Artykuł metodologiczny

Charakterystyka sierpa podczas kontrolowanego automatycznego odtleniania za pomocą ektacytometrii gradientu tlenu

11.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60213

⸱

5 listopada 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Clinical Chemistry and Hematology, University Medical Center Utrecht, Utrecht University, 2Van Creveldkliniek, University Medical Center Utrecht, Utrecht University, 3Department of Pediatrics, Division of Hematology/Oncology, Baylor College of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy ektacytometrię gradientu tlenu, szybką i powtarzalną metodę pomiaru odkształcalności czerwonych krwinek w próbkach pobranych od pacjentów z niedokrwistością sierpowatokrwinkową pod kontrolowaną deoksygenacją i reoksygenacją. Technika ta umożliwia badanie sierpowactwa czerwonych krwinek i monitorowanie skuteczności leczenia niedokrwistości sierpowatokrwinkowej.

Streszczenie

W niedokrwistości sierpowatokrwinkowej (SCD) pojedyncza mutacja punktowa w genie kodującym beta-globinę powoduje produkcję nieprawidłowej hemoglobiny S (HbS). Po odtlenieniu HbS może polimeryzować, tworząc sztywne pręty hemoglobiny, co powoduje sierpowość czerwonych krwinek (RBC). Te sierpowe erytrocyty znacznie zmniejszyły odkształcalność, powodując niedrożność naczyń, co prowadzi do licznych powikłań klinicznych związanych z SCD, w tym bólu, udaru i uszkodzenia narządów. Deformowalność RBC jest również zmniejszona przez odwodnienie RBC, co skutkuje gęstymi czerwonymi krwinkami, które są bardziej podatne na sierp. Do tej pory nie ma ani jednego powszechnie dostępnego, szybkiego i powtarzalnego testu laboratoryjnego zdolnego do przewidywania ciężkości choroby lub bezpośredniego monitorowania efektów leczenia w przypadku nowych, niepłodowych terapii indukujących hemoglobinę. W tym badaniu opisujemy protokół pomiaru odkształcalności RBC jako funkcji pO2, który pozwala na ilościowe określenie zachowania sierpowatego u pacjentów z SCD. Ektacytometria gradientu tlenu mierzy odkształcalność RBC, wyrażoną jako wskaźnik wydłużenia (EI), w funkcji pO2. Erytrocyty są narażone na stałe naprężenie ścinające wynoszące 30 Pa podczas jednej rundy odtleniania i ponownego natleniania. Wytwarzanych jest sześć parametrów odczytu. Spośród nich punkt sierpowatości (PoS), zdefiniowany jako pO2, przy którym maksymalne EI (EImax) wykazuje 5% spadek, oraz minimalne EI podczas odtleniania (EImin) są najbardziej pouczające, odzwierciedlając indywidualne pO2 pacjenta, przy którym zaczyna się sierp i minimalną odkształcalność czerwonych krwinek pacjenta, odpowiednio. PoS jest związany z powinowactwem hemoglobiny do tlenu u danego pacjenta, podczas gdy EImin wykazuje silną korelację z poziomem hemoglobiny płodowej. Wnioskujemy, że ektacytometria gradientu tlenu jest obiecującą techniką monitorowania leczenia pacjentów z SCD, jako biomarker środków przeciwsierpowych w badaniach klinicznych i przedklinicznych oraz ważne narzędzie do badania sierpowatego zachowania erytrocytów u osób z cechami SCD i sierpowatokrwinkowymi.

Wprowadzenie

W SCD, mutacja punktowa powoduje produkcję HbS, który może polimeryzować po odtlenieniu. Polimeryzacja HbS powoduje sierpowatość erytrocytów i zmniejsza odkształcalność krwinek czerwonych. Połączenie sierpowatości RBC i przylegania RBC do śródbłonka prowadzi do różnych powikłań SCD, w tym kryzysów naczynio-okluzyjnych (LZO), udaru, uszkodzenia narządów i przewlekłej niedokrwistości hemolitycznej. Nawet w warunkach normoksyjnych odkształcalność RBC jest zagrożona u pacjentów z SCD. Odkształcalność jest dodatkowo zmniejszona przy niskich stężeniach tlenu. Kluczowymi czynnikami, które decydują o odkształcalności w normoksji, są gęste komórki, nieodwracalnie sierpowate komórki (ISC) i odwodnione komórki, z których wszystkie mają zmniejszony stosunek powierzchni do objętości1,2,3.

Ektacytometria to sprawdzona metoda pomiaru odkształcalności RBC, szeroko stosowana do diagnozowania dziedzicznych niedokrwistości hemolitycznych, szczególnie membranopatii4. Może być również używany do badania hemorheologii5,6,7,8,9. Ektacytometria gradientu osmotycznego, w której odkształcalność RBC jest mierzona podczas ciągłej zmiany osmolalności, jest stosowana do badania SCD od ponad dekady10,11. Procentowa zawartość hemoglobiny płodowej (HbF) jest jednym z najsilniejszych inhibitorów polimeryzacji HbS, ponieważ ani HbF, ani jej mieszany hybrydowy tetramer (∝2βSγ) nie mogą wejść w fazę polimeru deoksyHbS12. Ostatnie badania sugerują, że zwiększenie poziomu HbF u pacjentów z SCD prowadzi do lepszego stosunku powierzchni do objętości, poprawiając w ten sposób stan nawodnienia, a tym samym odkształcalność u pacjentów bez transfuzji11.

Deformowalność RBC była badana w przeszłości jako biomarker powikłań SCD, ale z sprzecznymi wynikami. W badaniach przeprowadzonych przekrojowo i w stanie stacjonarnym stwierdzono, że osoby z wyższym poziomem odkształcalności RBC mają większą częstość występowania martwicy kości i więcej kryzysów bólowych13,14,15. W przeciwieństwie do tych wyników, w porównaniu z wartościami w stanie stacjonarnym podczas ostrego LZO, odkształcalność RBC była zmniejszona w badaniach podłużnych u tych samych osób16. Ta rozbieżność może być wynikiem badania odkształcalności RBC w różnych warunkach (tj. w stanie stacjonarnym w porównaniu z LZO). Odsetek komórek sierpowatych jest wysoki na początku LZO, a komórki są szybko niszczone w miarę postępu kryzysu, co może wyjaśniać różnicę między danymi dotyczącymi występowania w przekroju poprzecznym w stanie stacjonarnym a danymi dotyczącymi zmian w czasie uzyskanymi podczas LZO. Jednak inne czynniki, takie jak przyleganie subpopulacji RBC do powierzchni śródbłonka, mogą być również ważne w występowaniu LZO. W SCD bardziej istotne klinicznie jest mierzenie odkształcalności podczas odtleniania, ponieważ niedrożność naczyń krwionośnych zwykle występuje w niedotlenionych żyłkach postkapilarnych, a nie w mniej niedotlenionej sieci mikrokapilarnej17. Dodatkowo, obecność ISC może zmieniać zdolność ektacytometru do pomiaru odkształcalności w normoksji. Zniekształcenie wzoru dyfrakcyjnego jest spowodowane przez ISC, co wynika z niewyrównania podczas przepływu1,2,3.

Alternatywne podejścia do badania patofizjologii LZO obejmują pomiary przylegania RBC do sztucznej powierzchni18, cytometria mikroprzepływowa impedancji elektrycznej pojedynczej komórki19, modele mikroprzepływowe łączące ilościowe pomiary sierpowatości i niesierpowatości komórek z reologią pojedynczych komórek20, oraz polimeryzacja indukowana laserem21. Chociaż są obiecujące, techniki te są kosztowne, pracochłonne i wymagają intensywnego szkolenia operatorów. Ponadto testy oparte na morfologii nie mają możliwości badania zachowania komórek, takiego jak odkształcalność, w funkcji gradientu tlenu.

W tym badaniu opisujemy szybki i powtarzalny test funkcjonalny wykonywany za pomocą ektacytometru. Jest to pomiar ektacytometryczny nowej generacji, który mierzy różne jakościowe aspekty odkształcalności RBC wyrażonej jako EI podczas odtleniania (1300 s) i szybkiego dotlenienia (280 s). Te przedziały czasowe pozwalają na tworzenie się polimeru HbS, a co za tym idzie zachodzenie zmian morfologicznych, a następnie regenerację. Odtlenienie następuje poprzez wprowadzenie azotu gazowego, który powoli obniża ciśnienie tlenu w próbce krwi w szczelinie między bobem a miseczką ektacytometru. Odkształcalność RBC jest mierzona w sposób ciągły, podczas gdy napięcie tlenu jest mierzone co 20 s za pomocą małego punktu O2 znajdującego się w ściance kubka. Podczas badania około 80 pomiarów pO2 jest sprzężonych z EI zmierzonym w tym momencie. Podczas odtleniania ciśnienie tlenu spada poniżej 20 mmHg, a ponowne natlenienie jest ułatwione dzięki biernej dyfuzji otaczającego powietrza. Eksperymentalna konfiguracja ektacytometru i modułu ektacytometrii gradientu tlenu jest opisana w Rysunek 1 i Rysunek 2. Zasada ektacytometrii opiera się na indukowanym przez RBC rozpraszaniu światła z wiązki laserowej. Powoduje to eliptyczny wzór dyfrakcyjny, gdy naprężenie ścinające jest przykładane w tym samym czasie (Rysunek 1).

Protokół

Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez komisję etyczną Uniwersyteckiego Centrum Medycznego w Utrechcie (UMCU) i zgodnie z Deklaracją Helsińską. Pacjenci zapisani do Texas Children's Hematology Center (TCHC) zostali zatwierdzeni przez lokalny IRB i zgodnie z Deklaracją Helsińską.

1. Uwagi ogólne

  1. Zacznij od wykonania pomiaru testowego, aby rozgrzać bob i filiżankę. Upewnij się, że temperatura boba i kubka wynosi 37 °C. Jest to ważne dla dobrej odtwarzalności.
  2. Upewnij się, że lepki roztwór poliwinylopirolidonu (PVP) mieści się w ścisłych granicach osmolarności (282–286 mOsm/kg), pH (7,35–7,45) i lepkości (27,5–32,5 MPa) w temperaturze pokojowej (22 °C).
    UWAGA: PVP musi być używany w temperaturze pokojowej. Jeśli jest przechowywany w niższej temperaturze, upewnij się, że rozgrzał się do temperatury pokojowej przed wykonaniem jakichkolwiek pomiarów.

2. Uruchomienie ektacytometru

  1. Włącz komputer i ektacytometr od tyłu. Uruchom program (Spis materiałów) na komputerze.
  2. Upewnij się, że azot jest dostępny do odtlenienia próbki, otwierając butlę z azotem.
  3. Opuść boczek w miseczce i upewnij się, że kubek może się swobodnie obracać. Wyczyść kubek od wewnątrz i na zewnątrz miękką szmatką i wodą destylowaną, ponieważ zanieczyszczenia mogą utrudniać pomiary EI.
  4. Gdy program jest uruchomiony, sprawdź, czy na ekranie pojawia się następujący komunikat: "Upewnij się, że zawór gazu jest otwarty" i kliknij OK.
  5. Upewnij się, że ektacytometr rozpoczyna proces samokontroli pO2, który pojawi się na ekranie. Wybierz Start (wprowadź). Jeśli to się nie powiedzie, uruchom ponownie samokontrolę, klikając pozycję Sprawdzanie sprzętu | pO2 | Samokontrola.
    UWAGA: Jeśli samokontrola ponownie się nie powiedzie, rozważ wymianę punktu O2. Punkt O2 zastępuje się poprzez delikatne wypchnięcie punktu z wnętrza kubka opuszkiem palca. Nowe miejsce umieszcza się, delikatnie wciskając miejsce z zewnątrz do kubka.
  6. Wybierz skan pO2 z różnych testów wymienionych po lewej stronie. Wybierz Ustawienia po prawej stronie ekranu i upewnij się, że są one ustawione zgodnie z parametrami wymienionymi w Tabeli 1. Zachowaj te same ustawienia dla każdego pomiaru.
  7. Aby zapisać te ustawienia, naciśnij OK | OK.
    UWAGA: Preferowane ustawienia są wymienione w Tabeli 1, ale można je dostosować zgodnie z preferencjami użytkownika i celami badawczymi. Na przykład, aby dokładniej zbadać zachowanie sierpowatości, można zmienić szybkość i czas trwania odtleniania.

3. Pobieranie i przygotowanie próbek

UWAGA: Do walidacji techniki, użyto krwi poddanej działaniu kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) od 38 pacjentów z SCD i 5 zdrowych osób z grupy kontrolnej włączonych do University Medical Center Utrecht lub Texas Children's Hematology Center, w różnych badaniach klinicznych (identyfikator Holenderskiego Rejestru Badań [NTR], NTR 6779 i NTR 6462), a także anonimowe próbki krwi od pacjentów, którzy odwiedzili przychodnię lub byli hospitalizowani.

  1. Pobrać próbki krwi przez nakłucie dożylne (minimum 300 μl/próbkę) w probówce zawierającej EDTA. Upewnij się, że krew była przechowywana przez co najmniej 30 minut w temperaturze 4 °C, ale nie dłużej niż 24 godziny
    UWAGA: Można również stosować cytrynian, fosforan dekstrozadeninę adeninę (CPDA) lub heparynę, ale wpływ tych odczynników na zachowanie próbki w odniesieniu do ektacytometrii gradientu tlenu nie jest dobrze znany.
  2. Delikatnie wymieszać próbkę przez odwrócenie w celu homogenizacji. Nie potrząsaj próbką. Pozwól próbce rozgrzać się do temperatury pokojowej na stole rolkowym przed pomiarem.
    UWAGA: Probówka z próbką (9–10 ml), która jest przechowywana przez ponad 1 godzinę w temperaturze 4 °C, musi się nagrzewać przez 15 minut. W przypadku przechowywania krócej niż 1 godzinę w temperaturze 4 °C musi się nagrzewać przez 10 minut. Probówka z próbką (2–6 ml), która jest przechowywana przez ponad 1 godzinę w temperaturze 4 °C, musi się nagrzewać przez 10 minut. W przypadku przechowywania przez mniej niż 1 godzinę w temperaturze 4 °C musi się nagrzewać przez 5 minut.
  3. Zmierz pełną morfologię krwi na analizatorze hematologicznym. W tym celu należy pobrać 20–200 μl krwi pełnej w probówce zawierającej EDTA. Umieścić igłę aspiracyjną w probówce i nacisnąć przycisk za igłą analizatora hematologicznego, aby rozpocząć pomiar.
    UWAGA: W pełnej morfologii krwi mierzy się liczbę RBC, która jest ważnym czynnikiem standaryzacji pomiarów ektacytometrii gradientu tlenu. Liczba RBC jest obliczana na podstawie rozproszenia do przodu i na boki za pomocą cytometrii przepływowej. Prawidłowa liczba erytrocytów u zdrowych osób z grupy kontrolnej wynosi 3,7–5,0 x 1012/L dla kobiet i 4,2–5,5 x 1012/L dla mężczyzn. Liczba krwinek czerwonych u pacjentów z SCD jest na ogół zmniejszona. Niektóre analizatory hematologiczne mierzą również procentową gęstość czerwonych krwinek (% DRBC), co może mieć dodatkową wartość w interpretacji indywidualnych krzywych ektacytometrii gradientu tlenu.
  4. Standaryzować próbkę krwi pełnej do liczby RBC 200 x 106 RBC w 5 ml PVP (200 x 106 RBC / fiolkę), dostosowując objętość próbki, która zostanie dodana. Jeśli całkowita liczba RBC jest mniejsza niż 200 x 106, będzie to miało wpływ na wzór dyfrakcyjny i EI.
    1. Użyj poniższego równania, aby wykonać liczenie.
      4,0/xx (x 1012/L) x 50 = yy μL krwi pełnej/fiolkę PVP
      gdzie xx jest obliczoną liczbą krwinek czerwonych uzyskaną z kroku 3.3, a yy jest ilością krwi pełnej, która jest wymagana do rzeczywistego pomiaru. W zależności od stopnia niedokrwistości i innych czynników wpływających na liczbę krwinek czerwonych, wymagana ilość krwi pełnej wynosi 40–90 μl.

4. Pomiar ektacytometrii gradientu tlenu

  1. Odpipetować obliczoną objętość próbki (yy μl krwi) do PVP, aby uzyskać całkowitą objętość 5 ml. Wstępnie zwilż końcówkę, delikatnie ponownie zawieszając krew 3 razy. Użyj końcówki do pipety z szerokim otworem, aby uniknąć dodatkowego obciążenia RBC. Delikatnie wymieszaj próbkę ręcznie przez odwrócenie, aż stanie się jednorodna.
    UWAGA: Otwórz fiolkę PVP na jak najkrótszy czas, aby uniknąć kontaktu z powietrzem.
  2. Powoli pobrać 2,0 ml mieszaniny krwi i PVP do strzykawki o pojemności 3 ml bez igły. Nacisnąć tłok, aby usunąć wszelkie widoczne pęcherzyki powietrza i nadmiar roztworu próbki, aż w strzykawce pozostanie 1,5–1,8 ml (w zależności od objętości kubka).
  3. Wstrzyknąć całkowitą objętość próbki powoli i równomiernie do boba przez złącze. Upewnij się, że poziom próbki znajduje się powyżej sondy lambda (różowa plamka) i powyżej małego otworu ssącego. Nie pozostawiać roztworu próbki w strzykawce.
  4. Kliknij przycisk Nowa i wypełnij identyfikator próbki, uwagi, datę oddania i lepkość PVP. Kliknij przycisk OK |Aspirat. Po 60 s kubek obróci się i zasysa próbkę przez 15 sekund. Kliknij przycisk OK po zatrzymaniu obrotu. Zamknij pokrywę urządzenia. Kliknij przycisk Kontynuuj | Zacznij już teraz, ponieważ ektacytometria gradientu tlenu jest wykonywana ze stałym wzmocnieniem. Pomiar zajmie około 28 minut.
  5. Po pomiarze wydrukuj raport, który pokazuje krzywą i parametry, które są automatycznie obliczane przez oprogramowanie. Upewnij się, że nieprzetworzone dane są automatycznie przechowywane w wyznaczonym folderze w Ustawieniach. Maksymalne EI (EImax), minimalne EI (EImin), pO2@95%EI (PoS) i pole (pole pod krzywą) są automatycznie obliczane i dodawane do drukowanego raportu i surowych danych.
  6. Ręcznie uzyskaj ΔEI, obliczając różnicę między EImax a EImin. Obliczyć procentowy odzysk, biorąc pod uwagę różnicę między średnimi wartościami EI przed odtlenieniem (pO2 100–120 mmHg) i średnimi wartościami EI podczas reoksygenacji przy 100–120 mmHg.

5. Czyszczenie ektacytometru

  1. Wyjąć strzykawkę z próbką i zastąpić ją strzykawką wypełnioną wodą destylowaną lub wodą dejonizowaną.
  2. Naciśnij przycisk Wyczyść, powoli przepłukując złącze podczas płukania. Upewnij się, że spłukujesz w obu kierunkach.
  3. Wyjąć strzykawkę i podnieść bosk. Dokładnie osusz bob, kubek i łącznik miękką szmatką.
  4. Użyj dużej strzykawki (10–50 ml), aby przepłukać złącze, aby usunąć wodę pozostałą w rurkach i strzykawce. Zablokuj dolny wlot/wylot boba, aby uzyskać ciśnienie zwrotne w rurach, usuwając w ten sposób pozostałą wodę.
  5. Opuść bob w miseczce. Maszyna jest teraz gotowa do następnego pomiaru.

6. Wyłączenie maszyny

  1. Upewnij się, że maszyna została prawidłowo wypłukana po ostatnim pomiarze, jak opisano powyżej. Upewnij się, że odpowiednie rurki są podłączone do roztworu czyszczącego.
  2. Zamknij oprogramowanie, naciśnij Zamknij i naciśnij Start, aby uruchomić program czyszczenia na koniec dnia.
  3. Po zakończeniu całego programu czyszczenia wyjmij strzykawkę i podnieś bob. Przepłucz złącze dużą strzykawką.
  4. Opróżnij pojemnik na odpady i osusz bob i kubek miękką szmatką. Przepłucz złącze, aby usunąć wodę pozostałą w rurkach i bob. Zablokuj dolny wlot/wylot boba, aby uzyskać ciśnienie zwrotne w rurach, usuwając w ten sposób pozostałą wodę.
  5. Zamknij pokrywę urządzenia. Zamknij butlę z azotem. Wyłącz komputer i urządzenie.

Wyniki

Ektacytometria z gradientem tlenowym może być wykorzystana do charakteryzacji zjawiska sierpowania u pacjentów z SCD. W badaniu ujęto próbki krwi od łącznie 38 pacjentów z SCD oraz pięciu zdrowych osób z grupy kontrolnej. W zdrowych kontrolach wzór dyfrakcyjny jest okrągły w spoczynku i eliptyczny przy wyższym naprężeniu ścinającym4. Na podstawie eliptycznego wzoru dyfrakcyjnego oblicza się indeks wydłużenia (EI), bazując na wysokości i szerokości tego wzoru. W ektacytometrii z gradientem tlenowym powolnej i ciągłej deoksygenacji próbki za pomocą azotu towarzyszy szybka reoksygenacja powietrzem otoczenia. W tych warunkach w trakcie deoksygenacji można zaobserwować sierpowanie RBC. Powoduje to zniekształcenie wzoru dyfrakcyjnego, ponieważ sierpowate erytrocyty nie ustawiają się prawidłowo pod wpływem przyłożonego naprężenia ścinającego. W konsekwencji wydają się one mniej odkształcalne w porównaniu do zdrowych RBC (Ryc. 2).

Rycina 3A przedstawia, w jaki sposób erytrocyty sierpowate zmieniają kształt podczas odtleniania, co naśladuje warunki panujące podczas ektacytometrii z gradientem tlenu, podczas gdy kontrolne erytrocyty sierpowate bez odtleniania nie wykazują zmian kształtu. Proces ten prowadzi do zniekształcenia wzoru dyfrakcyjnego podczas ektacytometrii z gradientem tlenu, a w konsekwencji do spadku EI. Rycina 3B pokazuje różne wzory dyfrakcyjne, z których generowane są poszczególne parametry.

Na rysunku przedstawiono reprezentatywną krzywą uzyskaną za pomocą ektacytometru w Rysunek 3CSześć parametrów odzwierciedla różne cechy procesu sierpowacenia erytrocytów: EImaksymalny stanowi maksymalną wartość EI na początku pomiaru, przed odtlenieniem. Parametr ten reprezentuje pozycję bazową i odzwierciedla ogólną odkształcalność całej populacji RBC w powietrzu otoczenia. EImin jest minimalny EI, który reprezentuje minimalną odkształcalność po deoksygenacji. Parametr ten odzwierciedla zmiany w kształcie i orientacji (sierpowatych) erytrocytów po deoksygenacji. ΔEI to różnica między EImaksymalne or EImin, co wskazuje, ile komórek może ulec sierpowaceniu podczas jednej rundy deoksygenacji. 5-procentowy punkt sierpowacenia (PoS5%) jest pO2 (mmHg), przy którym następuje 5-procentowy spadek EImaksymalne podczas deoksygenacji jest mierzony. Reprezentuje on napięcie tlenu, przy którym rozpoczyna się proces sierpowacenia. Area odzwierciedla pole pod krzywą, które jest wyznaczane poprzez obliczenie całki z EI i pO2 pomiary pomiędzy 100 mmHg a pO22min (mmHg). Jest to wynik wcześniej opisanych parametrów EImaksymalny, EIminoraz PoS. Rekuperacja (recovery) stanowi różnicę między EI w końcowej fazie reoksygenacji a EI w punkcie wyjściowym. Obie wartości EI są mierzone przy pO2 do 100–120 mmHg. Parametr ten odzwierciedla zdolność erytrocytów, które ulegają sierpowaceniu podczas deoksygenacji, do odwrócenia tego procesu podczas reoksygenacji22Parametry z pomiarów powtórzonych charakteryzowały się zazwyczaj współczynnikiem zmienności (CV) <5% (mediana 1,83%). W przypadku CV > otrzymano wynik 5%, wykonano trzeci pomiar. Parametry EImaks. or odzyskiwanie wykazują największą powtarzalność z medianami współczynnika zmienności (CV) <1%.

Reprezentatywne krzywe dla RBC zdrowych grup kontrolnych, pacjentów z cechą HbS (heterozygotyczna HbS) oraz pacjenta z homozygotyczną SCD przedstawiono na Rysunku 4A. Reprezentatywna krzywa pacjenta z HbSC wykazuje niższy powrót, co może wskazywać na inny proces sierpowacenia (Rysunek 4B). Reprezentatywne krzywe pacjentów z HbSS leczonych hydroksymocznikiem (HU) i transfuzjami przedstawiono na Rysunku 4C oraz Rysunku 4D. Wyraźnie widać dużą różnicę między reprezentatywnymi krzywymi dla cech HS (komórki HbAS) a RBC pacjentów z HbSS leczonych transfuzjami (składającymi się z mieszaniny homozygotycznych komórek sierpowatych (HbSS) i homozygotycznych komórek prawidłowych (HbAA), Rysunek 4A,D). Wyraźne różnice w krzywych nieleczonego pacjenta z SCD oraz pacjentów leczonych HU i transfuzjami podkreślają użyteczność tego testu (Rysunek 4C,D). Poziomy HbF i HbS korelowały istotnie z EImin oraz, w mniejszym stopniu, z PoS (Rysunek 5A–D). Wskazuje to, że parametry laboratoryjne istotne w ocenie stanu pacjenta znajdują odzwierciedlenie również w ektacytometrii gradientu tlenowego. Liczba komórek sierpowatych w warunkach normoksji oraz odsetek gęstych RBC (DRBCs) wpływają na wartości EImax, ponieważ są one istotnie skorelowane (Rysunek 5E–F), co wskazuje, że EImax odzwierciedla kolejny ważny czynnik w procesie sierpowacenia. Wyniki te pokazują, w jaki sposób różne charakterystyki, takie jak %HbS, %HbF, liczba komórek sierpowatych w normoksji oraz %DRBCs, wpływają na poszczególne parametry.

Schemat układu wiskozymetru; równanie EI; wiązka laserowa, kamera, projekcja do pomiaru lepkości płynu.
Rycina 1. Schematyczny układ ektacytometru. Ektacytometr wykorzystuje układ Couette'a do przykładania naprężenia ścinającego do komórek. Obracający się zewnętrzny cylinder (kubek) oraz statyczny cylinder wewnętrzny (rdzeń) służą do wywoływania naprężenia ścinającego poprzez wytworzenie przepływu laminarnego w 37 ˚C. Pomiędzy rdzeniem a kubkiem znajduje się mała szczelina, do której wstrzykiwana jest zawiesina krwi. Wiązka laserowa świeci z rdzenia przez zawiesinę krwi i ulega rozproszeniu w obecności RBC. Wzorzec dyfrakcyjny jest projektowany i analizowany przez kamerę. Indeks wydłużenia (EI) oblicza się na podstawie wysokości (a) i szerokości (b) wzorca dyfrakcyjnego4. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dynamika przepływu krwi; schemat z układem dyfrakcyjnym, przedstawiający analizę rozcieńczonej zawiesiny krwi.
Rysunek 2. Schematyczny układ ektacytometru z modułem ektacytometrii z gradientem tlenu. Schematyczny rysunek modułu przedstawiający powolną deoksygenację zawiesiny krwi poprzez infuzję azotu (N2). Napięcie tlenowe jest mierzone na podstawie stopnia wygaszenia sygnału luminoforu przesyłanego z włókna LED do plamki O2. Podczas deoksygenacji erytrocyty sierpowate zaczną przybierać kształt sierpa, ich odkształcalność spadnie i przestaną one układać się równolegle do erytrocytów eliptycznych. Sierpowate erytrocyty zniekształcą obraz dyfrakcyjny, zmieniając jego kształt z elipsy na romb lub kształt diamentowy. Ta zmiana kształtu obrazu dyfrakcyjnego skutkuje spadkiem EI. Pomiary pO2 i EI nie są wykonywane na tej samej wysokości w kubku. Zapewnia to lepsze rozróżnienie między krzywymi deoksygenacji i reoksygenacji, a tym samym lepszą interpretację krzywej. Rysunek zmodyfikowano na podstawie pracy Rab et al.22 Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Proces oksygenacji; analiza danych spektroskopowych; obrazy mikroskopowe, krzywa oksygenacji-deoksygenacji.
Rysunek 3. Reprezentatywna krzywa ektacytometrii z gradientem tlenu oraz wzory dyfrakcyjne. (A) Po deoksygenacji w warunkach podobnych do ektacytometrii z gradientem tlenu nastąpiła fiksacja sierpowatych RBC. W przypadku kontrolnych sierpowatych RBC zastosowano te same warunki, ale bez użycia azotu. Zdeoksygenowane sierpowate RBC wykazują zmianę kształtu w przeciwieństwie do kontrolnych RBC. (B) W wyniku deoksygenacji i naprężenia ścinającego (30 Pa) wzór dyfrakcyjny zmienia się z elipsy w romb. (C) Reprezentatywna krzywa ektacytometrii z gradientem tlenu. Maksymalny indeks wydłużenia (EImax) reprezentuje pozycję bazową i wskazuje ogólną odkształcalność całej populacji RBC. Minimalny EI (EImin) reprezentuje minimalną odkształcalność, która jest spowodowana zmianą kształtu i orientacji RBC podczas deoksygenacji. ΔEI (dEI, różnica w EI między EImax a EImin) wskazuje, ile komórek ulega sierpowaniu podczas jednego cyklu deoksygenacji. Punkt sierpowania (PoS, pO2 przy 5% spadku EI) wskazuje ciśnienie tlenu, przy którym pierwsze RBC zaczynają przybierać kształt sierpa. Pole pod krzywą (od pO2min = 100 mmHg) jest obliczane w parametrze area. Podsumowuje ono EImax, EImin oraz PoS. Zdolność komórek sierpowatych do powrotu do pierwotnego kształtu podczas reoksygenacji jest reprezentowana przez parametr Recovery (procent EImax osiągnięty podczas reoksygenacji). Aby ułatwić interpretację, wszystkie punkty danych w każdym pojedynczym eksperymencie zostały połączone linią w celu graficznego przedstawienia wyników. Rysunek został zmodyfikowany na podstawie pracy Rab i wsp.22 Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Krzywe równowagi asocjacji tlenu w anemii sierpowatej; wykresy HbSC, HbSS; dane eksperymentalne.
Rycina 4Parametry ektacytometrii z gradientem tlenowym korelują z genotypem i schematami leczenia pacjentów z SCD. (A) Reprezentatywny wykres erytrocytów nosicieli HbS (cecha HbS) oraz zdrowych kontroli w odniesieniu do nieleczonych pacjentów z HbSS. (B) Reprezentatywny wykres erytrocytów pacjentów z hemoglobinopatią SC (HbSC) w odniesieniu do nieleczonych pacjentów z HbSS. (C) Reprezentatywny wykres erytrocytów pacjentów z homozygotyczną postacią SCD leczonych hydroksymocznikiem (HbSS HU) w odniesieniu do nieleczonych pacjentów z HbSS. (D) Reprezentatywny wykres erytrocytów pacjentów z HbSS leczonych transfuzją krwi (transfuzja HbSS) w odniesieniu do nieleczonych pacjentów z HbSS. Rysunek zmodyfikowany na podstawie pracy Rab i wsp.22 Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Korelacje na wykresach: HbF, HbS vs El, PoS. Analiza parametrów krwi, wyniki regresji liniowej.
Rycina 5. Parametry ektacytometrii w gradiencie tlenowym są powiązane z %HbF, %HbS, % komórek sierpowatych w normoksji oraz % gęstych erytrocytów. (A) Korelacja liniowa minimalnego indeksu elongacji (EImin) i %HbF u 15 pacjentów z HbSS lub HbS/β-talasemią bez transfuzji. (B) Korelacja liniowa EImin i %HbS. (C) Korelacja liniowa PoS i %HbF. (D) Korelacja liniowa PoS i %HbS. (E) Korelacja liniowa maksymalnego EI (EImax) i procenta komórek sierpowatych w normoksji zmierzonego za pomocą mikroskopii cyfrowej. (F) Korelacja liniowa EImax i odsetka gęstych erytrocytów (%DRBCs) u 21 pacjentów z HbSS. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Rab et al.22 Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Ustawienia
PlikiKatalog pamięci masowej
Opcje ogólneDomyślna lepkość mediumLepkość PVP
Skan pO2Minimalny czas aspiracji (s)60
Naprężenie ścinające podczas skanu pO2 (Pa)30
Wyznaczanie pO2 co (S)20
Rozmiar średniej ruchomej2
Kroki skanu pO2; Edycja0 -OFF; 60 -ON; 1360 –OFF; 1640 -OFF
Zakres kalibracji pomiędzy (mmHg)10 a 100
Kontrola pO2Wyłączona (niezaznaczona)

Tabela 1. Preferencyjne ustawienia ektacytometru.

Dyskusja

Tutaj opisujemy ektacytometrię gradientu tlenu, metodę, która może być wykorzystana do badania sierpowatego zachowania czerwonych krwinek od pacjentów z SCD w zakresie stężeń tlenu (ryc. 4 i ryc. 5). Aby uzyskać powtarzalne wyniki, ważne jest zidentyfikowanie czynników, które wpływają na wyniki. Na przykład temperatura ma duży wpływ na odkształcalność RBC, głównie ze względu na jej wpływ na gęstość lepkiego roztworu (PVP). Zalecamy wykonanie pomiaru testowego na początku dnia, aby dokładnie podgrzać maszynę do 37 °C. Poprawi to odtwarzalność wyników. Osmolarność lepkiego roztworu powinna mieścić się w wąskim zakresie (282–286 mOsm/kg dla PVP), ponieważ osmolarność wpływa na stan uwodnienia, co z kolei wpływa na odkształcalność RBC. pH i lepkość PVP również powinny być ściśle regulowane. Różnice w pH i temperaturze mogą mieć ogromny wpływ na krzywe22. Dodatkowo, pozostała woda w kubku, bobiku i rurkach może powodować lizę RBC, co skutkuje nieprawidłowymi danymi, ponieważ mierzonych będzie mniej nienaruszonych RBC obecnych w kubku.

Ustawienia do wykonywania ektacytometrii gradientu tlenu można dostosować w celu rozwiązania określonych pytań badawczych. Preferowane ustawienia są wymienione w Tabeli 1. Czas odtleniania wynoszący 1300 s został wybrany na podstawie obserwacji wykazujących, że wydłużenie odtlenienia nie skutkowało niższymEI min u większości pacjentów. Z kolei skrócenie czasu odtleniania ograniczyłoby moc dyskryminacyjną ektacytometrii gradientu tlenu. Czas reoksygenacji ustalono na 280 s ze względu na szybko rozpuszczające się polimery HbS podczas reoksygenacji i jednoczesne przywrócenie EI do wartości zmierzonych przed odtlenieniem. Naprężenie ścinające zostało ustawione na 30 Pa, co jest analogiczne do ektacytometrii gradientu osmotycznego. Obniżenie tego parametru może ograniczyć moc dyskryminacyjną. Kontrola odtleniania może być zastosowana, jeśli do każdej próbki pacjenta zostanie zastosowany zestaw prędkości odtleniania. W preferowanych przez nas ustawieniach ta opcja została wyłączona, ponieważ szybkość odtleniania jest specyficzna dla pacjenta ze względu na unikalną krzywą dysocjacji hemoglobiny. W związku z tym włączenie kontroli odtleniania wyeliminowałoby tę cechę z testu. Jednak ta cecha ektacytometrii gradientu tlenu jest nadal badana.

Na parametry ektacytometrii gradientu tlenu wpływa kilka dobrze znanych czynników, a mianowicie pH, temperatura i osmolarność. Na ektacytometrię, zwłaszcza PoS, wpływa 2,3-difosfoglicerynian (2,3-DPG)22. Istnieje również wyraźna korelacja między %HbF aEI min, a w mniejszym stopniu PoS (rysunek 5A–D). EImax jest związany z komórkami sierpowatymi w normoksji, co może wyjaśniać obserwację, że krótko po LZO odkształcalność RBC w normoksji (EImax) jest wyższa. To ostatnie jest spowodowane zniszczeniem najbardziej sierpowatych komórek, a tym samym mniej odkształcalnych erytrocytów podczas LZO16. Jak pokazano na rysunku 5F, erytrocyty o wyższej gęstości (zdefiniowane jako erytrocyty o stężeniu hemoglobiny >1,11 mg / ml) silnie korelują z niższym EImax. Wskazuje to, że gęste komórki są ważnym czynnikiem odkształcalności RBC w normoksji, podobnie jak wcześniej zgłaszane wyniki1.

Standaryzacja próbek jest bardzo ważna dla uzyskania powtarzalnych wyników oraz dla rozróżnienia między różnymi genotypami i zabiegami. Korekta liczby erytrocytów jest ważna, ponieważ liczba erytrocytów wpływa na intensywność wzoru dyfrakcyjnego. Jeśli niższe liczby RBC są obecne w przerwie między bobem a miseczką, krzywa przesunie się w górę i w lewo. Dodatkowo krzywa będzie się wahać, co utrudni dokładne obliczenie parametrów, zwłaszcza PoS.

Ograniczeniem tej techniki jest to, że wartość EI reprezentuje średnią ze wszystkich komórek, w tym z różnych subpopulacji. Intensywnie badano heterogeniczność populacji RBC u pacjentów z SCD i jej wpływ na pomiar ektacytometryczny. Doprowadziło to do standaryzacji, w której wielkość wzoru dyfrakcyjnego jest dostosowywana do stałej wartości, a nie korygowana dla liczby RBC23,24. To, czy ten sposób standaryzacji powinien być również stosowany do pomiarów ektacytometrii gradientu tlenu, jest obecnie badane.

Opracowano kilka technik pomiaru odkształcalności RBC w warunkach niedotlenienia w oparciu o etap odtleniania, który odtleniał się poza ektacytometrem 25,26,27. W tych warunkach nie zaobserwowano różnic w zachowaniu komórek między pacjentami z cechami HbS a zdrowymi osobami z grupy kontrolnej pod fizjologicznym pH25. Ektacytometria gradientu tlenu wyraźnie pokazuje jednak niski, ale wyraźny PoS u osób z cechami HbS (ryc. 4A). Do tej pory, w rutynowej praktyce klinicznej, jedynymi alternatywnymi metodami pomiaru skłonności erytrocytów poszczególnych pacjentów do sierpowatości in vitro jest test sierpowaty oparty na morfologii: erytrocyty są inkubowane w warunkach sprzyjających polimeryzacji HbS, takich jak niskie ciśnienie tlenu lub niskie pH. Po inkubacji dodaje się utrwalacz, a procent komórek sierpowatych zlicza się ręcznie lub cyfrowo za pomocą mikroskopii świetlnej. Wiele przedklinicznych i wczesnych faz badań farmakologicznych wykorzystuje test sierpowaty do wygenerowania drugorzędowej zmiennej końcowej, aby móc przewidzieć skuteczność kliniczną w SCD 28,29,30,31,32. Jest to jednak czasochłonne, zmienność jest duża, a czułość niska, technika nie jest zautomatyzowana, a zatem pracochłonna. Co więcej, zmiany morfologiczne spowodowane sierpem mogą nie korelować dobrze z parametrami fizjologicznymi, takimi jak odkształcalność RBC, ponieważ jest to dwuwymiarowy test statyczny2.

Ektacytometria gradientu tlenu zapewnia funkcjonalny test sierpowa, który jest szybki i powtarzalny. Jest to test in vitro, który nie bierze pod uwagę powierzchni śródbłonka. Zapewnia jednak funkcjonalne aspekty zachowania sierpowatości i charakterystyki krwinek czerwonych, co czyni ją obiecującą techniką do badań nad krwinkami sierpowatymi. Przyszłe zastosowania tej techniki obejmują monitorowanie skuteczności leczenia u pacjentów z SCD, służenie jako biomarker dla nowych strategii leczenia, badanie zachowania sierpów i monitorowanie chimeryzmu po przeszczepie komórek macierzystych w SCD.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

Ta praca była częściowo wspierana przez grant Eurostars estar18105 oraz przez nieograniczony grant dostarczony przez RR Mechatronics. Autorzy dziękują Sisto Hendriksowi i Janowi de Zoeten za wsparcie techniczne.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
ADVIA 120 Analizator hematologicznySiemens067-A004-14Instrument
Analizator hematologiczny Cell-Dyn SapphireAbbott8H00-01Instrument
LorrcaRR MechatronikLORC109230 lub LORC109110Instrument
Lorrca Wersja oprogramowania V5.08RR Mechatronika
Azot gazowy 4.8 lub 5.0Lokalnie-
O2-spotRR MechatronikaPO2S020153pomiar O2
Moduł Oxygenscan (pO2scan)RR MechatronikaPO2S109000Add-on
Oxy-ISORR MechatronikaQR 030905Lepki roztwór
X-CleanRR MechatronikaQR 010946Roztwór czyszczący Lorrca

Bibliografia

  1. Clark, M. R., Mohandas, N., Shohet, S. B. Deformability of oxygenated irreversibly sickled cells. Journal of Clinical Investigation. 65 (1), 189-196 (1980).
  2. Smith, C., Kuettner, J., Tukey, D., White, J. Variable Deformability of Irreversibly Sickled Erythrocytes. Blood. 58 (1), 71-78 (1981).
  3. Clark, M., Mohandas, N., Embury, S., Lubin, B. A simple laboratory alternative to irreversibly sickled (ISC) counts. Blood. 60 (3), 659-663 (1982).
  4. DaCosta, L., et al. Diagnostic tool for red blood cell membrane disorders Assessment of a new generation ektacytometer. Blood Cells, Molecules, and Diseases. 56 (1), 9-22 (2016).
  5. Rabai, M., et al. Deformability analysis of sickle blood using ektacytometry. Biorheology. 51 (2-3), 159-170 (2014).
  6. Ballas, S. K., Mohandas, N. Sickle red cell microrheology and sickle blood rheology. Microcirculation. 11 (2), 209-225 (2004).
  7. Connes, P., Alexy, T., Detterich, J., Romana, M., Hardy-Dessources, M. D., Ballas, S. K. The role of blood rheology in sickle cell disease. Blood Reviews. 30 (2), 111-118 (2015).
  8. Hierso, R., et al. Effects of oxidative stress on red blood cell rheology in sickle cell patients. British Journal of Haematology. 166 (4), 601-606 (2014).
  9. Mozar, A., et al. Red blood cell nitric oxide synthase modulates red blood cell deformabilityin sickle cell anemia. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 64 (1), 47-53 (2016).
  10. Clark, M. R., Mohandas, N., Shohet, S. B. Osmotic Gradient Ektacytometry: Comprehensive Characterization of Red Cell Volume and Surface Maintenance. Blood. 61 (5), 899-911 (1983).
  11. Parrow, N. L., et al. Measurements of red cell deformability and hydration reflect HbF and HbA2in blood from patients with sickle cell anemia. Blood Cells, Molecules, and Diseases. 65, 41-50 (2017).
  12. Steinberg, M. H., Chui, D. H. K., Dover, G. J., Sebastiani, P., Alsultan, A. Fetal hemoglobin in sickle cell anemia: A glass half full. Blood. 123 (4), 481-485 (2014).
  13. Ballas, S. K., Larner, J., Smith, E. D., Surrey, S., Schwartz, E., Rappaport, E. F. Rheologic predictors of the severity of the painful sickle cell crisis. Blood. 72 (4), 1216-1223 (1988).
  14. Lande, W. M., et al. The Incidence of Painful Crisis in Homozygous Sickle Cell Disease: Correlation with Red Cell Deformability. Blood. 72 (6), 2056-2059 (1988).
  15. Lemonne, N., et al. Does increased red blood cell deformability raise the risk for osteonecrosis in sickle cell anemia. Blood. 121 (15), 3054-3057 (2013).
  16. Ballas, S. K., Smith, E. D. Red blood cell changes during the evolution of the sickle cell painful crisis. Blood. 79 (8), 2154-2163 (1992).
  17. Telen, M. Cellular adhesion and the endothelium: E-selectin, L-selectin, and pan-selectin inhibitors. Hematology/Oncology Clinics of North America. 28 (2), 341-354 (2014).
  18. Papageorgiou, D. P., et al. Simultaneous polymerization and adhesion under hypoxia in sickle cell disease. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (38), 201807405(2018).
  19. Liu, J., Qiang, Y., Alvarez, O., Du, E. Electrical impedance microflow cytometry with oxygen control for detection of sickle cells. Sensors and Actuators, B: Chemical. 255, 2392-2398 (2018).
  20. Du, E., Diez-Silva, M., Kato, G. J., Dao, M., Suresh, S. Kinetics of sickle cell biorheology and implications for painful vasoocclusive crisis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (5), 1422-1427 (2015).
  21. Li, Q., et al. Kinetic assay shows that increasing red cell volume could be a treatment for sickle cell disease. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (5), 689-696 (2017).
  22. Rab, M. A. E., et al. Rapid and reproducible characterization of sickling during automated deoxygenation in sickle cell disease patients. American Journal of Hematology. 94, February 575-584 (2019).
  23. Renoux, C., et al. Importance of methodological standardization of ektacytometric measures of red blood cell deformability in sickle cell anemia. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 62 (2), 173-179 (2016).
  24. Parrow, N. L., et al. Measuring Deformability and Red Cell Heterogeneity in Blood by Ektacytometry. Journal of Visualized Experiments. (131), (2018).
  25. Bessis, M., Feo, C., Jones, E. Quantitation of red cell deformability during progressive deoxygenation and oxygenation in sickling disorders (the use of an automated Ektacytometer). Blood Cells. 8 (1), 17-28 (1982).
  26. Sorette, M. P., Lavenant, M. G., Clark, M. R. Ektacytometric measurement of sickle cell deformability as a continuous function of oxygen tension. Blood. 67 (6), 1600-1606 (1987).
  27. Huang, Z., Hearne, L., Irby, C. E., King, S. B., Ballas, S. K., Kim-Shapiro, D. B. Kinetics of increased deformability of deoxygenated sickle cells upon oxygenation. Biophysical journal. 85 (4), 2374-2383 (2003).
  28. Antoniani, C., et al. Induction of fetal hemoglobin synthesis by CRISPR/Cas9-mediated editing of the human β-globin locus. Blood. 131 (17), 1960-1973 (2018).
  29. Abdulmalik, O., et al. Crystallographic analysis of human hemoglobin elucidates the structural basis of the potent and dual antisickling activity of pyridyl derivatives of vanillin. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 67 (12), 1076(2011).
  30. Oder, E., Safo, M. K., Abdulmalik, O., Kato, G. J., Discovery, D. New Developments in Anti-Sickling Agents: Can Drugs Directly Prevent the Polymerization of Sickle Haemoglobin In Vivo. British Journal of Haematology. 175 (1), 24-30 (2016).
  31. Oksenberg, D., et al. GBT440 increases haemoglobin oxygen affinity, reduces sickling and prolongs RBC half-life in a murine model of sickle cell disease. British Journal of Haematology. 175 (1), 141-153 (2016).
  32. Xu, G. G., et al. Synthesis, and Biological Evaluation of Ester and Ether Derivatives of Antisickling Agent 5-HMF for the Treatment of Sickle Cell Disease. Molecular Pharmaceutics. 14 (10), 3499-3511 (2017).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Anemia sierpowataodkszta calno erytrocyt wpunkt sierpowaceniawska nik wyd u eniapolimeryzacja hemoglobiny Spoziomy hemoglobiny p odowejprzygotowanie pr bek krwideoksygenacja azotempomiar napr e cinaj cych
Charakterystyka sierpa podczas kontrolowanego automatycznego odtleniania za pomocą ektacytometrii gradientu tlenu
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.