Artykuł metodologiczny

Protokół mikrodysekcji z wychwytem laserowym, który zapewnia wysokiej jakości RNA ze świeżo zamrożonych kości myszy

DOI:

10.3791/60197

⸱

16 września 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Research, University of Veterinary Medicine Vienna

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół mikrodysekcji laserowej (LCM) został opracowany w celu uzyskania wystarczającej ilości wysokiej jakości RNA do analizy ekspresji genów w komórkach kostnych. Obecne badanie koncentruje się na mysich odcinkach kości udowej. Jednak opisany tutaj protokół LCM może być wykorzystany do badania ekspresji genów w komórkach dowolnej tkanki twardej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wydajność i integralność RNA są decydujące dla analizy RNA. Jednak często utrzymanie integralności RNA przez cały czas trwania procedury mikrodysekcji wychwytu laserowego (LCM) jest często technicznie trudne. Ponieważ badania LCM działają z małymi ilościami materiału, ważne są również obawy o ograniczoną wydajność RNA. W związku z tym opracowano protokół LCM, aby uzyskać wystarczającą ilość wysokiej jakości RNA do analizy ekspresji genów w komórkach kostnych. Oceniono wpływ protokołu barwienia, grubości kriosekcji, ilości mikrowypreparowanej tkanki, zestawu do ekstrakcji RNA i zastosowanego systemu LCM na wydajność i integralność RNA uzyskaną z mikrowypreparowanych komórek kostnych. Zamrożone skrawki kości o grubości ośmiu μm wykonano przy użyciu folii adhezyjnej i wybarwiono przy użyciu szybkiego protokołu dla komercyjnego barwienia LCM. Próbkę umieszczono pomiędzy membraną z politereftalanu etylenu (PET) a folią klejącą. W celu uzyskania wysokiej jakości RNA o wystarczającej wydajności zastosowano system LCM, który wykorzystuje grawitację do pobierania próbek, oraz metodę ekstrakcji RNA opartą na kolumnach. Obecne badanie koncentruje się na mysich odcinkach kości udowej. Jednak opisany tutaj protokół LCM może być wykorzystany do badania ekspresji genów in situ w komórkach dowolnej tkanki twardej zarówno w warunkach fizjologicznych, jak i procesach chorobowych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tkanki składają się z heterogenicznych i przestrzennie rozmieszczonych typów komórek. Różne typy komórek w danej tkance mogą różnie reagować na ten sam sygnał. Dlatego tak ważna jest możliwość wyizolowania określonych populacji komórek w celu oceny roli różnych typów komórek zarówno w stanach fizjologicznych, jak i patologicznych. Mikrodysekcja wychwytu laserowego (LCM) oferuje stosunkowo szybką i precyzyjną metodę izolowania i usuwania określonych komórek ze złożonych tkanek1. Systemy LCM wykorzystują moc wiązki laserowej do oddzielania komórek będących przedmiotem zainteresowania od histologicznych skrawków tkanek bez konieczności przetwarzania enzymatycznego lub hodowli. Oznacza to, że komórki znajdują się w swoim naturalnym środowisku tkankowym, a architektura tkankowa, w tym relacje przestrzenne między różnymi komórkami, jest zachowana. Morfologia zarówno schwytanych komórek, jak i pozostałej tkanki jest dobrze zachowana, a kilka składników tkanki może być pobieranych sekwencyjnie z tego samego szkiełka. Wyizolowane komórki mogą być następnie wykorzystane do późniejszej analizy zawartości ich RNA, DNA, białka lub metabolitu2,3.

Aby przeanalizować ekspresję genów w różnych populacjach komórek, lub po różnych zabiegach, konieczne jest uzyskanie mRNA o wystarczającej jakości i ilości do późniejszej analizy4,5. W przeciwieństwie do DNA, RNA są bardziej wrażliwe na utrwalanie i zaleca się stosowanie zamrożonej tkanki, gdy celem jest badanie RNA. Ponieważ mRNA są szybko degradowane przez wszechobecne rybonukleazy (RNazy), wymagane są rygorystyczne warunki wolne od RNaz podczas obchodzenia się z próbkami i ich przygotowywania oraz unikanie przechowywania próbek w temperaturze pokojowej. Ponadto, szybkie techniki bez długotrwałych etapów fazy wodnej są kluczowe dla zapobiegania degradacji RNA6. Na wydajność i integralność RNA może mieć również wpływ proces LCM i używany system LCM7,8. Obecnie dostępne są cztery systemy LCM o różnych zasadach działania2. Metoda ekstrakcji RNA może być również ważna, ponieważ przetestowano różne zestawy do izolacji RNA, które wykazały znaczne różnice w ilości i jakości RNA7,8.

Każda metoda przygotowania tkanek wymaga znalezienia równowagi między uzyskaniem dobrego kontrastu morfologicznego a utrzymaniem integralności RNA do dalszych analiz. Do przygotowania zamrożonych skrawków z kości opracowano i stale ulepszano folię samoprzylepną9. Skrawki kości są cięte i barwione bezpośrednio na folii samoprzylepnej. Ta folia samoprzylepna ma zastosowanie do wielu rodzajów barwienia i może być stosowana do izolowania komórek będących przedmiotem zainteresowania od kriosekcji kostnych za pomocą LCM9,10,11,12,13,14. Wszystkie etapy, w tym chirurgiczne usuwanie, osadzanie, zamrażanie, cięcie i barwienie, można wykonać w mniej niż godzinę. Co ważne, komórki takie jak osteoblasty, komórki wyściółki kostnej i osteoklasty można łatwo zidentyfikować9,10,11,12,13,14. Ta metoda ma tę zaletę, że jest szybka i prosta. Alternatywną metodą generowania kriosekcji kostnych jest użycie systemu transferu taśmy15. Jednak ta druga technika jest bardziej czasochłonna i wymaga dodatkowego oprzyrządowania, ponieważ odcinki muszą być przenoszone z taśmy klejącej na wstępnie powlekane szkiełka membranowe za pomocą sieciowania ultrafioletem (UV). Chociaż system przesyłania taśm został pomyślnie sprzężony z LCM16,17,18,19, należy zauważyć, że usieciowana powłoka może tworzyć wzór tła, który może zakłócać identyfikację typu komórki20.

Zazwyczaj, tylko niewielkie ilości RNA są ekstrahowane z mikropreparowanych komórek, a jakość i ilość RNA są często oceniane za pomocą elektroforezy mikrokapilarnej21. Program komputerowy służy do przypisywania ekstraktom RNA indeksu jakości zwanego numerem integralności RNA (RIN). Wartość RIN równa 1,0 oznacza całkowicie zdegradowany RNA, podczas gdy wartość 10,0 sugeruje, że RNA jest w pełni nienaruszony22. Zwykle indeksy powyżej 5 są uważane za wystarczające do badań RNA. Doniesiono, że wzorce ekspresji genów w próbkach o wartości RIN 5,0−10,0 dobrze ze sobą korelują23. Chociaż czułość tej metody jest wysoka, ponieważ można wykryć zaledwie 50 pg/μl całkowitego RNA, uzyskanie oceny jakości może być bardzo trudne, jeśli stężenie RNA w próbce jest bardzo niskie. Dlatego, aby ocenić jakość RNA, wycinek tkanki pozostały po LCM jest często używany do ekstrakcji RNA poprzez pipetowanie buforu na szkiełko24.

Chociaż LCM był szeroko stosowany na różnych zamrożonych tkankach, wartości RIN ekstrahowanych RNA są rzadko podawane. Ponadto nie ma badań porównawczych, które wyjaśniałyby najbardziej odpowiednią metodę badania RNA w kościach myszy. W niniejszym badaniu wykorzystano zamrożone skrawki kości udowej dorosłej myszy w celu optymalizacji przygotowania próbki, protokołu LCM i ekstrakcji RNA w celu uzyskania wysokiej jakości RNA. Obecny protokół został zoptymalizowany specjalnie dla systemu LCM, który wykorzystuje grawitację do pobierania próbek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tkanka kostna od myszy została wykorzystana zgodnie z obowiązującymi wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami i dołożono wszelkich starań, aby zminimalizować cierpienie zwierząt.

1. Zwierzęta i osadzanie zamrażania

  1. Zwierzęta gospodarskie w warunkach stałej temperatury pokojowej (RT; 24 °C) i cyklu 12 h światło/12 godzin ciemności ze swobodnym dostępem do pożywienia i wody.
    UWAGA: Tkanki kostne w tym badaniu uzyskano od 3-miesięcznych samców myszy typu dzikiego C57BL/6.
  2. Podczas sekcji zwłok wykrwawione myszy z żyły głównej jamy brzusznej w znieczuleniu ogólnym (ketamina/ksylazyna, 100/6 mg/kg dootrzewnowa).
    nuta: Aby uniknąć degradacji RNA, należy używać instrumentów i materiałów wolnych od RNaz, nosić rękawice i pracować szybko, unikając przechowywania próbek w temperaturze pokojowej przez cały czas trwania eksperymentu.
  3. Szybko usuń całe kości udowe, oczyść je z otaczających tkanek miękkich za pomocą skalpela i ręczników papierowych. Wlej związek o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) do formy do zatapiania i umieść kość udową na dnie formy do zatapiania. Próbki należy zamrozić błyskawicznie w ciekłym azocie. OCT jest przezroczysty w temperaturze pokojowej i biały po zamrożeniu.
  4. Po całkowitym zamrożeniu próbki zawinąć w folię i przenieść je na suchym lodzie do temperatury -80 °C. Próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszego przetwarzania.
    nuta: W tym miejscu protokół można wstrzymać.

2. Przygotowanie sekcji

  1. Ustawić temperaturę w kriostacie na -19 °C, a w uchwycie bloku na -17 °C. Przetrzeć wnętrze kriostatu 70% etanolem. Umieść jednorazowe ostrze do twardych chusteczek, szkiełka podstawowe i narzędzie do dopasowania w kriostacie, aby ostygło. Trzymaj je w kriostacie na czas cięcia.
  2. Przenieść zamrożony blok tkanki na suchym lodzie do kriostatu i pozostawić do zrównoważenia przez co najmniej 10 minut.
    nuta: Unikaj powtarzającego się rozmrażania i częstych cykli jednego bloku od -80 °C do -19 °C w celu kriosekcji.
  3. Naciśnij dolną część formy do zatapiania, aby wypchnąć blok OCT z formy. Nałóż wystarczającą ilość podłoża OCT na uchwyt bloku, aby przykleić do niego blok. Poczekaj, aż podłoże OCT zostanie całkowicie zamrożone.
  4. Umieść uchwyt bloku w uchwycie na przedmiot i dokręć go na miejscu. Wyreguluj położenie ostrza i przytnij blok, stosując przyrosty cięcia co 15 μm, aby usunąć OCT pokrywający próbkę. Jeśli próbka została wcześniej przecięta, a powierzchnia wystawiona na działanie powietrza, należy wyrzucić pierwsze 2-3 skrawki tkanki z bloku.
  5. Dostosuj kriostat tak, aby wygenerował sekcje o wielkości 8 μm i wytnij 2−3 kriosekcje, które zostaną odrzucone (kilka pierwszych będzie zwykle grubszych niż 8 μm). Umieść folię samoprzylepną na bloku i użyj narzędzia do montażu, aby przykleić folię do bloku. Wykonuj cięcie powoli i ze stałą prędkością, trzymając sekcję za folię.
  6. Umieść folię (próbka skierowana do góry) natychmiast na wstępnie schłodzonym szkiełku podstawowym (na kriobarze w kriostacie), aby uniknąć rozmrożenia próbki. Użyj taśmy, aby przymocować folię do szkiełka, aby ułatwić barwienie. Natychmiast postępuj zgodnie z protokołem barwienia.

3. Protokół szybkiego barwienia

  1. Przygotuj 40 ml następujących roztworów w probówkach o pojemności 50 ml i umieść je na lodzie: 95% etanolu, woda wolna od RNaz, 100% etanol, 100% etanol i 100% ksylen. Wykonaj wszystkie czynności na lodzie (z wyjątkiem barwienia). Na każdy dzień doświadczalny przygotuj wszystkie odczynniki wodne świeże w wodzie wolnej od RNaz.
    ostrożność: Pracuj w kapturze, aby uniknąć zatrucia ksylenem.
  2. Inkubuj sekcje przez 30 s w 95% etanolu, a następnie zanurz sekcje 30 s w wodzie wolnej od RNaz, aby ostrożnie i całkowicie usunąć OCT, co może zakłócać LCM i dalsze zastosowania.
  3. Dozować 50 μl komercyjnej zamrożonej barwie skrawkowej LCM (tabela materiałów) na sekcję, inkubować przez 10 s w temperaturze pokojowej i odsączyć, umieszczając krawędź szkiełka na chłonnej bibułce. Usuń nadmiar plamy, spłukując 30 s w 100% etanolu.
  4. Zanurz skrawki kości w drugiej probówce ze 100% etanolem na 30 s i przenieś je do 100% ksylenu na 30 s.
  5. Umieść folię samoprzylepną (próbka skierowana do góry) na suchym szkiełku jako podparcie. Uważaj, aby folia nie była uderzona i umieszczona tak płasko, jak to możliwe. Nie dopuścić do całkowitego wyschnięcia próbki.
  6. Umieść na nim prowadnicę ramy z membrany PET. Krótko naciśnij palec w rękawiczce na membranie, aby przymocować ją do folii. Próbka jest następnie umieszczana między membraną a folią klejącą. Folia samoprzylepna nie powinna być złożona ani pomarszczona, a między folią a membraną nie powinno być pęcherzyków powietrza. Natychmiast przystąp do LCM.

4. Mikrodysekcja przechwytywania laserowego

  1. Oczyść stolik i uchwyt nasadki z RNazy za pomocą środka do odkażania powierzchni (tabela materiałów). Załaduj suwak i nasadki odpowiednio w uchwycie suwaka i uchwycie nasadki.
  2. Dostosuj ostrość i uzyskaj przegląd slajdów za pomocą obiektywu 1,25x. Zmień obiektyw na 40x i wyreguluj ostrość. Wybierz obszar zainteresowania, korzystając z przeglądu slajdów. Dostosuj parametry lasera w następujący sposób: przysłona, 7; moc lasera, 60; prędkość, 5; częstotliwość impulsów, 201; Bilans próbki, 20. Zoptymalizuj te parametry dla każdego celu.
  3. Jeśli laser nie zdoła przeciąć próbki, zwiększ moc lasera. Alternatywnie, laser może być stosowany więcej niż jeden raz. Ponadto sprawdź, czy w miejscu docelowym nie ma miejsc niekompletnych cięć i ponownie narysuj linię w tych miejscach za pomocą opcji Przesuń i przetnij. Zapisz ustawienia lasera do preparowania kolejnych preparatów.
  4. Wybrać osteoblasty, osteocyty i komórki wyściółki kostnej w dystalnej kości udowej, gąbczastej lub korowej na podstawie kryteriów morfologicznych. Narysuj linię ścieżki lasera dalej od komórek docelowych, aby zminimalizować uszkodzenia spowodowane przez laser UV. Wszystkie mikrodysekcje należy wykonać w czasie krótszym niż 1 godzina po barwieniu.
  5. Zebrać każdy typ komórek w osobnej nasadce probówki o pojemności 0,5 ml.
    nuta: Wychwytywanie na sucho zamiast odzyskiwania cieczy może zapobiec degradacji RNA. Ponadto bardzo małe objętości buforu zawartego w nasadce probówki mikrowirówki mogą albo odparować, albo skrystalizować (w zależności od jego składu) podczas LCM.
  6. Potwierdzić powodzenie przechwytywania, obserwując nasadkę probówki zbiorczej po LCM, w stosownych przypadkach. Natychmiast przystąp do ekstrakcji RNA.

5. Ekstrakcja RNA

  1. Dozować 50 μl buforu do lizy zawierającego β-merkaptoetanol do nakrętki probówki zbiorczej i poddać próbkę lizie, pipetując w górę i w dół w nasadce przez 1 minutę. Odwirować lizat i dodać do probówki 300 μl buforu do lizy zawierającego β-merkaptoetanol. Jeśli ma zostać połączonych kilka czapeczek, należy upewnić się, że całkowita objętość buforu jest zgodna z zaleceniami dla zestawu do ekstrakcji RNA (Tabela materiałów).
    UWAGA: β-merkaptoetanol musi być dodany w celu ochrony RNA przed degradacją, ale jest uważany za toksyczny. Nosić odzież ochronną i rękawice ochronne oraz pracować w kapturze.
  2. Dodatkowo dla każdego szkiełka należy przygotować jedną znakowaną probówkę mikrowirówkową o pojemności 1,5 ml z 350 μl buforu do lizy zawierającego β-merkaptoetanol. Użyj skrawków pozostałych po LCM, aby wyekstrahować RNA. Ostrożnie oddzielić folię od membrany i poddać próbkę lizie, kilkakrotnie powoli pipetując bufor do lizy na sekcję.
    nuta: Całkowita ilość buforu do lizy powinna wynosić 350 μL. Nie używaj go całego na raz do trawienia, ponieważ będzie spływał ze szkiełka.
  3. Próbki lizatu umieścić na suchym lodzie i przechowywać w temperaturze -80 °C.
    UWAGA:     W tym miejscu protokół można wstrzymać.
  4. Rozmrozić lizaty w temperaturze pokojowej. Przenieść lizaty z komórek zebranych metodą LCM z probówek zbiorczych do probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Jeżeli do pobrania próbki użyto więcej niż jednej nakrętki, należy zebrać kilka lizatów.
  5. Ekstrahuj RNA zgodnie z instrukcjami producenta. Potraktuj kolumny DNazą I, aby usunąć genomowe DNA. Eluować RNA za pomocą 14 μl wody wolnej od RNaz, co daje 12 μl eluatu. Przechowywać RNA w temperaturze -80 °C.
    nuta: W tym miejscu protokół można wstrzymać.

6. Pomiar wydajności i integralności RNA

  1. Rozmrozić RNA na mokrym lodzie. Zmierz wydajność i integralność wyizolowanego RNA za pomocą elektroforezy mikrokapilarnej. Załaduj całkowite RNA (1 μl na próbkę) do chipa (tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół LCM został opracowany w celu uzyskania wystarczającej ilości wysokiej jakości RNA do analizy ekspresji genów w komórkach kostnych kości udowych myszy. W zoptymalizowanym protokole zamrożone skrawki kości o grubości 8 μm zostały wycięte na folii adhezyjnej i wybarwione przy użyciu szybkiego protokołu dla komercyjnego barwienia zamrożonych sekcji LCM. Próbkę umieszczono pomiędzy membraną PET a folią klejącą. Komórki kostne myszy poddano mikrodysekcji przy użyciu systemu LCM, który wykorzystuje grawitację do pobier...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zarówno jakość, jak i ilość RNA mogą mieć negatywny wpływ na wszystkich etapach przygotowania próbki, takich jak manipulacja tkankami, proces LCM i ekstrakcja RNA. W związku z tym opracowano protokół LCM, aby uzyskać wystarczającą ilość wysokiej jakości RNA do późniejszej analizy ekspresji genów.

W przypadku LCM większość laboratoriów używa sekcji o grubości 7−8 μm2. Grubsze odcinki pozwoliłyby na zebranie większej ilości materiału. Jeśli jednak są zbyt grube, może to zmniejszyć roz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują Ute Zeitz i Nikole Ginner za doskonałą pomoc techniczną, a także Vetcore i personelowi opieki nad zwierzętami za ich wsparcie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2-MerkaptoetanolSigma63689-25ML-F
Absolutny etanol EMPLURAMerck Millipore8,18,76,01,000
Folia samoprzylepna (folia LMD)Section-LabC-FL001
System bioanalizatora Agilent 2100Agilent Technologies
Zestaw chipów Agilent RNA 6000 PicoAgilent Technologies5067-1513
Roztwór do barwienia Arcturus HistoGeneApplied Biosystems12241-05
Narzędzie do montażu kriofilmuSection-LabC-FT000
Cryostat Leica CM 1950Leica Biosystems
Szkiełka mikroskopowe szklane, kolor szlifu matowy pomarańczowyVWR Life Science631-1559
Histologia formy tkankowe PVCMEDITE48-6302-00
LMD7  Laser  Mikrodissektion  SystemLeica Microsystems
Niskoprofilowe ostrza do mikrotomów Leica DB80 XLLeica Biosystems14035843496
Woda bez nukleazVWR Life ScienceE476-500ML
Prowadnice membranowe PET 1,4 i mu; mMaszyny molekularne i Industries GmbH50102
RNase Away Odkażanie powierzchniMolecular BioProduct7002
RNeasy Micro KitQiagen74004
Tissue-Tek mieszanka o optymalnej temperaturze cięcia (OCT)Sakura Finetek4583
KsylenVWR Life Science2,89,73,363

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Emmert-Buck, M. R., et al. Laser capture microdissection. Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).
  2. Legres, L. G., Janin, A., Masselon, C., Bertheau, P. Beyond laser microdissection technology: follow the yellow brick road for cancer research. American journal of Cancer Research. 4 (1), 1-28 (2014).
  3. Datta, S., et al. Laser capture microdissection: Big data from small samples. Histology and histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).
  4. Kerman, I. A., Buck, B. J., Evans, S. J., Akil, H., Watson, S. J. Combining laser capture microdissection with quantitative real-time PCR: effects of tissue manipulation on RNA quality and gene expression. Journal of Neuroscience Methods. 153 (1), 71-85 (2006).
  5. Adiconis, X., et al. Comparative analysis of RNA sequencing methods for degraded or low-input samples. Nature Methods. 10 (7), 623-629 (2013).
  6. Golubeva, Y. G., Warner, A. C. Laser Microdissection Workflow for Isolating Nucleic Acids from Fixed and Frozen Tissue Samples. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1723, 33-93 (2018).
  7. Farris, S., Wang, Y., Ward, J. M., Dudek, S. M. Optimized Method for Robust Transcriptome Profiling of Minute Tissues Using Laser Capture Microdissection and Low-Input RNA-Seq. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 185(2017).
  8. Garrido-Gil, P., Fernandez-Rodríguez, P., Rodríguez-Pallares, J., Labandeira-Garcia, J. L. Laser capture microdissection protocol for gene expression analysis in the brain. Histochemistry and Cell Biology. 148 (3), 299-311 (2017).
  9. Kawamoto, T., Kawamoto, K. Preparation of thin frozen sections from nonfixed and undecalcified hard tissues using Kawamot's film method. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1130, 149-164 (2014).
  10. Streicher, C., et al. Estrogen Regulates Bone Turnover by Targeting RANKL Expression in Bone Lining Cells. Scientific Reports. 7 (1), 6460(2017).
  11. Vaidya, M., et al. Osteoblast-specific overexpression of amphiregulin leads to transient increase in femoral cancellous bone mass in mice. Bone. 81, 36-46 (2015).
  12. Jay, F. F., et al. Amphiregulin lacks an essential role for the bone anabolic action of parathyroid hormone. Molecular and Cellular Endocrinology. 417, 158-165 (2015).
  13. Murali, S. K., Andrukhova, O., Clinkenbeard, E. L., White, K. E., Erben, R. G. Excessive Osteocytic Fgf23 Secretion Contributes to Pyrophosphate Accumulation and Mineralization Defect in Hyp Mice. PLoS Biology. 14 (4), e1002427(2016).
  14. Andrukhova, O., Schüler, C., Bergow, C., Petric, A., Erben, R. G. Augmented Fibroblast Growth Factor-23 Secretion in Bone Locally Contributes to Impaired Bone Mineralization in Chronic Kidney Disease in Mice. Frontiers in Endocrinology. 9, 311(2018).
  15. Golubeva, Y. G., Smith, R. M., Sternberg, L. R. Optimizing Frozen Sample Preparation for Laser Microdissection: Assessment of CryoJane Tape-Transfer System®. PLoS ONE. 8 (6), e66854(2013).
  16. Pacheco, E., Hu, R., Taylor, S. Laser Capture Microdissection and Transcriptional Analysis of Sub-Populations of the Osteoblast Lineage from Undecalcified Bone. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1723, 191-202 (2018).
  17. Nioi, P., et al. Transcriptional Profiling of Laser Capture Microdissected Subpopulations of the Osteoblast Lineage Provides Insight Into the Early Response to Sclerostin Antibody in Rats. Journal of Bone and Mineral Research. 30 (8), 1457-1467 (2015).
  18. Taylor, S., et al. Differential time-dependent transcriptional changes in the osteoblast lineage in cortical bone associated with sclerostin antibody treatment in ovariectomized rats. Bone Reports. 8, 95-103 (2018).
  19. Taylor, S., et al. Time-dependent cellular and transcriptional changes in the osteoblast lineage associated with sclerostin antibody treatment in ovariectomized rats. Bone. 84, 148-159 (2016).
  20. Martin, L. B. B., et al. Laser microdissection of tomato fruit cell and tissue types for transcriptome profiling. Nature Protocols. 11 (12), 2376-2388 (2016).
  21. Imbeaud, S., et al. Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces. Nucleic Acids Research. 33 (6), e56(2005).
  22. Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7, 3(2006).
  23. Gallego Romero, I., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification. BMC Biology. 12, 42(2014).
  24. Bevilacqua, C., Makhzami, S., Helbling, J. C., Defrenaix, P., Martin, P. Maintaining RNA integrity in a homogeneous population of mammary epithelial cells isolated by Laser Capture Microdissection. BMC Cell Biology. 11, 95(2010).
  25. Mahalingam, M. Laser Capture Microdissection: Insights into Methods and Applications. Laser Capture Microdissection: Methods and Protocols. Murray, G. I. , Humana Press. New York, NY. 1-17 (2018).
  26. Burgemeister, R., Gangnus, R., Haar, B., Schütze, K., Sauer, U. High quality RNA retrieved from samples obtained by using LMPC (laser microdissection and pressure catapulting) technology. Pathology, Research and Practice. 199 (6), 431-436 (2003).
  27. Cummings, M., et al. A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue. Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).
  28. Clément-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions. RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).
  29. Kölble, K. The LEICA microdissection system: design and applications. Journal of Molecular Medicine. 78 (7), B24-B25 (2000).
  30. Böhm, M., Wieland, I., Schütze, K., Rübben, H. Microbeam MOMeNT: non-contact laser microdissection of membrane-mounted native tissue. The American Journal of Pathology. 151 (1), 63-67 (1997).
  31. Micke, P., et al. A fluid cover medium provides superior morphology and preserves RNA integrity in tissue sections for laser microdissection and pressure catapulting. The Journal of Pathology. 202 (1), 130-138 (2004).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Laser Capture MicrodissectionRNA ExtractionMouse Bone SectionsCryosection PreparationStaining ProtocolGravity based LCM SystemColumn based RNA ExtractionMicrocapillary ElectrophoresisRIN Value AnalysisBone Cell Isolation

Powiązane artykuły