Charakterystyka sierpa podczas kontrolowanego automatycznego odtleniania za pomocą ektacytometrii gradientu tlenu

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy ektacytometrię gradientu tlenu, szybką i powtarzalną metodę pomiaru odkształcalności czerwonych krwinek w próbkach pobranych od pacjentów z niedokrwistością sierpowatokrwinkową pod kontrolowaną deoksygenacją i reoksygenacją. Technika ta umożliwia badanie sierpowactwa czerwonych krwinek i monitorowanie skuteczności leczenia niedokrwistości sierpowatokrwinkowej.

Streszczenie

W niedokrwistości sierpowatokrwinkowej (SCD) pojedyncza mutacja punktowa w genie kodującym beta-globinę powoduje produkcję nieprawidłowej hemoglobiny S (HbS). Po odtlenieniu HbS może polimeryzować, tworząc sztywne pręty hemoglobiny, co powoduje sierpowość czerwonych krwinek (RBC). Te sierpowe erytrocyty znacznie zmniejszyły odkształcalność, powodując niedrożność naczyń, co prowadzi do licznych powikłań klinicznych związanych z SCD, w tym bólu, udaru i uszkodzenia narządów. Deformowalność RBC jest również zmniejszona przez odwodnienie RBC, co skutkuje gęstymi czerwonymi krwinkami, które są bardziej podatne na sierp. Do tej pory nie ma ani jednego powszechnie dostępnego, szybkiego i powtarzalnego testu laboratoryjnego zdolnego do przewidywania ciężkości choroby lub bezpośredniego monitorowania efektów leczenia w przypadku nowych, niepłodowych terapii indukujących hemoglobinę. W tym badaniu opisujemy protokół pomiaru odkształcalności RBC jako funkcji pO₂, który pozwala na ilościowe określenie zachowania sierpowatego u pacjentów z SCD. Ektacytometria gradientu tlenu mierzy odkształcalność RBC, wyrażoną jako wskaźnik wydłużenia (EI), w funkcji pO₂. Erytrocyty są narażone na stałe naprężenie ścinające wynoszące 30 Pa podczas jednej rundy odtleniania i ponownego natleniania. Wytwarzanych jest sześć parametrów odczytu. Spośród nich punkt sierpowatości (PoS), zdefiniowany jako pO₂, przy którym maksymalne EI (EI_max) wykazuje 5% spadek, oraz minimalne EI podczas odtleniania (EI_min) są najbardziej pouczające, odzwierciedlając indywidualne pO₂ pacjenta, przy którym zaczyna się sierp i minimalną odkształcalność czerwonych krwinek pacjenta, odpowiednio. PoS jest związany z powinowactwem hemoglobiny do tlenu u danego pacjenta, podczas gdy EI_min wykazuje silną korelację z poziomem hemoglobiny płodowej. Wnioskujemy, że ektacytometria gradientu tlenu jest obiecującą techniką monitorowania leczenia pacjentów z SCD, jako biomarker środków przeciwsierpowych w badaniach klinicznych i przedklinicznych oraz ważne narzędzie do badania sierpowatego zachowania erytrocytów u osób z cechami SCD i sierpowatokrwinkowymi.

Wprowadzenie

W SCD, mutacja punktowa powoduje produkcję HbS, który może polimeryzować po odtlenieniu. Polimeryzacja HbS powoduje sierpowatość erytrocytów i zmniejsza odkształcalność krwinek czerwonych. Połączenie sierpowatości RBC i przylegania RBC do śródbłonka prowadzi do różnych powikłań SCD, w tym kryzysów naczynio-okluzyjnych (LZO), udaru, uszkodzenia narządów i przewlekłej niedokrwistości hemolitycznej. Nawet w warunkach normoksyjnych odkształcalność RBC jest zagrożona u pacjentów z SCD. Odkształcalność jest dodatkowo zmniejszona przy niskich stężeniach tlenu. Kluczowymi czynnikami, które decydują o odkształcalności w normoksji, są gęste komórki, nieodwracalnie sierpowate komórki (ISC) i odwodnione komórki, z których wszystkie mają zmniejszony stosunek powierzchni do objętości^1,2,3.

Ektacytometria to sprawdzona metoda pomiaru odkształcalności RBC, szeroko stosowana do diagnozowania dziedzicznych niedokrwistości hemolitycznych, szczególnie membranopatii⁴. Może być również używany do badania hemorheologii^5,6,7,8^,9. Ektacytometria gradientu osmotycznego, w której odkształcalność RBC jest mierzona podczas ciągłej zmiany osmolalności, jest stosowana do badania SCD od ponad dekady^10,11. Procentowa zawartość hemoglobiny płodowej (HbF) jest jednym z najsilniejszych inhibitorów polimeryzacji HbS, ponieważ ani HbF, ani jej mieszany hybrydowy tetramer (∝2βSγ) nie mogą wejść w fazę polimeru deoksyHbS¹². Ostatnie badania sugerują, że zwiększenie poziomu HbF u pacjentów z SCD prowadzi do lepszego stosunku powierzchni do objętości, poprawiając w ten sposób stan nawodnienia, a tym samym odkształcalność u pacjentów bez transfuzji¹¹.

Deformowalność RBC była badana w przeszłości jako biomarker powikłań SCD, ale z sprzecznymi wynikami. W badaniach przeprowadzonych przekrojowo i w stanie stacjonarnym stwierdzono, że osoby z wyższym poziomem odkształcalności RBC mają większą częstość występowania martwicy kości i więcej kryzysów bólowych^13,14,15. W przeciwieństwie do tych wyników, w porównaniu z wartościami w stanie stacjonarnym podczas ostrego LZO, odkształcalność RBC była zmniejszona w badaniach podłużnych u tych samych osób¹⁶. Ta rozbieżność może być wynikiem badania odkształcalności RBC w różnych warunkach (tj. w stanie stacjonarnym w porównaniu z LZO). Odsetek komórek sierpowatych jest wysoki na początku LZO, a komórki są szybko niszczone w miarę postępu kryzysu, co może wyjaśniać różnicę między danymi dotyczącymi występowania w przekroju poprzecznym w stanie stacjonarnym a danymi dotyczącymi zmian w czasie uzyskanymi podczas LZO. Jednak inne czynniki, takie jak przyleganie subpopulacji RBC do powierzchni śródbłonka, mogą być również ważne w występowaniu LZO. W SCD bardziej istotne klinicznie jest mierzenie odkształcalności podczas odtleniania, ponieważ niedrożność naczyń krwionośnych zwykle występuje w niedotlenionych żyłkach postkapilarnych, a nie w mniej niedotlenionej sieci mikrokapilarnej¹⁷. Dodatkowo, obecność ISC może zmieniać zdolność ektacytometru do pomiaru odkształcalności w normoksji. Zniekształcenie wzoru dyfrakcyjnego jest spowodowane przez ISC, co wynika z niewyrównania podczas przepływu^1,2,3.

Alternatywne podejścia do badania patofizjologii LZO obejmują pomiary przylegania RBC do sztucznej powierzchni¹⁸, cytometria mikroprzepływowa impedancji elektrycznej pojedynczej komórki¹⁹, modele mikroprzepływowe łączące ilościowe pomiary sierpowatości i niesierpowatości komórek z reologią pojedynczych komórek²⁰, oraz polimeryzacja indukowana laserem²¹. Chociaż są obiecujące, techniki te są kosztowne, pracochłonne i wymagają intensywnego szkolenia operatorów. Ponadto testy oparte na morfologii nie mają możliwości badania zachowania komórek, takiego jak odkształcalność, w funkcji gradientu tlenu.

W tym badaniu opisujemy szybki i powtarzalny test funkcjonalny wykonywany za pomocą ektacytometru. Jest to pomiar ektacytometryczny nowej generacji, który mierzy różne jakościowe aspekty odkształcalności RBC wyrażonej jako EI podczas odtleniania (1300 s) i szybkiego dotlenienia (280 s). Te przedziały czasowe pozwalają na tworzenie się polimeru HbS, a co za tym idzie zachodzenie zmian morfologicznych, a następnie regenerację. Odtlenienie następuje poprzez wprowadzenie azotu gazowego, który powoli obniża ciśnienie tlenu w próbce krwi w szczelinie między bobem a miseczką ektacytometru. Odkształcalność RBC jest mierzona w sposób ciągły, podczas gdy napięcie tlenu jest mierzone co 20 s za pomocą małego punktu O₂ znajdującego się w ściance kubka. Podczas badania około 80 pomiarów pO₂ jest sprzężonych z EI zmierzonym w tym momencie. Podczas odtleniania ciśnienie tlenu spada poniżej 20 mmHg, a ponowne natlenienie jest ułatwione dzięki biernej dyfuzji otaczającego powietrza. Eksperymentalna konfiguracja ektacytometru i modułu ektacytometrii gradientu tlenu jest opisana w Rysunek 1 i Rysunek 2. Zasada ektacytometrii opiera się na indukowanym przez RBC rozpraszaniu światła z wiązki laserowej. Powoduje to eliptyczny wzór dyfrakcyjny, gdy naprężenie ścinające jest przykładane w tym samym czasie (Rysunek 1).

Protokół

Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez komisję etyczną Uniwersyteckiego Centrum Medycznego w Utrechcie (UMCU) i zgodnie z Deklaracją Helsińską. Pacjenci zapisani do Texas Children's Hematology Center (TCHC) zostali zatwierdzeni przez lokalny IRB i zgodnie z Deklaracją Helsińską.

1. Uwagi ogólne

1. Zacznij od wykonania pomiaru testowego, aby rozgrzać bob i filiżankę. Upewnij się, że temperatura boba i kubka wynosi 37 °C. Jest to ważne dla dobrej odtwarzalności.
2. Upewnij się, że lepki roztwór poliwinylopirolidonu (PVP) mieści się w ścisłych granicach osmolarności (282–286 mOsm/kg), pH (7,35–7,45) i lepkości (27,5–32,5 MPa) w temperaturze pokojowej (22 °C).
   UWAGA: PVP musi być używany w temperaturze pokojowej. Jeśli jest przechowywany w niższej temperaturze, upewnij się, że rozgrzał się do temperatury pokojowej przed wykonaniem jakichkolwiek pomiarów.

2. Uruchomienie ektacytometru

1. Włącz komputer i ektacytometr od tyłu. Uruchom program (Spis materiałów) na komputerze.
2. Upewnij się, że azot jest dostępny do odtlenienia próbki, otwierając butlę z azotem.
3. Opuść boczek w miseczce i upewnij się, że kubek może się swobodnie obracać. Wyczyść kubek od wewnątrz i na zewnątrz miękką szmatką i wodą destylowaną, ponieważ zanieczyszczenia mogą utrudniać pomiary EI.
4. Gdy program jest uruchomiony, sprawdź, czy na ekranie pojawia się następujący komunikat: "Upewnij się, że zawór gazu jest otwarty" i kliknij OK.
5. Upewnij się, że ektacytometr rozpoczyna proces samokontroli pO₂, który pojawi się na ekranie. Wybierz Start (wprowadź). Jeśli to się nie powiedzie, uruchom ponownie samokontrolę, klikając pozycję Sprawdzanie sprzętu | pO₂ | Samokontrola.
   UWAGA: Jeśli samokontrola ponownie się nie powiedzie, rozważ wymianę punktu O₂. Punkt O₂ zastępuje się poprzez delikatne wypchnięcie punktu z wnętrza kubka opuszkiem palca. Nowe miejsce umieszcza się, delikatnie wciskając miejsce z zewnątrz do kubka.
6. Wybierz skan pO₂ z różnych testów wymienionych po lewej stronie. Wybierz Ustawienia po prawej stronie ekranu i upewnij się, że są one ustawione zgodnie z parametrami wymienionymi w Tabeli 1. Zachowaj te same ustawienia dla każdego pomiaru.
7. Aby zapisać te ustawienia, naciśnij OK | OK.
   UWAGA: Preferowane ustawienia są wymienione w Tabeli 1, ale można je dostosować zgodnie z preferencjami użytkownika i celami badawczymi. Na przykład, aby dokładniej zbadać zachowanie sierpowatości, można zmienić szybkość i czas trwania odtleniania.

3. Pobieranie i przygotowanie próbek

UWAGA: Do walidacji techniki, użyto krwi poddanej działaniu kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) od 38 pacjentów z SCD i 5 zdrowych osób z grupy kontrolnej włączonych do University Medical Center Utrecht lub Texas Children's Hematology Center, w różnych badaniach klinicznych (identyfikator Holenderskiego Rejestru Badań [NTR], NTR 6779 i NTR 6462), a także anonimowe próbki krwi od pacjentów, którzy odwiedzili przychodnię lub byli hospitalizowani.

1. Pobrać próbki krwi przez nakłucie dożylne (minimum 300 μl/próbkę) w probówce zawierającej EDTA. Upewnij się, że krew była przechowywana przez co najmniej 30 minut w temperaturze 4 °C, ale nie dłużej niż 24 godziny
   UWAGA: Można również stosować cytrynian, fosforan dekstrozadeninę adeninę (CPDA) lub heparynę, ale wpływ tych odczynników na zachowanie próbki w odniesieniu do ektacytometrii gradientu tlenu nie jest dobrze znany.
2. Delikatnie wymieszać próbkę przez odwrócenie w celu homogenizacji. Nie potrząsaj próbką. Pozwól próbce rozgrzać się do temperatury pokojowej na stole rolkowym przed pomiarem.
   UWAGA: Probówka z próbką (9–10 ml), która jest przechowywana przez ponad 1 godzinę w temperaturze 4 °C, musi się nagrzewać przez 15 minut. W przypadku przechowywania krócej niż 1 godzinę w temperaturze 4 °C musi się nagrzewać przez 10 minut. Probówka z próbką (2–6 ml), która jest przechowywana przez ponad 1 godzinę w temperaturze 4 °C, musi się nagrzewać przez 10 minut. W przypadku przechowywania przez mniej niż 1 godzinę w temperaturze 4 °C musi się nagrzewać przez 5 minut.
3. Zmierz pełną morfologię krwi na analizatorze hematologicznym. W tym celu należy pobrać 20–200 μl krwi pełnej w probówce zawierającej EDTA. Umieścić igłę aspiracyjną w probówce i nacisnąć przycisk za igłą analizatora hematologicznego, aby rozpocząć pomiar.
   UWAGA: W pełnej morfologii krwi mierzy się liczbę RBC, która jest ważnym czynnikiem standaryzacji pomiarów ektacytometrii gradientu tlenu. Liczba RBC jest obliczana na podstawie rozproszenia do przodu i na boki za pomocą cytometrii przepływowej. Prawidłowa liczba erytrocytów u zdrowych osób z grupy kontrolnej wynosi 3,7–5,0 x 10¹²/L dla kobiet i 4,2–5,5 x 10¹²/L dla mężczyzn. Liczba krwinek czerwonych u pacjentów z SCD jest na ogół zmniejszona. Niektóre analizatory hematologiczne mierzą również procentową gęstość czerwonych krwinek (% DRBC), co może mieć dodatkową wartość w interpretacji indywidualnych krzywych ektacytometrii gradientu tlenu.
4. Standaryzować próbkę krwi pełnej do liczby RBC 200 x 10⁶ RBC w 5 ml PVP (200 x 10⁶ RBC / fiolkę), dostosowując objętość próbki, która zostanie dodana. Jeśli całkowita liczba RBC jest mniejsza niż 200 x 10⁶, będzie to miało wpływ na wzór dyfrakcyjny i EI.
   1. Użyj poniższego równania, aby wykonać liczenie.
      4,0/xx (x 10¹²/L) x 50 = yy μL krwi pełnej/fiolkę PVP
      gdzie xx jest obliczoną liczbą krwinek czerwonych uzyskaną z kroku 3.3, a yy jest ilością krwi pełnej, która jest wymagana do rzeczywistego pomiaru. W zależności od stopnia niedokrwistości i innych czynników wpływających na liczbę krwinek czerwonych, wymagana ilość krwi pełnej wynosi 40–90 μl.

4. Pomiar ektacytometrii gradientu tlenu

1. Odpipetować obliczoną objętość próbki (yy μl krwi) do PVP, aby uzyskać całkowitą objętość 5 ml. Wstępnie zwilż końcówkę, delikatnie ponownie zawieszając krew 3 razy. Użyj końcówki do pipety z szerokim otworem, aby uniknąć dodatkowego obciążenia RBC. Delikatnie wymieszaj próbkę ręcznie przez odwrócenie, aż stanie się jednorodna.
   UWAGA: Otwórz fiolkę PVP na jak najkrótszy czas, aby uniknąć kontaktu z powietrzem.
2. Powoli pobrać 2,0 ml mieszaniny krwi i PVP do strzykawki o pojemności 3 ml bez igły. Nacisnąć tłok, aby usunąć wszelkie widoczne pęcherzyki powietrza i nadmiar roztworu próbki, aż w strzykawce pozostanie 1,5–1,8 ml (w zależności od objętości kubka).
3. Wstrzyknąć całkowitą objętość próbki powoli i równomiernie do boba przez złącze. Upewnij się, że poziom próbki znajduje się powyżej sondy lambda (różowa plamka) i powyżej małego otworu ssącego. Nie pozostawiać roztworu próbki w strzykawce.
4. Kliknij przycisk Nowa i wypełnij identyfikator próbki, uwagi, datę oddania i lepkość PVP. Kliknij przycisk OK |Aspirat. Po 60 s kubek obróci się i zasysa próbkę przez 15 sekund. Kliknij przycisk OK po zatrzymaniu obrotu. Zamknij pokrywę urządzenia. Kliknij przycisk Kontynuuj | Zacznij już teraz, ponieważ ektacytometria gradientu tlenu jest wykonywana ze stałym wzmocnieniem. Pomiar zajmie około 28 minut.
5. Po pomiarze wydrukuj raport, który pokazuje krzywą i parametry, które są automatycznie obliczane przez oprogramowanie. Upewnij się, że nieprzetworzone dane są automatycznie przechowywane w wyznaczonym folderze w Ustawieniach. Maksymalne EI (EI_max), minimalne EI (EI_min), pO₂@95%EI (PoS) i pole (pole pod krzywą) są automatycznie obliczane i dodawane do drukowanego raportu i surowych danych.
6. Ręcznie uzyskaj ΔEI, obliczając różnicę między EI_max a EI_min. Obliczyć procentowy odzysk, biorąc pod uwagę różnicę między średnimi wartościami EI przed odtlenieniem (pO₂ 100–120 mmHg) i średnimi wartościami EI podczas reoksygenacji przy 100–120 mmHg.

5. Czyszczenie ektacytometru

1. Wyjąć strzykawkę z próbką i zastąpić ją strzykawką wypełnioną wodą destylowaną lub wodą dejonizowaną.
2. Naciśnij przycisk Wyczyść, powoli przepłukując złącze podczas płukania. Upewnij się, że spłukujesz w obu kierunkach.
3. Wyjąć strzykawkę i podnieść bosk. Dokładnie osusz bob, kubek i łącznik miękką szmatką.
4. Użyj dużej strzykawki (10–50 ml), aby przepłukać złącze, aby usunąć wodę pozostałą w rurkach i strzykawce. Zablokuj dolny wlot/wylot boba, aby uzyskać ciśnienie zwrotne w rurach, usuwając w ten sposób pozostałą wodę.
5. Opuść bob w miseczce. Maszyna jest teraz gotowa do następnego pomiaru.

6. Wyłączenie maszyny

1. Upewnij się, że maszyna została prawidłowo wypłukana po ostatnim pomiarze, jak opisano powyżej. Upewnij się, że odpowiednie rurki są podłączone do roztworu czyszczącego.
2. Zamknij oprogramowanie, naciśnij Zamknij i naciśnij Start, aby uruchomić program czyszczenia na koniec dnia.
3. Po zakończeniu całego programu czyszczenia wyjmij strzykawkę i podnieś bob. Przepłucz złącze dużą strzykawką.
4. Opróżnij pojemnik na odpady i osusz bob i kubek miękką szmatką. Przepłucz złącze, aby usunąć wodę pozostałą w rurkach i bob. Zablokuj dolny wlot/wylot boba, aby uzyskać ciśnienie zwrotne w rurach, usuwając w ten sposób pozostałą wodę.
5. Zamknij pokrywę urządzenia. Zamknij butlę z azotem. Wyłącz komputer i urządzenie.

Wyniki

Ektacytometria gradientu tlenu może być użyta do scharakteryzowania zachowania sierpowatości u pacjentów z SCD. W badaniu tym uwzględniono próbki krwi od łącznie 38 pacjentów z SCD i pięciu zdrowych osób z grupy kontrolnej. W zdrowych kontrolach wzór dyfrakcyjny jest kołowy w spoczynku i eliptyczny przy wyższym naprężeniu ścinającym⁴. Na podstawie eliptycznego wzoru dyfrakcyjnego współczynnik wydłużenia (EI) oblicza się na podstawie wysokości i szerokości wzoru dyfrakcyjnego. W ektacytometrii gradientu tlenu powolne i ciągłe odtlenianie próbki przez gazowy azot następuje po szybkim ponownym natlenieniu przez powietrze otoczenia. W tych warunkach sierp RBC można zaobserwować podczas odtleniania. Spowoduje to zniekształcenie wzoru dyfrakcyjnego, ponieważ sierpowate krwinki czerwone nie ustawią się prawidłowo pod przyłożonym naprężeniem ścinającym. W związku z tym wydają się być mniej odkształcalne w przeciwieństwie do zdrowych krwinek czerwonych (Rysunek 2).

Rysunek 3A pokazuje, jak sierpowe RBC zmieniają swój kształt po odtlenieniu, co naśladowało warunki podczas ektacytometrii gradientu tlenu, podczas gdy kontrolne sierpowe RBC bez odtleniania nie wykazują zmiany kształtu. Proces ten powoduje zniekształcenie wzoru dyfrakcyjnego podczas ektacytometrii gradientu tlenu, a co za tym idzie spadek EI. Rysunek 3B pokazuje różne wzory dyfrakcyjne, z których generowane są różne parametry.

Reprezentatywna krzywa uzyskana za pomocą ektacytometru jest pokazana w Rysunek 3C. Sześć parametrów odzwierciedla różne cechy sierpowatego zachowania RBC: EI_max to maksymalne EI na początku pomiaru przed odtlenieniem. Parametr ten odpowiada położeniu początkowemu i odzwierciedla ogólną odkształcalność całej populacji erytrocytów w otaczającym powietrzu. EI_min to minimalna EI, która oznacza minimalną odkształcalność po odtlenieniu. Parametr ten odzwierciedla zmiany kształtu i orientacji (sierpowatych) erytrocytów po odtlenieniu. ΔEI to różnica między EI_max a EI_min, która wskazuje, ile komórek może sierpowi podczas jednej rundy odtleniania. 5% Punkt Sierpa (PoS_5%) to pO₂ (mmHg), przy którym mierzy się 5% spadek EI_max podczas odtleniania. Reprezentuje to ciśnienie tlenu w miejscu, w którym rozpoczyna się proces sierpowatości. Pole odzwierciedla obszar pod krzywą, który jest określany przez całkowe obliczenie pomiarów EI i pO₂ w zakresie od 100 mmHg do pO₂min (mmHg). Jest to wynik wcześniej opisanych parametrów EI_max, EI_min i PoS. Odzysk reprezentuje różnicę EI podczas końcowej fazy reoksygenacji w porównaniu z EI na początku badania. Obie wartości EI są mierzone przy pO₂ wynoszącym 100–120 mmHg. Ten parametr odzwierciedla zdolność erytrocytów, które poruszają się sierpowo podczas odtleniania, do odwrócenia sierpowatości podczas reoksygenacji²². Parametry z podwójnych pomiarów miały na ogół współczynnik zmienności (CV) <5% (mediana 1,83%). W przypadku uzyskania CV > 5% wykonywano trzeci pomiar. Najbardziej powtarzalne są parametry EI_max i Recovery z medianą CV <1%.

Reprezentatywne krzywe RBC zdrowych osób z grupy kontrolnej, pacjentów z cechami HbS (heterozygotyczne HbS) i homozygotycznego pacjenta z SCD są pokazane w Rysunek 4A. Reprezentatywna krzywa pacjenta z HbSC pokazuje mniejszą regenerację, co może wskazywać na inny proces sierpowaty (Rysunek 4B). Reprezentatywne krzywe pacjentów z HbSS leczonych hydroksymocznikiem (HU) i transfuzją są pokazane na Rysunek 4C i Rysunek 4D. Wyraźnie widać, że istnieje duża różnica między reprezentatywnymi krzywymi cech HS (komórki HbAS) a krwinkami czerwonymi pacjentów z HbSS leczonych transfuzją (składającą się z mieszaniny homozygotycznych komórek sierpowatych (HbSS) i homozygotycznych normalnych (HbAA), Figura 4A,D). Wyraźne różnice w krzywych u nieleczonego pacjenta z SCD i pacjentów z HU oraz pacjentów leczonych transfuzją podkreślają przydatność tego testu (Rysunek 4C,D). Poziomy HbF i HbS korelowały istotnie z EI_min oraz, w mniejszym stopniu, z PoS (Rysunek 5A–D). Wskazuje to, że te parametry laboratoryjne, które są ważne w ocenie pacjenta, znajdują również odzwierciedlenie w ektacytometrii gradientu tlenu. Liczba komórek sierpowatych w normoksji i procent gęstych erytrocytów (DRBC) wpływają na wartości EImax, ponieważ są one istotnie skorelowane (Rysunek 5E–F), co wskazuje, że EImax odzwierciedla inny ważny czynnik w procesie sierpowatości. Wyniki te pokazują, jak różne cechy, takie jak %HbS, %HbF, komórki sierpowate w normoksji i %DRBC, wpływają na różne parametry.

Rysunek 1. Schemat działania ektacytometru. Ektacytometr wykorzystuje system Couette'a do wywierania naprężeń ścinających na komórki. Obracający się cylinder zewnętrzny (miseczka) i statyczny cylinder wewnętrzny (bob) są używane do wywoływania naprężeń ścinających poprzez wytworzenie przepływu laminarnego w temperaturze 37 °C. Pomiędzy bobem a miseczką znajduje się niewielka szczelina, w którą wstrzykuje się zawiesinę krwi. Promień lasera świeci z boba przez zawiesinę krwi i jest rozpraszany przez obecność erytrocytów. Wzór dyfrakcyjny jest rzutowany i analizowany przez kamerę. Współczynnik wydłużenia (EI) jest obliczany na podstawie wysokości (a) i szerokości (b) wzoru dyfrakcyjnego⁴. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Schemat ektacytometru z modułem ektacytometrii gradientu tlenu. Schemat ideowy modułu, który pokazuje powolne odtlenianie zawiesiny krwi za pomocą infuzji azotu gazowego (N₂). Napięcie tlenu mierzy się ilością wygaszania sygnału luminoforu wysyłanego z włókna LED do punktu O₂. Po odtlenieniu sierpowe erytrocyty zaczną sierpowate, ich odkształcalność zmniejszy się i nie będą już ustawiać się w jednej linii z eliptycznymi krwinkami czerwonymi. Sierpowate erytrocyty zniekształcą wzór dyfrakcyjny, zmieniając jego kształt z elipsy na romboidalny lub romboidalny. Ta zmiana kształtu wzoru dyfrakcyjnego powoduje spadek EI. Pomiary pO₂ i EI nie są wykonywane na tej samej wysokości w miseczce. Zapewnia to lepszą dyskryminację między krzywymi odtleniania i retleniacji, a tym samym lepszą interpretację krzywej. Ten rysunek został zmodyfikowany z Rab et al.²² Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3. Reprezentatywna krzywa ektacytometrii gradientu tlenu i wzory dyfrakcyjne. (A) Po odtlenieniu w warunkach podobnych do ektacytometrii gradientu tlenu, utrwalono sierpowe erytrocyty. W kontrolnych krwinkach czerwonych sierpowych zastosowano te same warunki, ale bez azotu gazowego. Odtlenione sierpowe erytrocyty wykazują zmianę kształtu w przeciwieństwie do kontrolnych krwinek czerwonych. (B) Po odtlenieniu i naprężeniu ścinającym (30 Pa) wzór dyfrakcyjny zmienia się z elipsy na romboidalny. (C) Reprezentatywna krzywa ektacytometrii gradientu tlenu. Maksymalny wskaźnik wydłużenia (EI_max) reprezentuje pozycję wyjściową i pokazuje ogólną odkształcalność całej populacji RBC. Minimalna EI (EI_min) oznacza minimalną odkształcalność, która jest spowodowana zmianą kształtu i orientacji erytrocytów po odtlenieniu. ΔEI (dEI, różnica w EI_{między EI max} i EI_min) pokazuje, ile komórek może sierpowi podczas jednej rundy odtleniania. Punkt sierpowania (PoS, pO₂ przy 5% spadku EI) pokazuje ciśnienie tlenu, gdy pierwsze erytrocyty zaczynają sierpować. Pole pod krzywą (od pO_2min = 100 mmHg) oblicza się w obszarze parametrów. To podsumowuje EI_max, EI_min i PoS. Zdolność komórek sierpowatych do rozwikłania się podczas reoksygenacji jest reprezentowana przez parametr Recovery (procent_{EI max} osiągnięty podczas reoksygenacji). Aby ułatwić interpretację, wszystkie punkty danych w każdym pojedynczym eksperymencie zostały połączone linią, aby graficznie przedstawić wyniki. Ten rysunek został zmodyfikowany z Rab et al.²² Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4. Parametry ektacytometrii gradientu tlenu korelują z genotypem i schematami leczenia pacjentów z SCD z SCD. (A) Reprezentatywny wykres erytrocytów nosicieli HbS (cecha HbS) i zdrowych osób z grupy kontrolnej w odniesieniu do nieleczonych pacjentów z HbSS. (B) Reprezentatywny wykres erytrocytów u pacjentów z chorobą hemoglobiny SC (HbSC) w odniesieniu do nieleczonych pacjentów z HbSS. (C) Reprezentatywny wykres erytrocytów u pacjentów z homozygotycznym SCD leczonym hydroksymocznikiem (HbSS HU) w stosunku do nieleczonych pacjentów z HbSS. (D) Reprezentatywny wykres erytrocytów u pacjentów z HbSS leczonych transfuzją krwi (transfuzja HbSS) w stosunku do nieleczonych pacjentów z HbSS. Ten rysunek został zmodyfikowany z Rab et al.²² Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5. Parametry ektacytometrii gradientu tlenu są związane z %HbF, %HbS, %komórkami sierpowatymi w normoksji i %gęstymi krwinkami czerwonymi. (A) Liniowa korelacja minimalnego wskaźnika wydłużenia (EI_min) i %HbF u 15 HbSS lub HbS/β-talasemii pacjentów bez transfuzji. (B) Korelacja liniowa_{EI min} i %HbS. (C) Korelacja liniowa PoS i %HbF. (D) Korelacja liniowa PoS i %HbS. (E) Korelacja liniowa maksymalnego EI (EI_max) i procentu komórek sierpowatych w normoksji mierzona mikroskopią cyfrową. (F) Liniowa korelacja_{EI max} i procentowo gęstych erytrocytów (%DRBC) u 21 pacjentów z HbSS. Ten rysunek został zmodyfikowany z Rab et al.²² Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rozdział

Ustawienia
Pliki	Katalog pamięci masowej
Opcje ogólne	Domyślna średnia lepkość	Lepkość PVP
Skanowanie pO2	Minimalny czas aspiracji (s)	60
	naprężenie ścinające skanowania pO2 (Pa)	Rozdział 30
	Oznaczanie pO2 co (S)	20
	Wielkość średniej ruchomej	cyfra arabska
	krok skanowania pO2; Redagować	0 -WYŁ.; 60 -WŁ.; 1360 –WYŁ ; 1640 -WYŁ
	Powierzchnia kalkulacyjna pomiędzy (mmHg)	10 oraz 100
	Kontrola pO2	Wyłączone (niezaznaczone)

Tabela 1. Preferowane ustawienie ektacytometru.

Dyskusja

Tutaj opisujemy ektacytometrię gradientu tlenu, metodę, która może być wykorzystana do badania sierpowatego zachowania czerwonych krwinek od pacjentów z SCD w zakresie stężeń tlenu (ryc. 4 i ryc. 5). Aby uzyskać powtarzalne wyniki, ważne jest zidentyfikowanie czynników, które wpływają na wyniki. Na przykład temperatura ma duży wpływ na odkształcalność RBC, głównie ze względu na jej wpływ na gęstość lepkiego roztworu (PVP). Zalecamy wykonanie pomiaru testowego na początku dnia, aby dokładnie podgrzać maszynę do 37 °C. Poprawi to odtwarzalność wyników. Osmolarność lepkiego roztworu powinna mieścić się w wąskim zakresie (282–286 mOsm/kg dla PVP), ponieważ osmolarność wpływa na stan uwodnienia, co z kolei wpływa na odkształcalność RBC. pH i lepkość PVP również powinny być ściśle regulowane. Różnice w pH i temperaturze mogą mieć ogromny wpływ na krzywe²². Dodatkowo, pozostała woda w kubku, bobiku i rurkach może powodować lizę RBC, co skutkuje nieprawidłowymi danymi, ponieważ mierzonych będzie mniej nienaruszonych RBC obecnych w kubku.

Ustawienia do wykonywania ektacytometrii gradientu tlenu można dostosować w celu rozwiązania określonych pytań badawczych. Preferowane ustawienia są wymienione w Tabeli 1. Czas odtleniania wynoszący 1300 s został wybrany na podstawie obserwacji wykazujących, że wydłużenie odtlenienia nie skutkowało niższym_{EI min} u większości pacjentów. Z kolei skrócenie czasu odtleniania ograniczyłoby moc dyskryminacyjną ektacytometrii gradientu tlenu. Czas reoksygenacji ustalono na 280 s ze względu na szybko rozpuszczające się polimery HbS podczas reoksygenacji i jednoczesne przywrócenie EI do wartości zmierzonych przed odtlenieniem. Naprężenie ścinające zostało ustawione na 30 Pa, co jest analogiczne do ektacytometrii gradientu osmotycznego. Obniżenie tego parametru może ograniczyć moc dyskryminacyjną. Kontrola odtleniania może być zastosowana, jeśli do każdej próbki pacjenta zostanie zastosowany zestaw prędkości odtleniania. W preferowanych przez nas ustawieniach ta opcja została wyłączona, ponieważ szybkość odtleniania jest specyficzna dla pacjenta ze względu na unikalną krzywą dysocjacji hemoglobiny. W związku z tym włączenie kontroli odtleniania wyeliminowałoby tę cechę z testu. Jednak ta cecha ektacytometrii gradientu tlenu jest nadal badana.

Na parametry ektacytometrii gradientu tlenu wpływa kilka dobrze znanych czynników, a mianowicie pH, temperatura i osmolarność. Na ektacytometrię, zwłaszcza PoS, wpływa 2,3-difosfoglicerynian (2,3-DPG)²². Istnieje również wyraźna korelacja między %HbF a_{EI min}, a w mniejszym stopniu PoS (rysunek 5A–D). EI_max jest związany z komórkami sierpowatymi w normoksji, co może wyjaśniać obserwację, że krótko po LZO odkształcalność RBC w normoksji (EI_max) jest wyższa. To ostatnie jest spowodowane zniszczeniem najbardziej sierpowatych komórek, a tym samym mniej odkształcalnych erytrocytów podczas LZO¹⁶. Jak pokazano na rysunku 5F, erytrocyty o wyższej gęstości (zdefiniowane jako erytrocyty o stężeniu hemoglobiny >1,11 mg / ml) silnie korelują z niższym EI_max. Wskazuje to, że gęste komórki są ważnym czynnikiem odkształcalności RBC w normoksji, podobnie jak wcześniej zgłaszane wyniki¹.

Standaryzacja próbek jest bardzo ważna dla uzyskania powtarzalnych wyników oraz dla rozróżnienia między różnymi genotypami i zabiegami. Korekta liczby erytrocytów jest ważna, ponieważ liczba erytrocytów wpływa na intensywność wzoru dyfrakcyjnego. Jeśli niższe liczby RBC są obecne w przerwie między bobem a miseczką, krzywa przesunie się w górę i w lewo. Dodatkowo krzywa będzie się wahać, co utrudni dokładne obliczenie parametrów, zwłaszcza PoS.

Ograniczeniem tej techniki jest to, że wartość EI reprezentuje średnią ze wszystkich komórek, w tym z różnych subpopulacji. Intensywnie badano heterogeniczność populacji RBC u pacjentów z SCD i jej wpływ na pomiar ektacytometryczny. Doprowadziło to do standaryzacji, w której wielkość wzoru dyfrakcyjnego jest dostosowywana do stałej wartości, a nie korygowana dla liczby RBC^23,24. To, czy ten sposób standaryzacji powinien być również stosowany do pomiarów ektacytometrii gradientu tlenu, jest obecnie badane.

Opracowano kilka technik pomiaru odkształcalności RBC w warunkach niedotlenienia w oparciu o etap odtleniania, który odtleniał się poza ektacytometrem 25,26,27. W tych warunkach nie zaobserwowano różnic w zachowaniu komórek między pacjentami z cechami HbS a zdrowymi osobami z grupy kontrolnej pod fizjologicznym pH²⁵. Ektacytometria gradientu tlenu wyraźnie pokazuje jednak niski, ale wyraźny PoS u osób z cechami HbS (ryc. 4A). Do tej pory, w rutynowej praktyce klinicznej, jedynymi alternatywnymi metodami pomiaru skłonności erytrocytów poszczególnych pacjentów do sierpowatości in vitro jest test sierpowaty oparty na morfologii: erytrocyty są inkubowane w warunkach sprzyjających polimeryzacji HbS, takich jak niskie ciśnienie tlenu lub niskie pH. Po inkubacji dodaje się utrwalacz, a procent komórek sierpowatych zlicza się ręcznie lub cyfrowo za pomocą mikroskopii świetlnej. Wiele przedklinicznych i wczesnych faz badań farmakologicznych wykorzystuje test sierpowaty do wygenerowania drugorzędowej zmiennej końcowej, aby móc przewidzieć skuteczność kliniczną w SCD 28,29,30,31,32. Jest to jednak czasochłonne, zmienność jest duża, a czułość niska, technika nie jest zautomatyzowana, a zatem pracochłonna. Co więcej, zmiany morfologiczne spowodowane sierpem mogą nie korelować dobrze z parametrami fizjologicznymi, takimi jak odkształcalność RBC, ponieważ jest to dwuwymiarowy test statyczny².

Ektacytometria gradientu tlenu zapewnia funkcjonalny test sierpowa, który jest szybki i powtarzalny. Jest to test in vitro, który nie bierze pod uwagę powierzchni śródbłonka. Zapewnia jednak funkcjonalne aspekty zachowania sierpowatości i charakterystyki krwinek czerwonych, co czyni ją obiecującą techniką do badań nad krwinkami sierpowatymi. Przyszłe zastosowania tej techniki obejmują monitorowanie skuteczności leczenia u pacjentów z SCD, służenie jako biomarker dla nowych strategii leczenia, badanie zachowania sierpów i monitorowanie chimeryzmu po przeszczepie komórek macierzystych w SCD.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
ADVIA 120 Analizator hematologiczny	Siemens	067-A004-14	Instrument
Analizator hematologiczny Cell-Dyn Sapphire	Abbott	8H00-01	Instrument
Lorrca	RR Mechatronik	LORC109230 lub LORC109110	Instrument
Lorrca Wersja oprogramowania V5.08	RR Mechatronika
Azot gazowy 4.8 lub 5.0	Lokalnie	-
O2-spot	RR Mechatronika	PO2S020153	pomiar O2
Moduł Oxygenscan (pO2scan)	RR Mechatronika	PO2S109000	Add-on
Oxy-ISO	RR Mechatronika	QR 030905	Lepki roztwór
X-Clean	RR Mechatronika	QR 010946	Roztwór czyszczący Lorrca