Method Article

Ocena zdolności różnicowania komórek nabłonka prostaty myszy za pomocą hodowli organoidów

DOI:

10.3791/60223

⸱

November 22nd, 2019

 ,  ,  ,  , 
1Molecular Biology Interdepartmental Program, University of California, Los Angeles, 2Department of Molecular, Cell, and Developmental Biology, University of California, Los Angeles, 3Department of Urology, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles, 4Eli and Edythe Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research, University of California, Los Angeles, 5Jonsson Comprehensive Cancer Center, University of California, Los Angeles, 6Molecular Biology Institute, University of California, Los Angeles

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Organoidy prostaty myszy stanowią obiecujący kontekst do oceny mechanizmów regulujących różnicowanie. W artykule opisano ulepszone podejście do ustalania organoidów prostaty i przedstawiono metody (1) zbierania lizatu białkowego z organoidów oraz (2) utrwalania i barwienia organoidów do mikroskopii konfokalnej z pełną mocą.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nabłonek prostaty składa się głównie z komórek podstawnych i świetlnych. Śledzenie linii genetycznych in vivo wykorzystano do określenia zdolności różnicowania komórek podstawnych i luminalnych prostaty myszy podczas rozwoju, regeneracji tkanek i transformacji. Jednak ocena wewnętrznych i zewnętrznych regulatorów zdolności różnicowania nabłonka gruczołu krokowego przy użyciu podejścia opartego na śledzeniu linii często wymaga szeroko zakrojonej hodowli i może być zbyt kosztowna. W teście organoidów gruczołu krokowego komórki podstawne i luminalne wytwarzają nabłonek gruczołu krokowego ex vivo. Co ważne, pierwotne komórki nabłonkowe można wyizolować od myszy o dowolnym pochodzeniu genetycznym lub myszy leczonych dowolną liczbą małych cząsteczek przed lub po posiewie w trójwymiarowej (3D) hodowli. Wystarczający materiał do oceny zdolności różnicowania jest generowany po 7-10 dniach. Zbiór organoidów pochodzenia podstawnego i luminalnego do (1) analizy białek metodą Western blot oraz (2) analizy immunohistochemicznej nienaruszonych organoidów za pomocą mikroskopii konfokalnej typu full-mount umożliwia naukowcom ocenę zdolności komórek nabłonka prostaty do różnicowania ex vivo. W połączeniu, te dwa podejścia dostarczają uzupełniających się informacji na temat zdolności różnicowania komórek podstawnych i luminalnych prostaty w odpowiedzi na manipulacje genetyczne lub farmakologiczne.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki bazalne i luminalne stanowią większość nabłonka prostaty1. Badania nad linią produkcyjną wykazały, że te typy komórek są w przeważającej mierze samopodtrzymujące się przez odrębnych progenitorów w dorosłej klasie myszy2; Jednak zróżnicowanie luminalne od podstawowych przodków zaobserwowano w kilku kontekstach, w tym Development3,4, regeneracja tkanek5, zapalenie6,7 i inicjacja raka prostaty2,8. Co więcej, pojawiające się dane potwierdzają istnienie multipotencjalnych progenitorów luminalnych, a także progenitorów zaangażowanych w luminal9. W przypadku przerzutowego raka gruczołu krokowego różnicowanie się od linii luminalnej zależnej od AR do linii obojętnej AR o cechach podstawowych i neuroendokrynnych stanowi coraz bardziej doceniany mechanizm oporności na inhibitory szlaku androgenowego10,11,12. Dlatego, ponieważ różnicowanie jest związane z normalną fizjologią, inicjacją raka i opornością na terapię, wyjaśnienie kluczowych regulatorów molekularnych różnicowania komórek nabłonka prostaty ma kluczowe znaczenie.

Model organoidu prostaty u myszy stał się eleganckim kontekstem ex vivo do badania różnicowania komórek nabłonka prostaty9,13,14. W tym teście poszczególne komórki nabłonkowe są umieszczane w matrycy 3D, gdzie w ciągu 1 tygodnia generują struktury gruczołowe zawierające zarówno komórki podstawne, jak i świetlne. Podczas gdy istniejące podejścia do posiewania komórek w kulturze organoidów mogą być wykorzystane do wydajnego generowania organoidów, podejścia te wymagają dalszej optymalizacji14. Godne uwagi wyzwania związane z hodowlą organoidów prostaty obejmują (1) wykluczenie dwuwymiarowych (2D) kolonii, które tworzą się pod Matrigelem (żelem matrycowym) z analizy, (2) utrzymanie integralności żelu matrycowego podczas zmian pożywki oraz (3) dokładne liczenie organoidów. W artykule przedstawiono podejście do generowania organoidów z komórek nabłonkowych wyizolowanych z prostaty myszy. Opisane podejście polega na pokryciu płytek poli(2-hydroksyetylometakrylanem) (Poly-HEMA) w celu zapobieżenia występowaniu kolonii 2D. Co więcej, komórki są platerowane w pierścieniu żelowym matrycy, a nie w krążku żelu matrycowego, co sprawia, że zmiana podłoża i liczenie organoidów jest mniej trudne. Techniki te pozwalają naukowcom łatwiej zbadać, w jaki sposób zmiany genetyczne lub małe cząsteczki wprowadzone przed lub w trakcie tworzenia organoidów zmieniają kluczowe procesy, takie jak różnicowanie.

Pobieranie organoidów prostaty do Western blot lub analizy immunohistochemicznej za pomocą mikroskopii konfokalnej z całego wierzchowca może dostarczyć cennych mechanistycznych informacji na temat różnicowania13, jednak brakuje dobrze ugruntowanych protokołów do przygotowania organoidów do takich technik. Niniejszy manuskrypt opisuje podejścia do zbierania organoidów w celu (1) zbierania lizatu białkowego lub (2) utrwalania i barwienia do mikroskopii konfokalnej. Co ważne, opisane podejście do utrwalania i barwienia organoidów prostaty jest znacznie ulepszone w stosunku do istniejących metod. Chociaż opierają się one na dzieleniu organoidów na sekcje15, metoda opisana w tym manuskrypcie wykorzystuje nienaruszone organoidy, co pomaga chronić przed uszkodzeniem organoidów podczas przygotowywania próbki. W połączeniu, Western blot i mikroskopia konfokalna mogą dostarczyć cennych informacji na temat molekularnych regulatorów różnicowania. Alternatywnie, podejścia te można wykorzystać do modelowania innych procesów, takich jak rozwój i transformacja.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Institutional Review Board na Uniwersytecie Kalifornijskim w Los Angeles.

UWAGA: Schemat ilustrujący podejścia opisane w artykule znajduje się w Rysunek 1.

1. Izolowanie bazalnych i luminalnych komórek nabłonka prostaty myszy za pomocą sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) — CZAS: 30 min

UWAGA: Wykonaj kroki 1.3-1.5 w ciemności.

  1. Po dysocjacji komórek od całkowitej prostaty myszy zgodnie z opisem w Lawson et al.16, przenieś komórki do probówek FACS i ponownie zawieś 0,1-5 x 106 komórek w 100 μl pożywki dysocjacyjnej (Tabela 1).
  2. Dodać odpowiednią objętość następujących bezpośrednio sprzężonych przeciwciał pierwszorzędowych: CD45, CD31, Ter-119, EpCAM i CD49f.
  3. Inkubować na lodzie, chroniąc przed światłem, przez 20 min.
    nuta: Zaleca się wykorzystanie 10% całkowitej zdysocjowanych komórek do kontroli niebarwionych i barwionych pojedynczo. Te elementy sterujące są niezbędne do ustawienia prawidłowej kompensacji i napięcia sortowania.
  4. Ugasić koktajl przeciwciał, dodając 1 ml pożywki dysocjacyjnej do każdej próbki. Granulować komórki przez odwirowanie przy 800 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT) i usunąć supernatant przez zasysanie.
  5. Zawiesić komórki w odpowiedniej objętości (250 μl na 1 x 106 komórek) pożywki dysocjacyjnej zawierającej 1 μg/ml 4',6-diamidyno-2-fenyloindolu (DAPI). Przejdź do FACS. Wykresy cytometrii przepływowej pokazujące izolację mysich komórek podstawnego i luminalnego nabłonka prostaty są zilustrowane na Rysunek 2.

2. Posiewanie posortowanych komórek nabłonka prostaty do pierwotnej hodowli organoidów myszy — CZAS: 2-3 godziny (z wyłączeniem przygotowania płytki pokrytej poli-HEMA)

UWAGA: Płytki są pokryte Poly-HEMA, aby zapobiec tworzeniu się kolonii 2D na powierzchni studni pod żelem matrycowym. Przygotuj płytki pokryte poli-HEMA 1 dzień przed posiewem posortowanych komórek podstawnego lub luminalnego nabłonka prostaty w hodowli organoidów myszy. Rozmrozić 1 ml podwielokrotności żelu matrycowego o zredukowanym czynniku wzrostu, zwanego dalej żelem matrycowym, na lodzie 2 godziny przed etapem 2.1. Y-27632 (inhibitor ROCK) należy dodać do pożywek z organoidów myszy bezpośrednio przed krokiem 2.1. Wykonaj kroki 2.1-2.8 na lodzie.

  1. Osadzać komórki w probówkach okrągłodennych o pojemności 5 ml przez odwirowanie przy 800 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odessać supernatant.
  2. Umyj osad komórkowy w 500 μl mysiego podłoża organoidowego (Tabela 2)14.
  3. Granulować komórki przez odwirowanie w temperaturze 800 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odessać supernatant.
  4. Zawiesić w pożywkach organoidowych myszy przy gęstości komórek 1,000 komórek/μl.
  5. Aby przygotować mieszanki wzorcowe, wymieszaj komórki nabłonkowe zawieszone w mysich pożywkach organoidowych z żelem macierzowym, aby uzyskać końcową mieszaninę zawierającą 25% komórek/pożywki i 75% żelu matrycowego. Komórki podstawne są zwykle siane w stężeniu 100-2,000 komórek/80 μl, podczas gdy komórki luminalne są zwykle siane w stężeniu 2,000-10,000 komórek/80 μl. Gęstość posianych komórek różni się w zależności od przewidywanego dnia pobrania materiału i pożądanej dalszej aplikacji.
    nuta: Schłodzić probówkę (probówki) o odpowiedniej wielkości dla oczekiwanej objętości mieszanki głównej 5 minut przed przygotowaniem mieszanki głównej. Aby upewnić się, że żel matrycowy nie stwardnieje podczas przenoszenia, konieczne jest schłodzenie końcówki pipety poprzez odpipetowanie żelu matrycowego 3-4 razy przed przeniesieniem go do nowej probówki.
  6. Dodać 80 μl mieszaniny żelu matrycowego i komórek do dołka na płytce 24-dołkowej. Zaleca się pipetowanie kropli na dolną połowę ściany studni, unikając bezpośredniego kontaktu z powłoką Poly-HEMA. Po dodaniu żelu matrycowego należy zakręcić płytką, aby mieszanina żelu matrycowego i komórek utworzyła pierścień wokół krawędzi studzienki.
  7. Umieścić 24-dołkową płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C 5% CO2 prawą stroną do góry na 10 minut, aby żel matrycowy częściowo stwardniał.
    nuta: Rozpocząć podgrzewanie pożywki z organoidów mysich w temperaturze 37 °C natychmiast po umieszczeniu płytki 24-dołkowej w inkubatorze.
  8. Po inkubacji przez 10 minut odwróć 24-dołkową płytkę do góry nogami i inkubuj przez dodatkowe 50 minut, aby żel matrycowy całkowicie stwardniał.
  9. Dodaj kroplami 350 μl wstępnie podgrzanej pożywki z organoidów mysich do środka każdej studzienki.
    nuta: Aby zachować integralność żelu matrycowego, bardzo ważne jest, aby unikać pierścienia żelowego matrycy podczas dodawania podłoża.
  10. Po dodaniu pożywki umieścić 24-dołkową płytkę z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C 5% CO2 .

3. Uzupełnianie pożywki z organoidów myszy — CZAS: 10-15 min na płytkę 24-dołkową

UWAGA: Istniejące nośniki powinny być wymieniane na nowe media co 48 godzin. Przed każdą zmianą pożywki należy wstępnie podgrzać pożywkę organoidową myszy. Nie jest konieczne dodawanie inhibitora ROCK do pożywek używanych do uzupełniania.

  1. Przechyl 24-dołkową płytkę pod kątem 45° i delikatnie usuń istniejące media ze środka każdej studzienki za pomocą pipety p1000, unikając pierścienia żelowego matrycy.
  2. Dodać 350 μl wstępnie podgrzanej pożywki z organoidów mysich, jak w kroku 2.9. Zaleca się dodawanie większej objętości pożywki (do 1 ml) do organoidów hodowanych dłużej niż 5 dni, aby zapobiec szybkiemu wyczerpaniu kluczowych składników odżywczych i czynników wzrostu.

4. Ekstrakcja lizatu białkowego z organoidów prostaty do analizy Western Blot — CZAS: 2,5-4 godziny

UWAGA: Przed pobraniem organoidów do ekstrakcji lizatu białkowego, przygotuj i wstępnie podgrzej pożywkę zawierającą dyspazę (Tabela 1).

  1. Wyjmij nośnik z każdej studzienki, jak w kroku 3.1.
  2. Aby zebrać organoidy, należy kilkakrotnie przedmuchać żel matrycowy, pipetując 1 ml pożywki zawierającej dyspazę bezpośrednio na pierścień żelowy matrycy, aż cały pierścień zostanie usunięty, a następnie przenieść do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml.
    nuta: Bardzo ważne jest, aby unikać bezpośredniego kontaktu ze studzienkami pokrytymi poli-HEMA. Bezpośredni kontakt może spowodować zanieczyszczenie pobranego materiału preparatem Poly-HEMA, co może negatywnie wpłynąć na przeżywalność komórek.
  3. Umieścić probówkę (probówki) do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml w inkubatorze o temperaturze 37 °C 5% CO2 na 30 minut do 1 godziny, aby umożliwić całkowite roztrawienie żelu matrycowego przez dypazę.
  4. Organoidy osadzać przez odwirowanie przy 800 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i usunąć supernatant za pomocą mikropipety.
  5. Dodać sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) do osadu organoidowego i ponownie zawiesić, delikatnie strzepując.
    nuta: Niewystarczające ponowne zawieszenie osadu organoidowego może spowodować zanieczyszczenie materiału organoidowego pozostałościami dypazy lub żelu matrycowego.
  6. Osadzać organoidy przez odwirowanie przy 800 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i usunąć supernatant za pomocą mikropipety.
  7. Szybko zamroź granulki organoidów, umieszczając każdą probówkę w roztworze zawierającym suchy lód i metanol. Przechowywać probówkę (probówki) do przyszłego użycia w temperaturze -80 °C. Alternatywnie, wyekstrahować lizat białkowy natychmiast po kroku 4.6.
  8. Zawiesić osady organoidów w 100 μl buforu do lizy białek (Tabela 1) na 10 μl objętości upakowanych komórek. Przesuń, aby ponownie zawiesić.
    nuta: W przypadku wznawiania po szybkim zamrożeniu należy upewnić się, że bufor do lizy białek został rozmrożony przed usunięciem próbek z temperatury -80 °C, ponieważ bufor do lizy musi być natychmiast dodany do próbek, aby zapobiec aktywności fosfatazy i proteazy.
  9. Próbki inkubować w buforze do lizy białek na lodzie przez co najmniej 45 min.
    nuta: Zaleca się sonikację przed inkubacją na lodzie w celu zwiększenia efektywności odzyskiwania białek jądrowych; Sonikacja nie jest jednak wymagana. Jeśli sonikacja nie jest wykonywana, przejdź do kroku 4.10.
    1. Aby wykonać sonikat, zanurz probówki w mokrym lodzie i delikatnie przyłóż końcówkę dysmembratora sonicznego na zewnątrz probówki mikrowirówkowej. Sonikować przez 40 s przy 20 kHz.
  10. Przejdź do Western blot zgodnie z ustalonymi protokołami.

5. Utrwalanie i barwienie organoidów prostaty do analizy immunohistochemicznej za pomocą mikroskopii konfokalnej

  1. Pobieranie organoidów gruczołu krokowego z płytek 24-dołkowych — CZAS: 45-60 min
    nuta: Podczas pobierania organoidów prostaty do przetwarzania pod mikroskopią konfokalną bardzo ważne jest, aby obchodzić się z nimi ostrożnie, aby zachować ich strukturę. Poniższy protokół pobierania ma na celu zmniejszenie zakłóceń struktury organoidów podczas izolacji.
    1. Wyjmij nośnik z każdej studzienki, jak w kroku 3.1.
    2. Roztrawić żel matrycowy przez inkubację z 500 μl pożywki zawierającej dyspazę (tabela 1) przez 30 minut w inkubatorze o temperaturze 37 °C 5% CO2 .
    3. Zebrać strawioną zawiesinę organoidów do probówki do mikrowirówki i zagnieździć organoidy przez odwirowanie przy 800 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant.
  2. Barwienie immunofluorescencyjne organoidów prostaty metodą całego mocowania — CZAS: 3-4 dni (1-5 h/dzień)
    1. Dodać 500 μl 4% paraformaldehydu do PBS i inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając.
    2. Osadzać organoidy przez odwirowanie przy 800 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej, usunąć supernatant i przemyć osad 1 ml PBS przez 15 minut, delikatnie wstrząsając.
    3. Umyj osad jak w kroku 5.2.2 dodatkowo dwa razy.
    4. Osadzać organoidy przez odwirowanie przy 800 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej i usunąć supernatant. Dodać 1 μg/ml DAPI do roztworu blokującego (Tabela 1). Inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej lub alternatywnie przez noc w temperaturze 4 °C, delikatnie wstrząsając.
    5. Osadzać organoidy przez odwirowanie przy 800 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej i usunąć supernatant. Dodać przeciwciało pierwszorzędowe (królicze przeciwciało anty-p63, mysia anty-cytokeratyna 8) w roztworze blokującym i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C, delikatnie wstrząsając.
    6. Osadzać organoidy przez odwirowanie przy 800 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej i usunąć supernatant. Umyj granulkę 1 ml PBS przez 15 minut, delikatnie wstrząsając.
    7. Umyj granulkę jak w kroku 5.2.6 dodatkowo dwa razy.
    8. Osadzać organoidy przez odwirowanie przy 800 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej i usunąć supernatant. Dodać przeciwciało drugorzędowe (kozie przeciwciało anty-królicze IgG-Alexa Fluor 594, kozie przeciwciało anty-mysie IgG-Alexa Fluor 488) w roztworze blokującym i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C, delikatnie wstrząsając.
    9. Osadzać organoidy przez odwirowanie przy 800 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej, usunąć supernatant i przemyć osad 1 ml PBS przez 15 minut, delikatnie wstrząsając.
    10. Umyj granulkę jak w kroku 5.2.9 dodatkowo dwa razy.

6. Oczyszczanie tkanek i montaż barwionych organoidów prostaty do pełnej mikroskopii konfokalnej — CZAS: 7 godzin

  1. Osadzać organoidy przez odwirowanie przy 800 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej i usunąć supernatant.
  2. Dodać 1 ml 30% sacharozy w PBS z 1% Triton X-100 i inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej z delikatnym wstrząsaniem.
  3. Osadzać organoidy przez odwirowanie przy 800 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej i usunąć supernatant.
  4. Dodać 1 ml 45% sacharozy w PBS z 1% Triton X-100 i inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej z delikatnym wstrząsaniem.
  5. Osadzać organoidy przez odwirowanie przy 800 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej i usunąć supernatant.
  6. Dodać 1 ml 60% sacharozy w PBS z 1% Triton X-100 i inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej z delikatnym wstrząsaniem.
  7. Osadzać organoidy przez odwirowanie przy 800 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej i usunąć 95% supernatantu.
    nuta: Osad staje się luźniejszy wraz ze wzrostem stężenia sacharozy. Zaleca się obserwację organoidów wybarwionych DAPI w świetle UV w celu potwierdzenia, że nie zostały one utracone podczas usuwania supernatantu.
  8. Przenieść 10-20 μl kropli pozostałej zawiesiny do komorowego szkiełka nakrywkowego i przystąpić do mikroskopii konfokalnej.
    nuta: Fragmenty szkiełka nakrywkowego można umieścić po obu stronach kropli i wykorzystać jako przekładki (ryc. 4C). Zapobiegają one zapadaniu się organoidów po umieszczeniu szkiełka nakrywkowego na kropli.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki nabłonka prostaty są umieszczane w hodowli organoidów myszy, gdzie tworzą organoidy, które są zbierane przed przygotowaniem do dalszej analizy (Rysunek 1).

Komórki nabłonka podstawnego i luminalnego są izolowane za pomocą FACS. Po wykluczeniu komórek DAPI+ i wyczerpaniu komórek Lin+ (CD45, CD31, Ter119), komórki podstawowe i luminalne rozróżnia się na podstawie różnicowej ekspresji EpCAM i CD49f (Rysunek 2). Opisane podejście do umieszczania komórek podstawnych i luminalnych prostaty w hodowli organoidów obejmuje: (1) posiewanie komórek w pierścienie żelowe macierzy oraz (2) powlekanie studzienek poli-HEMA. Powlekanie w pierścienie zostało już wcześniej opisane w Agarwal et al9. Wykorzystanie tego podejścia (Rysunek 3A) pozwala naukowcom łatwiej uniknąć żelu matrycowego podczas uzupełniania pożywki (Krok 3) i łatwiej policzyć organoidy, śledząc obwód studni. Wykazano, że powlekanie studzienek Poly-HEMA zapobiega tworzeniu się kolonii 2D w organoidach siatkówki17; Jednak podejście to nie zostało wykorzystane w modelu organoidów prostaty. Co ważne, powlekanie studzienek Poly-HEMA (Tabela 3) eliminuje występowanie kolonii 2D bez ingerencji w tworzenie organoidów (Rysunek 3B). Modyfikacje te rozszerzają możliwości testu organoidowego prostaty.

Komórki bazalne i luminalne tworzą organoidy o odrębnych morfologiach (Rysunek 4A). Podczas gdy większość organoidów pochodzących z bazy ma podobną wielkość (średnica 100-300 μm) po 7 dniach w hodowli, organoidy pochodzące z luminacji wykazują znaczną niejednorodność (średnica 30-450 μm). Co więcej, większość organoidów pochodzenia podstawnego zawiera światła otoczone wielowarstwowym nabłonkiem (Ryc. 4A, góra), podczas gdy organoidy pochodzące z światła różnią się morfologią od pustych, z jednowarstwowym nabłonkiem do stałego, z wielowarstwowymi sznurami komórek, które nie kanalizują (Rysunek 4A, na dole). Opisane powyżej podejścia do przygotowania organoidów do dalszej analizy (kroki 4, 5) zostały wykorzystane do zbadania, czy te różnice fenotypowe odzwierciedlają różnice w ekspresji markerów rodowych. Analiza Western blot wykazała, że organoidy pochodzące z bazy i światła zachowują cechy związane z podstawnymi i luminalnymi komórkami pierwotnymi. Organoidy pochodzące z bazy wyrażają wyższe poziomy markera bazalnego cytokeratyny 5 (K5), podczas gdy organoidy pochodzące z światła wyrażają wyższe poziomy markera luminalnego cytokeratyny 8 (K8) (Figura 4B). Zarówno markery podstawowe, jak i luminalne wykryto w organoidach pochodzących z bazy i światła w populacji większościowej, co może sugerować różnicowanie (Rysunek 4B).

Staraliśmy się scharakteryzować ekspresję markerów linii w organoidach pochodzenia bazalnego i ustalić, czy morfologicznie odrębne organoidy pochodzące z luminalu wykazują różnice w ekspresji markerów poprzez barwienie nienaruszonych organoidów i przeprowadzanie mikroskopii konfokalnej (Rysunek 4D). Organoidy pochodzące z bazy zawierały wielowarstwowy nabłonek z warstwami zewnętrznymi wyrażającymi wysokie poziomy markera bazalnego p63 i umiarkowane poziomy markera luminalnego K8 (p63hi, K8mid) oraz warstwy wewnętrzne bez wykrywalnych poziomów p63 i wysokich poziomów K8 (p63lo, K8hi) (Rysunek 4D, góra). Podczas gdy wszystkie komórki w jednowarstwowych organoidach pochodzących z luminalu wybarwiały się dodatnio na obecność K8, tylko wybrane komórki zawierały jądrowy p63 (Rysunek 4D, na dole). Dane te potwierdzają słuszność metod zbierania i przygotowywania organoidów do analizy za pomocą mikroskopii Western blot lub mikroskopii konfokalnej, a tym samym rozszerzają możliwości testu organoidowego do badania kluczowych procesów komórkowych, w tym różnicowania.

figure-results-1
Rysunek 1: Schemat ilustrujący proces generowania organoidów prostaty do zbierania i analizy. Całkowita prostata myszy jest dysocjowana, a podstawowe i luminalne komórki nabłonka prostaty są izolowane przez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją za pomocą ustalonych protokołów18,19. Komórki podstawowe lub luminalne zawieszone w mieszaninie mysich pożywek organoidowych i żelu matrycowego są powlekane w pierścienie żelowe macierzy. Po 5 do 7 dniach hodowli organoidy są zbierane do analizy za pomocą Western blot lub mikroskopii konfokalnej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rycina 2: Izolacja mysich komórek podstawnego i luminalnego nabłonka prostaty przy użyciu sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS). Zdysocjowane komórki z prostaty myszy są barwione DAPI, aby odróżnić żywe komórki od martwych, oraz przeciwciałami powierzchniowymi, aby odróżnić komórki podstawowe od luminalnych, przed FACS. Po lewej = bramkowany na komórkach DAPI-. FSC-A = rozproszenie do przodu. Centrum = bramkowane na komórkach Lin- (CD45lo, CD31lo, Ter119lo). SSC-A = rozproszenie boczne. Po prawej = Komórki podstawowe (Bas) (EpCAMhi, CD49fhi), Komórki luminalne (Lum) (EpCAMhi, CD49fmid). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rycina 3: Tworzenie organoidów prostaty myszy. (A) Schemat ilustrujący podejście do generowania matrycowego pierścienia żelowego w studzience 24-dołkowej płytki. (B) Reprezentatywne obrazy z kontrastem fazowym organoidów (płaszczyzna wzrostu 3D) i dwuwymiarowych kolonii (płaszczyzna wzrostu 2D) utworzonych 7 dni po posieciu komórek nabłonka prostaty na niepowlekanych (Poly-HEMA (-)) lub powlekanych (Poly-HEMA (+)) 24-dołkowych płytkach. Obszary ramkowe na płaszczyźnie wzrostu 2D są powiększone po prawej stronie. Podziałka = 200 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rycina 4: Analiza ekspresji markerów linii w organoidach prostaty za pomocą Western blot i mikroskopii konfokalnej z całego wierzchołka. (A) Reprezentatywne obrazy kontrastu fazowego organoidów pochodzenia podstawnego (na górze) i luminalnego (na dole) po 7 dniach hodowli. Pasek skali = 100 μm. (B) Analiza Western blot organoidów pochodzenia podstawowego (Bas) i luminalnego (Lum) po 5 dniach hodowli. Barwienie markera podstawowego, cytokeratyny 5 (K5) i markera światła, cytokeratyny 8 (K8) i kontroli obciążenia, histonu H3 (HH3). (C) Schemat ilustrujący komorowe szkiełko nakrywkowe z przekładkami. (D) Reprezentatywne obrazy różnicowego kontrastu interferencyjnego (DIC) i immunofluorescencji organoidów pochodzących z bazy (na górze) i w świetle (na dole) po 7 dniach hodowli. Barwienie dla p63 (czerwony), K8 (zielony) i DAPI (niebieski) pojedynczo i połączone. Podziałka = 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Przepisy
Pożywki zawierające prozazę1 mg/ml dypazy + 10 μM inhibitor ROCK w zaawansowanym DMEM F12. Filtr sterylizować za pomocą filtra 0,22 μm.
Media dysocjacyjne10% FBS + 1x penicylina-streptomycyna w RPMI 1640. Filtr sterylizować za pomocą filtra 0,22 μm.
Bufor do lizy białekBufor RIPA + inhibitory fosfatazy + inhibitory proteazy
Rozwiązanie blokujące10% FBS w PBS z 0,2% Triton X-100

Tabela 1: Instrukcje dotyczące przygotowania kluczowych rozwiązań.

składnikkoncentracja
B-271x (rozcieńczyć od 50x koncentratu)
GlutaMAX1x (rozcieńczyć od 100x koncentratu)
N-acetylo-L-cysteina1,25 mM
Normocin (Normocyna)50 μg/ml
Rekombinowany ludzki EGF, wolny od zwierząt50 ng/ml
Rekombinowany ludzki Noggin100 ng/ml
Pożywki kondycjonowane R-spondyną 110% kondycjonowane media
A83-01200 nM
Protokół DHT1 nM
Dichlorowodorek Y-27632 (inhibitor ROCK)10 μM
Zaawansowany DMEM/F-12Nośnik bazowy
Pożywka kondycjonowana R-spondyną 1 jest generowana zgodnie z opisem w Drost, et al.13. Po dodaniu wszystkich składników przefiltruj sterylizację mysich pożywek organoidowych za pomocą filtra 0,22 μm. Inhibitor ROCK dodaje się tylko podczas tworzenia hodowli i pasażowania organoidów.

Tabela 2: Instrukcje dotyczące przygotowania pożywki dla organoidów myszy.

Protokół przygotowania płyt pokrytych poli-HEMA
1Dodaj 0,25 g Poly-HEMA do 50 ml 98% EtOH. Rozpuścić Poly-HEMA w temperaturze 37 °C na shakerze. Proces ten trwa co najmniej 4 godziny.
cyfra arabskaFiltr sterylizuje Poly-HEMA za pomocą filtra 0,22 μm.
3Dodać 200 μl roztworu Poly-HEMA do dołka z 24-dołkowej płytki (płytek).
4Zdjąć pokrywkę (pokrywki) z 24-dołkowej płytki (płytek) po dodaniu Poly-HEMA i pozostawić roztwór do odparowania przez noc.
5Umyj każdą studzienkę dwukrotnie za pomocą PBS i upewnij się, że studzienki są całkowicie suche przed przechowywaniem po ostatnim myciu. UWAGA: Przerwanie powłoki Poly-HEMA podczas prania może przyczynić się do 2-wymiarowego wzrostu po posianiu komórek nabłonka w hodowlę organoidów. Aby zapobiec uszkodzeniu studzienek pokrytych poli-HEMA, należy unikać bezpośredniego kontaktu z końcówką pipety podczas mycia. Integralność studzienek pokrytych poli-HEMA pozostanie nienaruszona, chyba że poli-HEMA zostanie zeskrobana przez końcówkę pipety.
6Płytki pokryte poliamidem HEMA można przechowywać w temperaturze 4 °C do dwóch tygodni. UWAGA: Owinięcie płytek w parafilm przed przechowywaniem zmniejszy ryzyko zanieczyszczenia.

Tabela 3: Protokół przygotowania płytek pokrytych poli-HEMA.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Różnicowanie komórek nabłonka gruczołu krokowego jest związane zarówno z normalną biologią prostaty 2,3,4,5,6,7, jak i biologią choroby 8,10,11,12; Jednak główne regulatory tego procesu pozostają nieokreślone. Identyfikacja kluczowych regulatorów różnicowania komórek nabłonka prostaty była trudna częściowo ze względu na brak dobrze ugruntowanych kontekstów do jego modelowania. Podczas gdy hodowla jednowarstwowa 2D może być wykorzystana do modelowania różnicowania11,12, kontekst ten nie podsumowuje złożonego mikrośrodowiska prostaty. Co więcej, konteksty in vivo do różnicowania modeli nie nadają się do badań mechanistycznych, ponieważ trudno jest nimi manipulować. W związku z tym kluczowe znaczenie ma identyfikacja łatwego do manipulowania, a jednocześnie fizjologicznie istotnego kontekstu do badania różnicowania.

Model organoidów gruczołu krokowego reprezentuje elegancki kontekst ex vivo, w którym zgłasza się różnicowanie od podstawowego do luminalnego. Metody tworzenia organoidów gruczołu krokowego są dobrze ugruntowane14; Konieczna jest jednak dalsza optymalizacja tych metod. Ponadto podejścia do pobierania i przygotowywania organoidów prostaty do analizy nie są jasno opisane. W artykule opisano podejście do płytki komórek nabłonka prostaty wyizolowanych z mysiej prostaty do hodowli organoidów. Takie podejście pozwala naukowcom (1) zapobiegać występowaniu kolonii 2D podczas tworzenia organoidów, (2) zmniejszyć ryzyko zakłócenia działania żelu matrycowego podczas uzupełniania pożywki oraz (3) skuteczniej zliczać organoidy. Ponadto w manuskrypcie tym przedstawiono podejścia do pozyskiwania organoidów w celu przygotowania do analizy Western blot lub mikroskopii konfokalnej z całą mocą. Co ważne, podejście wykorzystane do przygotowania organoidów do mikroskopii konfokalnej utrzymuje nienaruszoną strukturę organoidów przez cały czas jej trwania, co zmniejsza uszkodzenia organoidów przed uzyskaniem obrazu. Podsumowując, opisane podejścia rozszerzają możliwości testu organoidów prostaty.

Warto zauważyć, że zdolność komórek podstawnych i luminalnych do tworzenia organoidów może być zmieniona zarówno przez metody stosowane do izolowania odpowiednich populacji, jak i przez warunki hodowli. Warunki hodowli organoidów zastosowane w tym teście zostały po raz pierwszy opisane przez Karthausa i wsp.13. Podczas gdy Karthaus i wsp. stwierdzili, że komórki podstawne mają wyższą zdolność tworzenia organoidów (15%) niż komórki luminalne (1%)13, Chua i wsp., stosując różne metody izolacji i warunki hodowli, stwierdzili, że komórki luminalne (0,2-0,3%) mają wyższą zdolność tworzenia organoidów niż komórki podstawne (0,03%)20. Ogólnie rzecz biorąc, metody opisane przez Karthausa i wsp. prowadzą do wyższych wskaźników tworzenia organoidów zarówno dla komórek podstawnych, jak i luminalnych, prawdopodobnie odzwierciedlając różnice w podejściu stosowanym do izolowania komórek podstawnych i luminalnych13, w przeciwieństwie do warunków hodowli, które utrudniają tworzenie organoidów z komórek luminalnych. Nie jest jasne, czy protokół opisany w tym manuskrypcie faworyzuje tworzenie organoidów luminalnych od multipotencjalnych progenitorów luminalnych, czy też od zaangażowanych przodków luminalnych9. Chociaż jest to czasowe i kosztowne, badania śledzenia linii in vivo można wykorzystać do walidacji cech progenitorowych związanych z odrębnymi liniami nabłonka prostaty wyjaśnionymi w teście organoidowym.

Procesy takie jak rozwój, różnicowanie i transformacja są istotne nie tylko dla biologii prostaty, ale także dla biologii innych tkanek, w tym mózgu, płuc, jelit, trzustki i wątroby. Opisane metody ułatwiają wykorzystanie modelu organoidowego do badania tych procesów nie tylko w prostacie, ale także w szerokim zakresie tkanek.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PDC i JMG są wspierane przez Ruth L. Kirschstein National Research Service Award GM007185. JAD jest wspierany przez Narodowy Instytut Ogólnych Nauk Medycznych Narodowych Instytutów Zdrowia (R25GM055052) przyznany T. Hassonowi i stypendium Saula Martineza. ASG jest wspierane przez Spitzer Family Foundation Fund i Gill Endowment. Praca ta była wspierana przez American Cancer Society (RSG-17-068-01-TBG), Departament Obrony (W81XWH-13-1-0470), Margaret E. Early Medical Research Trust, NIH/NCI (P50CA092131/UCLA SPORE in Prostate Cancer), Rose Hills Foundation oraz wsparcie ze strony UCLA's Jonsson Comprehensive Cancer Center, Broad Stem Cell Research Center, Clinical and Translational Science Institute oraz Institute of Urologic Oncology.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
&Micro;-Naczynie 35 mm, wysokieibidi81156
16% ParaformaldehydThermo Fisher Scientific50-980-487
4',6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI)Thermo Fisher ScientificD1306
A83-01Tocris2939
Advanced DMEM/F-12Thermo Fisher Scientific12634010
Przeciwciało anty-mysie CD326 APC/Cy7 (Ep-CAM), 100 μ gBioLegend118218
Suplement B-27 (50x), Bez surowicyThermo Fisher Scientific17504044
Kompletny koktajl inhibitorów proteazySigma11836145001
(DiHydro)testosteron (5α-Androstan-17β-ol-3-one)SigmaA-8380
Dispase II, ProszekThermo Fisher Scientific17-105-041
Płodowa surowica bydlęca (FBS)SigmaF8667
FITC przeciwciało anty-mysie CD31 (0,5 mg / ml, 50 μ g)BioLegend102405
FITC przeciwciało anty-mysie CD45 (0,5 mg/ml, 50 & mu; g)BioLegend103107
FITC przeciwciało przeciw mysim TER-119/komórkom erytroidalnym (0,5 mg/ml, 50 μ g)BioLegend116205
Goat anty-mysie IgG-Alexa Fluor 488InvitrogenA28175
Kozia anty-królicza IgG-Alexa Fluor 594InvitrogenA11012
GlutaMAXThermo Fisher Scientific35050061
Inhibitor fosfatazy HaltThermo Fisher Scientific78428
Matrigel GFR Membrane MatrixCorningCB-40230C
Mysia antycytokeratyna 8BioLegend904804
N-acetylo-L-cysteinaSigmaA9165
NormocinThermo Fisher Scientificant-nr-1
PE anty-ludzkie/mysie przeciwciało CD49fBioLegend313612
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15-140-122
Poli(2-hydroksyetylometakrylan) (Poly-HEMA)SigmaP3932-25G
Królik anty-p63BioLegend619002
Test radioimmunoprecypitacyjny (RIPA)Thermo Fisher ScientificPI89901
Rekombinowany ludzki EGF, bez zwierzątPeproTechAF-100-15
Rekombinowany ludzki NogginPeproTech120-10C
RPMI 1640 Medium, HEPES (cs of 10)Thermo Fisher Scientific22400105
Sonic DismembratorThermo Fisher ScientificFB120
SacharozaSigmaS0389-500G
Triton X-100SigmaX100-5ML
Y-27632 dichlorowodorek (inhibitor ROCK)Selleck ChemicznyS1049-50MG

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kwon, O. J., Xin, L. Prostate epithelial stem and progenitor cells. American Journal of Clinical and Experimental Urology. 2 (3), 209-218 (2014).
  2. Choi, N., Zhang, B., Zhang, L., Ittmann, M., Xin, L. Adult Murine Prostate Basal and Luminal Cells Are Self-Sustained Lineages that Can Both Serve as Targets for Prostate Cancer Initiation. Cancer Cell. 21 (2), 253-265 (2012).
  3. Ousset, M., Van Keymeulen, A., et al. Multipotent and unipotent progenitors contribute to prostate postnatal development. Nature Cell Biology. 14 (11), 1131-1138 (2012).
  4. Wang, J., et al. Symmetrical and asymmetrical division analysis provides evidence for a hierarchy of prostate epithelial cell lineages. Nature Communications. 5, 1-13 (2014).
  5. Wang, Z. A., Mitrofanova, A., et al. Lineage analysis of basal epithelial cells reveals their unexpected plasticity and supports a cell-of-origin model for prostate cancer heterogeneity. Nature Cell Biology. 15 (3), 274-283 (2013).
  6. Kwon, O. J., Zhang, B., Zhang, L., Xin, L. High fat diet promotes prostatic basal-to-luminal differentiation and accelerates initiation of prostate epithelial hyperplasia originated from basal cells. Stem Cell Research. 16 (3), 682-691 (2016).
  7. Kwon, O. J., Zhang, L., Ittmann, M. M., Xin, L. Prostatic inflammation enhances basal-to-luminal differentiation and accelerates initiation of prostate cancer with a basal cell origin. Proceedings of the National Academy of Sciences. 192 (3), 997-999 (2014).
  8. Stoyanova, T., et al. Prostate cancer originating in basal cells progresses to adenocarcinoma propagated by luminal-like cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (50), 20111-20116 (2013).
  9. Agarwal, S., Hynes, P. G., et al. Identification of Different Classes of Luminal Progenitor Cells within Prostate Tumors. Cell Reports. 13 (10), 2147-2158 (2015).
  10. Ku, S. Y., et al. Rb1 and Trp53 cooperate to suppress prostate cancer lineage plasticity, metastasis, and antiandrogen resistance. Science. 355 (6320), 78-83 (2017).
  11. Mu, P., et al. SOX2 promotes lineage plasticity and antiandrogen resistance in TP53- and RB1-deficient prostate cancer. Science. 355 (6320), 84-88 (2017).
  12. Bishop, J. L., et al. The Master Neural Transcription Factor BRN2 Is an Androgen Receptor-Suppressed Driver of Neuroendocrine Differentiation in Prostate Cancer. Cancer Discovery. 7 (1), 54-71 (2016).
  13. Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
  14. Drost, J., Karthaus, W. R., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).
  15. McCray, T., Richards, Z., Marsili, J., Prins, G. S., Nonn, L. Handling and Assessment of Human Primary Prostate Organoid Culture. Journal of Visualized Experiments. (143), e59051(2019).
  16. Lawson, D. A., Xin, L., Lukacs, R. U., Cheng, D., Witte, O. N. Isolation and functional characterization of murine prostate stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (1), 181-186 (2007).
  17. Chen, H. Y., Kaya, K. D., Dong, L., Swaroop, A. Three-dimensional retinal organoids from mouse pluripotent stem cells mimic in vivo development with enhanced stratification and rod photoreceptor differentiation. Molecular vision. 22, 1077-1094 (2016).
  18. Liu, X., et al. Low CD38 Identifies Progenitor-like Inflammation-Associated Luminal Cells that Can Initiate Human Prostate Cancer and Predict Poor Outcome. Cell Reports. 17 (10), 2596-2606 (2016).
  19. Lukacs, R. U., Goldstein, A. S., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. Isolation, cultivation and characterization of adult murine prostate stem cells. Nature protocols. 5 (4), 702-713 (2010).
  20. Chua, C. W., Shibata, M., et al. Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture. Nature Cell Biology. 16 (10), 951-961 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Prostate Organoid CultureBasal Luminal CellsMouse Prostate Epithelial CellsOrganoid Differentiation CapacityWestern Blot AnalysisWhole Mount Confocal MicroscopyMatrix Gel HandlingCytokeratin 5 8 MarkersOrganoid Media PreparationDispase Digestion Protocol

Related Articles