektóre patologie mogą powodować znaczne zmiany w spoczynkowej długości sarkomeru. Aby mieć pewność, że fenotyp jest prawdziwy, a nie artefaktem izolacji, należy zastosować następujące podejścia do rozwiązywania problemów.
Jeśli miocyty konsekwentnie nie podążają za stymulacją 1:1, mają długość sarkomeru poniżej 1,75 μm, ciężkie pęcherzyki błonowe lub nie przeżywają izolacji, pierwszą rzeczą do sprawdzenia jest czas potrzebny do kaniulacji serca. Im dłuższy czas kaniulacji, tym niższa będzie wydajność. Jeśli wymagany jest długi czas kaniulacji, żywotność można poprawić, umieszczając serce w roztworze kardioplegicznym19. Niemniej jednak, ponieważ kolagenaza jest enzymem, aktywność i swoistość określonej partii zmieniają się w czasie. Jeśli ogólna wydajność stopniowo pogarsza się pomimo dobrych czasów kaniulacji, należy oznaczyć nowe partie. Chociaż nasz protokół został zoptymalizowany pod kątem nagrań 5-sekundowych, jeśli potrzebne są dłuższe ścieżki napięcia, konieczne będzie zakupienie dodatkowych filtrów o neutralnej gęstości. System opisany w protokole wyposażony jest w filtry o neutralnej gęstości, które redukują przepuszczane światło o 37%, 50%, 75%, 90% i 95%.
Podsumowując, opisaliśmy metodologię, która pozwoliła na izolację dorosłych mysich miocytów komorowych, które wykorzystano do pomiarów skrócenia wapnia, napięcia i sarkomeru.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Dziękujemy Dana Morgenstern za staranną korektę manuskryptu.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Zbiornik z płaszczem wodnym 0,25 litra | Radnoti, LLC | 120142-025 | |
| Kolba miarowa o pojemności 1 litra | Fisher Scientific | 10-205F | |
| Zlewka 100 ml | Fisher Scientific | FB-100-100 | |
| Cylinder z podziałką 100 ml | Fisher Scientific | 08 562 5C | |
| 1000 ml Kolba | Fisher Scientific | FB-500-1000 | |
| Statyw laboratoryjny 2-barowy z drążkiem stabilizującym i 24-calowymi prętami ze stali nierdzewnej | Radnoti, LLC | 159951-2 | |
| 4-aminopirydyna | Sigma-Aldrich | 275875 | |
| 40X Oly UApo/340 Obiektyw bez zanurzenia (NA 0,9, WD 0,2 mm) | IonOptix | MSCP1-40 (b) | |
| Strzykawka 60 ml, końcówka BD Luer-Lok | BD | 309650 | |
| Kaniule metalowe aorty | Harvard Aparatura | 73-0112 | |
| Albumina surowicy bydlęcej | Fisher Scientific | BP9703-100 | |
| C-6 Standardowy cyrkulator grzewczy | Chemyx | A30006 | |
| CaCl2 | Fisher Scientific | BP510500 | |
| Adapter ramowy do komórek | IonOptix | CFA300 | |
| CellPr0 System filtracji próżniowej, 1 litr, 0,22 i mikro; m,Cs/12 | Sprzedaż produktów laboratoryjnych, Inc | V100022 | |
| System filtracji próżniowej CellPro, 250 ml, 0,22 i mikro; m,Cs/12 | Sprzedaż produktów laboratoryjnych, Inc | V25022 | |
| System filtracji próżniowej CellPro, 500 mL, 0,22 i mikro; m,12/CS | Labratory Product Sales, Inc | V50022 | |
| CMC (mTCII) Regulator temperatury z liniową nagrzewnicą przepływową | IonOptix | TEMPC2 | |
| Cole-Parmer 3-drogowy o dużej średnicy, z zamkiem męskim, kurkami | Cole-Parmer | EW-30600-23 | |
| Złączki Cole-Parmer Luer, Kranki o dużym otworze, zamek męski, 4-drożny | Cole-Parmer | EW-30600-12 | |
| Krany Cole-Parmer z przyłączami Luer; 1-kierunkowy; męski poślizg | Cole-Parmer | EW-30600-01 | |
| Kolagenaza typu II | Worthington | LS004177 | |
| Corning Sterylne sitka komórkowe | Fisher Scientific | 07-201-432 | |
| Dell Optiplex 790 mini-tower, 4G RAM, 250G HD, Windows 7 Pro | IonOptix | CPUD7M | |
| DMSO | Pęseta Fisher Scientific | 50980367 | |
| Dumont Styl 5 | Amazon | B00F70ZDEQ | |
| Szybkowymienna komora stymulacyjna FHD | IonOptix | FHDRCC1 | |
| Fluo-3/4 | IonOptix | IonOP-Fluo | |
| Interfejs systemu fluorescencji – (z kartą PCI-I/O) | IonOptix | FSI700 | |
| Gibco Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/mL) | Fisher Scientific | 15-140-122 | |
| Glukoza | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Hemostat, zakrzywiony 5-1/2" | Amazon | B00GGAAPD0 | |
| HEPES | Źródło | ||
| HyperSwitch | IonOptix | HSW400 | |
| Mikroskop fluorescencyjny z odwróconym motokiem | IonOptix | MSCP1-40 (a) | |
| IonWizard Core + analiza | IonOptix | IONWIZ | |
| , zakrzywione | Amazon | B018KRRMY6 | |
| K2HPO4 | Fisher Scientific | P288-100 | |
| KCl | Fisher Scientific | BP3661 | |
| L-Glutation zredukowany | Sigma-Aldrich | G4251 | |
| LOOK Jedwabna szpula, plecionka, 4-0, 100yds | SouthernAnesthesiaSurgical Inc. | SP116-EA | |
| M199 Media | Fisher Scientific | 12 340 030 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | MP021914215 | |
| MgSO4 | Fisher Scientific | BP2131 | |
| MyoCam-S Cyfrowy system wideo CCD | IonOptix | MCS100 | |
| MyoPacer Stymulator pola | IonOptix | MYP100 | |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358212 | |
| NaH2PO4 | Fisher Scientific | 56-754-9250GM | |
| Dotleniacz Bubbler z wlotem płynu do 0,25 litra | Radnoti, LLC | 140143-025 | |
| Podsystem fotopowielacza | IonOptix | PMT400 | |
| PMT Akwizycja | IonOptix | PMTACQ | |
| Radnoti 5 ml z syfonem odgazowującym | Radnoti, LLC | 158830 | |
| Zacisk pierścieniowy o średnicy 60 & ndash; 80 mm do zbiornika 250 ml | Radnoti, LLC | 120141-025 | |
| Zacisk pierścieniowy do komory zgodności pułapki bąbelkowej | Radnoti, LLC | 120149RC | |
| Saint-Gobain ACF000010 5/32 cala 9/32 cala | Fisher Scientific | 14-171-214 | |
| Saint-Gobain ACF000013 3/16 cala 3/8 cala | Fisher Scientific | 14-171-217 | |
| Saint-Gobain ACF000016 1/4 cala 5/16 cala | Fisher Scientific | 14-171-219 | |
| Saint-Gobain ACF000025 5/16 cala 5/8 cala | Fisher Scientific | 14-171-226 | |
| Saint-Gobain ACF00003 1/16 cala 3/16 cala | Fisher Scientific | 14-171-209 | |
| Saint-Gobain ACF00005 1/16 cala 3/32 cala | Fisher Scientific | 14-171-210 | |
| Saint-Gobain ACF00009 5/32 cala 7/32 cala | Fisher Scientific | 14-171-213 | |
| Dodatek do nagrywania długości Sarcomere | IonOptix | SARACQ | |
| T / C Adson Kleszcze do chirurgii tkankowej 4,75 " | Amazon | B00JDWRBGC | |
| VETUS Antystatyczna pęseta z zakrzywioną końcówką | Amazon | B07QMZC94J | |
| Vistek 3200 Motic Platforma izolacji drgań | IonOptix | ISO100 |
Bibliografia
- Hagen, B. M., Boyman, L., Kao, J. P., Lederer, W. J. A comparative assessment of fluo Ca2+ indicators in rat ventricular myocytes. Cell Calcium. 52 (2), 170-181 (2012).
- Schaffer, P., Ahammer, H., Muller, W., Koidl, B., Windisch, H. Di-4-ANEPPS causes photodynamic damage to isolated cardiomyocytes. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 426 (6), 548-551 (1994).
- Hardy, M. E., Lawrence, C. L., Standen, N. B., Rodrigo, G. C. Can optical recordings of membrane potential be used to screen for drug-induced action potential prolongation in single cardiac myocytes. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 54 (2), 173-182 (2006).
- Tian, Q., et al. Optical action potential screening on adult ventricular myocytes as an alternative QT-screen. Cellular Physiology and Biochemistry. 27 (3-4), 281-290 (2011).
- Warren, M., et al. High-precision recording of the action potential in isolated cardiomyocytes using the near-infrared fluorescent dye di-4-ANBDQBS. The American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 299 (4), 1271-1281 (2010).
- FluoVolt™ Membrane Potential Kit. ThermoFisher Scientific. , Available from: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0009668_FluoVolt_Membrane_Potential_Kit_UG.pdf (2018).
- Fluorescence SpectraViewer. ThermoFisher Scientific. , Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html (2019).
- Calcium and Contractility in Isolated Myocytes. IonOptix. , Available from: http://www.ionoptix.com/product/myocyte-calcium-and-contractility-recording-system/ (2019).
- Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D. Chemical calcium indicators. Methods. 46 (3), 143-151 (2008).
- Davis, J., et al. Diastolic dysfunction and thin filament dysregulation resulting from excitation-contraction uncoupling in a mouse model of restrictive cardiomyopathy. The Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 53 (3), 446-457 (2012).
- Ren, J., Davidoff, A. J. Diabetes rapidly induces contractile dysfunctions in isolated ventricular myocytes. The American Journal of Physiology. 272, 1 Pt 2 148-158 (1997).
- Roe, M. W., Lemasters, J. J., Herman, B. Assessment of fura-2 for measurements of cytosolic free calcium. Cell Calcium. 11 (2-3), 63-73 (1990).
- Goldhaber, J. I., et al. Action potential duration restitution and alternans in rabbit ventricular myocytes: the key role of intracellular calcium cycling. Circulation Research. 96 (4), 459-466 (2005).
- Weiss, J. N., et al. The dynamics of cardiac fibrillation. Circulation. 112 (8), 1232-1240 (2005).
- Baher, A., et al. Short-term cardiac memory and mother rotor fibrillation. The American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 292 (1), 180-189 (2007).
- Kleber, A. G., Rudy, Y. Basic mechanisms of cardiac impulse propagation and associated arrhythmias. Physiological Reviews. 84 (2), 431-488 (2004).
- McPheeters, M. T., Wang, Y. T., Werdich, A. A., Jenkins, M. W., Laurita, K. R. An infrared optical pacing system for screening cardiac electrophysiology in human cardiomyocytes. PLoS ONE. 12 (8), 0183761(2017).
- Gordon, A. M., Huxley, A. F., Julian, F. J. The variation in isometric tension with sarcomere length in vertebrate muscle fibres. The Journal of Physiology. 184 (1), 170-192 (1966).
- Li, Y., et al. Three Preservation Solutions for Cold Storage of Heart Allografts: A Systematic Review and Meta-Analysis. The Journal of Artificial Organs. 40 (5), 489-496 (2016).
Przedruki i uprawnienia
